Tạo ống ghép mạch máu có nguồn gốc dị loại hướng tới ứng dụng trong công nghệ tim mạch

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TẠO ỐNG GHÉP MẠ

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

CẤP THÀNH PHỐ

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

TẠO ỐNG GHÉP MẠCH MÁU CÓ NGUỒN GỐC

DỊ LOẠI HƯỚNG TỚI ỨNG DỤNG TRONG

CÔNG NGHỆ TIM MẠCH

Cơ quan chủ trì nhiệm vụ:

Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ

Chủ nhiệm nhiệm vụ:

ThS Tô Minh Quân

Thành phố Hồ Chí Minh – 2018

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

CẤP THÀNH PHỐ

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

TẠO ỐNG GHÉP MẠCH MÁU CÓ NGUỒN GỐC

DỊ LOẠI HƯỚNG TỚI ỨNG DỤNG TRONG

CÔNG NGHỆ TIM MẠCH

Chủ nhiệm nhiệm vụ

ThS Tô Minh Quân

Chủ tịch Hội đồng nghiệm thu Cơ quan chủ trì nhiệm vụ

PGS TS Lê Huyền Ái Thúy Đoàn Kim Thành

Thành phố Hồ Chí Minh – 2018

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC HÌNH iv

DANH MỤC BẢNG v

MỞ ĐẦU 1

MỤC TIÊU 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cấu tạo mạch máu 3

1.2 Căn bệnh xơ vữa mạch máu 4

1.3 Các phương pháp chữa trị hiện nay 6

1.4 Ống ghép mạch máu vô bào 7

1.5 Các phương pháp tạo mảnh ghép mạch máu vô bào 8

1.6 Kết hợp tế bào gốc trung mô vào phục hồi mạch máu 11

1.6.1 Tế bào gốc trung mô 11

1.6.2 Ứng dụng tế bào gốc trung mô phục hồi mạch máu 12

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 14

2.1 Mẫu vật 14

2.2 Nội dung 1: Khảo sát quy trình khử tế bào động mạch cảnh heo 14

Phương pháp 1: Thu nhận động mạch cảnh heo 14

Phương pháp 2: Phương pháp khử tế bào động mạch cảnh 14

Phương pháp 3: Đánh giá hiệu quả khử tế bào 14

2.3 Nội dung 2: Khảo sát độc tính của động mạch cảnh vô bào trong điều kiện in vitro 15

Phương pháp 4: Phương pháp đánh giá độc tính tế bào in vitro 15

2.4 Nội dung 3: Khảo sát độc tính của động mạch cảnh vô bào trong điều kiện in vivo 16

Phương pháp 5: Phương pháp đánh giá độc tính ống ghép động mạch ảnh vô bào trong cơ thể chuột 16

2.5 Nội dung 4: Khảo sát sự tăng sinh tế bào gốc trung mô trên động mạch cảnh vô bào 17

Phương pháp 7: Phương pháp cấy tế bào gốc trung mô (MSC) trên ống ghép

mạch máu 17

Phương pháp 8: Phương pháp đánh giá sự tăng sinh tế bào MSC trên động mạch cảnh vô bào 17

KẾT QUẢ 18

3.1 Kết qủa khảo sát quy trình khử tế bào động mạch cảnh heo 18

3.1.1 Kết quả khảo sát động mạch cảnh tự nhiên 18

3.1.2 Kết quả khử tế bào của nước cất trong 24 giờ 20

3.1.3 Kết quả khử tế bào của peracetic acid trong 24 giờ 21

3.1.4 Kết quả khử tế bào của Triton X100 22

3.1.5 Kết quả khử tế bào của SDS 0,5% trong 24 giờ 23

3.1.6 Kết quả khử tế bào kết hợp SDS và nước cất 24

3.2 Kết quả khảo sát độc tính của động mạch cảnh vô bào trong điều kiện in vitro 27 3.3 Kết quả khảo sát độc tính của động mạch cảnh vô bào trong điều kiện in vivo 30 3.3.1 Kết quả đánh giá đáp ứng viêm ngày 7 31

3.3.2 Kết quả đánh giá đáp ứng viêm ngày 14 32

3.3.3 Kết quả đánh giá đáp ứng viêm ngày 28 34

3.4 Kết quả khảo sát sự tăng sinh tế bào gốc trung mô trên động mạch cảnh vô bào 36 Bàn luận: 39

KẾT LUẬN 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC a

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc ba lớp của mạch máu 3

Hình 1.2 Động mạch xơ vữa 4

Hình 1.3 Cấu tạo mảng xơ vữa 5

Hình 1.4 Xơ vữa động mạch vành 6

Hình 1.5 Các phương pháp chữa trị xơ vữa động mạch vành 6

Hình 1.6 Ống ghép Dacron 8

Hình 1.7 Phương pháp loại tế bào 9

Hình 1.8 Ống ghép SIS 11

Hình 3.1 Động mạch heo sau xử lý 18

Hình 3.2 Kết quả nhuộm mô học động mạch cảnh heo chưa xử lý (x200) 19

Hình 3.3 Kết quả nhuộm mô học ĐMC heo xử lý với bước cất 24 giờ (x200) 20

Hình 3.4 Kết quả nhuộm mô học ĐMC xử lý với PAA 5% trong 24 giờ (x200) 21

Hình 3.5 Kết quả nhuộm mô học ĐMC xử lý với Triton X100 0,1% trong 24 giờ (x200) 23

Hình 3.6 Kết quả nhuộm mô học ĐMC xử lý với SDS 0.5% trong 24 giờ (x200) 24

Hình 3.7 Kết quả nhuộm mô học ống ghép mạch máu xử lý kết hợp SDS 0.5% 24 giờ và nước cất 24 giờ (x200) 25

Hình 3.8 Mảnh ghép được đặt trực tiếp trên bề mặt tế bào trên đĩa nuôi cấy (x100) 27 Hình 3.9 Kết quả thử nghiệm độc tính trực tiếp sau 24 giờ (x100) 27

Hình 3.10 Kết quả nhuộm Giemsa tế bào sau khi đặt mảnh ghép 24 giờ (x100) 28

Hình 3.11 Kết quả nhuộm MTT tế bào sau khi tiếp xúc với dịch chiết 24 giờ (x100) 29 Hình 3.12 Ống ghép Gelsoft TM Plus 30

Hình 3.13 Kết quả ghép mảnh ghép ĐMC vô bào vào cơ thể chuột 30

Hình 3.14 Kết quả nhuộm mô học mảnh ghép đối chứng sau khi ghép trong cơ thể chuột 7 ngày 31

Hình 3.15 Kết quả nhuộm mô học mảnh ghép thí nghiệm sau khi ghép trong cơ thể

bào đánh giá bằng phương pháp MTT 38

Hình 3.24 Mảnh ghép Gelsoft TM Plus 42

DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Bảng tóm tắt hiệu quả khử tế bào và bảo tồn collagen của các phương

pháp xử lý khác nhau 26

Bảng 2 Tóm tắt kết quả thử nghiệm độc tính tế bào theo phương pháp trực tiếp và

dịch chiết 29

MỞ ĐẦU

Hằng năm, các căn bệnh mạch máu như xơ vữa hoặc phình mạch đang gây ra hàng triệu cái chết tại các quốc gia trên toàn thế giới Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 2017, mỗi năm trên thế giới có khoảng 17,7 triệu người qua đời do bệnh tim mạch (chiếm 31% số ca tử vong trên toàn thế giới) Theo thống kê của Hiệp hội Tim mạch Hoa kỳ năm 2017, trung bình, số ca tử vong do bệnh tim mạch chiếm 1/3 tổng số ca tử vong nước Mỹ (gần 810.000 ca mỗi năm), trong đó bệnh mạch vành chiếm khoảng 45% số ca tim mạch Khoảng 22.000 người Mỹ qua đời do tim mạch, tương đương với 40 giây mỗi ca Nguy hiểm hơn, những căn bệnh này xuất hiện ngày càng phổ biến với triệu chứng ngày càng nặng và độ tuổi mắc bệnh ngày càng trẻ Tại Việt Nam, mặc dù chưa có nghiên cứu chính thức thống kê

số lượng bệnh nhân mắc bệnh mạch máu nhưng theo ghi nhận của nhiều bệnh viện, lượng bệnh nhân mắc bệnh mạch máu đang ngày càng gia tăng Theo thống kê của Viện Tim Mạch Trung Ương, năm 2003 tỉ lệ bệnh nhân nhập viện do bệnh động mạch vành chiếm 11,2%, đến năm 2008 tỉ lệ này đã tăng lên 24%

Một số phương pháp chữa trị bệnh mạch máu được áp dụng như: sử dụng một mạch máu khác làm cầu nối qua đoạn bị tổn thương hoặc đặt một khung kim loại (stent)

để nong lòng mạch bị hẹp do xơ vữa Tuy nhiên, những phương pháp này vẫn chưa chữa trị được hoàn toàn căn bệnh mạch máu, khoảng 1/3 bệnh nhân không có mạch máu phù hợp, chi phí phẫu thuật cao, hiện tượng tái hẹp vẫn có khả năng xảy ra Do

đó, kỹ nghệ mạch máu ra đời nhằm tạo ra ống ghép mạch máu nhân tạo phù hợp được sử dụng làm đoạn mạch bắc cầu qua vị trí bị tổn thương hoặc được sử dụng để thay thế mạch máu bị tổn thương Một phương pháp đang được nghiên cứu nhiều hiện nay để tạo ống ghép mạch máu nhân tạo là khừ tế bào động mạch tự nhiên để tạo ống ghép mạch máu vô bào Phương pháp này có những ưu điểm như cấu trúc, hình dạng, thành phần của ống ghép mạch máu vô bào tương tự với mạch máu tự nhiên, nguồn thu nhận mẫu dồi dào và chi phí sản xuất tương đối thấp hơn Do đó, ống ghép mạch máu vô bào hứa hẹn đem đến nhiều hy vọng cho các nghiên cứu trong kỹ nghệ mạch máu

Hiện nay, công nghệ tế bào được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực mạch máu nhân tạo Tế bào nội mô, tế bào cơ trơn là đối tượng ứng dụng được nghiên cứu đầu tiên bởi đây là 2 loại tế bào tự nhiên của mạch máu Tuy nhiên, nguồn tế bào này bị hạn chế trong cơ thể người trưởng thành Do đó, các loại tế bào gốc như tế bào gốc trung mô được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực này Tế bào gốc trung mô thu nhận từ nguồn tự thân, có khả năng biệt hóa thành tế bào nội mô, tế bào cơ trơn Do đó, nguồn tế bào này đang được nghiên cứu kỹ để tạo thành mạch máu nhân tạo Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “TẠO ỐNG GHÉP MẠCH MÁU CÓ NGUỒN GỐC DỊ LOẠI HƯỚNG TỚI ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ TIM MẠCH”

để tiến hành đánh giá tiềm năng sử dụng ống ghép động mạch cảnh có nguồn gốc dị loại trong lĩnh vực mạch máu

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Phần lớn các động mạch, tĩnh mạch trong cơ thể được được cấu tạo bởi 3 lớp: lớp ngoài, lớp giữa và lớp trong

- Lớp ngoài là lớp mô liên kết được cấu thành từ các nguyên bào sợi, dây thần kinh và những mạch máu nhỏ Thành phần ECM (ExtraCellular Matrix) chủ yếu lớp ngoài là sợi collagen và elastin Những sợi collagen lớp ngoài được định hướng theo chiều dọc Nhờ đó, động mạch có độ bền cần thiết để ngăn chặn hiện tượng giãn mạch máu quá mức khi cơ thể vận động (45)

- Lớp giữa bao gồm các tế bào cơ trơn và những sợi protein như collagen, elastin Tế bào cơ trơn và các sợi protein được tổ chức thành những vòng tròn đồng tâm xoay quanh trục mạch máu Ranh giới giữa lớp giữa và lớp ngoài là phiến đàn hồi ngoài được cấu tạo từ các sợi elastin (30, 48)

- Lớp trong (còn gọi là lớp nội mô hay lớp nội mạc) bao gồm một lớp tế bào nội mô Tế bào nội mô bao phủ hoàn toàn lòng trong của tất cả mạch máu trong cơ thể Ranh giới giữa lớp trong và lớp giữa là phiến đàn hồi trong được cấu tạo từ các phân tử elastin (30, 48)

Hình 1.1 Cấu trúc ba lớp của mạch máu (http://iupucbio2.iupui.edu)

Tế bào cơ trơn

1.2 Căn bệnh xơ vữa mạch máu

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế Giới (WHO) năm 2017, khoảng 17,5 triệu người qua đời vì bệnh tim mạch trên toàn thế giới (chiếm 31% số ca tử vong trên toàn thế giới) Trong số những bệnh nhân qua đời vì bệnh tim mạch, hơn 7,4 triệu người qua đời do bệnh mạch vành Theo dự đoán, đến năm 2030, hai mươi ba triệu người qua đời vì bệnh tim mạch Theo thống kê của Hiệp hội Tim mạch Hoa kỳ năm 2017, số ca tử vong do bệnh mạch vành chiếm 1/7 tổng số ca tử vong trên toàn nước Mỹ (7) Nguy hiểm hơn, những căn bệnh này xuất hiện ngày càng phổ biến với triệu chứng ngày càng nặng và độ tuổi mắc bệnh ngày càng trẻ Hiện nay,

số lượng người mắc bệnh tim mạch đang gia tăng mạnh trong những nước có thu nhập thấp và trung bình do sự thay đổi lối sống và sự thiếu thốn về điều kiện kinh

tế

Nhiều căn bệnh liên quan đến mạch máu được biết đến trong xã hội hiện tại như xơ vữa mạch máu, phình mạch và những trường hợp mạch máu bị tổn thương do tai nạn, bệnh lý Trong đó, căn bệnh thường xãy ra nhất và đưa đến những hậu quả thảm khốc là xơ vữa mạch máu Xơ vữa mạch máu là hiện tượng các phân tử lipid lắng đọng vào thành mạch dẫn đến thành mạch trở nên xơ và cứng hơn

Hình 1.2 Động mạch xơ vữa (http://www.pic2fly.com)

Nguyên nhân:

Xơ vữa mạch máu xãy ra do sự tích lũy những phân tử lipoprotein có mật độ thấp (Low-Density Lipoprotein, LDL) trong lòng mạch Trong điều kiện sinh lý, tế bào nội mô ngăn cản sự lắng tụ LDL vào thành mạch Tuy nhiên, khi tế bào nội mô bị suy chức năng, khe hở được hình thành giữa các tế bào nội mô Các phân tử LDL

xâm nhập vào lớp cận nội mô thông qua những khe hở giữa các tế bào Đồng thời, các tế bào bạch cầu như monocyte, lympho T cũng xâm nhập vào lớp cận nội mô theo con đường tương tự LDL Nguyên nhân thường gặp đối với hiện tượng suy chức năng nội mô bao gồm bệnh cao huyết áp, bệnh tiểu đường, chứng nghiện thuốc lá, nồng độ các phân tử LDL bị oxi hóa cao, nhiễm vi sinh vật như virus herpes (40)

Trong lớp cận nội mô, các hạt LDL bị oxi hóa (LDLox) bởi các sản phẩm được sản xuất bởi tế bào nội mô và tế bào cơ trơn và bị hấp thu bởi các đại thực bào Đại thực bào dung hợp một lượng lớn các phân tử LDLox tạo thành tế bào foam Các tế bào foam tích lũy theo thời gian tạo thành những mảng mỡ lấn vào lòng mạch máu Ngoài ra, LDLox tác động mạnh lên tế bào nội mô, gây suy giảm chức năng tế bào nội mô trên diện rộng (8, 32)

Hình 1.3 Cấu tạo mảng xơ vữa (40)

Sau đó, tế bào nội mô tiết ra các chất cảm ứng quá trình hoạt hóa và di cư tế bào cơ trơn Tiếp theo, tế bào cơ trơn trải qua quá trình hoạt hóa, di cư, tăng sinh và tổng hợp ECM (chủ yếu là collagen, proteoglycan) trong lớp cận nội mô Sau đó, tế bào

cơ trơn, nguyên bào sợi tạo nên lớp vỏ xơ bao bọc bên ngoài mãng xơ vữa và các

tế bào, các phân tử lipid bên trong mãng mỡ bị phân hủy hình thành phần lõi vữa bên trong mãng xơ vữa (32)

Tác hại của xơ vữa mạch máu

Khi tiếp xúc với LDLox, tế bào nội mô chuyển sang khả năng cảm ứng đông máu thay vì chống đông máu Những khối máu đông có thể hình thành trên bề mặt mảng xơ vữa gây tắc mạch máu

Nguy hiểm nhất, màng bao ngoài mãng xơ vữa có thể bị phá vỡ bởi các enzyme do

tế bào bạch cầu sản xuất hoặc do áp lực dòng máu Ngay tức thời, khối máu đông

sẽ được hình thành tại vị trí mảng xơ vữa dẫn đến tắc một phần hoặc tắc hoàn toàn mạch máu Mảng xơ vữa bị bong khỏi mạch sẽ di chuyển theo dòng máu và có thể gây tắc những mạch nhỏ hơn

Màng bao xơ Lõi vữa

Tế bào foam

Sự nguy hiểm của xơ vữa mạch máu phụ thuộc nhiều vào vị trí mạch máu Xơ vữa động mạch vành có thể dẫn tới bị nhồi máu cơ tim, xỡ vữa động mạch não có thể dẫn tới tai biến mạch máu não, xơ vữa tại động mạch chi có thể dẫn tới liệt chi Tóm lại, bệnh xơ vữa mạch máu có thể gây ra những tổn thương nghiêm trọng đến bệnh nhân như bị bại liệt, sống đời sống thực vật… và thường xuyên dẫn đến tử vong

Hình 1.4 Xơ vữa động mạch vành (http://www.professays.com)

Hiện nay, các phương pháp lâm sàng được áp dụng chữa trị xơ vữa mạch máu bao gồm: phương pháp chữa trị bằng thuốc, phương pháp bắc cầu động mạch, phương pháp tạo hình động mạch

- Phương pháp bắc cầu động mạch: Phương pháp này sử dụng một mạch máu làm cầu nối ngang qua đoạn mạch bị xơ vữa Cầu nối mạch máu giúp phục hồi dòng máu đến các mô, cơ quan nằm phía sau đoạn xơ vữa (16)

Phương pháp đặt stent Phương pháp bắc cầu động mạch

- Phương pháp tạo hình động mạch: Phương pháp này sử dụng một khung kim loại được gọi là stent Stent được đưa vào cơ thể bằng phương pháp nội soi và di chuyển theo tĩnh mạch đùi đến vị trí xơ vữa Tại vị trí xơ vữa, stent được căng ra để nén mãng xơ vữa vào thành mạch và cố định tại vị trí xơ vữa Qua đó, mãng xơ vữa bị hẹp lại, sự lưu thông của dòng máu qua vị trí xơ vữa được phục hồi (33)

Các phương pháp chữa trị xơ vữa mạch máu hiện nay đều có những ưu điểm và nhược điểm riêng Nhược điểm chung của các phương pháp này là vẫn chưa chữa trị hoàn toàn căn bệnh xơ vữa (mãng xơ vữa vẫn tồn tại trong mạch máu và có khả năng bong ra khỏi vị trí ban đầu), chi phí cho mỗi ca chữa trị cao, số lượng mạch máu tự thân phù hợp cho phẫu thuật bắc cầu mạch máu không nhiều và vẫn có khả năng bị tái hiẹp

Trong bối cảnh đó, kỹ nghệ mạch máu ra đời nhằm giải quyết những vấn đề vẫn tồn đọng đến hiện tại của các phương pháp chữa trị truyền thống Mạch máu nhân tạo được thiết kế nhằm thay thế những mạch máu tổn thương hoặc dùng để làm cầu nối bắc qua đoạn mạch xơ vữa Mạch máu nhân tạo có thể được sản xuất ở quy mô công nghiệp với chi phí sản xuất thấp Do đó, mạch máu nhân tạo hoàn toàn có khả năng đáp ứng được nhu cầu của các bệnh nhân trên toàn thế giới (46)

1.4 Ống ghép mạch máu vô bào

Ống ghép mạch máu là một cấu trúc hình ống được tạo bởi vật liệu tự nhiên hoặc tổng hợp có hoạt tính sinh học Nhiều loại ống ghép mạch máu sử dụng tạo mạch máu nhân tạo được nghiên cứu từ nhiều thập kỷ trước Về thành phần, ống ghép mạch máu nhân tạo được chia thành các nhóm sau: polymer tổng hợp không phân hủy, ống ghép polymer khả năng phân hủy, ống ghép protein và ống ghép mạch máu vô bào (12) Các loại ống ghép mạch máu tổng hợp và protein được xem là những ống ghép mạch máu truyền thống trong kỹ nghệ mạch máu lẫn trong kỹ nghệ mô bởi vì chúng xuất hiện khá sớm và được nghiên cứu cặn kẽ từ nhiều thập

kỷ trước đây Hầu hết những ống ghép mạch máu nhân tạo được tạo từ những polymer tổng hợp có khả năng phân hủy sinh học hoặc polymer sinh học như

collagen, fibrin… Bất lợi rõ ràng của 2 loại ống ghép mạch máu trên là thành phần

và cấu trúc của ống ghép mạch máu nhân tạo không giống với thành phần và cấu trúc của mạch máu tự nhiên và khả năng hỗ trợ quá trình tái cấu trúc mạch máu không tốt Thông thường, các loại ống ghép mạch máu trên nhanh chóng bị phân hủy trong cơ thể (38)

Các phương pháp tạo ống ghép mạch máu truyền thống đều dựa trên một ý tưởng chung là tạo ống ghép có cấu trúc tương tự cấu trúc mô cần thay thế Hình dạng, cấu trúc và thành phần ống ghép càng giống với mô tự nhiên càng tốt Sau đó, một

ý tưởng khác hình thành: nếu các loại ống ghép được tạo ra bằng cách mô phỏng cấu trúc, tính chất của cơ quan tự nhiên cần thay thế, vậy tại sao chúng ta không sử dụng chính cơ quan tự nhiên để làm ống ghép bởi vì bản thân mô, cơ quan đã mang cấu trúc, tính chất của chính nó Từ đó, ý tưởng tạo ống ghép từ mô tự nhiên bằng phương pháp loại tế bào đã ra đời trong những năm gần đây (22)

Tất cả các mô, cơ quan trong cơ thể đều được cấu thành từ hai thành phần chính là

tế bào và khung nâng đỡ ngoại bào (ECM) Giữa các mô và các cơ quan khác nhau, thành phần tế bào và ECM sẽ không giống nhau ECM là khung nâng đỡ protein của mô và cơ quan do tế bào tổng hợp và tiết ra ngoài Tế bào là đơn vị cấu trúc và

chức năng của mô và cơ quan Đồng thời, tế bào còn là mục tiêu tấn công của hệ miễn dịch cơ thể chủ đối với các ống ghép đồng loại hoặc khác loại Phương pháp loại tế bào được tiến hành với mục đích loại bỏ hoàn toàn các tế bào trong mô, cơ quan và thu nhận một cách toàn vẹn ECM của mô, cơ quan ban đầu Sản phẩm của quá trình loại tế bào là một khung nâng đỡ protein có thành phần, cấu trúc và hình dạng tương tự với mô tự nhiên và khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch cơ thể chủ trở nên yếu đi Khung nâng đỡ protein sau xử lý được gọi là ống ghép vô bào (trong kỹ nghệ mạch máu, ống ghép vô bào còn được gọi là ống ghép mạch máu vô bào) Khung nâng đỡ protein có thể được sử dụng trực tiếp cấy ghép thay thế mô,

cơ quan hoặc được cố định tế bào trước khi cấy ghép (21)

dị loại bởi vì phương pháp loại tế bào có thể tận dụng ưu điểm về số lượng dồi dào

Tế bào

Các ion Các ion

Tế bào

và hạn chế nhược điểm về tính kháng nguyên mạnh của các mạch dị loại Trong hai thành phần tế bào và ECM, tế bào là thành phần kháng nguyên chính gây đáp ứng kích thích đáp ứng miễn dịch vật chủ (43) Sau khi loại tế bào, khả năng kích thích miễn dịch của mạch máu dị loại giảm mạnh Sản phẩm quá trình khử tế bào mạch máu là ống ghép mạch máu vô bào (21)

Phương pháp khử tế bào mạch máu có những ưu điểm sau đây

- Ống ghép mạch máu vô bào có cấu trúc, hình dạng và thành phần giống mạch máu tự nhiên

- Đáp ứng miễn dịch của ống ghép mạch máu vô bào yếu

- Số lượng mẫu dồi dào

- Quy trình xử lý đơn giản, chi phí sản xuất thấp

Nhiều nghiên cứu ghép ống ghép mạch máu vô bào vào cơ thể động vật đã được tiến hành Ống ghép mạch máu vô bào được sử dụng trực tiếp (Hiles và đồng nghiệp 1993, Martin và đồng nghiệp 2005) hoặc được cố định tế bào mạch máu cơ thể chủ trước khi cấy ghép (Hodde và đồng nghiệp 2002, Amiel và đồng nghiệp 2006) (1, 26, 42) Sau 4 tuần, tỉ lệ thông máu của những động mạch chuột được cấy tế bào với tế bào nội mô là 89%, trong khi đó, những ống ghép không được cấy tế bào nội mô có tỉ lệ thông máu là 29% (3)

Ngoài ra, ống ghép mạch máu vô bào có thể được thu nhận từ những mô khác đã trải qua quá trình xử lý tế bào như SIS (Small Intestial Submucosa), Alloderm SIS

là SIS và Alloderm là những sản phẩm loại tế bào được thương mại hóa trên thị trường SIS có bản chất là lớp dưới niêm mạc ruột non SIS được thu nhận bằng cách loại bỏ lớp niêm mạc, lớp thanh mạc và lớp cơ ruột non và sau đó được cắt thành những tấm nhỏ Sau đó, SIS trải qua quá trình loại tế bào, khử trùng để trở thành sản phẩm được thương mại hóa trên thị trường SIS được ứng dụng nhiều trong y học từ năm 1989 Trong kỹ nghệ mạch máu, SIS được cuộn tròn quanh một lõi kim loại, sau đó được khâu lại để tạo dạng ống (46)

Hình 1.8 Ống ghép SIS ( http://www.rcsed.ac.uk )

1.6.1 Tế bào gốc trung mô

Tế bào gốc trung mô (MSCs) từ mô mỡ đã được nghiên cứu từ rất lâu và được phát hiện đầu tiên vào năm 1964 bởi Rodbell, ông đã đề ra phương pháp phân lập các loại tế bào mỡ từ phân lớp mạch nền (Stromal vascular fraction) của mô mỡ chuột trong công trình của mình Mãi cho đến năm 2001, Patricia Zuk và nhóm nghiên cứu của đại học California (Mỹ) công bố thu nhận được một loại tế bào từ dung dịch mỡ hút được xử lý (Processed lipoaspirate - PLA) và đặt tên ADSC PLA là dung dịch giàu tế bào được thu nhận bằng kỹ thuật chọc hút mỡ Kể từ khi ra đời chính thức, ADSC đã được nghiên cứu rộng rãi từ khoa học cơ bản đến nghiên cứu ứng dụng lâm sàng (5)

ADSC là nguồn tế bào tự thân thu từ mô mỡ người không gây đáp ứng miễn dịch như các nguồn tế bào đồng loại và dị loại khác ADSC đã được chứng minh là một nguồn tế bào gốc trung mô có khả năng tăng sinh, phân chia rất nhiều lần, tự làm mới và biệt hoá thành nhiều loại tế bào chuyên biệt như mỡ, sụn, xương, cơ, …, giúp tái tạo chức năng của các mô bị hư hỏng, mang tính ưu việt hơn các tế bào mỡ trưởng thành vốn chỉ có khả năng tăng sinh hạn chế ADSC dễ dàng thu nhận từ việc chọc hút mỡ, đây là phương thức thu nhận xâm lấn tối thiểu, có thể thu lượng lớn tế bào, khoảng 5x103 tế bào/1g mô mỡ So với tế bào gốc trung mô thu nhận từ

tuỷ xương, tế bào gốc phôi, tế bào gốc nhũ nhi, ADSC có thể thu nhận ở bất kì giai đoạn nào ở người, tránh được các vấn đề về đạo lý sinh học hay không quá gây xâm lấn, đau đớn cho cơ thể bệnh nhân Ngoài ra, ADSC còn có một số đặc điểm như có hình dạng giống nguyên bào sợi sau khi được tăng sinh in vitro, đó là hình thái đặc trưng của các tế bào gốc trung mô, dương tính với các dấu ấn phân tử bề mặt của tế bào gốc trung mô như CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD54, CD55, CD71, CD73, CD90, CD105, CD146, CD166, Stro-1 và âm tính với các dấu ấn phân tử của tế bào gốc máu và tế bào gốc nội mô như HLA-DR, CD4, CD11b, CD14, CD16, CD45, CD56, CD62E, CD79, CD104 CD117, CD106, CD31, CD144 ADSC còn tiết ra rất nhiều yếu tố tăng trưởng và các cytokine quan trọng trong việc làm lành vết thương, cải thiện sự hình thành mạch máu Với các ưu điểm như số lượng nhiều, ít gây đau đớn khi thu nhận, ADSC cũng có một số hạn chế như phụ thuộc vào độ tuổi, dẫn đến thời gian cấy chuyền hạn chế Sự tăng sinh và biệt hóa phụ thuộc vào vị trí thu nhận, độ tuổi và giới tính của người cho Tuy nhiên, tế bào gốc thu nhận từ mô mỡ vẫn là tế bào tiềm năng trong kỹ nghệ tái tạo

mô Tóm lại, ADSC là nguồn tế bào lý tưởng cho chiến lược phát triển kỹ nghệ mô

mỡ hướng tới ứng dụng trong tái tạo mô mềm (11, 31)

1.6.2 Ứng dụng tế bào gốc trung mô phục hồi mạch máu

Những nghiên cứu hiện nay sử dụng MSC trong phục hồi mạch máu thường nhắm tới hai khả năng của MSC: khả năng biệt hóa thành tế bào mạch máu và chống đông máu (10, 36),(39)

Năm 2010, Zhao và cộng sự đã tiến hành thu nhận tế bào MSCs tủy xương bò và biệt hóa thành các dòng tế bào mạch máu như là ECs và SMCs Biệt hóa ECs được tiến hành trong môi trường DMEM bổ sung với FBS, penicillin-streptomycin, glutamine, nhân tố tăng trưởng nội mô mạch máu, nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi và acid ascorbic Biệt hóa SMCs được tiến hành trong môi trường DMEM bổ sung với FBS, penicillin-streptomycin, insulin và TGF-b1 Kết quả cho thấy tế bào MSCs biểu hiện kiểu hình đặc trưng của ECs: dạng bầu dục, biểu hiện marker và thể nội bào đặc trưng của ECs: thể vWF Tế bào MSCs biểu hiện hình dạng đặc trưng của tế bào SMCs và biểu hiện marker đặc trưng của tế bào SMCs như SM-

actin Một số nghiên cứu khác tiến hành xác định VEGF và kích thích của dòng chảy đối với biệt hóa EC Sau 3 tuần nuôi cấy trong điều kiện dòng chảy tuần hoàn liên tục, tế bào MSCs đã biểu hiện một phần tính chất của tế bào nội mô như khả năng tái sắp xếp trong ống ghép và khả năng tạo thành cấu trúc dạng ống trong matrigel, CD31 (19) Khi thêm vào môi trường nuôi cấy VEGF, tế bào MSCs biểu hiện gia tăng những marker tế bào nội mô như eNOS, vWF và CD31 (13)

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

- Động mạch cảnh: thu trực tiếp từ lò mổ heo

- Tế bào MSC từ mô mỡ: cung cấp bởi bộ môn Mô – Phôi, đại học Y Phạm Ngọc Thạch

Phương pháp 1: Thu nhận động mạch cảnh heo

- Động mạch cảnh được thu nhận trực tiếp từ lò mổ và được bảo quản lạnh 4oC trong PBS vô trùng có bổ sung kháng sinh Penicillin và Streptomycin 4X và được vận chuyển ngay lập tức về PTN

- Động mạch cảnh được loại bỏ phần mỡ và cơ xung quanh, sau đó bảo quản trong PBS vô trùng có kháng sinh Penicillin và Streptomycin 1X cho đến khi bắt đầu

xử lý

Phương pháp 2: Phương pháp khử tế bào động mạch cảnh

- Động mạch cảnh heo được xử lý với các loại hóa chất sau để đánh giá hiệu quả khử tế bào của từng chất đối trong khoảng thời gian xác định:

+ Triton X100 1% trong 24 giờ

+ Peracetic acid 5% trong 24 giờ

Phương pháp 3: Đánh giá hiệu quả khử tế bào

- Đánh giá sự tồn đọng tế bào sau xử lý: Hiệu quả khử tế bào được đánh giá thông qua phương pháp nhuộm HE Mẫu sao khi thu nhận được cố định bằng dung dịch

formalin 10% Sau đó, mẫu được vùi trong dung dịch parafilm lỏng, để khô thành khối Khối mẫu được cắt thành những lát mỏng 2-3 µm và nhuộm với hóa chất Hematyoxylin và Eosin

- Đánh giá sự bảo tồn collagen khuôn nền ngoại bào Hiệu quả bảo tồn collagen được đánh giá thông qua phương pháp nhuộm Trichrome Mẫu sao khi thu nhận được

cố định bằng dung dịch formalin 10% Sau đó, mẫu được vùi trong dung dịch parafilm lỏng, để khô thành khối Khối mẫu được cắt thành những lát mỏng 2-3 µm và nhuộm với hóa chất Trichrome

2.3 Nội dung 2: Khảo sát độc tính của động mạch cảnh vô bào trong điều

kiện in vitro

Phương pháp 4: Phương pháp đánh giá độc tính tế bào in vitro

Độc tính tế bào in vitro được đánh giá theo tiêu chuẩn ISO 10993-5 theo phương pháp đánh giá độc tính trực tiếp và gián tiếp thông qua dịch chiết

- Nguyên bào sợi được cấy trên bề mặt đĩa nuôi cấy với mật độ 7.000 tế bào/giếng của đĩa 96 giếng và được nuôi ổn định trong 1 ngày

- Đối với phương pháp đánh giá gián tiếp thông qua dịch chiết:

+ Ống ghép mạch máu vô bào được cắt thành những miếng 3x3m2 và ngâm trong môi trường nuôi cấy trong 24 giờ ở 37oC để tạo dịch chiết

+ Sau 24 giờ, thay môi trường nuôi nguyên bào sợi trong đĩa 96 giếng bằng môi trường dịch chiết

+ Tiếp tục ở trong 24 giờ ở 37oC, 5% CO2

+ Sau 24 giờ, tiến hành phương pháp MTT để đánh giá độc tính của dịch chiết: MTT được bổ sung vào môi trường với nồng độ 5 mg/ml Sau 4 giờ, hút hết dịch nổi,

bổ sung DMSO/Ethanol để hòa tan tinh thể trong 4 giờ, đo OD dung dịch ở bước sóng

545 nm

- Đối với phương pháp đánh giá trực tiếp

+ Ống ghép mạch máu vô bào được cắt nhỏ thành từng mảnh 3x3 mm2

+ Hút hết môi trường cũ, đặt mỗi mảnh vào mỗi đĩa 4 giếng, bổ sung môi trường nuôi cấy

+ Sau 24 giờ, đánh giá độc tính bằng phương pháp MTT: MTT được bổ sung vào môi trường với nồng độ 5 mg/ml Sau 4 giờ, hút hết dịch nổi, bổ sung DMSO/Ethanol

để hòa tan tinh thể trong 4 giờ, đo OD dung dịch ở bước sóng 545 nm

2.4 Nội dung 3: Khảo sát độc tính của động mạch cảnh vô bào trong điều

kiện in vivo

Phương pháp 5: Phương pháp đánh giá độc tính ống ghép động mạch ảnh vô bào trong cơ thể chuột

Đối tượng thí nghiệm:

- Chuột Mus musculus 4 tuần tuổi, 20-25 g

- Mảnh ghép mạch máu vô bào kích thước 4x4 mm2

2.5 Nội dung 4: Khảo sát sự tăng sinh tế bào gốc trung mô trên động mạch

- Mảnh ghép mạch máu vô bào được cắt thành các mảnh nhỏ kích thước 3x3

mm2 Mỗi mảnh được cho vào 1 giếng trong đĩa 96 giếng

- Tế bào MSC được tách ra khỏi bề mặt nuôi cấy và chỉnh về mật độ 3×104 tế bào/ml Nhỏ 10 µl lên bề mặt mảnh ghép mạch máu vô bào, sau 4h tiếng hành bổ sung

150 µl môi trường vào giếng

- Sau ngày đầu tiên, tiến hành thay môi trường, sau 2 ngày thay môi trường một lần

Phương pháp 8: Phương pháp đánh giá sự tăng sinh tế bào MSC trên mảnh ghép mạch máu vô bào

- Sự tăng sinh tế bào trên mảnh ghép mạch máu vô bào được đánh giá bằng phương pháp MTT Phương pháp này đánh giá sự tăng sinh tế bào gián tiếp thông qua

sự tạo formazan Nồng độ OD càng cao thì mật độ tế bào càng cao

- Thí nghiệm được tiến hành trong 9 ngày với các mốc thời gian là 1, 3, 5, 7, 9 Mỗi mốc tiến hành đánh giá MTT với 3 mẫu thí nghiệm (có cấy tế bào) và 3 mẫu đối chứng (không cấy tế bào)

- Phương pháp MTT cho mỗi ngày:

+ Hút hết môi trường cũ

+ Bổ sung môi trường mới

+ Bổ sung MTT nồng độ 5 mg/ml, ủ ở 37oC trong 4 giờ

+ Sau 4 giờ, hút hết môi trường cũ, bổ sung DMSO/ethanol, ủ 37oC trong 4 giờ + Đo OD ở bước sóng 545 nm

KẾT QUẢ

Hình 3.1 Động mạch heo sau xử lý

Thu được 18 đoạn động mạch cảnh, chiều dài khoảng 5-13 cm, độ dày trung bình 1

mm Động mạch có đường kính ở hai đầu không giống nhau, lớn nhất khoảng 5-7

mm, đầu còn lại khoảng 2-4 mm Kết quả nhuộm HE cho thấy mạch đối chứng được cấu tạo bởi 3 lớp tế bào (Hình 3.2.A):

- Lớp ngoài cùng mạch máu là lớp mô liên kết Tương tự như các loại động mạch khác, lớp ngoài động mạch cảnh tương đối mỏng hơn so với lớp giữa Các tế bào mô liên kết trong lớp ngoài phân bố đều với mật độ thấp

- Lớp giữa là lớp dày nhất trong ba lớp mạch máu Thành phần tế bào chính trong lớp giữa là tế bào cơ trơn Tế bào cơn trơn được xếp thành các lớp xoay quanh thành mạch Mật đột tế bào dày đặc

- Lớp trong cùng là lớp tế bào nội mô Tế bào nội mô tạo thành một lớp đơn bao phủ lòng động mạch

Kết quả nhuộm Trichrome cho thấy (Hình 3.2.B):

- Trong lớp ngoài, màu xanh của collagen gần như chiếm hết toàn bộ, màu hồng của các loại protein khác rất ít Điều này chứng tỏ sợi collagen chiếm tỉ lệ lớn

trong lớp ngoài Kết quả này phù hợp với bản chất của lớp ngoài là lớp mô liên kết

- Trong lớp giữa, màu xanh của collagen kết thành phiến xung quanh thành mạch Các phiến này khá dày đặc và phân bố đều trong lớp giữa

Hình 2: Kết quả nhuộm mô học mạch máu tự nhiên (x100)

Hình 3.2 Kết quả nhuộm mô học động mạch cảnh heo chưa xử lý (x200)

A: Nhuộm HE, B: Nhuộm Trichrome (Mũi tên: collagen màu xanh)

- Thành phần collagen lớp trong cũng không hiển thị rõ Điều này có thể giải thích là do lớp nội mô mỏng, lƣợng collagen thấp

A

B

3.1.2 Kết quả khử tế bào của nước cất trong 24 giờ

Hình 3.3 Kết quả nhuộm mô học ĐMC heo xử lý với bước cất 24 giờ (x200)

A: Nhuộm HE, B: Nhuộm Trichrome (Mũi tên: tế bào) Kết quả nhuộm HE, Trichrome ĐMC sau xử lý với nước cất 24 giờ được thể hiện ở Hình 3.3 Kết quả nhuộm với HE cho thấy hiệu quả loại tế bào của nước cất không tốt Kết quả nhuộm Trichrome cho thấy khung nâng đỡ mạch máu không thay đổi nhiều so với mẫu đối chứng

B

A

Qua đó, chúng ta có thể kết luận là nước cất không thích hợp sử dụng để loại tế bào

và nước cất không tác động nhiều lên khung nâng đỡ ngoại bào

3.1.3 Kết quả khử tế bào của peracetic acid trong 24 giờ

Hình 3.4 Kết quả nhuộm mô học ĐMC xử lý với PAA 5% trong 24 giờ (x200)

A: Nhuộm HE, B: Nhuộm Trichrome (Mũi tên: tế bào)

A

B