Sử dụng phương pháp rapd để xác định nguồn gốc giống dứa cayenne và xây dựng biện pháp phòng trừ một số bệnh hại quan trọng trên cây dứa tại tp hồ chí minh

Một số loài thiên địch và mức độ xuất hiện của chúng trên ruộng dứa Cayenne trồng tại nông trường Lê Minh Xuân, Bình Chánh, Hồ Chí Minh .... Một số loài kiến và mức độ xuất hiện của chún

BÁO CÁO TỔNG KẾT

Đề tài

SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP RAPD ĐỂ XÁC ĐỊNH NGUỒN GỐC DỨA CAYENNE VÀ XÂY DỰNG BIỆN PHÁP PHÒNG TRỪ MỘT SỐ SÂU

BỆNH HẠI QUAN TRỌNG TRÊN CÂY DỨA

Cơ quan chủ quản: Sở Khoa học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Chủ nhiệm đề tài: Lê Đình Đôn và Huỳnh Văn Quang

Tháng 05 năm 2007

Tên đề tài: sử dụng phương pháp RAPD để xác định nguồn gốc dứa cayenne và

xây dựng biện pháp phòng trừ một số sâu bệnh hại quan trọng trên cây dứa

Chủ nhiệm đề tài: Lê Đình Đôn và Huỳnh Văn Quang

Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Thời gian thực hiện đề tài: 1/2004 đến thàng 7/2006

Kinh phí được duyệt: 432.000.000 đồng

Kinh phí đã cấp: 200.000.000 đồng theo TB số: 38/TB-SKHCN ngày 10/03/2004 Kinh phí đã cấp: 189.000.000 đồng theo TB số: 92/TB-SKHCN ngày 27/07/2005 Mục tiêu: xác định nguồn gốc các giống dứa Cayenne trồng tại Thành phố Hồ Chí

Minh quy trình phòng trừ một số sâu bệnh hại quan trọng trên dứa Cayenne trồng ở Thành phố Hồ Chí Minh

Nội dung:

1 Xác định nguồn gốc các giống dứa Cayenne

2 Điều tra sâu bệnh, cỏ dại, thiên địch và vi sinh vật có ích trên dứa

3 Xác định tác nhân gây bệnh do virus và vi khuẩn

4 Xây dựng biện pháp phòng trừ sâu bệnh hại dứa

5 Tổ chức hội thảo khoa học và tập huấn về giống và sâu bệnh hại dứa

Sản phẩm giao nộp:

1 Báo cáo phân tích:

+ Xác định được các loại sâu bệnh hại dứa

+ Xây dựng quy luật phát sinh và phát

triển của một số sâu bệnh hại quan trọng

+ Xác định giống dứa Cayenne bằng kỹ

thuật sinh học

Tên khoa học các tác nhân bệnh được định danh tới giống

2 Bảng số liệu:

+ Số liệu rõ ràng, chính xác, phù hợp với

nội dung đề ra

Xử lý thống kê trong trường hợp có bố trí thí nghiệm so sánh

3 Các primer phân tích tính đúng giống dứa

4 Các marker phân tử dùng định danh virus,

5 Phương pháp phát hiện virus gây bệnh trên

6 Phương pháp phát hiện vi khuẩn gây bệnh

thối trái

Một phương pháp

MỤC LỤC

Trang

Mục lục i

Danh sách các bảng iii

Danh sách các hình v

THỰC HIỆN CÁC NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1

Nội dung 1: Xác định nguồn gốc các giống dứa Cayenne 1

Thí nghiệm 1.1: Khảo sát quy trình tách chiết DNA từ mẫu lá dứa Cayenne 1

Thí nghiệm 1.2: Tối ưu hóa phản ứng RAPD sử dụng DNA tổng số ly trích từ mẫu lá dứa Cayenne trong thí nghiệm 1.1 5

Thí nghiệm 1.3: Ứng dụng RAPD phân tính đa dạng di truyền của Dứa Cayenne 9

Nội dung 2: Điều tra sâu bệnh, cỏ dại, thiên địch có ích trên dứa trồng tại thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh thành phía nam 14

Thí nghiệm 2.1: Điều tra thành phần cỏ dại trên ruộng dứa 14

Thí nghiệm 2.2: Điều tra sâu hại và thiên địch của chúng trên dứa Cayenne 17

Thí nghiệm 2.3 Xác định thành phần kiến hiện diện trên ruộng dứa Cayenne và mối liên quan giữa kiến và rệp sáp giả trên ruộng dứa 23

Thí nghiệm 2.4: Mức độ gây hại của rệp sáp Dysmicoccus brevipes - loài sâu hại phổ biến trên cây dứa ở Tp Hồ Chí Minh 30

Thí nghiệm 2.5: Điều tra thành phần bệnh hại trên ruộng dứa Cayenne 33

Thí nghiệm 2.6: Điều tra tình hình bệnh héo khô đầu lá dứa do PMWaV tại Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh/thành trồng dứa 41

Thí nghiệm 2.7: Bước đầu điều tra bệnh héo đỏ đầu lá với sự hiện diện rệp sáp trên dứa Cayenne và Queen, kiểu phân bố bệnh do vi rút 44

Thí nghiệm 2.8: Đánh giá thiệt hại của bệnh héo đỏ đầu lá trên dứa Cayenne và so sánh với dứa Queen 47

Nội dung 3: Xác định tác nhân vi sinh vật gây bệnh trên dứa 52

Thí nghiệm 3.1: Xác định nguyên nhân gây bệnh thối nõn dứa, lây nhiễm nhân tạo trên lá dứa tách rời 52

Thí nghiệm 3.2: Xác định nguyên nhân gây bệnh thối nõn dứa, lây nhiễm nhân tạo trên cây dứa con 3-4 tháng tuổi 53

Thí nghiệm 3.3: Xác định nguyên nhân gây bệnh thối nõn dứa, lây nhiễm nhân tạo trên cây dứa Cayenne 10 tháng tuổi 55

Thí nghiệm 3.4: Xác định các triệu chứng của bệnh héo đỏ đầu lá 56

Thí nghiệm 3.5: Xác định sự hiện diện vi rút PMWaV trong mẫu lá dứa thu tại thành phố Hồ Chí Minh 61

Thí nghiệm 3.6: Khảo sát sự lây nhiễm của rệp sáp Dysmicoccus brevipes truyền bệnh héo đỏ đầu lá dứa Cayenne 63

Thí nghiệm 3.7: Điều tra quan hệ giữa kiến với sự hiện diện của rệp sáp trên dứa 67

Nội dung 4: Xây dựng biện pháp phòng trừ sâu bệnh hại dứa tại Thành phố Hồ Chí Minh 69

Thí nghiệm 4.1: Đánh giá các loại thuốc hóa học trong phòng trừ tuyến trùng 69

Thí nghiệm 4.2: Aûnh hưởng của thảm phủ hữu cơ đến cỏ dại và lý hóa tính

của đất trồng dứa tại Bình Chánh, TP Hồ Chí Minh 71

Thí nghiệm 4.3: Mối quan hệ giữa rệp sáp - bệnh đỏ đầu lá, vai trò truyền bệnh đỏ đầu lá của rệp sáp trên giống dứa ở Lâm Đồng bị nhiễm bệnh đỏ đầu lá và giống cấy mô sạch bệnh 75

Thí nghiệm 4.4: Bước đầu xác định quan hệ giữa kiến nâu vàng nhỏ Tetramonium sp với sự hiện diện rệp sáp và bệnh héo đỏ đầu lá trên dứa Cayenne 77

Thí nghiệm 4.5: Biện pháp phủ bạt trên luống trồng dứa Cayenne trong mối liên quan với rệp sáp và bệnh héo đỏ đầu lá 80

Thí nghiệm 4.6: Xác định hiệu lực trừ rệp sáp Dysmicoccus brevipes hại dứa của một số loại thuốc hoá học 82

Thí nghiệm 4.7: Hiệu quả của thuốc trừ sâu Supracide 40 EC trong phòng trừ rệp sáp giả trên dứa Cayenne 83

Thí nghiệm 4.8: So sánh sự phát triển của dứa Cayenne trồng từ chồi và từ cây mô tại nông trường Lê Minh Xuân 86

Thí nghiệm 4.9: Tác động của thuốc bảo vệ thực vật, sâu và bệnh, đến sự phát triển của bệnh héo đỏ đầu lá và bệnh thối nõn dứa 89

Thí nghiệm 4.10: So sánh sự sinh trưởng và phát triển của giống dứa Cayenne Thái Lan trồng từ cây chồi và từ cây nuôi cấy mô 93

Thí nghiệm 4.11: Tác động của thuốc bảo vệ thực vật, sâu và bệnh, đến sự phát triển của bệnh héo đỏ đầu lá và bệnh thối nõn dứa trồng tại nông trường Phạm Văn Hai 96

Thí nghiệm 4.12: Thí nghiệm khống chế tác hại của hiện tượng ngộ độc phèn trên dứa Cayenne bằng phân bón Hydrophos 100

Thí nghiệm 4.13: Xây dựng mô hình phòng trừ tổng hợp trên dứa Cayenne trồng tại Bình Chánh, Tp Hồ Chí Minh 101

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 111

Nội dung 1: Xác định nguồn gốc các giống dứa Cayenne 111

Nội dung 2: Điều tra sâu bệnh, cỏ dại, thiên địch và vi sinh vật có ích trên dứa 111

Nội dung 3: Xác định tác nhân gây bệnh do virus và vi khuẩn 112

Nội dung 4: Xây dựng biện pháp phòng trừ sâu bệnh hại dứa 112

ĐỀ NGHỊ 114

LỜI CẢM ƠN 118

TÀI LIỆU THAM KHẢO 118

PHỤ LỤC 121

DACH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 1 Tỉ lệ mẫu được tinh sạch ở các quy trình tách chiết được khảo sát 4

Bảng 2 Nồng độ DNA thu được từ các quy trình 4

Bảng 3 Bảng so sánh sự khác nhau giữa các quy trình tách chiết 5

Bảng 4 Nguồn gốc các giống dứa được lấy mẫu cho thí nghiệm 10

Bảng 5 Kết quả phản ứng RAPD trên 10 mồi ngẫu nhiên 11

Bảng 6 Mức tương đồng gen (màu xám) và khoảng cách di truyền giữa các quần thể 11

Bảng 7 Thành phần và mức độ phổ biến của các loài cỏ dại trên ruộng dứa 14

Bảng 8 Sâu hại và mức độ xuất hiện của chúng trên dứa Cayenne trồng tại nông trường Lê Minh Xuân, Bình Chánh, Tp Hồ Chí Minh 18

Bảng 9 Một số loài thiên địch và mức độ xuất hiện của chúng trên ruộng dứa Cayenne trồng tại nông trường Lê Minh Xuân, Bình Chánh, Hồ Chí Minh 20

Bảng 10 Một số loài kiến và mức độ xuất hiện của chúng trên ruộng dứa Cayenne trồng tại nông trường Lê Minh Xuân, Bình Chánh, Tp Hồ Chí Minh 24

Bảng 11 Xác định sự hiện diện đồng thới giữa kiến và rệp sáp trên dứa 25

Bảng 12 Mức độ gây hại của rệp sáp Dysmicoccus brevipes tại tp Hồ Chí Minh 31

Bảng 13 Tỉ lệ bẹ lá, trái dứa Cayenne bị rệp sáp gây hại và mật số của chúng trên cây được điều tra tại nông trường Lê Minh Xuân, Bình Chánh, Tp Hồ Chí Minh 32

Bảng 14 Mức độ phổ biến của các loại bệnh trên dứa Cayenne điều tra từ 2004- 2006 36

Bảng 15 Tình hình tuyến trùng ký sinh trên dứa Cayenne bị bệnh và không bị bệnh đỏ đầu lá tại nông trường Lê Minh Xuân - Bình Chánh,Tp Hồ Chí Minh , năm 2004-2005 37

Bảng 16 Tình hình tuyến trùng ký sinh trên dứa Cayenne bị bệnh và không bị bệnh đỏ đầu lá tại nông trường Phạm Văn Hai - Bình Chánh Tp Hồ Chí Minh, năm 2004-2005 37

Bảng 17 Tình hình bệnh héo khô đầu lá nghi do PMWaV tại vùng dứa Cayenne 42

Bảng 18 So sánh diễn biến bệnh héo khô đầu lá do PMWaV giữa dứa Cayenne và dứa Queen tại Tp.Hồ Chí Minh 43

Bảng 19 Tỷ lệ bệnh héo đỏ đầu lá trên dứa Cayenne ở các địa điểm điều tra khác nhau tại Tân Phước, tỉnh Tiền Giang, tháng 05-2005 43

Bảng 20 Bệnh đỏ đầu lá trên hai giống dứa trồng tại Tân Phước, tỉnh Tiền Giang, năm 2005 43

Bảng 21 Sự khác biệt về mật số rệp sáp giữa cây nhiễm và không nhiễm bệnh đỏ đầu lá trên 2 giống dứa khác nhau 45

Bảng 22 Ảnh hưởng của bệnh héo khô đầu lá nghi do PMWaV lên năng suất và chất lượng trái dứa Cayenne tại Tp Hồ Chí Minh 48

Bảng 23 Ảnh hưởng của bệnh đỏ đầu lá đến năng suất dứa Queen và Cayenne tại Tân Phước, tỉnh Tiền Giang, năm 2005 48

Bảng 24 Kết quả lây bệnh nhân tạo trên l á dứa tách rời 53

Bảng 25 Kết quả lây bệnh nhân tạo trên cây dứa con 3 tháng tuổi 55

Bảng 26 Phát triển triệu chứng bệnh và dân số rệp sáp giả trên cây dứa Cayenne được chủng bệnh trong điều kiện nhà lưới 65 Bảng 27 Sinh trưởng của cây dứa Cayenne sau khi chủng rệp sáp giả thu từ nguồn

bệnh khác nhau trong điều kiện nhà lưới 65

Bảng 28 Sự xuất hiện đồng thời của kiến và rệp sáp giả trên dứa Cayenne trồng tại Bình Chánh- Hồ Chí Minh, điều tra năm 2006 67

Bảng 29 Thành phần tuyến trùng và mức độ phổ biến trên ruộng thí nghiệm 70

Bảng 30 Mật số Pratylenchus sp trên nghiệm thức thí nghiệm 71

Bảng 31 Aûnh hưởng của thảm phủ hữu cơ đến cỏ dại phổ biến ở ruộng dứa Cayenne 72

Bảng 32 Trọng lượng tươi của các nhóm cỏ dại trong thí nghiệm phủ hữu cơ 73

Bảng 33 Aûnh hưởng của thảm phủ hữu cơ đến sự thay đổi về lý, hóa tính của đất 73

Bảng 34 Biến động mật số rệp sáp trên dứa Cayenne sau chủng với số rệp khác nhau 76

Bảng 35 Thời gian xuất hiện và tỉ lệ cây bệnh đỏ đầu lá sau khi thả rệp D brevipes trên cây dứa Cayenne 77

Bảng 36 Diễn biến bệnh đỏ đầu lá và mật độ rệp sáp D brevipes trên các cây dứa có chủng rệp và kiến Tetramorium sp 78

Bảng 37 Tỉ lệ cây bệnh héo khô đầu lá dứa do PMWaV giữa ruộng có phủ bạt và ruộng không phủ bạt tại Tp.HCM, năm 2004 – 2005 81

Bảng 38 So sánh sự khác biệt về bệnh và mật số rệp sáp trong thí nghiệm phủ bạt và không phủ bait 81

Bảng 39 Ảnh hưởng của biện pháp phủ bạt đến năng suất và chất lượng trái dứa Cayenne trồng tại Bình Chánh, Tp Hồ Chí Minh 82

Bảng 40 Diễn biến mật độ rệp Dysmicoccus brevipes trên dứa Cayenne trước và sau xử lý 5 loại thuốc thí nghiệm tại nông trường Delta 83

Bảng 41 Hiệu lực trừ rệp sáp Dysmicoccus brevipes trên dứa Cayenne sau xử lý thuốc thí nghiệm tại nông trường Delta 83

Bảng 42 Ảnh hưởng của biện pháp xử lý thuốc Supracide đền bệnh đỏ đầu lá, rệp sáp và năng suất trái dứa Cayenne trồng tại Bình Chánh, Tp Hồ Chí Minh 86

Bảng 43 Sự sinh trưởng và mức độ bệnh héo đầu lá giữa 2 nguồn cây giống 89

Bảng 44 Sâu bệnh hại trên các lô dứa thí nghiệm dưới tác động khác nhau 90

Bảng 45 Aûnh hưởng của biện pháp tác động đến năng suất dứa thương phẩm 92

Bảng 47 Hiệu quả kinh tế khi trồng dứa Cayenne trên đất phèn Lê Minh Xuân 93

Bảng 48 Sự sinh trưởng và mức độ bệnh héo đầu lá giữa 2 nguồn cây giống 93

Bảng 49 Bệnh và tác nhân truyền bệnh trên cây dứa Cayenne ở các nghiệm thức 97

Bảng 50 Năng suất dứa trái trên các nghiệm thức tác động khác nhau 99

Bảng 51 Chi phí đầu tư cho trồng 1 hecta dứa Cayenne trong các nghiệm thức thí nghiệm tại Nông Trường Phạm văn Hai 99

Bảng 52 Hiệu quả kinh tế khi trồng dứa Cayenne trên đất phèn Phạm Văn Hai dưới tác động của các biện pháp trong thí nghiệm 99

Bảng 53 Sự hạn chế ngộ độc phèn của dứa Cayenne với Hydrophos 100

Bảng 54 Những tác động kỹ thuật chính giữa mô hình thí nghiệm và nông trường 102

Bảng 55 Sự hiện diện và phát triển của cỏ dại trên 2 mô hình canh tác dứa 105

Bảng 56 So sánh sự phát triển của dứa Cayenne trong mô hình tổng hợp 105

Bảng 57 So sánh sâu bệnh hại dứa Cayenne trong mô hình tổng hợp 108

Bảng 58 Tỉ lệ (%) dứa trái các loại trên lô nông trường và thí nghiệm 108

Bảng 59 Kết quả của những tác động trên dứa Cayenne dựa trên quy trình canh tác dứa đang phổ biến hiện nay và một số tác động khác 108

DANH SÁCH CÁC HINH

Hình 1 Khảo sát chất lượng DNA 5

Hình 2 Khảo sát nồng độ mồi thích hợp 7

Hình 3 Khảo sát nồng độ Mg2+ 7

Hình 4 Khảo sát nồng độ dNTP 4

Hình 5 Khảo sát nồng độ DNA 5

Hình 6 Khảo sát nồng độ Taq DNApolymerase 9

Hình 7 Các vạch DNA từ phản ứng RAPD trên mồi RAPD 4 (A), mồi RAPD 6 (B) và mồi RAPD 10 (C) 12

Hình 8 Phân nhóm các giống dứa theo nguồn gốc lấy mẫu dựa vào dữ liệu RAPD và phân tích theo UPGMA 12

Hình 9 Một số hình ảnh các loài cỏ dại phát triển trên ruộng dứa Cayenne trồng tại Bình Chánh-thành phố Hồ Chí Minh, điều tra năm 2004-2006 16

Hình 10 Côn trùng hại dứa Cayenne trồng tại nông trường Lê Minh Xuân, Bình Chánh, Tp Hồ Chí Minh 18

Hình 11 Hình ảnh côn trùng thiên địch trên dứa Cayenne trồng tại nông trường Lê Minh Xuân, Bình Chánh, Tp Hồ Chí Minh 22

Hình 12 Hình ảnh các loài kiến tìm thấy trên ruộng dứa Cayenne trồng tại Thành phố Hồ Chí Minh , điều tra năm 2004-2007 29

Hình 13 Vị trí định cư và gây hại của rệp sáp giả dứa 31

Hình 14 Bệnh thối nõn dứa và thối thân dứa phần thân ngầm 38

Hình 15.Bệnh cháy khô đầu lá dứa Cayenne 38

Hình 16 Các dạng bệnh trên lá dứa Cayenne chưa rõ tác nhân gây bệnh 39

Hình 17 a, Triệu chứng thối phần gốc dưa; b, hiện tượng dứa không hình thành rễ; c, thối rễ dứa gây hiện tượng chết cây sau trồng; d, cây không bệnh với nhiều rễ mới 39

Hình 18 Bệnh trên trái dứa Cayenne 40

Hình 19.Các dạng triệu chứng gây hại đến trái dứa Cayenne 40

Hình 20 Tuyến trùng (a) Meloidogyne sp.; b) Helicotylenchus sp.; (c) Pratylenchus sp.; phân lập được từ rễ dứa Cayenne 41

Hình 21.Vi khuẩn gây bệnh được phân lập từ vết bệnh thối trái dứa Cayenne 41

Hình 22 Sơ đồ diễn tả sự lây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá dứa Cayenne trên ruộng trồng, cây bệnh thường xuất hiện tại mép luống dứa 46

Hình 23 Kiểu phân bố bệnh héo đỏ đầu lá 46

Hình 24 Tác hại của bệnh héo đầu lá do vi rút 49

Hình 25 A, Diễn biến lượng mưa và nhiệt độ trung bình hàng tháng tại Thành phố Hồ Chí Minh B, Diễn biến mật số rệp định cư trên cây dứa giảm khi lượng mưa gia tăng C, Diễn biến bệnh đỏ đầu lá trên ruộng dứa Cayenne sau trồng 2 tháng với sự gia tăng cây bệnh liên tục 51 Hình 26 Triệu chứng bệnh trên lá dứa do nấm và vi khuẩn gây ra sau khi

chủng bệnh trong phòng thí nghiệm 53 Hình 27 Triệu chứng bệnh do nấm và vi khuẩn gây ra trên cây dứa Cayenne

3 tháng tuổi được chủng bệnh trong phòng thí nghiệm tại trường Đại

học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh 55 Hình 28.Các mẫu lá biểu hiện triệu chứng bệnh MWP ở các mức độ nhiễm

bệnh khác nhau 56 Hình 29 Các dạng triệu chứng của bệnh héo đỏâ đầu lá dứa Cayenne do vi

rút PMWaV 59 Hình 30.Nhận dạng cây dứa bị bệnh héo đỏ đầu lá do PMWaV, so với các

triệu chứng bệnh lý khác trên dứa Cayenne được ghi nhận tại Tp.HCM Đồng Nai và Lâm Đồng 60 Hình 31 Kết quả phát hiện đoạn gen HSP 70 của 2 loài PMWaV trong mẫu

dứa bị héo đỏ đầu lá dựa vào quy trình đã thiết lập với cặp primer

chuyên biệt p225/p226 và p224/223 62 Hình 32 Xác định sự hiện diện của PMWaV trong dứa dựa vào phản ứng

RT-PCR với các cặp primer chuyên biệt 62 Hình 33.Kết quả phát hiện gen HSP 70 của PMWaV ở các nghiệm thức lây

nhiễm Dysmicoccus brevipes 66

Hình 34 Bộ sưu tập dứa Cayenne (a), chuẩn bị dứa Cayenne sạch bệnh vi

rút 66 Hình 35.Cỏ dại phát triển trong ruộng dứa phủ bạt 74 Hình 36 Hiệu quả hạn chế cỏ dại khi dùng thảm phủ hữu cơ trong ruộng dứa 74

Hình 37 Thí nghiệm về mật độ rệp sáp Dysmicoccus brevipes với bệnh héo

đỏ đầu lá trên dứa Cayenne có nguồn gốc khác nhau 79 Hình 38.Triệu chứng bệnh đỏ đầu lá Cayenne sau khi chủng 25 rệp sáp 79 Hình 39 Bố trí thí nghiệm xác định sự truyền bệnh héo đỏ đầu lá dứa Cayenne

của rệp sáp giả Dysmicoccus brevipes và kiến nâu vàng nhỏ

Tetramorium sp 79

Hình 40 Diễn biến bệnh héo đỏ đầu lá trên ruộng dứa dùng Supracide 40EC

so với ruộng của nông dân Thuốc phun 1 tháng/lần theo nồng độ

khuyến cáo 84 Hình 41.Sinh trưởng của dứa Cayenne trên lô có và không có phủ bạt 85 Hình 42.Ruộng thí nghiệm trên ruộng hộ nông dân tại Bình Chánh 85 Hình 43 So sánh sự phát triển của dứa Cayenne trồng từ chồi và từ cây mô

tại nông trường Lê Minh Xuân 88 Hình 44.Tác động của thuốc bảo vệ thực vật, sâu và bệnh, đến sự phát triển

của bệnh héo đỏ đầu lá và bệnh thối nõn dứa trên vùng dứa Lê

Minh Xuân 91 Hình 45 So sánh sự sinh trưởng và phát triển của giống dứa Cayenne Thái Lan trồng từ cây chồi và từ cây nuôi cấy mô trên vùng dứa Phạm

Văn Hai 95 Hình 46.Tác động của thuốc bảo vệ thực vật, sâu và bệnh, đến sự phát triển

của bệnh héo đỏ đầu lá và bệnh thối nõn dứa trồng tại nông trường

Phạm Văn Hai 98

a

Hình 47 Dứa Cayenne bị biến đổi màu sắc do khô hạn và ngộ độc phèn ngay cả trên cùng một liếp trồng và cùng tuổi cây 101 Hình 48 Ruộng mô hìng với tác động thuốc bảo vệ thực vật trồng ngày 19

tháng 11 năm 2005 tại lô 6/2B nông trường Phạm Văn Hai 106 Hình 49 Ruộng thí nghiệm với tác động thuốc bảo vệ thực vật trồng ngày

19 tháng 11 năm 2005 tại lô 6/2B nông trường Phạm Văn Hai 107

THỰC HIỆN CÁC NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nội dung 1: Xác định nguồn gốc các giống dứa Cayenne

Tìm những marker phân tử đặc trưng có liên quan đến tính đa dạng di truyền của các giống dứa Cayenne đang trồng như giữa dứa có gai hay không có gai hoặc để nhận diện giữa giống dứa cayenne này với các giống dứa Cayenne khác

Thí nghiệm 1.1: Khảo sát quy trình tách chiết DNA từ mẫu lá dứa Cayenne Mục đích: Nghiên cứu nucleic acid là nội dung cơ bản của kỹ thuật gen và marker

phân tử DNA là vật chất cơ bản trong nghiên cứu di truyền phân tử, do đó chúng ta phải ly trích được DNA, tách khỏi tế bào và các vật chất khác như RNA, protein, cellulose vv… Muốn kết quả thành công, phải tạo ra một lượng DNA tinh khiết và đây cũng là mục đích của thì nghiệm này

Thời gian: Tháng 3 năm 2004 đến tháng 12 năm 2006

Người thực hiện: PSG.TS Bùi Văn Lệ và công tác viên

Phương pháp nghiên cứu: Bố trí thí nghiệm trong phòng thí nghiệm với các quy trình

tách chiết DNA khác nhau

Mô tả thí nghiệm:

a, Đối tương thí nghiệm: Mẫu lá dứa Cayenne, DNA tổng số

b, Bố trí thí nghiệm: Thực hiên các quy trình ly trích DNA tổng số từ mẫu lá dứa

Cayenne, so sánh kết quả nhằm chọn quy trình phù hợp cho nghiên cứu tiếp theo Bốn quy trình được chọn như sau:

Quy trình 1: Theo Scott O Rogers và Arnold J Bendich [12]

1 Giã 1 g mô lá với nước đá khô bằng cối và chày

2 Chuyển toàn bộ mô và nước đá khô vào trong một eppendorf

3 Chờ cho nước đá khô bay hết, thêm vào đệm 2X CTAB nóng (65oC)

4 Thêm một thể tích chloroform/isoamyl alcolhol (24:1) Trộn đều

5 Ly tâm 30 giây ở 11000 g

6 Chuyển dịch nổi bên trên sang một eppendorf mới Bỏ pha bên dưới (chloroform/isoamyl alcolhol)

7 Thêm 1/10 thể tích dung dịch CTAB 10% và lắc đều

8 Thực hiện lắc mẫu với chloroform/isoamyl alcolhol (từ bước 4 – 6)

9 Thêm một thể tích CTAB tủa và lắc nhẹ Đặt trong nước đá từ 5 – 30 phút

10 Ly tâm từ 10 – 60 giây Đổ bỏ dịch nổi (supernatant)

11 Hòa tan cặn (pellet) trong dung dịch muối TE

12 Thêm hai lần thể tích Ethanol 95% (hay 100%) lạnh và lắc đều

13 Ly tâm 5 – 15phút Đổ bỏ dịch nổi (supernatant)

14 Thêm vào một thể tích Ethanol 80% lạnh ly tâm trong 5 phút Đổ bỏ dịch

15 Để khô trong tủ sấy 20 – 30 phút, khi chất lỏng bên trong bay hơi hết

16 Hoà lại trong 0,1X TE; xử lý với RNase; và bảo quản ở –20oC

Quy trình 2: Phương pháp do Guillemaut và Marechal- Drouard (1992) đề xuất, các

dung dịch sử dụng có tính chất acid ngăn cản sự ion hóa và oxy hóa của polyphenol Quy trình này thực hiện cho kết quả tốt với những loài cây thân gỗ (Ziegenhagen và Fladung, 1997) Ở đây, lượng vật liệu (lá) được nâng lên từ 100 mg đến 1 g để thực hiện theo quy trình biến đổi được mô tả bởi Ziegenhagen (1993)

1 Cho vào 1 g mẫu đã nghiền 20 ml dịch ly trích có SDS (làm nóng ở 65oC)

2 Ủ mẫu trong 20 phút ở nhiệt độ 65oC

3 Ly tâm 15 phút ở 6000 vòng/phút

4 18 ml dịch nổi được thêm 6 ml potassium acetat và ủ 30 phút trong nước đá

5 Ly tâm 20 phút ở 14000 vòng/phút và tách dịch nổi ra 2 ống

6 Tủa DNA bằng cách thêm 4,8 ml isopropanol vào 8 ml dịch nổi (supernatant) và ủ trong 30 phút ở –20oC

7 Ly tâm ở 4oC trong 30 phút (6000 vòng/phút)

8 Hòa tan kết tủa trong 750 l TE và chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml

9 Thêm 10 l RNase và ủ mẫu trong 30 phút ở 37oC

10 Thực hiện ly trích lặp lại, mỗi lần thêm 750 l dung dịch phenol/chloroform (ly tâm 5 phút), chloroform/isoamyl alcohol (ly tâm 10 phút)

11 Với 400 l dịch nổi (supernatant), thêm vào 1100 l ethanol 96% và 40 l sodium acetate, ủ 30 phút (hoặc để qua đêm) ở -20oC

12 Ly tâm 14000 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC để thu DNA

13 Rửa kết tủa bằng 1 ml Ethanol 70% và hòa tan DNA trong 500 l TE

Quy trình 3: Theo Doyle & Doyle [9]

Quy trình này sử dụng là một quy trình bổ sung sau quy trình của Doyle & Doyle (1987, 1990), cho được lượng DNA tiêu chuẩn để sử dụng cho nghiên cứu Quy trình được dựa trên sự phân giải và tinh sạch với CTAB mà lựa chọn cách tủa DNA CTAB phải được rửa hết một cách cẩn thận

1 Giã 1 g lá và thêm 1 ml dịch 2X CTAB được ủ nóng ở 65oC

2 Ủ mẫu trong 30 phút ở 65oC

3 Sau đó giữ mẫu ở 40oC, tách chiết bằng 1 ml chloroform / isoamyl alcohol

4 Ly tâm 15 phút ở 14000 vòng/phút Sau đó hút lấy dịch nổi

5 Thêm 0,2 ml 5X CTAB, lặp lại với 1 ml chloroform/isoamyl alcohol

6 Ly tâm 15 phút, hút dịch nổi sang ống eppendorf mới

7 Để tủa DNA, thêm 1 ml isopropanol và ủ ở nhiệt độ phòng trong 60 phút

8 Ly tâm lấy tủa DNA ở 14000 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC

9 Rửa cặn DNA bằng 1 ml dung dịch đệm rửa (ethanol 70o)

10 Ly tâm ở 14000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC

11 Làm khô DNA và hòa trong 50 l TE

12 Thêm vào 0,5 l RNase (10 mg/ml) và ủ trong 30 phút ở 37oC

13 Lặp lại bước loại protein bằng phenol/chloroform

14 Tủa DNA bằng cách cho thêm vào 50 l sodium acetate và 1 ml ethanol, ủ ở

4oC trong 15 phút

15 Ly tâm thu DNA ở 14000 vòng/phút trong 30 phút

16 Sau đó, rửa lại bằng ethanol 70o, ly tâm

17 Để khô và hoà DNA trong 20 l 0,1X TE

Quy trình 4 : Dựa vào các bước chính trong quá trình tách chiết DNA, chúng tôi cũng

thực hiện một quy trình tách chiết DNA với các bước rút gọn đơn giản như sau:

1 Giã 0,1 g lá trong Nitơ lỏng, và thêm vào 1 ml dung dịch 2X CTAB đã được đun nóng ở 65oC

2 Mẫu được ủ trong 1 giờ ở 65oC

3 Sau đó, thêm vào 500 l phenol/chloroform, lắc đều

4 Ly tâm trong 15 phút ở 14000 vòng/phút

5 Hút dịch nổi và tủa DNA bằng cách thêm vào 1 ml isopropanol, để ở 4oC trong 15 – 30 phút

6 Ly tâm thu DNA ở 14000 vòng/phút trong 30 phút

7 Rửa lại DNA bằng ethanol 70o

8 Ly tâm và để khô Sau đó hòa trong dung dịch 0,1X TE

9 Sau đó, ủ mẫu trong dung dịch RNase 1 giờ

10 Bảo quản mẫu ở –20oC

c, Điều kiện thí nghiệm: Thực hiện trong phòng với các dụng cụ chính xác cao

d, Chỉ tiêu theo dõi: Đo chất lượng và số lượng DNA tồng số

Kết quả thí nghiệm và thảo luận:

Sau nhiều lần khảo sát bốn quy trình tách chiết DNA nêu trên, mẫu được xác định nồng độ và độ tinh sạch DNA bằng phương pháp đo mật độ quang Các mẫu có độ tinh sạch cao (có tỉ lệ OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1,8 – 2) được sử dụng cho các phản ứng tiếp theo

Bảng 1 Tỉ lệ mẫu được tinh sạch ở các quy trình tách chiết được khảo sát

Từ những mẫu tinh sạch này, dựa trên OD260nm có thể tính được nồng độ DNA theo công thức sau:

Bảng 2 Nồng độ DNA thu được từ các quy trình Quy trình Nồng độ DNA thu được (ng/ l)

Ở quy trình 1: sử dụng tác nhân tủa DNA là đệm tủa CTAB và sau đó tủa lại bằng Ethanol tuyệt đối Có thể do đệm tủa CTAB không thích hợp cho việc tủa DNA của đối tượng này, và ethanol tuyệt đối là tác nhân tủa cần có điều kiện nhiệt độ lạnh và nồng độ muối thích hợp Do vậy, lượng DNA thu được từ quy trình tách chiết này khá thấp

Quy

trình

Số mẫu thực hiện

Số mẫu không tinh

Bảng 3 Bảng so sánh sự khác nhau giữa các quy trình tách chiết

1 2x CTAB Chlorofor/isoamyl alcohol Ethanol tuyệt đối Đệm tủa CTAB 8,0

2 SDS Chlorofor/isoamyl alcohol Potassium acetate

Phenol/chloroform

Isopropanol Ethanol tuyệt đối + sodium acetate 3 M

5,2

3 2x CTAB Chlorofor/isoamyl alcohol Phenol/chloroform

Isopropanol Ethanol tuyệt đối +

Ở quy trình 2: có lẽ do tác động của pH môi trường đệm tách chiết nên ảnh hưởng đến lượng DNA tách chiết Ở quy trình 3: lượng DNA thu được ít hơn lượng DNA thu được ở quy trình 4, có thể là do thực hiện quá trình biến tính protein nhiều lần, qua nhiều lần thao tác làm mất đi một ít lượng DNA Tuy nhiên, lượng DNA thu được từ quy trình này khá tinh sạch Ở quy trình 4: lượng DNA thu được khá cao do chỉ qua một lần biến tính, tránh được sự sai sót trong thao tác Tuy nhiên, tỉ lệ DNA tinh sạch thu được từ quy trình này không cao bằng quy trình 3

Chất lượng DNA được chúng tôi khảo sát qua điện di trên gel agarose Do lượng DNA thu được ở quy trình 1 và quy trình 2 quá ít, nồng độ không đủ để thực hiện chạy điện di nên chúng tôi không khảo sát chất lượng DNA ở hai quy trình này Kết quả điện di khảo sát chất lượng DNA ở quy trình 3 và quy trình 4 cho thấy chất lượng DNA thu được ở cả hai quy trình 3 và quy trình 4 đều như nhau

Thí nghiệm 1.2: Tối ưu hóa phản ứng RAPD sử dụng DNA tổng số ly trích từ mẫu lá dứa Cayenne trong thí nghiệm 1.1

Mục đích: Sự bắt cặp không đặc hiệu giữa mồi và DNA mạch khuôn đã làm cho phản

ứng RAPD khó tối ưu và kết quả các vạch DNA khuếch đại ghi nhận được qua điện di

Hình 1 Khảo sát chất lượng DNA

(mẫu DNA Trung Quốc 250)

Giếng 1: DNA tách chiết từ quy trình 3 Giếng 2: DNA tách chiết từ quy trình 4

không ổn định Do đó, chúng tôi tiến hành tối ưu hóa thành phần phản ứng RAPD

trước khi áp dụng để phân tích mẫu

Thời gian: Tháng 3 năm 2004 đến tháng 12 năm 2006

Người thực hiện: PSG.TS Bùi Văn Lệ và công tác viên

Phương pháp nghiên cứu: Bố trí thí nghiệm trong phòng thí nghiệm với các quy trình

RAPD được thay đổi các thành phần phản ứng

Mô tả thí nghiệm:

a, Đối tương thí nghiệm: Mẫu lá dứa Cayenne, DNA tổng số

b, Bố trí thí nghiệm: DNA sử dụng cho phản ứng là DNA tổng số sau khi kiểm tra

nồng độ bằng máy đo OD và kiểm tra chất lượng về độ tinh sạch RAPD được thực hiện dựa theo chương trình phản ứng RAPD của nhóm tác giả người Ấn Độ (Jaya R Soneji, PS Rao và Minal Mhatre) 1 chu kỳ với 94oC trong 4 phút, 45 chu kỳ với 92oC,

30 giây; 36oC, 1 phút; 72oC, 2 phút; 1 chu kỳ 72oC, 10 phút Thành phần phản ứng RAPD được tối ưu hoá bằng việc khảo sát từng thành phần như sau:

+ Nồng độ primer: Với nồng độ primer quá cao thì không những không cần thiết mà còn tạo ra bất lợi, vì dẫn đến sự hình thành hiện tượng primer dimers, và hiện tượng primer nhầm Chúng tôi tiến hành khảo sát primer ở các nồng độ: 0,1 M; 0,2 M; 0,5 M; 1 M

- Nồng độ Mg2+: Một trong những ảnh hưởng có tính chất quyết định là nồng độ Mg2+, kể cả về tác dụng chuyên biệt và kết quả PCR Môi trường có tính chất ion như vậy làm cho dung dịch đệm trở nên năng động hơn rất nhiều Nồng độ cao của Mg2+ sẽ làm cho phân tử DNA của dây đôi trở nên ổn định hơn, và ngăn ngừa sự biến chất hoàn toàn (sự tách mạch đôi tạo ra mạch đơn) của sản phẩm trong mỗi chu kỳ, làm giảm kết quả PCR Lượng dư thừa Mg2+ còn làm cho hiện tượng bắt cặp giả (anneaning) tại những vị trí không đúng của dây đơn, cho ra những sản phẩm không mong muốn với số lượng lớn, nhưng mức độ chuyên tính rất thấp Ngược lại, nếu nồng độ Mg2+ quá thấp, sẽ ảnh hưởng quá trình kéo dài (extension) Do đó, cần phải xác định nồng độ tối ưu của Mg2+ nhằm đảm bảo kết quả số lượng sản phẩm và sự chuyên tính của số lượng sản phẩm Với Mg2+, tiến hành khảo sát ở các nồng độ: 0,5 mM; 1,5 mM; 2,5 mM; 3,5 mM

+ Nồng độ dNTP: điều quan trọng của nồng độ dNTP là phải giữ cho nồng độ của tất cả các deoxynucleotide bằng nhau, để tránh sự kết gắn vào nhầm lẫn Tiến hành khảo sát dNTP ở các nồng độ: 0,2 mM; 0,4 mM; 0,6 mM; 0,8 mM

+ Nồng độ DNA: tiến hành khảo sát ở nồng độ 10 ng; 50 ng; 100 ng; 200 ng

+ Nồng độ Taq DNA polymerase: Nếu DNA polymerase quá dư thừa, sẽ có hiện

tượng tổng hợp DNA do phản ứng giả của primer trên dây đơn Hầu hết trong các

protocol chúng tôi tham khảo, nồng độ Taq DNA polymerase khuyến cáo nên sử dụng là 0,5U/25 l Đối với Taq DNA polymerase, chúng tôi tiến hành khảo sát ở các

nồng độ: 0,5 U; 1 U; 1,5 U; 2 U

Với mỗi thí nghiệm khảo sát nồng độ tối ưu được thực hiện lặp lại nhiều lần nhằm thu được những kết quả ổn định trước khi thực hiện phản ứng RAPD Sản phẩm DNA sau

Hình 3 Khảo sát nồng độ Mg 2+

Giếng 1: nồng độ Mg 2+ là 0,5 mM Giếng 2: nồng độ Mg 2+ là 1,5 mM Giếng 3: nồng độ Mg 2+ là 2,5 mM Giếng 4: nồng độ Mg 2+ là 3,5 mM

khi được khuếch đại được kiểm tra kích thước bằng điện di trên gel agarose 2%, trong dung dịch đệm TAE 1X, dưới hiệu điện thế 50 V trong 50 phút Sau đó, gel được ngâm trong dung dịch Ethidium bromide 10 mg/ml và các vạch DNA sẽ được quan sát dưới đèn UV Kích thước các đoạn DNA sẽ được xác định bằng cách so sánh với thang chuẩn 100 bp

c, Điều kiện thí nghiệm: Thực hiện trong phòng với các dụng cụ chính xác cao

d, Chỉ tiêu theo dõi: Toàn bộ các vạch dao động từ 100 bp – 2000 bp sẽ được phân

tách trên gel agarose 2% Đánh giá dựa vào sự hiện diện các sản phẩm PCR rõ ràng và mức độ tạp nhiễm Xác định điều kiện tối ưu của phản ứng

Kết quả thí nghiệm và thảo luận:

Xác định nồng độ primer thích hợp: Kết quả khảo sát cho thấy nồng độ mồi cũng

ảnh hưởng nhiều đến phản ứng RAPD Nồng độ mồi quá ít sẽ làm cho phản ứng khuếch đại không tốt, trong khi nồng độ mồi càng cao thì sẽ càng ức chế phản ứng RAPD Theo như kết quả thì nồng độ mồi thích hợp nhất cho phản ứng RAPD là 0,2

M (giếng 2 trong hình 2)

Xác định nồng độ Mg 2+ thích hợp cho phản ứng PCR

Theo kết quả khảo sát, cho thấy nồng độ Mg2+ cũng ảnh hưởng đến phản ứng RAPD Nồng độ Mg2+ quá nhỏ hoặc quá cao đều ức chế phản ứng Nồng độ Mg2+ tối

ưu cho phản ứng được chúng tôi khảo sát là 1,5 mM (giếng 2, Hình 3)

Hình 2 Khảo sát nồng độ mồi thích hợp Giếng 1: Nồng độ mồi là 0,1 M

Giếng 2: Nồng độ mồi là 0,2 M Giếng 3: Nồng độ mồi là 0,5 M Giếng 4: Nồng độ mồi là 1 M

Xác định nồng độ dNTP thích hợp cho phản ứng PCR

Kết quả khảo sát cho thấy nồng độ dNTP tối ưu cho phản ứng RAPD là 0,2 mM

Xác định nồng độ DNA khuôn cho phản ứng PCR

Trong phản ứng RAPD, nồng độ DNA không ảnh hưởng nhiều đến phản ứng Kết quả khảo sát cho thấy nồng độ DNA tối ưu nhất là ở giếng 2, tương ứng với nồng độ DNA là 50 ng

Nồng độ Taq DNA polymerase

Nồng độ Taq DNA polymerase quá thấp sẽ không tạo được xúc tác để cho sản

phẩm PCR theo ý muốn Tuy nhiên, nếu nồng độ quá cao thì sẽ tạo ra những sản phẩm không chuyên tính, làm sai lệch kết quả Qua kết quả khảo sát nồng độ Taq polymerase thể hiện ở hình 6, chúng tôi quyết định chọn nồng độ tối ưu cho phản ứng RAPD 1 U

Hình 5 Khảo sát nồng độ DNA

Giếng 1: nồng độ DNA là 10 ng

Giếng 2: nồng độ DNA là 50 ng Giếng 3: nồng độ DNA là 100 ng Giếng 4: nồng độ DNA là 200 ng

Hình 4 Khảo sát nồng độ dNTP

Giếng 1: nồng độ dNTP là 0,2 mM

Giếng 2: nồng độ dNTP là 0,4 mM Giếng 3: nồng độ dNTP là 0,6 mM

Giếng 4: nồng độ dNTP là 0,8 mM

Hình 6 Khảo sát nồng độ Taq DNApolymerase

Giếng 1: nồng độ Taq là 0,5 U

Giếng 2: nồng độ Taq là 1 U Giếng 3: nồng độ Taq là 1,5 U

Giếng 4: nồng độ Taq là 2 U

Sau khi khảo sát tất cả các thành phần của phản ứng RAPD, thành phần phản ứng tối

ưu được đề nghị như sau:

Thành phần Nồng độ cuối

Nước cất thêm vào cho đủ 25 l

Thí nghiệm 1.3: Ứng dụng RAPD phân tính đa dạng di truyền của Dứa Cayenne Mục đích: Phân tích sự đa dạng về di truyền giữa các mẫu giống dứa Cayenne có

nguồn gốc xuất xứ và được trồng từ nhiều vùng địa lý khác nhau

Thời gian: Tháng 3 năm 2004 đến tháng 12 năm 2006

Người thực hiện: PSG.TS Bùi Văn Lệ và cộng tác viên

Phương pháp nghiên cứu: Bố trí thực nghiệm trong phòng thí nghiệm với quy trình

chuẩn hóa trong các thí nghiệm 1.1 và 1.2

Mô tả thí nghiệm:

a, Đối tương thí nghiệm: Mẫu lá dứa Cayenne, DNA tổng số

b, Bố trí thí nghiệm: Sử dụng vật liệu lá dứa từ 11 giống dứa khác nhau theo địa

điểm canh tác cho ly trích DNA tổng số theo kết quả của thí nghiệm 1.1 tại Tại bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật & Chuyển hóa Sinh học – Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Sau đó mẫu DNA được làm khuôn mẫu cho phản ứng RAPD với các thành phần được tối ưu trong thí nghiệm 1.2 Sử dụng 10 RAPD primer cho khảo sát từng phản ứng trên các mẫu DNA (mỗi giống dứa) RAPD 1: 5’AGGTCACTGA 3’, RAPD 2: 5’ TGCACACTGA 3’, RAPD 3: 5’ TGGTCACTGT 3’, RAPD 4: 5’AGTCAGCCAC 3’, RAPD 5: 5’AATCGG GCTG 3’, RAPD 6: 5’ CAGCACCCAC 3’, RAPD 7: 5’CAATCGCCGT 3’, RAPD 8: 5’ TGGTACCTGA 3’, RAPD 9: 5’ GGGTAACGCC 3’, RAPD 10: 5’ GTGATCGCAG

3’ Sử dụng thang 100 bp, gồm 12 băng DNA có kích thước từ 100 bp đến 3000 bp (Fermentas) Mẫu dứa được thu nhận từ lá của cây non, rửa sạch lá và bảo quản trong tủ lạnh -20oC Mẫu dứa thu nhận từ Công ty giống cây trồng TP HCM cung cấp gồm các giống sau:

Bảng 4 Nguồn gốc các giống dứa được lấy mẫu cho thí nghiệm

c, Điều kiện thí nghiệm: Thực hiện trong phòng với các dụng cụ chính xác cao

d, Chỉ tiêu theo dõi: Toàn bộ các vạch dao động từ 100 bp – 2000 bp sẽ được phân

tách trên gel agarose 2% Sự hiện diện (mã hóa là 1) hay vắng mặt (mã hoá là 0) của các băng vạch trên bảng gel sẽ được ghi nhận ở mỗi cá thể, được dùng để phân tích bằng phần mềm Popgen32 Xác định mức tương đồng gen giữa các cá thể:

Sxy = 2nxy/ (nx +ny) trong đó nx,ny là số vạch ghi nhận được ở mỗi cá thể x, y;

nxy là số vạch ghi nhận được ở cả 2 cá thể x, y

Mức tương đồng gen giữa các quần thể: công thức tính tương tự như giữa 2 cá thể: Sij

= 1 + S’ij – 0,5(Si +Sj) trong đó Si , Sj biểu hiện mức tương đồng gen trong quần thể i, j; S’ij là mức tương đồng gen trung bình giữa các cặp cá thể ngẫu nhiên trong 2 quần thể i, j; Sij sau đó được biến đổi thành khoảng cách gen

(Dij ) theo công thức: Dij = -In[Sij / (Si Sj )]

Sơ đồ cây phát sinh loài sẽ được tạo ra khi sử dụng phương pháp UPGMA

(Unweighed pair-group method with arithmetic average) trong phần mềm POPGEN32

Kết quả thí nghiệm và thảo luận:

Sử dụng 10 mồi cho phản ứng RAPD, kết quả tạo được 78 locus Trung bình 7,8 locus/mồi (Bảng 5) Những mồi này cho tính đa hình cao (75 vạch đa hình) Trong đó mồi RAPD 9 và RAPD 10 cho số vạch nhiều nhất (11 vạch) với 11 vạch đa hình Mồi RAPD 8 cho số vạch ít nhất (1 vạch), chỉ xuất hiện ở vài cá thể và không có ở các cá thể khác (Hình 7)

Bảng 5 Kết quả phản ứng RAPD trên 10 mồi ngẫu nhiên

Mồi Số vạch phát hiện Số vạch đa hình

* Quần thể Đắc Lắc và Bình Phước, Trung Quốc 220 và Trung Quốc 250 có sự tương đồng di truyền khá cao, chứng tỏ chúng có nguồn gốc gần nhau

* Bên cạnh đó, quần thể Nha Trang và Tây Ninh là hai quần thể đứng gần nhau trong cây phát sinh loài, có thể xác nhận chúng là hai quần thể gần nhau về mặt di truyền

Hình 7 Các vạch DNA từ phản ứng RAPD trên mồi RAPD 4 (A), mồi RAPD 6 (B) và mồi RAPD 10 (C)

* Quần thể Philippine có khoảng cách di truyền xa với các quần thể khảo sát còn lại Chứng tỏ nguồn gốc của chúng xa nhau

Như vậy, kết quả khảo sát tính đa dạng di truyền của các quần thể dứa Cayenne

sử dụng kỹ thuật phân tích RAPD cho thấy có sự khác biệt nhau giữa các quần thể phân bố ở các vùng địa lý khác nhau, chứng tỏ có sự phân vùng giữa các quần thể Dứa Cayenne Bên cạnh đó, cũng có những quần thể cách nhau về mặt địa lý nhưng kết quả về mức tương đồng gen lại cao, chứng tỏ có thể nguồn gốc phát sinh của chúng gần nhau Quy trình thiết lập trong nghiên cứu cho phép xác định nguồn gốc các giống dứa Cayenne phân ly trong tự nhiên hoặc trong thời gian canh tác lâu dài trong một vùng địa lý, sinh thái khác biệt (Hình 8)

(A)

(B)

(C)

Hình 8 Phân nhóm các giống dứa theo nguồn gốc lấy mẫu dựa vào dữ liệu RAPD và phân tích theo UPGMA

Nội dung 2: Điều tra sâu bệnh, cỏ dại, thiên địch có ích trên dứa trồng tại thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh thành phía nam

Điều tra thành phần và xác định biến động về dân số của các tác nhân gây hại cho dứa là yêu cầu bắt buộc trước khi đề ra biện pháp phòng trừ các loại sâu bệnh hại chính có hiệu quả, làm giảm chi phí đầu tư tăng thu nhập cho người trồng dứa Kết quả nhiều nghiên cứu cho thấy, có sự lây nhiễm nguồn sâu bệnh qua hom, cây giống giữa các vùng trồng, từ đó cần thiết phải có những số liệu điều tra cơ bản về sâu bệnh hại trong từng vùng nhằm đề ra biện pháp hạn chế lây lan nguồn sâu bệnh hại

Thí nghiệm 2.1: Điều tra thành phần cỏ dại trên ruộng dứa

Mục đích: Cỏ dại là một trong những vấn đề gây trở ngại trong canh tác dứa hiện

nay, cỏ dại có thể làm giảm năng suất dứa trên 80% nếu không có biện pháp quản lý hợp lý (Brent, 2000) Thành phần cỏ dại trên dứa chưa được điều tra thống kê trước đây và tìm kiếm các biện pháp khác bổ sung cho quy trình phòng trừ cỏ dại là cần thiết trong định hướng phát triền cây dứa tại Tp Hồ Chí Minh

Thời gian: Tháng 5 năm 2004 đến 5 năm 2006

Người thực hiện: KS Nguyễn Hữu Trúc, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

Phương pháp nghiên cứu: Điều tra đồng ruộng và phân tích trong phòng thí nghiệm Mô tả thí nghiệm:

a, Đối tương thí nghiệm: Dứa Cayenne, cỏ dại trên ruộng dứa

b, Bố trí thí nghiệm: Chọn ruộng dứa theo các tuổi cây khác nhau tại các vùng dứa

nông trường và hộ cá thể ở Tp Hồ Chí Minh, Long An, Tiền Giang, và Đồng Nai Mỗi ruộng điều tra 8 điểm ngẫu nhiên bằng khung 1 m2 , không lặp lại Thu thập mẫu để phân loại theo tài liệu của Dương Văn Chín và cộng tác viên (2003)

c, Điều kiện thí nghiệm: Điều tra tất cả cỏ dại trong các tháng mùa mưa

d, Chỉ tiêu theo dõi: Ghi nhận thành phần, mật số và trọng lượng tươi của cỏ dại Kết quả thí nghiệm và thảo luận:

Thành phần cỏ dại trên ruộng dứa là một trong những chỉ tiêu quan trọng giúp đề xuất biện pháp quản lý hợp lý Chỉ tiêu này được điều tra ở các vùng trồng dứa tại

Tp Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận để ghi nhận tất cả các loài cỏ dại hiện diện trên ruộng, thành phần loài và mức độ phổ biến của cỏ dại trên ruộng dứa

Bảng 7 Thành phần và mức độ phổ biến của các loài cỏ dại trên ruộng dứa

Ruột gà Borreria latifolia (Aubl) Schum + + + -

(-): không hiện diện; (+): ít phổ biến, xuất hiện từ 1 – 25% mẫu quan sát; (++): phổ biến, xuất hiện từ 26-75% mẫu quan sát; (+++): rất phổ biến, xuất hiện > 76% mẫu quan sát, HCM: Thành phố Hồ Chí Minh; LA – TG: Long An – Tiền Giang; ĐN: Đồng Nai

Thành phần cỏ dại và mức độ phổ biến của chúng trên ruộng dứa phụ thuộc vào điều kiện sinh thái và trình độ canh tác của nông hộ trong từng vùng Ở Bình Chánh, Tp Hồ Chí Minh, thành phần cỏ dại trên ruộng dứa khá đa dạng, có khoảng

36 loài cỏ dại hiện diện nơi đây, trong đó rất phổ biến như: màng màng tím (Cleome rutidosperma DC.); Lồng vực cạn [Echinochloa colona (L.) Link]; Cỏ chác [Fimbristylis miliacea (L.) Vahl] (Hình 9)

Cỏ lồng vực cạn (Echinochloa colona) Cỏ chác (Fimbristylis miliacea)

Cỏ ruột gà (Borreria latifolia) Cỏ màng màng tím (Cleome rutidosperma)

Rau mương (Ludwigia octovalvis) Cú ma (Cyperus polystachyos)

Hình 9 Một số hình ảnh các loài cỏ dại phát triển trên ruộng dứa Cayenne trồng tại Bình Chánh-thành phố Hồ Chí Minh, điều tra năm 2004-2006

Trong khi đó, ở khu vực Đồng Nai (chủ yếu là ở Nông trường Thọ Vực) số loài cỏ dại hiện diện trên ruộng dứa ít hơn, chỉ khoảng 24 loài nhưng sự hiện diện của chúng chỉ ở mức ít phổ biến Tại nông trường Thọ Vực hầu hết diện tích dứa đều có phủ bạt và tưới nhỏ giọt nên đã giảm cỏ dại cả về thành phần loài lẫn mật số của chúng Ngược lại ở Tp Hồ Chí Minh, diện tích dứa mới phát triển trong một vài năm trở lại đây, ngoài ở các nông trường, nông dân trồng dứa còn thiếu kinh nghiệm trong việc thâm canh, đặc biệt là việc phòng trừ cỏ dại Hơn nữa, do công tác quản lý, triển khai về việc cho nông dân vay vốn trồng dứa còn nhiều bất cập nên nông dân không nhận kinh phí kịp thời để mua các vật tư trồng dứa cho đúng thời vụ, trong đó có bạt nhựa phủ đất để trừ cỏ, dẫn đến nhiều hộ dân trồng dứa không phủ bạt nên cỏ dại phát triển với thành phần và mật số cao Riêng khu vực trồng dứa ở Tiền Giang – Long An do có điều kiện sinh thái gần giống với khu vực trồng dứa ở Bình Chánh -

Tp Hồ Chí Minh nên có thành phần cỏ dại gần giống với khu vực TP Hồ Chí Minh Tuy nhiên, mức độ phổ biến của các loài cỏ thấp hơn Ở đây, phần lớn dứa được trồng trong các nông trường (NT Tân Lập), thăm canh cao và có phủ bạt nên đã hạn chế được cỏ dại

Thí nghiệm 2.2: Điều tra sâu hại và thiên địch của chúng trên dứa Cayenne Mục đích: Xác định thành phần côn trùng hiện diện trên ruộng dứa và các loài thiên

địch của chúng nhằm cung cấp những hiểu biết cơ bản về sinh thái ruộng dứa trong quan hệ với sinh vật gây hại và có ích

Người thực hiện: PSG.TS Nguyễn Thị Chắt và cộng sự, Đại học Nông Lâm

Thời gian: Tháng 12 năm 2005 đến tháng 7 năm 2006

Phương pháp nghiên cứu: Điều tra đồng ruộng và phân tích trong phòng thí nghiệm Mô tả thí nghiệm:

a, Đối tượng thí nghiệm: Sâu hại trên dứa Cayenne, thiên địch các loại trên dứa

b, Bố trí thí nghiệm: Thực hiện các điều tra trên ruộng dứa trồng tại nông trường Lê

Minh Xuân, Bình Chánh, Tp Hồ Chí Minh, theo ‛Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng‛ do Viện bảo Vệ thực Vật ban hành năm

1997, nhà xuất bản Nông nghiệp Dựa vào tuổi dứa trồng tại nông trường, chọn 3 độ tuổi cây 9, 16, và 24 tháng sau trồng, để quan sát thu thập mẫu côn trùng gây hại và thiên địch Chọn 3 ruộng ngẫu nhiên có diện tích >5 000 m2 thực hiện điều tra trong 9 điểm ngẫu nhiên, 5 cây tại 1 điểm Mười ngày điều tra 1 lần trên ruộng không lặp lại và một số vườn của nông dân nhằm bổ sung kết quả Thiết lập các ‚bẫy hầm‛ tại 3 ruộng dứa cho mỗi độ tuổi cây; 4 bẫy/điểm x 5 điểm/ruộng, nhằm thu thập côn trùng hoạt động trên mặt đất trong ruộng dứa Bẫy được thiết kế theo tài liệu của Kitching (2000), bằng những ống nhựa cao 17 cm, đường kính 5 cm, chứa dung dịch cồn 700

khoảng 1/3 thể tích bẫy Chôn ống xuống đất sao cho miệng ống ngang với mặt đất và che bẫy bằng miếng mica diện tích 100cm2 Thu mẫu sau 1 ngày đặt bẫy và xử lý định danh mẫu tại bộ môn Bảo vệ thực vật, Đại học Nông Lâm dựa vào tài liệu phân loại

của Onoyama và cs (2003), Brian Taylor (2006), Eguchi và cs (2005), Nguyễn Văn Huỳnh (2002), và các tài liệu chuyên ngành được tổng hợp.

c Điều kiện thí nghiệm: Thực hiện trên dứa Cayenne vào mùa khô và đầu mưa, định

danh mẫu côn trùng và thiên địch theo tài liệu tìm thấy từ nhiều nguồn khác nhau

d Các chỉ tiêu theo dõi: Ghi nhận thành phần sâu hại và thiên địch, vị trí gây hại, và

tần số xuất hiện [(TSXH% = điểm điều tra xuất hiện/tổng số điểm điều tra) x 100]

Kết quả thí nghiệm và thảo luận:

Kết quả điều tra xác nhận sự hiện diện của 9 tác nhân gây hại thuộc 4 bộ khác nhau trên dứa Các tác nhân ký sinh hay gây hại từ gốc tới trái dứa trong điều kiện đồng ruộng và xuất hiện nhiều là rệp sáp giả dứa màu hồng và nhện đỏ (Bảng 8) Các loài ruồi đục quả ký sinh trên trái dứa hay các loài rệp ký sinh trên lá đều làm giảm sức khỏe của cây và chất lượng của trái Bên cạnh, trên ruộng dứa đã ghi nhận được một loài sâu bộ chân dệt, chúng sống và hoạt động trong khe giữa các mắt trái dứa Đối tượng côn trùng có thể gây hại cho dứa trồng tại Tp Hồ Chí Minh là rệp sáp giả dứa màu hồng, nhện đỏ, rệp sáp giả màu xám và rệp vảy tròn (Hình 10)

Bảng 8 Sâu hại và mức độ xuất hiện của chúng trên dứa Cayenne trồng tại nông trường Lê Minh Xuân, Bình Chánh, Tp Hồ Chí Minh

Vị trí trên cây

1 Rệp sáp giả

dứa màu hồng

Dysmicoccus brevipes Ckll

(Pseudococcidae-Homoptera)

XXX Gốc, trái,

bẹ lá

2 Rệp sáp giả

dứa màu xám Dysmicoccus neobrevipes Beard (Pseudococcidae-Homoptera) XX Trái, bẹ lá

3 Rệp sáp giả

vằn Ferrisia virgata Ckll (Pseudococcidae-Homoptera) X Trái

4 Rệp vảy nâu

tròn Melanaspis bromelia Leornadi (Diaspididae-Homoptera) X Lá, bẹ lá

5 Rệp vảy tròn

xám trắng

Diaspis bromelia Kerner

(Diaspididae-Homoptera)

XX Lá, bẹ lá

6 Ruồi đục trái

1.Nhện đỏ Dolichotetranychus floridanus 2 Rệp sáp giả vằn Ferrisia virgata

3.Rệp sáp giả Dysmicoccus brevipes, (b) Rệp sáp giả Dysmicoccus neobrevipes

4 Rệp Diaspis bromeliae Kerner 5 Rệp Melanaspis bromeliae Leornadi

6 Ruồi Bactrocera dorsalis Hend 7 Ruồi Bactrocera correcta Bezzi

Hình 10 Côn trùng hại dứa Cayenne trồng tại nông trường Lê Minh Xuân, Bình Chánh, Tp Hồ Chí Minh

Bảng 9 Một số loài thiên địch và mức độ xuất hiện của chúng trên ruộng dứa Cayenne trồng tại nông trường Lê Minh Xuân, Bình Chánh, Hồ Chí Minh

Vị trí phát hiện

1 Nhện giả kiến

2 Nhện đinh ba Pardosa pseudoannulata Boesenberg

10 Bọ cánh cụt Paederus furcipes Curtis

11 Bọ chân chạy

đốm vàng Planetes pronticeps And (Carabidae-Coleoptera) 30,0 Bẫy hầm

12 Bọ chân chạy

2 đốm vàng Chlaenius bimaculatus Dej (Carabidae-Coleoptera) 2,8 Gốc dứa

13 Bọ rùa 6 vệt Coccinella transversalis Fab

Kết quả điều tra ghi nhận sự hiện diện của 14 loài thiên địch trên ruộng dứa gồm 8 loài vào bẫy hầm và 6 loài quan sát trực tiếp trên cây dứa Nhện linh miêu

Oxyopes sp xuất hiện nhiều trong mẫu kế đến là nhện đinh ba Pardosa pseudoannulata Đã ghi nhận 6 loài bọ cánh cứng trong đó có 2 loài bọ rùa

Coccinellidae, tuy nhiên chúng xuất hiện không nhiều tại các điểm điều tra Xác nhận

có 2 loài bọ xít ăn mồi là bọ xít mép trắng Andrallus spinidens và bọ xít bắt mồi Rhynocoris sp trên ruộng dứa Mặc dù tần số xuất hiện thấp nhưng chúng được xem

là loài thiên địch khá phổ biến trên các cây trồng khác Các loài thiên địch ghi nhận trong ruộng dứa là loài đa thực, ăn được nhiều loại mồi và xuất hiện trên nhiều cây trồng khác như lúa, cây ăn quả và cây công nghiệp Vai trò của các loài thiên địch

này trong việc khống chế các loài rệp gây hại trên dứa chưa được xác nhận và đánh giá trong nghiên cứu này Sự xuất hiện của chúng làm tăng sự đa dạng về thành phần côn trùng trong ruộng dứa và là yếu tố quan trọng trong đánh giá mức độ tốt hay xấu của những tác động từ các biện pháp canh tác cây dứa hiện nay (Bảng 9)

Mô tả hình thái côn trùng thiên địch được ghi nhận

Nhện giả kiến đen Myrmarachne bidentata Banks (Salticidae-Arachnida)

Hình dáng bên ngoài giống kiến đen, có chiều dài 7-8 mm, đầu-ngực dài hơn bụng và nhỏ dần về phía bụng Mắt bên phải khá lớn, màu trắng đặc biệt Bụng hình bầu dục, chân trước có đốt đùi màu đen, chân giữa và chân sau đốt đùi, đốt cẳng và đốt bàn trong màu đen, các đốt khác màu vàng nhạt (Hình 11.1) Mô tả này phù hợp với mô tả bỡi Nguyễn Văn Huỳnh (2002)

Nhện ánh kim Phintella spp (Salticidae-Arachnida) (Hình 11.2)

Nhện có màu đen và có ánh kim loại, dài 4-5 mm, đầu-ngực to hơn bụng Chân dài, đốt đùi và đốt chày màu nâu đen, các đốt khác màu vàng nâu Bốn mắt trước to hơn các mắt bên Cuối bụng có 4 ống nhả tơ Nhện xuất hiện trong ruộng dứa rất phổ biến vớt tần số xuất hiện 78,2%

Nhện đinh ba Pardosa pseudoannulata Boesenberg & Trand (Lycosidae-Araneae)

Nhện có màu nâu xám hay nâu đậm, có chiều dài 7-9 mm, trên lưng đầu-ngực có vệt màu xám trắng hình chữ ‚Y‛ chạy dọc ở giữa, hai bên có 2 vệt màu nhạt hơn, thoáng nhìn rất giống ‚chạc ba‛ Bụng hình ovan, phần lưng bụng màu nâu đậm có 5 sọc ngang màu nhạt hơn nhưng không liên tục, chân và cẳng chân có nhiều gai Nhiện xuất hiện trong 83,3% bẫy và chiếm 30,6% trong các loài nhện vào bẫy (Hình 11.3)

Nhện linh miêu Oxyopes sp (Oxyopidae-Araneae) (Hình 11.4)

Nhện có màu nâu hơi xanh, dài 7-8 mm, con cái có bụng to, con đực có bụng nhỏ và thon dài Mắt trên đầu-ngực xếp theo hình lục giác, hai bên bụng có vệt nâu đậm chạy dọc Chân có nhiều gai Nhện tìm thấy phổ biến trong 91,6% bẫy hầm và trên cây dứa cũng như các cây trồng xung quanh ruộng

Bọ cánh cứng Pheropsophus jessoensis Morawitz (Cicindellidae-Coleoptera)

Con trưởng thành thuốc bộ cánh cứng Coleoptera, thường vào bẫy hầm, chiều dài cơ thể 63 13-18 mm Ngực trước màu nâu vàng có vệt nâu đen hình chữ ‚I‛, giữa 2 mắt kép có đốm nâu đen Râu đầu hình sợi chỉ, gốc râu nằm dưới mắt kép và phía trên chân hàm Cánh cứng màu nâu đen, gốc cánh trước có vệt nâu vàng nhỏ hơn vệt nâu vàng giữa cánh cứng (Hình 11.9)

Bọ chân chạy Planetes pronticeps And (Carabidae-Coleoptera) (Hình 11.8)

Trưởng thành bọ chân chạy có chiều dài 13-15 mm, toàn thân màu nâu xám, riêng chân và râu có màu nâu vàng Chiều ngang của ngực trước lớn hơn chiều ngang của đầu bao gồm cả mắt kép Mắt kép to lồi sang hai bên, bàn chân có 5 đốt Cánh cứng có nhiều vân nổi chạy dọc cánh, giữa cánh cứng có 2 đốm nâu vàng

1 Myrmarachne bidentata Banks 2 Phintella spp 3 Pardosa pseudoannulata

4 Oxyopes sp 5 Coccinella transversalis Fab 6 Chlaenius bimaculatus Dej.

7 Scymmus frontalis 8 Planetes pronticeps And 9 Pheropsophus jessoensis Mor

Hình 11 Hình ảnh côn trùng thiên địch trên dứa Cayenne trồng tại nông trường Lê Minh Xuân, Bình Chánh, Tp Hồ Chí Minh

Bọ chân chạy 2 đốm vàng Chlaenius bimaculatus Dej (Carabidae-Coleoptera)

Thành trùng có màu nâu đen hoặc đen, hơi bóng Chiều dài cơ thể 12-13 mm, râu đầu dạng sợi chỉ, ngực trước rộng hơn đầu bao gồm cả mắt kép Trên cánh có nhiều vân nổi, gần cuối cánh cứng có hai đốm tròn nâu vàng Bàn chân có 5 đốt Bọ quan sát thấy vùng gốc dứa, tần số xuất hiện thấp (Hình 11.6)

Bọ cánh cụt Paederus furcipes Curtis (Staphylinidae-Coleoptera)

Có chiều dài cơ thể 15-18 mm màu nâu vàng ngoại trừ đốt cuối bụng, đầu và cánh Cánh cứng có màu đen và có ánh kim, cánh chỉ che khoảng 2 đốt bụng Ngực trước hình trứng hơi dài màu nâu vàng, mép trước hơi rộng hơn mép sau Chân màu nâu vàng, riêng đầu đốt đùi chân sau màu nâu đen Bọ vào bẫy với 23,2% tần số

Bọ rùa 6 vệt Coccinella transversalis Fab (Coccinellidae-Coleoptera) (Hình 11.5)

Chiều dài cơ thể 2-3 mm, hình bầu dục, mặt lưng cơ thể vồng lên hình bán cầu, mặt bụng phẳng Ngực trước hơi chùm lên đầu, mép trước ngực trước có vệt nâu vàng, mép dưới ngực trước màu đen Cánh cứng màu vàng hoặc màu đỏ cam, mỗi bên cánh có vệt đen hơi giống hình chữ ‘Y’, phía dưới có vệt đen hình sóng, phía cuối cánh có 2 vệt đen nhỏ Gốc cánh cứng, sát mép sau ngực trước một đốm đen nằm giữa 2 cánh

Bọ rùa 4 chấm Scymmus frontalis (Coccinellidae-Coleoptera) (Hình 11.7)

Kích thước nhỏ 1,5-1,8 x 1,2-1,3 mm, hình ovan, màu nâu đen, trên cánh cứng có 4 vệt nâu vàng Mép trước ngực có vệt nâu vàng Bọ 4 chấm xuất hiện nhiều trong ruộng dứa vào tháng 6 và 7, là loài ăn mồi khá phổ biến

Thí nghiệm 2.3 Xác định thành phần kiến hiện diện trên ruộng dứa Cayenne và mối liên quan giữa kiến và rệp sáp giả trên ruộng dứa

Mục đích: Xác định biến động mật số và thành phần kiến, tác nhân giúp phát tán

nhanh rệp sáp, trong ruộng dứa vùng Bình Chánh Bên cạnh bước đầu điều tra sự hiện diện đồng thời giữa kiến và rệp trên cùng cây hoặc trong ruộng dứa

Người thực hiện: PSG.TS Nguyễn Thị Chắt và cộng sự, Đại học Nông Lâm

Thời gian: Tháng 12 năm 2005 đến tháng 7 năm 2006

Phương pháp nghiên cứu: Điều tra đồng ruộng và phân tích trong phòng thí nghiệm Mô tả thí nghiệm:

a Đối tượng thí nghiệm: Các loài kiến trên ruộng dứa

b Bố trí thí nghiệm: Thực hiện các điều tra trên ruộng dứa trồng tại nông trường Lê

Minh Xuân, Bình Chánh, Tp Hồ Chí Minh, theo ‛Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng‛ do Viện Bảo vệ Thực vật ban hành năm

1997, nhà xuất bản Nông nghiệp Dựa vào tuổi dứa trồng tại nông trường, chọn 3 ruộng cố định với diện tích 1ha đại diện cho 3 độ tuổi cây 9, 16, và 24 tháng sau trồng để thí nghiệm Mười ngày điều tra 1 lần tại 5 điểm theo hình Z, thu mẫu kiến bằng cách đặt 1 bẫy hầm và bẫy bã tại vị trí theo dõi, kèm theo việc quan sát trên cây lấy mẫu và vùng gốc cây

b Điều kiện thí nghiệm: Thực hiện điều tra vào mùa khô và đầu mưa

c Các chỉ tiêu theo dõi: Xác định thành phần và mô tả hình thái của các loài kiến

theo tài liệu phân loại của Onoyama và cs (2003), Brian Taylor (2006), Eguchi và cs (2005), Nguyễn Văn Huỳnh (2002), và các tài liệu chuyên ngành được tổng hợp.

Kết quả thí nghiệm và thảo luận:

Kiến được xem là nguyên nhân giúp cho sự phát tán của rệp sáp giả ở tuổi lớn trong ruộng dứa (Rohrbach G và cs, 1998) Qua điều tra đã ghi nhận 11 loài kiến hiện diện trong ruộng dứa Cayenne trồng tại Bình Chánh Chúng được phân bố trong 4 họ

phụ Formicinae, Myrmicinae, Dolichoderinae, và Ponerinae Mức độ xuất hiện và

thành phần các loài kiến trên ruộng dứa biến động tùy thuộc vào độ tuổi của dứa Cayenne (Bảng 10)

Bảng 10 Một số loài kiến và mức độ xuất hiện của chúng trên ruộng dứa Cayenne trồng tại nông trường Lê Minh Xuân, Bình Chánh, Tp Hồ Chí Minh

TSXH (%)

TLHD (%)

TSXH (%)

TLHD (%)

1 Kiến xám đen Diacamma sp

6 Kiến hôi vàng

chân dài Anoplolepis gracilipes

Ở dứa 9 tháng tuổi ghi nhận được 8 loài, trong đó loài kiến lửa nhỏ phủ lông

Tetramorium sp xuất hiện nhiều nhất (60%) và phổ biến trong ruộng Trên dứa 16 tháng tuổi ghi nhận 9 loài, trong đó Tetramorium sp và kiến hôi Paratrechina sp xuất hiện nhiều Ở ruộng 24 tháng tuổi, Tetramorium sp., Paratrechina sp., Diacamma sp., Camponotus sp., và Anoplolepis spp có tần số xuất hiện lớn hơn 60% Kết quả cũng cho thấy kiến Oecophylla smaragdina Fab chỉ xuất hiện khi dứa đã có trái và kiến Tetranorium sp có tỉ lệ hiện diện cao nhất trong ruộng dứa, và kiến tìm kiếm

thức ăn dưới mặt đất và trong tán cây, xuất hiện thành đám Những nghiên cứu của

Kenneth (1998) và Rohrbach (1998) cho rằng kiến đầu to Pheidole megacephala, kiến Iridomyrmex humillis, và Solenopsis geminata là tác nhân phát tán rệp sáp giả trên

dứa Ba loài kiến này không tìm thấy trong ruộng dứa tại Bình Chánh, Tp Hồ Chí Minh, và 11 loài kiến ghi nhận được cần xem xét vai trò của chúng trong mối quan hệ với rệp sáp và bệnh do vi rút gây ra trên dứa hiện nay

Bảng 11 Xác định sự hiện diện đồng thới giữa kiến và rệp sáp trên dứa Thời điểm

theo dõi(*)

Dứa 6 tháng tuổi Dứa 16 tháng tuổi Dứa 24 tháng tuổi

Tỉ lệ bẹ

bị rệp (%)

TSXH của kiến trên bẹ (%)

Tỉ lệ trái

bị rệp (%)

TSXH của kiến trên trái (%)

Tỉ lệ trái bị rệp (%)

TSXH của kiến trên trái (%)

trái dứa Mùa mưa tỉ lệ rệp dưới gốc giảm mạnh và kiến cũng có xu hướng cư trú và tìm nguồn thức ăn ở phần cao hơn của cây dứa

Bước đầu xác định các mối tương quan giữa rệp và kiến qua giá trị tỉ lệ hại và tần số xuất hiện, cho thấy có tương quan chặt giữa 2 giá trị điều tra này theo độ tuổi của dứa Cayenne trên đồng ruộng Ở dứa 6 tháng tuổi có r (tính) = 0.623; y = 3.82+0.31x ; dứa 16 tháng r (tính) = 0.898; y = 4.33+0.28x ; dứa 24 tháng r (tính) = 0.964 ; y = 6.26+0.17x (Phụ lục 4)

Mô tả hình thái các loại kiến được ghi nhận

Kiến xám đen Diacamma sp (Ponerinae-Formicidae) (Hình 12.1)

Kiến thợ có ánh kim xanh, dài khoảng 10 mm, da cơ thể cứng ráp, đầu có 12 đốt, đốt chân râu dài qua mép sau đầu Bụng một đốt chuyển, trên đốt chuyển có 2 gai nhọn, ở đốt bụng cuối có gai dài, đốt bụng thứ 2 không uốn cong Hàm trên hơi giống hình tam giác , môi trên hình tam giác Phần tiếp giáp giữa đốt chuyển bụng và bụng hẹp

Kiến gỗ Camponotus sp (Formicinae-Formicidae) (Hình 12.2)

Kiến thợ có màu nâu đen, dài khoảng 7-9 mm, bụng có một đốt chuyển, không có gai

ở đốt bụng cuối cùng mà chỉ có một chùm lông Râu đầu 12 đốt, đốt chân râu dài hơn đầu Râu hàm dưới có 4 đốt, hàm trên có 5-6 răng

Kiến hôi vàng chân dài Anoplolepis gracilipes (Formicinae-Formicidae) (Hình 12.3)

Kiến thợ có màu nâu vàng, dài khoảng 4-5 mm, bụng có một đốt chuyển, không có gai ở đốt bụng cuối cùng mà chỉ có một chùm lông Râu đầu 11 đốt, đốt chân râu dài hơn đầu 2-3 lần Đốt ngực trước hẹp, ngực giữa lõm hình yên ngựa

Kiến chân dài nâu đen Anoplolepis sp (Formicinae-Formicidae) (Hình 12.4)

Kiến thợ có màu nâu nhạt, dài khoảng 9 mm, bụng có một đốt chuyển, có một chùm lông Râu đầu 12 đốt, mặt lưng của đốt ngực cuối gồ lên, râu hàm dưới có 4 đốt, hàm trên có 6 răng nhỏ Chân dài, cuối đốt đùi có 2 gai nhọn, cuối đốt chày có 1 gai lớn và

3 gai nhỏ

Kiến hôi Paratrechina sp (Formicinae-Formicidae) (Hình 12.5)

Kiến thợ có màu nâu đen phía lưng, dài khoảng 2,5-3,0 mm, cơ thể có nhiều lông, bụng có một đốt chuyển Râu đầu 12 đốt, đốt chân râu dài quá mép sau của đầu, hàm trên có 6 răng nhỏ

Kiến lửa nhỏ phủ lông Tetramorium sp (Myrmicinae-Formicidae) (Hình 12.6)

Kiến thợ có màu nâu vàng, đầu và lưng ngực, lưng bụng màu nâu đậm, dài khoảng

2-3 mm, bụng có hai đốt chuyển Đốt ngực sau có 2 gai nhỏ Râu đầu 12 đốt, chùy 2-3 đốt, hàm trên có 6 răng nhỏ và tương đối đều nhau

Kiến Pharaoh Monomorium pharaonis L (Myrmicinae-Formicidae) (Hình 12.7)

Kiến thợ nhỏ có màu nâu đen, dài khoảng 2-2,5 mm, râu đầu dạng dùi trống 12 đốt, chùy 3 đốt Bụng có hai đốt chuyển, đốt chuyển trước lớn hơn đốt chuyển sau Đốt chuyển sau gắn với bụng qua cuống đốt chuyển rất hẹp Phía trán của đầu khá bóng

3 Kiến hôi vàng chân dài Anoplolepis gracilipes F.Smith, (a) cơ thể kiến, (b) đầu và ngực

4 Kiến chân dài nâu Anoplolepis sp., (a) cơ thể kiến và cuối đốt chày chân giữa, (b) hàm

trên của kiến

a

5 Kiến hôi Paratrechina sp., (a) nhìn nghiêng, (b) nhìn phía lưng

6 Kiến lửa Tetramorium sp., (a) cơ thể kiến và đốt chuyển bụng, (b) đầu và râu đầu

7 Kiến Monomorium pharaonis L., (a) cơ thể (b) râu đầu và đốt chuyển ngực-bụng

8 Kiến vàng Oecophylla smaragdina Fab., (a) cơ thể và đốt chuyển bụng, (b) đầu kiến

9 Kiến đầu to Pheidole noda F.Smith, (a) cơ thể và 2 đốt chuyển bụng, (b) đầu và râu

10 Kiến đen bóng Ochetella sp., (a) cơ thể kiến, (b) ngực, bụng và đốt chuyển bụng,

(c) đốt cuối bụng

11 Kiến đen ráp Dolichoderus sp., (a) cơ thể kiến, (b) đầu và râu kiến, (c) hàm trên

Hình 12 Hình ảnh các loài kiến tìm thấy trên ruộng dứa Cayenne trồng tại thành phố Hồ Chí Minh , điều tra năm 2004-2007

Kiến vàng Oecophylla smaragdina Fab (Formicinae-Formicidae) (Hình 12.8)

Kiến thợ màu nâu vàng, dài 8-9 mm, Bụng một đốt chuyển, đốt chuyển dài, nhỏ, và uốn thấp Đốt bụng cuối cùng có chùm lông Râu đầu 12 đốt, đốt đầu tiên dài hơn đốt

2 và 3 cộng lại Môi trên lớn hơi cong, hàm trên dài hình tam giác có nhiều răng nhỏ, răng cuốn cong và đan vào nhau khi nghỉ Mắt kép lớn, đốt chày chân trước có cựa lớn, râu hàm dưới 2 đốt

Kiến đầu to Pheidole noda F Smith (Myrmicinae-Formicidae) (Hình 12.9)

Kiến thợ có màu nâu đen, nhất là đầu và lưng bụng, cơ thể dài 4,5-5,0 mm Bụng có 2 đốt chuyển, đốt trước nhỏ và đốt sau lớn Đốt chuyển sau bị chẻ hai bên và có gai nhọn Râu đầu 12 đốt, chùy 3 đốt Đầu to chẻ ở giữa, hàm trên có 4 răng, đốt chày chân trước có cựa to

Kiến đen bóng Ochetellus sp (Dolichoderinae-Formicidae) (Hình 12.10)

Kiến thợ có màu đen, chân vàng, dài khoảng 5 mm Bụng một đốt chuyển và trên đốt chuyển có hai gai Đốt bụng cuối có sự sắp xếp của pygydium Râu đầu 12 đốt

Kiến đen ráp Dolichoderus sp (Dolichoderinae-Formicidae) (Hình 12.11)

Kiến thợ có màu đen, da có ráp có nhiều vân lồi lõm, đầu và lưng bụng màu đen, cơ thể dài 3,0-3,5 mm Bụng có một đốt chuyển Hàm trên hơi hình tam giác, có 2 răng lớn và nhiều răng nhỏ kế theo Mép sau đầu hơi lõm, đốt chân râu dài quá mép sau đầu Ngực trước và giữa hơi nhô cao, ngực sau lõm hình yên ngựa, đốt ngực cuối hơi vuông

Thí nghiệm 2.4: Mức độ gây hại của rệp sáp Dysmicoccus brevipes - loài sâu hại

phổ biến trên cây dứa ở Tp Hồ Chí Minh

Mục đích: Điều tra xác định diễn biến mật số rệp sáp giả trên vùng dứa Tp Hồ Chí

Minh, nhằm bổ sung cho những hiểu biết về sự định cư gây hại của chúng và xác định thời điểm tác động các biện pháp phòng trừ loại dịch hại này trên dứa Cayenne

Thời gian: Từ năm 2004 đến 2006

Người thực hiện: Th.S Trần Thị Thiên An và cộng sự, PSG.TS Nguyễn Thị Chắt và

cộng sự, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

Phương pháp nghiên cứu: Điều tra đồng ruộng và phân tích trong phòng thí nghiệm Mô tả thí nghiệm:

a, Đối tương thí nghiệm: Dứa Cayenne, rệp sáp hại dứa

b, Bố trí thí nghiệm: Tiến hành chọn ruộng dứa đại diện cho thời gian sinh trưởng

của cây, của giống, thời vụ, điều tra mỗi ruộng 5 điểm cố định trên 2 đường chéo góc, mỗi điểm 5 cây với thời gian theo dõi định kì 15 ngày/ lần

c, Điều kiện thí nghiệm: Điều tra trên thực tế đồng ruộng

d, Chỉ tiêu theo dõi: Mật số rệp sáp giả dứa/cây, tỉ lệ cây bị hại (%) = (Số cây bị hại

/Tổng số cây điều tra) x100

Kết quả thí nghiệm và thảo luận:

Kết quả điều tra thực tế các hộ nông dân và cán bộ kĩ thuật của các nông

trường Phạm Văn Hai, Lê Minh Xuân và Delta đã cho biết, trong năm, rệp sáp

Dysmicoccus brevipes thường phát sinh gây hại trên ruộng dứa chủ yếu vào mùa khô,

vì mùa mưa vùng đất trồng dứa thấp, quá ẩm ướt không phù hợp cho rệp phát triển

(Hình 13)

Bảng 12 Mức độ gây hại của rệp sáp Dysmicoccus brevipes tại tp Hồ Chí Minh

Thời gian

điều tra

Tỉ lệ cây bị hại (%) Mật độ D brevipes

(con/gốc bẹ lá) Dứa tơ

(< 9 TST)

Dứa cho trái (>12 TST)

Dứa tơ (< 9 TST)

Dứa cho trái (< 12 TST)

TST: Tháng sau trồng ; Số liệu: trung bình của 2 lần điều tra trong 1 tháng Mật độ

rệp được tính đối với cả rệp non và rệp trưởng thành Số cây điều tra 215 cho mỗi tuổi dứa.

Hình 13 Vị trí định cư và gây hại của rệp sáp giả dứa. a và b, rệp định cư trên trái và

gốc trái Dysmicoccus neobrevipes; c và d, rệp định cư trê gốc cây và trên rễ dứa Cayenne