Tạo bộ sưu tập giống nấm họ linh chi ganodermataceae giai đoạn 2

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.. HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU TẠO BỘ SƯU TẬP GIỐNG NẤM HỌ LINH CHI HỌ G

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP HCM

TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO

BÁO CÁO NGHIỆM THU

TẠO BỘ SƯU TẬP GIỐNG NẤM HỌ LINH CHI

(HỌ Ganodermataceae) - GIAI ĐOẠN 2

KS Nguyễn Thị Ngọc Sương

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 01/2018

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP HCM

TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

TẠO BỘ SƯU TẬP GIỐNG NẤM HỌ LINH CHI

(HỌ Ganodermataceae) - GIAI ĐOẠN 2

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 01/2018

CƠ QUAN CHỦ TRÌ

(Ký tên, đóng dấu xác nhận)

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

(Ký tên)

,

Amauroderma subresinosum), T0300 (Amauroderma rugosum), T0302 (Ganoderma sp2.), T0317 (Ganoderma fulvellum

subresinosum, Ganoderma australe Ganoderma aff gibbosum, Ganoderma aff mastoporum, Ganoderma aff lobatum, Ganoderma capense, Ganoderma cochlear, Ganoderma flexipes, Ganoderma fulvellum, Ganoderma philippii, Ganoderma resinaceum, Humphreya aff lloydii, Humphreya coffeatum

Trong

c

qu c

Trang

TÓM T T i

M C L C iii

DANH SÁCH CÁC CH VI T T T v

DANH SÁCH B NG vi

TÀI vii

M U 8

NG QUAN NGHIÊN C U 9

1.1 Gi i thi u v h Ganodermataceae 9

1.2 L ch s phân lo i và h th ng h c h n m Linh Chi trên th gi i 9

1.3 Ganoderma 12

1.3.1 Ngu n g c, phân lo i và s phân b Linh Chi 12

1.3.2 m hình thái và v trí phân lo i 14

1.3.3 Chu trình s m nuôi tr ng 15

1.3.4 Thành ph n hóa h c ch y u c a n m Linh Chi 19

1.3.5 Vai trò c a n i v i s c kh e 22

1.4 Amauroderma 27

m sinh h c 27

1.4.2 M t s nghiên c u v Amauroderma 28

1.5 Haddowia 29

1.6 Humphreya Steyeart (1972) 30

I DUNG NGHIÊN C U 35

2.1 Th i g m nghiên c u 35

35

35

2.2 V t li u và thi t b 35

35

35

2.3 N i dung nghiên c u 36

c hi n và x lý th ng kê 36

T QU VÀ TH O LU N 44

3.1 Kh o sát m t s u ki n b o qu i v i các gi ng n m trong b p 44

3.2 Kh ng d ng c a các gi ng n m thu th c 50

3.3 Phân lo i các m u n m trong b p 53

c a b p 67

T LU N VÀ KI N NGH 124

4.1 K t lu n 124

4.2 Ki n ngh 124

TÀI LI U THAM KH O 125

CZA Czapek dox agar

YMA Yeast malt extract agar

B ng T a b ng Trang

44 51

60

62

Giai

01/2017 - 12/2017 252.589.000

T NG QUAN NGHIÊN C U

1.1 Gi i thi u v h Ganodermataceae

Ganoderma lucidum Tuy nhiên, Ganoderma lucidum ch là m t loài trong m t h

n m Linh Chi Ganodermataceae H n i di n cho m t ph c h p n m l n và

ng Nhi u loài trong h này là n m gây m c g , m t s gây b nh cho cây tr ng

và m t s có giá tr c li a, s phân lo i c a nó r t thú v và thu hút nhi u nhà n m h c nghiên c u h n m này Cùng v i s phát tri n nhanh chóng trên toàn th

gi i trong nghiên c u v h n m này, s phân lo i h n c ti n b l n

Ganodermataceae g m 81 loài thu c 4 chi (Ganoderma, Amauroderma, Haddowia và Humphreya)

1.2 L ch s phân lo i và h th ng h c h n m Linh Chi trên th gi i

Nghiên c u h th ng h u tiên v h Ganodermataceae ch y u d a trên các

sinh v c chia nhóm d ng v hình thái h c trên gi nh r ng nhó v âm v h v m t di truy n Nh ng khái ni m này làm cho các tác gi trong quá kh (Steyaert, 1972; Juhlich, 1981 và Furtado, 1981)

phân lo i khác nhau v h n m Ganodermatceae

Ganoderma s lato (Ganodermataceae Donk) nh b ng s hi n di n

c a bào t m (basidiospore) vách kép b m này là duy nh t trong s n m nhi u l (polypore) và hình thái bào t c các nhà n m h

m t y u t quan tr ng nh t trong nh m phân lo i , vi c phân chia

h Ganodermataceae thành nh ng nhóm chính g y u d a vào hình thái bào

(Amauroderma Murr.) Nh ng nghiên c u b ng kính hi n vi quang h c cho th y bào

n sóng theo chi u d c (Haddowia Stey.) Kính hi n t quét phát hi n bào t n sóng theo chi u d c m t vài loài (Hseu, 1990; Buchanan và Wilkie, 1995)

Pilear crust (v c ng trong h n m Ganodermataceae và

là m m phân lo i nhóm Nó có th c t o nên t các

các loài c a nhóm G lucidum (Ganoderma subgen Ganoderma);

thu c nhóm G applanatum G australe (Ganoderma subg elfvingia) Trong nh ng

loài có bào t n l n các taxon không có pilocystidia và

leptopus, A renidens, Ha aetii, Ha longipes) M t vài tác gi (Furtado, 1965;

Steyaert, 1972) c g ng phân bi t nh ng lo m x n màu khác nhau gi a

nhóm t nhiên

Tomophagus phù h p v i G colossum vì nó có th t n m m ng Tuy nhiên, h u h t các tác gi c tính này có hi u qu quan tr ng trong phân lo i m gi ng loài và trong h u h t nghiên c u phân lo i h

Ganodermataceae, chi Tomophagus là m a Ganoderma Phân tích phát sinh loài (phylogenetic analysis) trên d li u phân t ch ra r ng G colossum

i v i Ganoderma và Amauroderma và nó ch ng minh th h ng gi ng loài c a

trúc s i trong s hi u bi t v h th ng h c Ganodermataceae m

m t h th ng phân lo i trên n n t u trúc s i trong mô c a T colossus khác

v i Ganoderma n hình s thi u nhi u s i liên k

hyphae) hay s i khung hình cây (arboriform skeletal hyphae) Th t v y mô th t c a T

c tìm th y trong G hildebrandii, G leucocreas (Moncalvo và Ryvarden, 1995),

Humphreya eminii và các loài khác H s i c a Amauroderma c báo cáo là

i liên k t (binding

hyphae) và nhánh m ng c a s i hình cây khá giòn không gi ng Ganoderma

(Ryvarden và Johansen, 1982) Corner (1983) mô t nh ng bi i trong c u trúc s i

bên trong h Ganodermataceae và nh n m nh s khác nhau gi các loài Ganoderma

n hình, mà trong nó nh ng t bào khung x

ng t n cùng và nh ng loài Amauroderma n hình mà trong nó nh ng t bao

c t n cùng l n xen gi a Tuy nhiên, c Steyaert (1972) và Corner (1983) nh n m nh r ng vì trong pilear crust khong có s khác bi t rõ ràng gi a

nh ng s i khác nhau trong mô th t

cu ng) giúp ích không nhi u trong phân bi t nh ng dòng ti n hóa chính Ví d m t

vài loài Ganoderma ng in vivo (Corner, 1983) hay in vitro (Hseu, 1990) s

hình thành cu ng ph thu u ki n bên ngoài

thái h c Chúng s ng trên cây s ng ho c ch t, trên cây hai lá m m (cây h

t tr n) hay cây m t lá m m Ký ch c bi n Tuy nhiên,

ho c r ) hay trên nh ng r m c lan c a cây nhi i hay g c cây, trong khi h u h t

nh ng loài Ganoderma m c thân cây ho nhiên, s chuy n ti p

gi a nh ng taxa m t và nh ng taxa m c trên thân h c ch n x y ra

T t c các tác gi phân bi t Amauroderma và Ganoderma d dày

vách bào t Trong Ganoderma, t t c tác gi phân bi t nh ng loài bóng láng (subg Ganoderma) v i nh ng loài không bóng láng (subg Elfvingia) Juhlich (1981) b ra

kh i taxa Ganodermataceae v i các bào t m g gh và t o ra h Haddowiaceae cho

Haddowia và Humphreya Trong m t h th ng d a vào Furtado, Haddowia c phân

lo i trong chi Amauroderma trong khi Humphreya và Tomophagus c x p l ng

trong chi Ganoderma Trong m t h th ng d a vào Steyaert (1972), Ganoderma,

Amauroderma, Tomophagus, Haddowia và Humphreya hi n di n 5 dòng khác nhau

v i nh ng m i quan h c gi i quy t

1.3 Ganoderma

Lingzhi - hay theo

Loan)

-Chi Ganoderma

Ganoderma

1.3.1 Ngu n g c, phân lo i và s phân b Linh Chi

Ganoderma lucidum)

-

Thám, 2010)

th Amauroderma, Ganoderma và Haddowia

G amboinense, G applanatum, G capense, G lucidum và G sinense (Ngô Anh và ctv, 2008)

nuôi (Wachtel-Galor và ctv, 2011)

Fungi Ngành: Basidiomycota

Agaricomycetes Polyporales Ganodermataceae

Ganoderma, Amauroderma, Haddowia, Tomophagus, Humphreya

a

b

loài

PG) và endopectin methyl translinase (endo

1993)

o (28 350

26oC) (Lê Xuân Thám, 1996a)

c

Nguyên li u nuôi tr ng n m Linh Chi:

Linh Chi là loài n

( , 2002; Lê Xuân Thám, 1996b)

:

(Lê Xuân Thám, 2005; Suy

, 2009)

- (Lê Xuân Thám, 2005)

Ganoderma lucidum

1

1

1

A (mouse sarcoma) và LLC (mouse lung carcinoma)

rên

1.4 Amauroderma

m sinh h c

Chi Amauroderma

Amauroderma: Amauroderma amoiense, A africana, A andina, A auriscalpium, A austrosinense, A bataanense, A boleticeum, A brasiliense, A buloloi, A calcigenum, A coltricioides, A congregatum,A conicum, A conjunctum, A dayaoshanense, A deviatum, A ealaense, A elegantissimum, A exile,

A fujianense, A fuscoporia, A guangxiense, A infundibuliforme, A insulare, A jiangxiense, A kwiluense, A leptopus, A leucosporum, A longgangense, A macrosporum, A malesianum, A parasiticum, A perplexum, A praetervisum, A preussii, A pudens, A renidens, A rude, A rugosum, A salisburienseA Schomburgkii, A scopulosum, A secedens, A solomonense, A sprucei, A subrugosum, A unilaterum, A wuzhishanense

-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) và bis (3 ethylbenzothiazoline-6-sulph

2,2-azino-A rugosum

viêm

i ba loài n m cho ti c ch s phát tri n kh i u và phát hi n ra r ng chi t xu c c a Amauroderma rude có ho t tính

cao nh t Các nghiên c ra r ng các polysaccharide trong d ch chi t

ti a các polysaccharide v u hòa mi n d ng kh i u S

d ng ch t chi t thô Amauroderma rude trong thí nghi m in vitro cho th c c a

bào lympho và s n xu t kháng th Ngoài ra, các s n ph m tinh khi t kích thích s ti t

cytokine in vitro và in vivo Nhìn chung, các chi t xu t gi m t ng kh i u

Cu i cùng, các ho t ch c tinh s nh là polysaccharide F212 Quan

tr ng nh t, các polysaccharide tinh khi t có ho t tính cao nh t trong vi

sinh t bào lympho

Thành ph n acid béo c a n Amauroderma subresinosum c

-octadecaenoic có h ng cao nh t (kho ng 51,01% acid béo t a hai acid béo lignoceric acid và 11-octadecaenoic cùng v i 3 ester c a cholesta-7,22-dien- i 3 acid béo 14-methylpentadecanoic, 8,11-octadecaenoic và 8-octadecenoic v i t l c phân l p nh c u trúc

Nh ng k t qu là m t b ng ch ng m i cho phân lo i h A subresinosum t trong m t chi riêng bi t Amauroderma, tách kh i chi Ganoderma, vì nó không t o ra b t k ng l p t nh ng loài

ph ng, màu nâu, mép tù, màu tr c 1 - ng kính ng n m 5 17

mm chi u dài, màu nâu nh t Mô n m dày 5 mm, ch t s i Bào t màu nâu hình oval,

có g theo chi u th c 7,5 x 12 µm M c trên g c cây s

ch t Phân b g, Ninh Bình

c phân l p t ch t chi t ethyl acetate c a qu th n m

lanosta-8-en-7,11-dioxo- -acetyloxy-24,25,26-trihydroxy, lanosta-8-en-7-oxo- 24,25,26-tetrahydroxy, lanosta-7,9(11)-dien- -acetyloxy-24,25,26-trihydroxy, lanosta-7,9(11)-dien- -acetyloxy-24,26-dihydroxy-25-methoxy, 11-oxo-lucidadiol, -hydroxy-lucidadiol, lucidone H and lanosta-7,9(11),24E-trien- -acetyloxy-

ho t tính c ch acetylcholinesterase (AchE) c a chín lanostanoid cô l c và chín

ch t cho th y r ng 13 h p ch t có ho t tính c ch AchE v i kho ng ph

a Tình hình nghiên c u t i Vi t Nam

Ganoderma lucidum hau trong

loài

Ganoderma và 1 loài Amauroderma

G.lucidum complex (Hseu và ctv, 1995)

Casurina equiestifolia và Morinda tinctoria

Staphylococcus aureus và Micrococcus sp (K Rajesh và ctv, 2014)

Ganoderma applanatum, Ganoderma lucidum

N I DUNG NGHIÊN C U

: 12 tháng : T i Trung tâm Nghiên c u và Phát tri n Nông nghi p Công ngh

ng MEA (malt extract agar): 20 g malt extract, peptone 1 g, dextrose

c c t (Garcia-Garcia, 2014)

ng Czapek agar: 30 g sucrose;1,0 g dipotassium phosphate; 2,0 g sodium nitrate; 0,5g magnesium sulfate; 0,5g potassium chloride; 0,01g ferrous sulfate; 15 g agar

Shinseang

Hirayama

- Satorius

Carl Zeiss

NT8 Lúa g otrong glycerol 10%

NT9 PDA trong glycerol 10%

-20oC NT10 YMA trong glycerol 10%

NT11 y trong glycerol 10%

NT12 Lúa g otrong glycerol 10%

c y n m t ng th ch YMA vào ng nghi m ch y ng

- T l ph c h i (%): T l ph c h i c a gi ng n m sau b o qu n trên t ng môi

sau b o qu ng thích h p cho ph c h i gi ng n m Công th c tính là

T l ph c h i (%) = s ch c y còn s ng x 100 / t ng s y

- T ch (mm/ngày): Gi ng sau 1 tháng b o qu c c y vào

n l

m i ngày theo 4 chi u trong 10 ngày Ghi nh ng kính khu n l c (R2-R1; mm) trong kho ng th i gian nh nh (t2-t1; ngày) và ghi nh n t lan (mm/ngày)

nh sau khi b o qu n 1 tháng

cám g i lúa vào các ng nghi

h p kh trùng Gi ng sau th i gian b o qu c c y vào th ch, nuôi trong kho ng

-L1; mm) d c theo ng nghi ng t trên

mi ng xu ng nghi m trong kho ng th i gian nh nh (t2-t1; ngày)

tr n v i 2% cám g o, phân ph i vào các ng nghi

-L1; mm) d c theo ng nghi ng t trên

mi ng xu ng nghi m trong kho ng th i gian nh nh (t2-t1; ngày)

Công th c tính t

(L3-L2)/(t3-(Ln-Ln-1)/(tn-tn-1)] / (n-1)

L: chi i t ng th m ghi nh n s li u ng th ch là

ng kính khu n l c t i t ng th m ghi nh n s li u

T: th i gian nuôi (ngày)

2.4.2 N i dung 2 - Tr ng th nghi m các gi ng n m nghi ng

s n vào cu ng, màu s c th t n m, hình d ng cu ng n m, màu s c cu ng n

- m c a n m trong nuôi c y thu n khi t: t m l n, màu

s c c a s i, màu s c c ng, bào t vô tính

nh danh v hình thái, nh ng m nh thu c h Linh Chi s

nh l i trên c phân t b i trình t vùng ITS2

Ly trích DNA

- Thêm 1,5 ml dung d m chi c c (65 ) và phá m u

và máy phá m u siêu âm Branson SLPe v và xung 60%

- Thêm 10 l dung d ch - amylaza, 10 l dung d ch RNaza-A và tr n nh nhàng

- 30 phút nhi 65 , trong khi v n l c tr n

- Thêm 10 l dung d ch proteinaza-K, l c tr n nh nhàng ng nghi 30 phút 65 , trong khi v n l c tr n

- Ly tâm 10 phút kho ng 12 000 g Chuy n ph n n i phía trên sang m t ng nghi m m i, thêm 0,7 th n 1 th tích chlorofom và tr n k

- Ly tâm 15 phút kho ng 12 000 g Chuy n pha phía trên (pha l ng) sang m t

ng nghi m m i

- Cho thêm 2 th tích dung d m k t t yên 60 phút nhi phòng

- Ly tâm 15 phút kho ng 12 000 g G n b ph n phía trên

- Hòa tan ADN k t t a b ng cách thêm 350 l dung d ch NaCl

- Thêm 350 l dung d ch chlorofom và tr n k Ly tâm 10 phút kho ng 12 000

g Chuy n pha l ng sang m t ng nghi m m i

- Cho thêm 0,6 th tích isopropanol, tr n k b o chi u ng nghi m và

gi trong 20 phút nhi phòng Ly tâm 15 phút 12 000 g

- G n b ph n n i phía trên Cho thêm 500 l dung d ch ethanol vào ng nghi m

o chi u ng nghi m vài l n

- Ly tâm 10 phút kho ng 12 000 g G n b ph n n i phía trên

- Làm khô các k t t a ADN và hòa tan l i vào 100 l dung d

ADN g c chính

PCR vùng ITS2

H n h p PCR bao g m 50 ng DNA, 12,5ul Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer 2X (NEB), 0,5 µM of m i primer Chu k PCR bao g m 95°C trong 5 phút, 35 chu k : 95°C trong 30 giây; 62°C trong 30 giây và 72°C trong 30

n kéo dài cu i cùng 72°C trong 7 phút S n ph n di

s n ph ng cách so sánh v i Quick-Load® 2-Log DNA Ladder (NEB)

nh n di n các loài c a các ngu c nghiên c

ng c a các trình t v i cùng các loài có các trình t

database (Benson và c ng s , 2008)