Sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học từ dịch chiết lá cây thầu dầu ricinus communis và lá cây thuốc cá deris scandens ứng dụng trong phòng trừ bọ phấn bemisia tabaci hại cây trồng

Hàm lượng Ricin, Rotenone trong dịch chiết lá cây thầu dầu, lá cây thuốc cá bằng các phương pháp chiết khác nhau.... TÓM TẮT Nhiệm vụ KHCN cấp cơ sở “Sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh họ

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO

SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ

DỊCH CHIẾT LÁ CÂY THẦU DẦU (Ricinus communis)

VÀ LÁ CÂY THUỐC CÁ (Derris scandens) ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ BỌ PHẤN (Bemisia tabaci) HẠI

CÂY TRỒNG

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO

SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ DỊCH CHIẾT

LÁ CÂY THẦU DẦU (Ricinus communis) VÀ LÁ CÂY THUỐC CÁ (Derris scandens) ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ BỌ PHẤN (Bemisia tabaci)

MỤC LỤC

TÓM TẮT v

THÔNG TIN CHUNG VỀ NHIỆM VỤ vi

PHẦN MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của nhiệm vụ 1

2 Mục tiêu cuả nhiệm vụ 2

3 Giới hạn của nghiên cứu 2

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về Ricin trong cây thầu dầu ( Ricinus communis) 3

1.2 Tổng quan về cây thuốc cá (Derris scandens) 5

1.3 Phát sinh gây hại của bọ phấn (Bemisia tabaci) 9

1.4 Giới thiệu một số phương pháp chiết 14

1.5 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới 19

CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Nội dung nghiên cứu 24

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24

2.3 Vật liệu nghiên cứu 25

2.4 Phương pháp nghiên cứu 26

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Thử nghiệm các phương pháp chiết khác nhau 33

3.2.Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến chất lượn dịch chiết 36

3.3.Khảo sát khả năng diệt trừ bọ phấn (Bemisia tabaci)của dịch chiết lá cây thầu dầu (R Communis) kết hợp với dịch chiết của các lá cây thuốc cá (Derris scandens) 40

3.4.Thí nghiệm khảo sát khả năng diệt trừ sâu của hỗn hợp dịch chiết sau khi

phối trộn với các loại phụ gia khác nhau 46

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

4.1 Kết luận 50

4.2 Kiến nghị 50

Tài liệu tham khảo 51

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cành, hoa của cây thầu dầu (R cummunis) 3

Hình 1.2 Cấu trúc của ricin 4

Hình 1.3 Cây thuốc cá (Derris scandens) 5

Hình 1.4 Phân tử rotenone 7

Hình 1.5 Ba pha phát dục của bọ phấn 9

Hình 1.6 Bọ phấn chích hút nhựa lá cây gây nên bệnh xoăn đọt 11

Hình 1.7 Bệnh khảm xoăn lá ở dưa do bọ phấn môi giới truyền Virus 11

Hình 2.1 Quy trình xử lý lá cây trước khi tách chiết 26

Hình 2.2 Tủ nuôi bọ phấn 30

Hình 2.3 Bọ phấn được nuôi trong lồng nuôi 32

Hình 3.1 Bột lá trước và sau khi chiết 34

Hình 3.2 Dịch chiết lá cây thầu dầu, lá cây thuốc cá sau cô quay chân không 36

Hình 3.3 Chạy máy cô quay chân không loại bỏ dung môi trong dịch chiết 37

Hình 3.4 Biểu đồ hàm lượng Ricin thu được ở các tỉ lệ dung môi chiết khác nhau 39

Hình 3.5 Khoai tây không ngâm dịch chiết lá, khoai tây ngâm dịch chiết lá cây 41

Hình 3.6 Bọ phấn chết được quan sát qua kính hiển vi soi nổi 42

Hình 3.7 Phòng nuôi bọ phấn thí nghiệm tỉ lệ pha trộn 2 loại dịch chiết lá cây thầu dầu, lá cây thuốc cá 42

Hình 3.8 Bọ phấn không di chuyển bám vào nắp lồng nuôi 43

Hình 3.9 Bọ phấn chết ở các công thức pha trộn dịch chiết lá khác nhau 45

Hình 3.10 Tủ nuôi bọ phấn 47

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Hàm lượng Ricin, Rotenone trong dịch chiết lá cây thầu dầu, lá cây thuốc cá bằng các phương pháp chiết khác nhau 35 Bảng 3.2 Hàm lượng Ricin thu được ở các tỉ lệ dung môi/nguyên liệu khác nhau 38 Bảng 3.3 Hàm lượng Rotenone thu được ở các tỉ lệ dung môi/nguyên liệu khác nhau 39 Bảng 3.4 Hiệu lực diệt trừ bọ phấn ở các tỉ lệ phối trộn khác nhau 44 Bảng 3.5 Hiệu lực của thuốc sau khi phối trộn với các loại phụ gia khác nhau 48

TÓM TẮT

Nhiệm vụ KHCN cấp cơ sở “Sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học từ

dịch chiết lá cây thầu dầu (Ricinus communis) và lá cây thuốc cá

(Derrisscandens) ứng dụng trong phòng trừ bọ phấn (Bemisia tabaci) hại cây

trồng”gồm 2 giai đoạn: Giai đoạn 1: Xây dựng được quy trình tách chiết hoạt chất có chứa ricin, rotenone từ lá cây thầu dầu, lá cây thuốc cá ( năm 2018) Giai đoạn 2: Đánh giá hiệu lực của sản phẩm ngoài đồng ruộng ( năm 2019)

Giai đoạn 1 được thực hiện từ tháng 1/2018 đến tháng 12/2018 tại Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao đã thu được các kết quả sau: Sản phẩm dịch chiết lá cây được xác định bằng máy sắc kí lỏng cao áp

có hàm lượng ricin: 30,51 g/L; hàm lượng rotenone: 205 mg/L Quy trình tách chiết hoạt chất chưa ricin, rotenone từ lá cây thầu dầu, lá cây thuốc cá Lá cây sau khi xử lý được sấy ở 500C đến khi lá cây đạt độ ẩm khoảng 12%-13%, xay nhỏ thành bột 6 Kg bột lá cây được trộn với 24 lít dung dịch ethanol 980 Tiếp theo cho hỗn hợp vào bình thủy tinh và chạy mẫu trong bể siêu âm để phá vớ tế bào lá Lọc bỏ xác lá bằng màng lọc Nylon Advantec 5 µm thu dịch lọc Sau đó dịch lọc được tách bỏ dung môi bằng máy cô chân không Thu 500 mL dịch chiết cô đặc Dịch chiết 2 loại lá được pha trộn theo tỉ lệ: 50% dịch chiết lá cây thầu dầu + 50% dịch chiết lá cây thuốc cá Sản phẩm hỗn hợp dịch chiết lá cây thầu dầu và lá cây thuốc cá đạt khả năng diệt trừ bọ phấn trong phòng thí nghiệm

là 56,98 % Sản phẩm dịch chiết được bổ sung thêm phụ gia là Aceton với tỉ lệ 1:10 Sản phẩm dịch chiết sau khi bổ sung chất phụ gia đạt khả năng diệt trừ bọ phấn là 60,19 %

THÔNG TIN CHUNG VỀ NHIỆM VỤ

1 Tên nhiện vụ: Sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học từ dịch chiết lá cây

thầu dầu (Ricinus communis) và lá cây thuốc cá (Derrisscandens) ứng dụng trong phòng trừ bọ phấn (Bemisia tabaci) hại cây trồng

Chủ nhiệm:

Họ và tên: Trần Thu Trang

Năm sinh: 1994 Giới tính: Nữ

Học vị: Cử nhân Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Năm đạt học vị: 2017

Chức danh khoa học: Năm được phong chức danh:

Chức vụ: Kỹ sư phòng Hỗ trợ công nghệ vi sinh

Tên cơ quan đang công tác: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao

Đại chỉ cơ quan: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, Tp.HCM

Điện thoại cơ quan: 02862646103 Fax: 02862646104

Địa chỉ nhà riêng:

Điện thoại riêng: ĐTDĐ: 0379974672

Email: tranthutrang.160494@gmail.com

Tên cơ quan chủ trì:

Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao

Điện thoại: 028.62646103 Fax: 028.62646104

E-mail: info@abi.com.vn Website: www.abi.com.vn

Địa chỉ: ấp 1, xã Phạm Văn Cỗi, huyện Củ Chi, Tp HCM

Văn phòng giao dịch: Số 499, Cách Mạng Tháng 8, phường 13, quận 10, Tp.HCM

Thời gian thực hiện: 24 tháng

Kinh phí: 156.945.000 đồng

2 Nội dung

Nội dung 1: Xây dựng được quy trình tách chiết hoạt chất có chứa ricin,

rotenone từ lá cây thầu dầu, lá cây thuốc cá

Nội dung 2: Xác định hiệu lực diệt trừ bọ phấn của chế phẩm trong phòng thí

nghiệm

3 Sản phẩm

- Báo cáo khoa học

- Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ dịch chiết lá cây thầu dầu

(Ricinus communis) và lá cây thuốc cá (Derrisscandens) ứng dụng trong

phòng trừ bọ phấn (Bemisia tabaci) hại cây trồng

Trần Thu Trang

01/2018

đến

04/2018

2

Thử nghiệm ảnh hưởng của

tỉ lệ giữa dung môi và

nguyên liệu

Hoàn thành 100%

Trần Thu Trang

Nguyễn Tiến Duy

05/2018 đến 06/2018

Nguyễn Duy Long

Trần Thu Trang

07/2018 đến 9/2018

4

Thí nghiệm khảo sát khả

năng diệt trừ sâu của hỗn

hợp dịch chiết sau khi phối

trộn với các loại phụ gia

khác nhau trong phòng thí

nghiệm

Hoàn thành 100%

Trần Thu Trang

10/2018 đến 11/2018

5

Tổng hợp tài liệu và viết

báo cáo nghiệm thu (giai

đoạn 1)

Hoàn thành 100%

Trần Thu Trang

Nguyễn Tiến Duy

11/2018 đến 12/2018

PHẦN MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của nhiệm vụ

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa nên rất đa dạng về côn trùng Trong đó loài bọ phấn gây thiệt hại rất lớn cho người nông dân Ngoài ra chúng còn tấn công nhiều cây trồng như ớt, khoai tây, cà tím, dưa leo, khổ qua, bầu bí, đậu, dưa lưới, dưa hấu Ở Việt Nam thì dưa lưới được biết đến là một loại quả có giá trị dinh dưỡng và đem lại giá trị kinh tế cao Hiện nay trên thị trường giá 1 kg dưa lưới dao động từ 30.000- 40.000 đồng Dưa lưới được nhiều người ưa thích,

và chúng được trồng rộng rãi trên khắp cả nước Tuy nhiên, cây dưa lưới và các cây dưa nói chung thì thường xuyên bị bọ phấn phá hoại Bọ phấn hút nhựa ở cây, đẻ trứng ở các lá non trên cây dẫn đến lụi cây, làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm, thậm chí là thất thu hoàn toàn cho người trồng Việc phòng trừ

bọ phấn hiện nay còn gặp nhiều khó khăn do bọ phấn có tính kháng thuốc hóa

học cao và chúng có khả năng bay rất nhanh, rất xa

Trước sự tàn phá của bọ phấn đối với cây trồng mà trước đây con người đã

sử dụng thuốc hóa học nhưng gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe của người dân và làm ô nhiễm môi trường; đặc biệt khi sử dụng thuốc trừ sâu hóa học nếu thời gian cách li không đủ dài sẽ làm tồn dư thuốc trên sản phẩm gây ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng Để hạn chế các tác hại của việc sử dụng thuốc hóa học thì ngày nay rất nhiều nước đã áp dụng các sản phẩm sinh học trong diệt trừ sâu, côn trùng gây hại, trong đó có sử dụng dịch chiết của một số lá như: lá cây thuốc lá, lá cây cà chua, lá cây đại hoàng (Rhubarb Leaf), lá bạc hà, lá cây

thầu dầu (Ricinus communis)

Theo một số nghiên cứu chỉ ra rằng hoạt tính kháng nấm và gây độc ở sâu

bọ của dịch chiết cây thầu dầu có chứa chất gây độc mạnh là ricin Đặc biệt, ricin

Trong dầu, lá và hoa của R.communis chứa ricinin alkaloid lần lượt là 0,77; 0,38

và 1,07% trọng lượng khô của chúng (Waller và cộng sự, 1965) Năm 1930, Davidson thực hiện các nghiên cứu về độc tính của rotenone từ dịch chiết thực vật trong dung môi hòa tan là aceton cho thấy hoạt tính gây độc cho các loai sâu,

bọ khác nhau, đặc biệt đối với sâu bướm bị giết ở nồng độ rotenone rất nhỏ, bướm bắp cải bị tiêu diệt ở nồng độ rotenone 1/ 75.000

Vì những đặc tính trên của lá cây thầu dầu, lá cây thuốc cá nên chúng tôi

đề xuất thực hiện đề tài: “Sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học từ dịch chiết lá

cây thầu dầu (Ricinus communis) và lá cây thuốc cá (Derris scandens) ứng dụng trong phòng trừ bọ phấn (Bemisia tabaci) hại cây trồng” là hoàn toàn cần thiết để

nhanh chóng, chủ động phòng chống sâu, bọ hại cây trồng, bảo vệ nền sản xuất nông nghiệp và môi trường sinh thái

2 Mục tiêu cuả nhiệm vụ

- Xây dựng được quy trình tách chiết hoạt chất có chứa ricin và rotenone từ lá cây thầu dầu, lá cây thuốc cá

- Sản xuất được 2 lít chế phẩm sinh học phòng trừ sâu hại cây trồng

3 Giới hạn của nghiên cứu

Trong giai đoạn 1 do giới hạn về thời gian nên nhiệm vụ hoàn toàn chỉ thực hiện trong quy mô phòng thí nghiệm tại Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao; chưa có thực hiện thí nghiệm khảo sát hiệu lực của chế phẩm trên quy mô ngoài đồng ruộng

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về Ricin trong cây thầu dầu ( Ricinus communis)

Cây thầu dầu là loài cây bụi hoặc cây nhỏ phát triển nhanh, cho năng suất cao và rất sớm, thích nghi tốt với môi trường khác nhau và đã được con người trồng rộng rãi Ở nhiều quốc gia, đặc biệt là ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới; cây

thầu dầu có khả năng xâm lấn mạnh vì những khu rừng dày đặc che bóng hệ thực

vật tự nhiên có thể có những tác động tiêu cực đến đa dạng sinh học (Gordon và cộng sự, 2011; Bridgemohan và Bridgemohan, 2014)

Hình 1.1 Cành, hoa của cây thầu dầu (R cummunis) Ricin (chất độc trong cây thầu dầu)

Ricin được tổng hợp trong nội nhũ của hạt cây thầu dầu(Lord và Roberts, 2005) Ngoài ra ricin còn được tổng hợp từ tất cả các bộ phận của cây thầu dầu Các tiền protein của ricin là chuỗi chứa 576 phân tử acid amin, gồm một peptide tín hiệu (1-35), ricin chuỗi A (36-302), một liên kết peptide (303-314) và ricin

Hình 1.2 cấu trúc của ricin

Ricin được phân loại là một protein bất hoạt ribosome (RIP) loại 2 Trong khi các RIP loại 1 được cấu tạo từ một chuỗi protein duy nhất hoạt động xúc tác, thì các RIP loại 2, còn được gọi là holotoxin, bao gồm hai chuỗi protein khác nhau tạo thành một phức hệ heterodimer RIP loại 2 bao gồm một chuỗi A có chức năng tương đương với một RIP loại 1, liên kết cộng hóa trị với chuỗi B bằng một liên kết disulfide duy nhất Chuỗi B không hoạt động xúc tác nhưng có tác dụng làm trung gian vận chuyển của các protein phức hệ A-B từ bề mặt tế bào, vào trong khoang lưới nội chất (ER) Cả hai RIP loại 1 và loại 2 đều có chức năng hoạt động cản trở các ribosome trong ống nghiệm (in vitro), tuy nhiên chỉ RIP loại 2 thể hiện có độc tính tế bào do các tính chất giống lectin của chuỗi

B Để có thể bất hoạt ribosome, liên kết disulfide của ricin phải bị khử (Wright

sống Ricin khá bền, nhưng có thể bị thủy phân bởi các enzyme peptidase (Schep

và cộng sự, 2009) Một số nghiên cứu chỉ ra rằng ricin bị khử hoạt tính khi được hấp ở nhiệt độ cao bằng nồi hấp

Tử vong do ăn phải hạt thầu dầu rất hiếm, một phần vì quả nang khó tiêu, và

do hệ tiêu hóa có khả năng phân hủy được ricin mặc dù có khó khăn (Aplin và Eliseo, 1997) Ricin đã được nghiên cứu về tiềm năng sử dụng của nó như một thuốc trừ sâu, thể hiện hoạt động diệt khuẩn và diệt côn trùng (Zahir và cộng sự, 2010)

Hiện nay, nguồn thu thập lá cây thầu dầu khá lớn Tại các tỉnh vùng Tây Nguyên là Gia Lai, Đắk Lắk và Đắk Nông phát triển được hơn 3.000 ha cây thầu dầu trong các vùng đồng bào dân tộc thiểu số; trong đó xã còn khá nhiều quỹ đất nương rẫy cằn cỗi, bạc màu cũng như đất hoang hóa trong các buôn làng lâu nay không sử dụng đến, chính quyền và các đoàn thể trong xã đang tiếp tục vận động

và tạo mọi điều kiện cho bà con đưa vào trồng cây thầu dầu

1.2 Tổng quan về cây thuốc cá (Derris scandens)

Hình 1.3 Cây thuốc cá (Derris scandens)

Theo Đỗ Tất Lợi (1999), Trần Công Khánh, Phạm Quang Hải (1992), Phạm Khắc Hiếu, Bùi Thị Tho (1994) đã mô tả cây thuốc như sau:

- Thuốc cá là cây dây leo khỏe, thường mọc thành bụi hoặc tựa vào cây khác

- Thân dài từ 7 – 10 m, lá kép lông chim gồm 9-13 lá chét mọc so le, dài khoảng từ 25-30 cm, lá chét lúc đầu mỏng sau dày, hình mác, đầu nhọn, phía dưới tròn, lá non có lông trắng ở mặt dưới, lá già gần như nhẵn

- Hoa màu hồng nhạt hoặc trắng, xếp lại thành chùm dài 20cm, ở nách lá

- Quả thuộc loại quả đậu, dẹt, dài 5-7 cm, rộng 2 cm, mép quả có một cánh rộng 2 mm, chứa 1-4 hạt

a Thành phần hóa học

Hoạt chất chính có nhiều trong lá thuốc cá là rotenone, có công thức phân tử

là C22H22O6 hay tubotoxin, derin Rotenone được Nagai chiết ra năm 1902

Rotenone có tên khoa học là isopropenyl-8,9-dimethoxychoromeno[3,4-b]furo[2,3-h]chromen-6-one

(2R,6aS,12aS)-1,2,6,6a,12,12a-hexahydro-2-Năm 1932-1934, La Forge và Hailler đã xác định được công thức cấu tạo của retonon với 5 vòng: 2 vòng benzen A và D, 1 vòng pyran B, 1 vòng pyron C,

1 vòng furan E, ngoài ra còn 2 nhóm metoxy

Rotenone là chất kết tinh hình lăng trụ, không màu, có nhiệt độ nóng chảy

1650C-1660C (dạng lưỡng hình 1850C-1860C) không tan trong nước nhưng tan trong cồn, aceton, cacbondisunfit, cacbontetraclorua, clorofrom và nhiều dạng dung môi hữu cơ khác Theo Nguyễn Duy Cường, Nguyễn Hữu Quỳnh (1999) thì dung dịch rotenone không màu trong dung môi hữu cơ nhưng khi để ngoài trời sẽ chuyển sang màu vàng, màu da cam có khi đỏ sẫm rồi kết tinh dehydrorotenone

Hình 1.4 Phân tử rotenone

Trong cây thuốc cá còn có 3 hợp chất nữa cũng có tác dụng gần giống như rotenone:

- Deguelin: (C23H22O6) là tinh thể hình kim, màu lục nhạt, nóng chảy ở 1700C

- Tephroxin là tinh thể không màu, nóng chảy ở 1980C

- Toxicarol (C23H22O7); là tinh thể hình lục lăng, nóng chảy ở 2190C

Theo Đỗ Tất Lợi (1999), để xác định sự có mặt của rotenone người ta dùng những phương pháp sau:

- Phản ứng Jones, Smith: dung dịch 0,1% trong axeton thêm axit nitric rồi nước Khi kiềm hóa bằng amoniac sẽ xuất hiện màu xanh tím nhạt rồi mất

- Phản ứng Durham, Howard, Jones, Smith (1993): đun 0,05g bột rễ thuốc cá với 5ml cloroform lọc, phần dịch lọc được cô trên kính đồng hồ, thêm 2 giọt axit sulfuric đặc sẽ xuất hiện màu vàng cam rất rõ sau đó ngả sang màu nâu và tím khi cho thêm một hạt nitrit natri, phản ứng nhạy tới 1/10 mg

b Độc tính của rotenone

Thứ tự độ độc của các chất như sau: rotenone mạnh gấp 400 lần so với dguelin; deguelin mạnh gấp hơn 40 lần so với tephroxin; tephroxin mạnh hơn gấp 10 lần so với toxicarol

Khi uống liều LD50 của chuột lang là 133 mg/kg thể trọng, với chuột bạch

là 350 mg/kg thể trọng Phun dung dịch rotenone 5% với lượng 1ml/250cm2 đã gây chí tử cho lợn 100 pound (1p = 0,45kg) Với nồng độ 2.10-8 rotenone đã độc đối với cá, rotenone có tác dụng diệt côn trùng ở nồng độ 10-6

(Nguyễn Duy Cương, Nguyễn Hữu Quỳnh, 1999)

Rotenone nhanh chóng suy giảm trong đất và trong nước, thời gian bán hủy là 2-3 ngày Dễ bị phân hủy dưới ánh sáng mặt trời, hoạt tính gần như mất hết trong 5-6 ngày vào mùa xuân hoặc 2-3 ngày vào mùa hè

Rotenone có tác dụng diệt cá tạp, liều dùng thường từ 0,05 – 1ppm

c Cơ chế tác động

Rotenone tác động đến cơ thể bằng cách ức chế trao đổi chất về năng lượng Trao đổi chất và chuyển hóa năng lượng trong cơ thể liên quan mật thiết với nhau, không có trao đổi chuyển hóa năng lượng thì không có trao đổi chất vì mọi hoạt động sống đều đòi hỏi có sự tiêu hao năng lượng Năng lượng này lấy

từ các hợp chất hữu cơ dưới dạng thức ăn thông qua chuỗi hô hấp mô bào

Rotenone tác động đến quá trình hô hấp mô bào bằng cách ức chế hoạt tính của enzim hô hấp như: enzim hydrogenaza, enzim cytocrom b, c1, c và enzim oxydaza (Trần Quang Hùng, 1995); (Kate và Leny, 1998)

d Một số công dụng của thuốc cá

+ Đối với người: Zureller (1942) đã dùng cây thuốc cá để chữa ghẻ, sử dụng hỗn hợp bột thuốc cá, diêm sinh, bột talc và tinh bột mì

+ Đối với súc vật: làm thuốc tẩy giun, chữa ghẻ ngứa bôi vào vết loét của chân

bò có dòi bọ Một số vùng ở nước ta còn hái cây thuốc cá tươi làm thành một

vòng treo trên sừng của những trâu, bò hay bị dòi ký sinh Dòi thấy mùi thuốc cá

sẽ tự đi

+ Làm chế phẩm sinh học trừ sâu, bọ hại cây trồng

e.Tác động đối với côn trùng

Rotenone ngăn chặn hô hấp của côn trùng bằng cách vận chuyển điện tử trên phức hợp I Rotenone cho thấy phổ hoạt động rộng trên nhiều loài côn trùng

và sâu bọ, bao gồm bọ cánh cứng, sâu bướm, chấy, muỗi, bọ ve, bọ chết, kiến lửa, bọ trĩ (Davidson, 1930)

Davidson (1930) phát hiện ra rằng rotenone là một loại thuốc trừ sâu tiếp xúc độc hại và hiệu quả chống lại một số loài bướm trắng, rệp, sâu bướm, ve, bọ trĩ ở nồng độ khác nhau <1%, Rotenon là một loại thuốc trừ sâu tiếp xúc có độc tính cao và hiệu quả đối với một số loài rệp, bướm trắng, gián, sâu bướm và bọ

ve Rotenone nhanh chóng suy giảm trong không khí, trong đất và trong nước, thời gian bán hủy là 2-3 ngày Dễ bị phân hủy dưới ánh sáng mặt trời, hoạt tính gần như mất hết trong 5-6 ngày vào mùa xuân hoặc 2-3 ngày vào mùa hè

1.3.Phát sinh gây hại của bọ phấn (Bemisia tabaci)

Đặc điểm hình thái:

Hình 1.5 Ba pha phát dục của bọ phấn

Bọ phấn hoàn thành vòng đời qua 3 pha phát dục: trứng, ấu trùng, thành trùng;

ấu trùng có 4 tuổi, trong đó ấu trùng tuổi 4 (nhộng giả) có nhiều đặc điểm hình thái nên được sử dụng trong phân loại bọ phấn

+ Ấu trùng tuổi 1: bò chậm chạp và yếu ớt

+ Ấu trùng tuổi 2 và tuổi 3 sống cố định 1 chỗ

- Pha nhộng: hóa nhộng ngay trên lá Nhộng của bọ phấn thực ra là nhộng giả, hình bầu dục, không đều, màu sáng, có túm lông ở 2 bên sườn lưng Trong thời gian 4-6 ngày nhộng vũ hóa thành con trưởng thành (Bohmalk và cộng sự, 1996)

- Pha trưởng thành: nhỏ, màu vàng nhạt, cơ thể được phủ một lớp phấn trắng, chân dài và mảnh Bọ phấn trưởng thành con cái có kích thước lớn hơn con đực Khi đậu cánh bọ phấn úp vào nhau, che kín cơ thể, có hình mái nhà Bọ phấn trong nhà màng khi đậu cánh nằm ngang nhìn như hình tam giác

Một số bệnh do bọ phấn gây ra

- Bọ phấn trắng phát sinh và gây hại trên nhiều loại cây trồng như cà chua, ớt, khoai tây, cà tím, dưa leo, khổ qua, bầu bí, đậu

- Bọ non và trưởng thành hoạt động vào sáng sớm và chiều mát, chích hút nhựa

ở đọt và lá non, lá bị hại có đốm hoặc biến màu vàng Bọ tiết dịch bài tiết tạo môi trường cho nấm muội đen phát triển làm giảm quang hợp Mật số bọ làm lá khô héo, chết cây

Hình 1.6 Bọ phấn chích hút nhựa lá cây gây nên bệnh xoăn đọt, lá nhỏ

quăn queo ở cây dưa

- Bọ phấn còn là môi giới truyền Virus gây bệnh khảm xoăn lá (hình 1.6)

Hình 1.7 Bệnh khảm xoăn lá ở dưa do bọ phấn môi giới truyền Virus

Các biện pháp phòng trừ bọ phấn sử dụng hiện nay

* Biện pháp sử dụng giống chống chịu

Sử dụng giống chống chịu là công việc không còn mới mẻ trong phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng nông nghiệp nói chung và dưa lưới nói riêng Tuy nhiên

sử dụng giống chống chịu để trừ bọ phấn nói riêng cũng như phòng trừ sâu bệnh hại nói chung không tránh khỏi tính bất cập của nó như: đòi hỏi thời gian dài và khó có thể quy tụ được tất cả các ưu điểm của các giống đang sử dụng trong sản xuất cùng với tính chống chịu sâu bệnh hại

* Biện pháp vật lý, kỹ thuật trồng trọt

Dựa vào tính hướng ánh sáng của bọ phấn, đã có những nghiên cứu sử dụng bẫy dính màu vàng để phòng trừ bọ phấn Murigan (2001) quan sát bọ phấn trưởng thành trên bẫy dính màu vàng đặt ở những ruộng trồng các giống bông khác nhau tại Ấn Độ trong 17 tuần (mùa đông) và 16 tuần (mùa hè) thấy bẫy dính màu vàng đã làm giảm mật độ bọ phấn trên các ruộng trồng bông Việc phòng chống bệnh hại dưa lưới hạn chế khả năng gây bệnh thông qua biện pháp canh tác đã được thực hiện Kết quả là cách này đã hạn chế được sự lây lan của virus do bọ phấn không tiếp xúc trực tiếp với cây dưa lưới

* Biện pháp hóa học

Theo Dharmendar (2003) sử dụng thuốc hoá học phòng trừ bọ phấn nhanh chóng và hữu hiệu nhất Các loại thuốc hoá học để phòng trừ bọ phấn ở mỗi vùng, mỗi nước là rất khác nhau tuỳ theo điều kiện môi trường, tập quán canh tác của từng vùng Sharaf (1986) phòng trừ bọ phấn là công việc khó khăn bởi vì

bọ phấn có phổ ký chủ rộng tới 500 loài, các giai đoạn phát dục đều ở mặt dưới

lá, trưởng thành di động mạnh và có tính kháng thuốc trừ sâu mạnh Tuy nhiên những loại thuốc hoá học hiện nay sử dụng để trừ bọ phấn có hiệu quả thì lại rất độc, phần lớn đã bị cấm sử dụng trên cây trồng có sản phẩm ăn Mặt khác tính chống thuốc của bọ phấn đối với các loại thuốc trừ sâu: Carbosulfan, Polytrin

(Sherpa), Admire, Sumilarv, Nudrin, Methamidophos, một số thuốc nhóm Pyrethoid (Cúc) đã xuất hiện, đặc biệt trong sản xuất đại trà Tính kháng thuốc trừ sâu của bọ phấn đã được các tác giả phát hiện và nghiên cứu: Cardona (2001)

ở Colombia và Equado, El Kady (2002) ở Ai Cập, Morin (2002) ở Mỹ, Horowitz (2001) ở Israel, đồng thời các mẫu đối chứng để so sánh cũng được thu thập ở những nước này Sự kháng thuốc của dịch hại, việc lạm dụng thuốc hoá học trong biện pháp phòng trừ là nguy cơ tiềm ẩn cho ô nhiễm môi trường, dư lượng độc hại cao trong sản phẩm và ảnh hưởng tới sức khoẻ con người

*Biện pháp sinh học

Bọ phấn cũng lại bị nhóm bắt mồi ăn thịt, bị ký sinh và bị nấm bệnh như những loài côn trùng khác Trong điều kiện tự nhiên ký sinh chỉ đạt mật độ cao vào giai đoạn cuối của cây trồng và ở nơi sử dụng thuốc BVTV thấp nhất Các tác nhân sinh học này cũng bị ảnh hưởng bởi thuốc BVTV như bọ phấn Vì vậy

sử dụng ký sinh để phòng trừ sinh học bọ phấn là một vấn đề khó khăn hiện nay khi việc sử dụng thuốc BVTV một cách tràn lan Theo Ryvany và Gerling (1987)

2 loài ong : Encarsia ruteola và Eretmocerus đã được đưa vào phòng trừ bọ phấn

trên cây bông ở Israel và đã gặp sự cố nên chưa thành công Như vậy việc phòng trừ bọ phấn bằng biện pháp sinh học đang còn là một vấn đề rộng mở đòi hỏi sự quan tâm của các nhà khoa học nông nghiệp

Hiện nay trên thị trường cũng có bán một số chế phẩm sinh học dung để diệt trừ bọ phấn: chế phẩm METARHIZIUM, chế phẩm CNX-RS, chế phẩm BIO-HLC nhưng những chế phẩm này kí sinh và gây chết chủ yếu ở dạng sâu non, nhộng của côn trùng, tỉ lệ gây chết ở dạng trưởng thành ít; hầu hết các chế phẩm sinh học sử dụng nấm để kháng lại côn trùng gây bệnh vì vậy khi sử dụng trong nhà màng với nhiệt độ môi trường cao thì các nấm đối kháng thể hiện vai

Chế phẩm sinh học từ dịch chiết lá cây thầu dầu và lá cây thuốc cá của nhóm nghiên cứu đã thực hiện có chứa 2 chất gây độc cực mạnh đối với bọ phấn

là ricin và rotenone Ricin gây độc mạnh theo đường chích hút, rotenone gây độc mạnh qua con đường tiếp xúc và đường miệng Đặc biệt, ricin và rotenone là 2 chất độc phân hủy nhanh trong môi trường có nhiều ánh sáng mặt trời (mùa đông: 4-5 ngày, mùa hè: 2-3 ngày) Vì vậy, chế phẩm sau khi sản xuất đạt được hiệu quả diệt trừ bọ phấn, an toàn với người sử dụng và không gây ô nhiễm môi trường

1.4 Giới thiệu một số phương pháp chiết

Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung môi để lấy chất tan ra khỏi mô thực vật Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là một dung môi của các chất hòa tan trong dung môi Dung dịch này được gọi là dịch chiết Có 3 quá trình quan trọng đồng thời xảy ra trong chiết xuất là:

- Sự hòa tan các chất vào dung môi

- Sự khuếch tán của các chất tan trong dung môi

- Sự di chuyển các phân tử chất tan qua vách tế bào thực vật

Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng của dịch chiết: bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt độ, áp suất, kích thước tiểu phần bột nguyên liệu, cấu tạo vách tế bào

Quy trình chiết xuất điển hình gồm các bước:

1 Chuẩn bị nguyên liệu: làm khô, chia nhỏ hoặc làm đồng nhất các bộ phận tươi ( lá, hoa) hay ngâm toàn bộ bộ phận của cây trong dung môi

2 Lựa chọn dung môi chiết: Dung môi chiết phụ thuộc vào bản chất của chất cần chiết, các thành phần của chất cần chiết, tạp chất trong nguyên liệu và phương pháp chiết Có 3 nhóm dung môi chính (dựa vào độ phân cực):

- Dung môi phân cực cao: nước, ethanol, methanol

- Dung môi phân cực trung bình: ethyl acetat, dichloromethane

- Dung môi phân cực kém: n-hexan, ether dầu hỏa

3 Lựa chọn phương pháp chiết: Có nhiều phương pháp, kĩ thuật chiết khác nhau được lựa chọn tùy thuộc vào bản chất của chất cần chiết, dung môi chiết, điều kiện cơ sở vật chất có sẵn Các phương pháp thường dung: ngâm; ngấm kiệt; chiết siêu tới hạn; thăng hoa; soxhlet

Các phương pháp chiết được chia làm 2 loại chính: phương pháp truyền thống

và phương pháp hiện đại

a, Phương pháp chiết truyền thống

Thường sử dụng dung môi kết hợp với gia nhiệt và khuấy trộn Các phương pháp chiết hay sử dụng:

- Phương pháp ngâm

Là phương pháp cho nguyên liệu đã chia nhỏ tới độ mịn thích hợp, tiếp xúc với dung môi trong thời gian thích hợp, sau đó gạn, ép, lắng, lọc thu dịch chiết Tùy vào nhiệt độ chiết mà chia thành:

+ Ngâm lạnh: ngâm ở nhiệt độ phòng, có thể kết hợp với khuấy trộn, sử dụng với các chất cần chiết dễ bị phân hủy bởi nhiệt như: protein, emzym

+ Hãm: cho dung môi vào nguyên liệu đã được nghiền nhỏ trong thời gian xác định, có thể khuấy trộn, dùng cho chất dễ tan trong thời gian ngắn ở nhiệt độ cao

+ Hầm: ngâm nguyên liệu nghiền nhỏ và dung môi trong một bình kín, giữ nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ sôi của dung môi nhưng cao hơn nhiệt độ phòng trong thời gian nhất định, thỉnh thoảng có khuấy trộn; dùng cho chất khó tan ở nhiệt độ thường và dễ phân hủy ở nhiệt độ cao

+ Sắc: đun sôi đều nguyên liệu và dung môi trong thời gian nhất định

 Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, chi phí ít, khả năng áp dụng với các chất chiết rộng

 Nhược điểm: Năng suất thấp, thủ công, tốn dung môi, tốn thời gian

- Phương pháp ngâm kiệt

Là phương pháp cho dung môi chảy rất chậm qua khối nguyên liệu, trong suốt quá trình không khuấy trộn Nguyên liệu luôn được tiếp xúc với dung môi mới, luôn tạo ra chênh lệch nồng độ hoạt chất cao nên có thể chiết kiệt được hoạt chất

 Ưu điểm: hoạt chất được chiết kiệt, dung dịch đầu đậm đặc

 Nhược điểm: hiệu suất thấp, thủ công

- Phương pháp chiết hồi lưu và cất kéo hơi nước

Nguyên liệu được ngâm cùng dung môi trong bình cầu đáy tròn được nối với

hệ thống ngưng tụ Đun nóng bình cầu chứa nguyên liệu và dung môi đến nhiệt

độ sôi, dung môi sẽ bay hơi và ngưng tụ quay trở lại bình chiết Là phương pháp cất một hỗn hợp gồm 2 chất lỏng bay hơi được và chúng không trộn lẫn vào nhau Khi áp suất hơi bão hòa bằng áp suất hơi khí quyển Hỗn hợp bắt đầu sôi

và hơi nước kéo theo hơi chất lỏng còn lại Hơi nước có thể được đưa từ ngoài hoặc có thể tạo trong nồi cất

- Phương pháp Soxhelt

Nguyên liệu được đưa vào một ống giấy lọc và đặt vào ngăn chiết Dung môi mới được cho vào bình cầu và đun hồi lưu Dung môi bốc hơi lên và được ngưng tụ xuống ngăn chiết và khi tràn sẽ chảy qua ống xi phông và xuống bình bên dưới, mang theo các chất hòa tan từ nguyên liệu Ở bình cất chất tan được giữ lại, dung môi bốc hơi lên sẽ ngưng tụ xuống bình chiết và đi qua lớp dược liệu để hòa tan các chất còn lại Cứ như vậy cho đến khi nguyên liệu được chiết kiệt

 Ưu điểm: chiết liên tục, không tốn dung môi, dịch chiết không cần phải lọc

 Nhược điểm: các chất không bền nhiệt bị phá hủy, không khuấy trộn được

b, Phương pháp chiết hiện đại

- Chiết xuất với sự hỗ trợ của sóng siêu âm (Chiết siêu âm – UAE)

Nguyên lý: sử dụng sóng siêu âm làm cho dung môi bị sủi bọt đẩy các chất cần thiết ra khỏi nguyên liệu, chất tan vào dung môi

 Ưu điểm: thiết bị dễ vận hành, không quá mắc tiền, hiệu suất thu hồi cao, chiết được nhiều nhóm hoạt chất và dung môi khác nhau, tiết kiệm được thời gian

 Nhược điểm: dung môi khó được làm mới, thời gian lọc rửa dịch chiết kéo dài, chi phí cao

- Chiết xuất với sự hỗ trợ của vi sóng (Chiết vi sóng – MAE)

Nguyên lý: khi chiếu xạ vi sóng làm cho các phân tử dung môi và phân tử phân cực rung lên và nóng lên nhanh chóng tăng khả năng hòa tan các chất vào dung môi Vi sóng cũng phá vỡ cấu trúc thành tế bào giải phóng các chất vào dung môi

 Ưu điểm: hiệu suất cao, dễ sử dụng, thời gian nhanh, thích hợp với chiết các chất phân cực

 Nhược điểm: có thể gây nổ, khó áp dụng trong công nghiệp, phạm

vi áp dụng hẹp

- Chiết xuất lỏng siêu tới hạn (Chiết siêu tới hạn – SPE)

Nguyên lý: phương pháp sử dụng dung môi đặc biệt đó là dung môi tới hạn Lợi dụng các đặc tính đặc biệt của dung môi khi ở điểm tới hạn để tách chất

cần thiết khỏi nguyên liệu và chất cần chiết lắng lại được thu riêng Dung môi được hóa lỏng thu hồi và tái sử dụng

 Ưu điểm: hiệu suất cao, độ chọn lọc với chất cần chiết cao

 Nhược điểm: thiết bị đắt tiền, chỉ chiết được các chất kém phân cực

- Chiết xuất bằng dung môi với áp lực cao (Chiết dung môi nhanh – ASE)

Nguyên lý: là phương pháp kết hợp nhiệt độ tăng cao (500-2000C) và áp suất (100-140 atm) và các dung môi lỏng (không đạt tới hạn) để tiến hành trích

ly nhanh và hiệu quả các chất cần phân tích từ các cơ chất mẫu rắn và nửa rắn (Lê Văn Việt Mẫn, 2011) Nhiệt độ và áp suất cao làm tăng khả năng hòa tan và khuếch tán dung môi để cho hiệu quả chiết là cao hơn Trong chiết xuất, người ta

có xu hướng tăng nhiệt độ để tăng hiệu suất chiết, nhưng đến nhiệt độ sôi, dung môi hóa hơi không còn khả năng hòa tan các chất nữa Người ta sẽ tăng áp suất

để nhiệt độ của dung môi được đưa lên cao nhưng chưa đến vùng giới hạn

 Ưu điểm: tiết kiệm được dung môi, thời gian, hiệu suất chiết cao, phạm vi áp dụng rộng

 Nhược điểm: Thiết bị đắt tiền

Từ ưu điểm và nhược điểm của các phương pháp chiết nêu ở trên và điều kiện của cơ sở thực hiện thí nghiệm chúng tôi đã chọn ra 2 phương pháp để tiến hành đề tài: phương pháp ngâm chiết và phương pháp chiết siêu âm (UAE) có sử dụng máy cô quay chân không

 Ưu điểm của 2 phương pháp chiết: có sự kết hợp giữa 2 phương pháp chiết truyền thống (phương pháp chiết hồi lưu, phương pháp ngâm chiết) và phương pháp chiết hiện đại (sử dụng máy cô quay chân không tạo áp lực) Chính

sự kết hợp giữa các phương pháp chiết sẽ tiết kiệm được dung môi, thời gian, hiệu suất chiết cao, phạm vi áp dụng rộng, chi phí đầu tư và vận hành máy móc

ít, dễ dàng áp dụng và chuyển giao cho doanh nghiệp, hạ giá thành sản phẩm

Hai phương pháp sử dụng nhiệt độ không quá cao trong quá trình tách chiết nên đảm bảo được việc tách chiết ricin (bản chất là protein nên dễ biến tính ở nhiệt

độ cao) và rotenone (bản chất là một hợp chất hữu cơ có nhiệt độ nóng chảy ở

1650C) từ lá thực vật không bị biến tính các chất

 Nhược điểm của 2 phương pháp chiết: dung môi không được làm mới liên tục Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu khá cao

1.5 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới

Chiết xuất cây thầu dầu có hoạt tính diệt côn trùng đối với dạng trưởng

thành Haemaphysalis bispinosa Neumann (Acarina: Ixodidae) và ruồi giun mật

Hippobosca maculata Leach (Diptera: Hippoboscidae) (Zahir và cộng sự, 2010)

Chất độc trong dầu từ cây thầu dầu giúp bảo vệ cây một cách tự nhiên khỏi sâu bệnh như rệp Ricin trong cây thầu dầu đã được nghiên cứu về tiềm năng sử dụng của nó như một thuốc trừ sâu, thể hiện hoạt động diệt khuẩn và diệt côn trùng (Zahir và cộng sự, 2010)

Tiềm năng của chiết xuất thực vật như Celosia argenea (Caryophyllales:

Amaranthaceae), cây thầu dầu (Malpighiales: Euphorbiaceae), Mikania micrantha (Astrales: Asteraceae) và Catharanthus roseus (Cúc hương: Apocynaceae) để kiểm soát côn trùng đã được Chaojun và cộng sự (2012) đánh

giá trong một thử nghiệm sinh học và thử nghiệm bán trường Tất cả các chất chiết xuất được thử nghiệm đều làm giảm khả năng nở trứng của bọ dừa Đặc

biệt, chiết xuất của M micrantha cho thấy hoạt tính cao hơn các chất khác ở

R communis và sự sụt giảm mật độ là 75,56% và 80,00% sau bảy ngày điều trị,

tương ứng, với nồng độ 20 mg/mL

Cazal và cộng sự năm 2009, đã tiến hành thử nghiệm tách chiết Ricin từ dịch chiết lá cây thầu dầu bằng các phương pháp khác nhau và tìm ra phương pháp HSCCC và sử dụng dung môi methanol thay cho dung môi ethanol cho hiệu quả tách chiết Ricin cao hơn

Tính chất gây độc cho sâu bọ của dịch chiết từ cây thuốc cá cũng được các nhà khoa học nghiên cứu từ rất sớm Năm 1930, Davidson thực hiện các nghiên cứu về độc tính của rotenone từ dịch chiết thực vật trong dung môi hòa tan là aceton cho thấy hoạt tính gây độc cho các loai sâu, bọ khác nhau: sâu bướm bị giết ở nồng độ rotenone rất nhỏ, bướm bắp cải bị tiêu diệt ở nồng độ rotenone 1/75.000, ngay cả ở bọ xít với tỉ lệ 1/10.000 gây ra tỉ lệ tử vong là 60%; thử nghiệm trên loài rệp ở trong nhà kính với nồng độ rotenone 1/100.000 và 1/200.000 thể hiện tính gây độc cho rệp, đối với thử nghiệm ngoài đồng ruộng của loài rệp trên cây ăn quả nồng độ rotenone ở mức 1/40.000 và 1/60.000 thể hiện khả năng kiểm soát rệp Với nồng độ rotenone là 1/500 và 1/250 gây chết cho tất cả các dạng của bọ cánh cứng

Nghiên cứu chiết xuất rotenone từ thực vật được Zubairi và cộng sự công

bố năm 2004 Chỉ ra tỷ lệ dung môi khác nhau đã được sử dụng trong phương pháp ngâm chiết để chiết xuất rotenone đó là: Methyl clorua: Methanol (1:1); sau

đó sử dụng thiết bị bay hơi quay ở 400C và dưới 800 mbar chân không áp lực để

cô đặc dung dịch Đồng thời nhóm nghiên cứu cũng thử nghiệm hoạt tính gây chết của rotenone trên ấu trùng của 6 loại muỗi; cho tỉ lệ chết tối đa là 83,33% ở 0,05 mg/ml sau 5 giờ điều trị

Năm 2003, Hiền và cộng sự công bố các đánh giá về tiềm năng và triển vọng của rotenone trong phát triển nông nghiệp bền vững Nhóm nghiên cứu

cũng cho thấy rotenone với dung môi hữu cơ là ethanol ở nồng độ 1-2% có thể gây chết 65-95% côn trùng, sâu gây hại

Năm 2013, Zhou và cộng sự tiên hành thì nghiệm tối ưu hóa khả năng khai thác bằng siêu âm và khả năng thu nhặt cấp tiến của phenol và flavonoid từ

lá cây bọ mẩy cho thấy chiết xuất bằng siêu âm (UAE) để thu các chất chống oxy hoá phenol và flavonoid từ lá cây bọ mẩy đạt hiểu quả cao Điều kiện khai thác tối ưu cho việc sử dụng sóng siêu âm để khai thác các chất chống oxi hóa từ lá cây bọ mẩy như sau: 60,9% ethanol, 85,4 phút, và 63,3° C để chiết suất tổng hàm lượng phenol tối đa (16,8 ± 0,2 mg GAE / g DW); 67,7% ethanol, 82,9 phút, và 63,0° C đối với khai thác tối đa tổng hàm lượng flavonoid (49,3 ± 0,4 mg RT/g DW); 48,8% ethanol, 85,1 phút và 63,9 ° C đối với công suất thu nhặt gốc cực đại các gốc tự do chống oxi hóa tối đa (86,8 ± 0,2%); và 50,6% ethanol, 81,3 phút và 63,4 ° C đối với công suất thu hồi gốc tối đa ABTS (92,9 ± 0,5%) Tất cả các thí nghiệm được thực hiện ở tần số 40 kHz

Các tác giả sử dụng phương pháp ngâm chiết trong quá trình tách chiết các chất ra khỏi lá cây; đây là một phương pháp đơn giản, dễ thực hiện nhưng phương pháp nay không thể phá vỡ được màng tế bào thực vật rắn chắc Phương pháp này không thể nào khai thác được tối đa các chất cần thiết có trong lá thực vật Vì vậy, khả năng diệt trừ sâu bọ của dịch chiết thực vật chưa đạt được hiệu quả cao

Đề tài dựa trên nghiên cứu của nhóm tác giả Cazal và cộng sự (2009) với công trình: “High-speed counter-current chromatographic isolation of ricinine,

an insecticide from Ricinus communis” về việc thử nghiệm các phương pháp và dung môi sử dụng để tách chiết ricin từ lá của cây thầu dầu Kết quả của nghiên

ricin cao hơn và nghiên cứu này đã chứng minh rằng HSCCC là một kỹ thuật mạnh để tách ricin từ lá thực vật Ngoài ra đề tài dựa trên quy trình tách chiết rotenone bằng phương pháp ngâm chiết trong nghiên cứu của Davidson (1930)

và nghiên cứu chiết xuất rotenone từ thực vật được Zubairi và cộng sự công bố năm 2004; Năm 2013, Zhou và cộng sự tiến hành thì nghiệm tối ưu hóa khả năng khai thác bằng siêu âm và khả năng thu nhặt cấp tiến của phenol và flavonoid từ

lá cây bọ mẩy cho thấy chiết xuất bằng siêu âm (UAE) để thu các chất chống oxy hoá phenol và flavonoid từ lá cây bọ mẩy đạt hiểu quả cao Từ các nghiên cứu trên đưa ra quy trình tách chiết thử nghiệm:

 Bước 1: Xử lý nguyên liệu

Lá cây sau khi thu thập về được rửa sạch bằng nước máy và được sấy ở

500C trong 12 h, xay nhỏ thành bột Lá sau khi sấy có độ ẩm đạt khoảng

12% -13% bảo quản trong túi nilong đen

 Bước 2: Tiến hành tách chiết các chất từ bột lá

Thử nghiệm trên 2 phương pháp chiết khác nhau: phương pháp ngâm chiết

và phương pháp chiết siêu âm (UAE)

- Phương pháp ngâm chiết: bột lá ngâm với dung môi ethanol 980

tiến hành ngâm trong 12 giờ Tiếp theo, lọc dịch ngâm bằng màng lọc Nylon Advantec 5µm thu dịch lọc

- Phương pháp chiết siêu âm: bột lá trộn với dung môi ethanol 980

trong bình thủy tinh lớn Sau đó đặt bình thủy tinh vào bể siêu âm Các thông số nhiệt độ: 650

C, tần số cố định: 37 kHz, thời gian chạy: 85 phút Tiếp theo lọc bỏ xác lá bằng màng lọc Nylon Advantec 5 µm thu dịch lọc

-

 Bước 3: Tiến hành tách bỏ dung môi

Dịch lọc thu được sau quá trình tách chiết đem đi chạy bằng máy cô quay chân không với các thông số ở 450C, tốc độ quay 50 vòng/phút và 700 mbar chân không áp lực thu dịch cô đặc

Sản phẩm của quá trình chiết được chạy máy sắc kí lỏng cao áp để xác định hàm lượng các chất trong dịch chiết

CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

- Giai đoạn 1: Xây dựng được quy trình tách chiết hoạt chất có chứa ricin,

rotenone từ lá cây thầu dầu, lá cây thuốc cá (giai đoạn I, năm 2018) Bao gồm các thí nghiệm:

 Thử nghiệm hai phương pháp chiết khác nhau: phương pháp ngâm chiết và phương pháp chiết siêu âm có sử dụng máy cô quay chân không

 Xác định ảnh hưởng của dung môi đến chất lượng dịch chiết trong phòng thí nghiệm

 Khảo sát khả năng diệt trừ bọ phấn (Bemisia tabaci) của dịch chiết

lá cây thầu dầu (R Communis) kết hợp với dịch chiết của các lá cây thuốc cá (Derrisscandens) trong phòng thí nghiệm

 Thí nghiệm khảo sát khả năng diệt trừ sâu của hỗn hợp dịch chiết sau khi phối trộn với các loại phụ gia khác nhau trong phòng thí nghiệm

- Giai đoạn 2: Đánh giá hiệu lực của sản phẩm (giai đoạn II, năm 2019) Bao

- Địa điểm: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao tại

ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh

2.3 Vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu

- Lá của cây thầu dầu (R Communis) và lá cây thuốc cá (Derrisscandens) được

mua tại tỉnh Gia Lai, Cà Mau

- Bọ phấn (Bemisia tabaci) thu thập ở các vườn rau ở ấp 3, Xuân Thới Thượng,

Hóc Môn, TP Hồ Chí Minh

- Đối tượng nghiên cứu sau khi thu thập về phòng thí nghiệm được định danh và tiến hành thí nghiệm

Thiết bị

- Tủ sấy lạnh joongang Hàn Quốc: Máy ứng dụng bơm nhiệt duy trì nhiệt độ sấy

từ 15 – 45℃ trong khi loại bỏ độ ẩm

- Máy sấy lạnh có 52 khay dùng để sấy, mỗi khay sấy được 2 Kg lá/1 lần sấy

- Nồi hấp tiệt trùng HV-110: Kích thước buồng hấp: Æ420 x 795 mm, thể tích hiện dụng: 110 lít, khoảng nhiệt độ tiệt trùng: 105 ~ 135o

C

- Tủ lạnh TOSHIBA: dung tích 546 lít

- Tủ cấy vô trùng an toàn sinh học cấp II rộng 1,3m- Model SCBN 1013 (1300)

- Máy ly tâm công suất lớn Centrifuge Eppendorf 5801R, dung tích tối đa 1 mẻ

là 2 lít

- Máy cô quay chân không của Đức: dung tích 20 lít/mẻ

- Bể siêu âm Elma được sản xuất tại CHLB Đức với tiêu chuẩn công nghiệp khắt khe Bộ vi xử lý kiểm soát và làm sạch bằng sóng siêu âm với công nghệ đa tần