VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thu mẫu cá rô phi nhiễm TiLV tại Việt Nam
Các mẫu cá rô phi dương tính với virus TiLV đã được cung cấp bởi các đơn vị chẩn đoán dịch bệnh thú y và khoa học trong nước, tất cả đều được xác nhận dương tính với TiLV thông qua quy trình phát hiện bằng kỹ thuật semi-nested RT-PCR (TCCS 05:2017/TY-TS) áp dụng cho các đơn vị thuộc Cục Thú y Quy trình này được tối ưu hóa dựa trên nghiên cứu của TS Đồng Thanh Hà.
Nhóm nghiên cứu đã thu thập mẫu cá rô phi nghi ngờ nhiễm TiLV tại Quận 9, Tp Hồ Chí Minh và An Bình, Long Hồ, Vĩnh Long, dựa trên các dấu hiệu bệnh lý như xuất huyết, lở loét thân, bụng phình, tróc vảy và mắt lồi (Dong et al., 2017b; Ferguson et al., 2014; Jansen and Mohan, 2017; Surachetpong et al., 2017) Các mẫu cá chết được vận chuyển trong đá lạnh trong vòng 24 giờ về Trung tâm Công nghệ sinh học Tp HCM, nơi mẫu gan, thận, lách và não của các mẫu cá nghi ngờ nhiễm TiLV được thu thập và bảo quản ở nhiệt độ -80°C và trong cồn 96°.
Kiểm tra sự hiện diện của TiLV trong các mẫu cá bằng RT-PCR
Sự hiện diện của virus TiLV được xác định trong các mẫu cá dương tính và nghi ngờ nhiễm TiLV thông qua việc tách chiết RNA bằng phương pháp Trizol/1-bromo-3-chloropropane (BCP)/Chloroform hoặc sử dụng bộ kit QIAmp Viral RNA Mini (Qiagen) Quy trình RT-PCR được thực hiện theo các nghiên cứu của tác giả Đồng Thanh Hà và cộng sự (Dong et al., 2020; Dong, Siriroob, et al., 2017b).
RNA virus được tách chiết từ mẫu cá bằng dung dịch Trizol Nội quan cá (100 mg) được cắt nhỏ và đồng nhất trong 1 mL TRISure (Bioline) bằng máy Qiagen TissueLyserII ở tần số 50 Hz trong 1 phút ở 4°C Sau khi đồng nhất, mẫu được ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút và bổ sung 100 µL BCP (Merck) hoặc Chloroform, lắc mạnh và ủ thêm 15 phút Mẫu được ly tâm ở 20,000 xg trong 15 phút ở 4°C để tách các pha, sau đó chuyển phần pha nổi sang tuýp mới (300-500 µL) Isopropanol lạnh được bổ sung để tủa RNA, các tuýp được đảo đều và ly tâm lại Cặn được rửa với 1 mL ethanol 75% lạnh và ly tâm ở 20,000 xg trong 5 phút Cuối cùng, cặn sau khi rửa được phơi khô ở nhiệt độ phòng.
Sau khi xử lý trong 5-10 phút, cặn được hòa trong 10-20 µL nước nuclease-free (Thermo Fisher Scientific) và để qua đêm ở 4°C RNA được bảo quản ở -80°C cho đến khi sử dụng Đối với dịch nuôi cấy TiLV trên tế bào E11, 200 µL dịch virus được pha trộn với 1 mL dịch TRISure và quy trình tách chiết RNA được thực hiện tương tự Nồng độ và chất lượng RNA sau khi tách được kiểm tra bằng máy Nanodrop (Thermo Scientific).
Ngoài ra, để làm tăng hiệu suất tách chiết RNA, bộ kit QIAmp Viral RNA Mini (Qiagen) cũng được sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất
2.2.2 RT-PCR chẩn đoán TiLV
Quy trình RT-PCR để khuếch đại đoạn trình tự thứ 3 của virus TiLV sử dụng bộ mồi Nested ext-1, ME1 và 7450/150R/ME2, là phương pháp phổ biến hiện nay tại các Trung tâm chẩn đoán virus TiLV Phản ứng tổng hợp cDNA được thực hiện bằng bộ kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific™), với 5 μl mẫu RNA có nồng độ từ 100–400 ng và 0,4 μM cho mỗi mồi Nested ext.
1 và ME1, 1 mM dNTP, 1 μl Reverse Transcriptase, 1 μl RiboLock RNAse inhibitor và 1X dung dịch đệm trong tổng thể tích 20 μl Chương trình nhiệt gồm 25 o C 10 phút, 45 o C
Sản phẩm cDNA được khuếch đại qua phản ứng Nested PCR với cặp mồi Nested ext-1 và ME1 cho PCR1 (415 bp) và cặp mồi 7450/150R/ME2 và ME1 cho PCR2 (250 bp) bằng bộ kit DreamTaq Green PCR master mix (Thermo Scientific) Phản ứng PCR1 sử dụng 1,5 μL cDNA, 0,4 μM mỗi mồi và 1X DreamTaq Green PCR master mix trong tổng thể tích 25 μL, với chương trình nhiệt gồm một chu kỳ 94°C trong 2 phút, 25 chu kỳ 94°C trong 30 giây, 60°C trong 30 giây, 72°C trong 30 giây, và một chu kỳ 72°C trong 5 phút Phản ứng PCR2 thực hiện trong thể tích 20 μL với 1 μL sản phẩm PCR1, 0,25 μM mỗi mồi và 1X DreamTaq PCR master mix, áp dụng chương trình nhiệt tương tự như PCR1 (Dong et al., 2017a).
Quy trình RT-PCR để khuếch đại đoạn trình tự thứ 1 của TiLV sử dụng bộ mồi TiLV/nSeg1F, TiLV/nSeg1R và TiLV/nSeg1RN, được thiết kế với độ nhạy cao gấp nhiều lần (Dong et al., 2020).
Quy trình tổng hợp cDNA được thực hiện bằng bộ kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, sử dụng 5 μl mẫu RNA (100 ng) cùng với 0,4 μM mỗi mồi TiLV/nSeg1F và TiLV/nSeg1R, 1 mM dNTP, 1 μl Reverse Transcriptase, 1 μl RiboLock RNAse inhibitor và 1X dung dịch đệm, tổng thể tích là 20 μl Chương trình nhiệt cho quá trình này bao gồm 25 oC trong 10 phút, cho phép tăng cường độ nhạy gấp 100 lần so với quy trình RT-PCR trên đoạn trình tự số 3 của TiLV.
Sản phẩm cDNA được khuếch đại bằng phản ứng Nested PCR, sử dụng cặp mồi TiLV/nSeg1F và TiLV/nSeg1R cho PCR1 (620 bp) và cặp mồi TiLV/nSeg1F và TiLV/nSeg1RN cho PCR2 (274 bp) Phản ứng PCR1 bao gồm 1,5 μL cDNA, 0,4 μM mỗi mồi, và 1X DreamTaq Green PCR master mix trong tổng thể tích 25 μL, với chương trình nhiệt gồm một chu kỳ 94°C trong 2 phút, sau đó là 25 chu kỳ với 94°C trong 30 giây, 60°C trong 30 giây, 72°C trong 30 giây, và kết thúc bằng một chu kỳ 72°C trong 2 phút Phản ứng PCR2 được thực hiện trong thể tích 25 μL, bao gồm 5 μL sản phẩm PCR1, 0,5 μM mồi TiLV/nSeg1F và 0,6 μM mồi TiLV/nSeg1RN.
X DreamTaq Green PCR master mix Chương trình nhiệt tương tự như phản ứng PCR1 Ngoài ra, việc sử dụng cặp mồi Random hexamer (5´ – d (NNNNNN) –3´ N = G,
A, T or C) và OligodT (5´-d (TTT TTT TTT TTT TTT TTT)-3´) để tổng hợp cDNA thay cho các cặp mồi đặc hiệu với đoạn trình tự số 1 và số 3 nhằm tối ưu quy trình chẩn đoán TiLV Phản ứng tổng hợp cDNA được tiến hành với bộ kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, gồm 5 μL mẫu RNA (100 ng), 0,4 μM mỗi mồi Random hexamer và OligodT, 1 mM dNTP, 1 μl Reverse Transcriptase, 1 μl RiboLock RNAse inhibitor và 1X dung dịch đệm trong tổng thể tích 20 μl Chương trình nhiệt gồm 25 o C trong 10 phút, 45 o C trong 60 phút và 85 o C ở 5 phút Sau đó sản phẩm cDNA được khuếch đại với 02 bộ mồi liên quan đến đoạn trình tự số 1 và số 3 của TiLV với quy trình PCR tương tự như trên
Mẫu RNA của virus TiLV được phân lập tại Thái Lan, do TS Đồng Thanh Hà cung cấp, được sử dụng làm chứng dương cho các phản ứng RT-PCR, trong khi chứng âm là mẫu nước Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1% với dung dịch GelRed® 10,000X.
Biotum được sử dụng trong dung dịch đệm TAE 0,5X, bao gồm 20 mM Tris, 10 mM axit acetic và 0,5 mM EDTA Kết quả của quá trình điện di được ghi lại bằng máy chụp ảnh gel điện di GelDoc-it2 của UVP.
Giải trình tự bộ gen TiLV Việt Nam bằng phương pháp Sanger và Next-
2.3.1 Khuếch đại bộ gen TiLV
Mẫu cDNA được tổng hợp từ RNA virus TiLV phân lập tại Việt Nam đã được khuếch đại 10 đoạn trình tự gen bằng các cặp mồi PCR do nhóm nghiên cứu thiết kế dựa trên bộ gen TiLV Israel (KU751814 - KU751823) Phản ứng PCR khuyếch đại sử dụng 2 μL mẫu cDNA, 0,2 μM mỗi mồi và 1X DreamTaq Green PCR Mastermix trong tổng thể tích 60 μL Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR bao gồm 1 chu kỳ 94°C trong 5 phút, tiếp theo là 35 chu kỳ với 94°C trong 30 giây, 48-53°C trong 30 giây, và 72°C trong 90 giây.
Sản phẩm PCR được xử lý ở nhiệt độ 72 độ C trong 10 phút và kiểm tra trên gel agarose 1% với dung dịch GelRed 1X trong đệm TAE 0,5X Kết quả điện di được quan sát bằng máy GelDoc-it2 Các sản phẩm PCR có kích thước đúng được tinh sạch từ gel bằng bộ kit E.Z.N.A Gel Extraction (Omega) và sau đó được đo bằng Nanodrop để đánh giá chất lượng và hàm lượng DNA.
Bảng 2 1 Thông tin các cặp mồi PCR dùng để khuếch đại 10 đoạn trình tự bộ gen TiLV
Kích thước (bp) Đoạn trình tự
2.3.2 Giải trình tự bộ gen TiLV Việt Nam
Sản phẩm cDNA từ mẫu RIA2 và sản phẩm PCR tinh sạch của 10 đoạn trình tự bộ gen TiLV HB196 đã được gửi đi giải trình tự tại Trung tâm Ktest bằng hệ thống Illumina MiniSeq 2x150 bps Các trình tự đã được xử lý để loại bỏ adapter và nucleotide chất lượng kém bằng công cụ Trimmomatic v0.36 Sau khi tinh sạch, dữ liệu được phân loại taxonomy bằng centrifuge v1.0.4 để đánh giá nguồn gốc vi sinh vật trong mẫu, sử dụng cơ sở dữ liệu trình tự bộ gen hoàn chỉnh trên NCBI Dữ liệu giải trình tự đã tinh sạch được sắp gióng cột với trình tự tham chiếu của virus hồ cá tilapia (Mã truy cập KU751814-KU751823) bằng công cụ BWA v0.7.17, và kết quả sắp gióng cột được đánh giá bằng công cụ Qualimap v.2.2.1.
Các đột biến điểm trong gen TiLV tại Việt Nam đã được phân tích thông qua phương pháp giải trình tự Sanger tại Trung tâm Công nghệ sinh học TP HCM, với một mẫu khoảng 200.
Sản phẩm PCR tinh sạch 300 ng và 1,6 μM mồi được sử dụng để giải trình tự bằng bộ kit BigDye™ Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Mỹ) Thành phần phản ứng PCR bao gồm 1 μL mẫu DNA, 1,6 μM mồi, 2 μL BigDye™ Terminator v3.1 và dung dịch đệm 1X trong tổng thể tích 20 μL Chương trình nhiệt thực hiện 30 chu kỳ với nhiệt độ bắt cặp 50 °C và bước kéo dài ở 60 °C trong 4 phút Sản phẩm PCR BigDye được tinh sạch bằng hỗn hợp NaOAC 3M, EDTA 125 mM và Ethanol 99% theo tỷ lệ 1:1:25, sau đó là Ethanol 70%, trước khi giải trình tự trên máy Genetic Analyzer 3500 (Thermo Fisher) Mỗi đoạn trình tự được giải theo hai chiều và dữ liệu gen của chủng TiLV Việt Nam được lắp ráp và nối bằng công cụ Align Sequence trong phần mềm MegaX v.10.1.6 Các trình tự sau đó được so sánh với dữ liệu từ ngân hàng gen NCBI thông qua công cụ BLAST.
2.3.3 Phân tích bộ gen TiLV Việt Nam
Bài phân tích sử dụng hai bộ gen TiLV Việt Nam RIA2 và HB196, cùng với 21 bộ gen TiLV tham khảo khác từ ngân hàng gen NCBI Các bộ gen này bao gồm hai từ Israel, một từ Ecuador, một từ Peru, hai từ Mỹ, bốn từ Bangladesh và 11 từ Thái Lan.
2) a) Hiện tượng tái tổ hợp (reassortment event)
Hiện tượng tái tổ hợp giữa các bộ gen TiLV đã được phát hiện thông qua bảy thuật toán trong chương trình RDP4, bao gồm RDP, GENECONV, Chimera, MaxChi, Bootscan, SiScan, và 3Seq Sự kiện tái tổ hợp được ghi nhận khi có hơn bốn thuật toán phát hiện với giá trị p< 0.01, tương tự như nghiên cứu của Thawornwattana et al (2021).
Sự tương đồng giữa các trình tự gen được tính toán bằng chương trình SIAS, cho phép xác định các vùng đọc mở thông qua MUSCLE trong MEGA v.11.0.10 Sự khác biệt trung bình giữa các trình tự nucleotide và amino acid của gen TiLV được tính toán bằng mô hình với 1000 bootstrap Các cây quan hệ di truyền được xây dựng bằng khung Maximum likelihood với độ tin cậy của các phân nhánh cũng được xác định qua mô hình tối ưu với 1000 bootstrap trong MEGA v.11.0.10.
Nuôi cấy dòng tế bào E-11
Dòng tế bào E-11, được chiết xuất từ cá lóc Ophicephalus striatus, là dòng tế bào nhạy cảm với virus TiLV Tế bào E-11 đông lạnh (khoảng 10^6 tế bào/mL) được rã đông nhanh ở 37°C và chuyển vào môi trường Liebovitz L-15 (Bioind) ở nhiệt độ phòng Sau đó, môi trường đông lạnh được loại bỏ bằng cách ly tâm với tốc độ 450 x g ở 25°C trong 5 phút Cặn tế bào được huyền phù trong môi trường L-15 bổ sung 5% huyết thanh bò (FBS, Sigma) và 2 mM L-glutamine (Sigma) với mật độ 3 x 10^5 tế bào/cm^2, sau đó ủ ở 25°C trong điều kiện không có CO2 Môi trường L-15 + 5% FBS + 2 mM L-glutamine sẽ được thay khi tế bào lan rộng 50% diện tích đĩa nuôi cấy.
Khi tế bào E-11 phát triển thành lớp đơn liên tục chiếm 70 – 80% diện tích đĩa nuôi cấy, chúng được cấy chuyền sang đĩa mới Sau khi hút bỏ môi trường cũ và rửa bằng PBS 1X, tế bào được ủ với Trypsin 1X trong 3 phút ở 37 °C, sau đó huyền phù lại trong L-15 có 5% FBS và 2mM L-glutamine Mật độ tế bào được đo và cấy vào đĩa mới với mật độ 3 x 10^5 tế bào/cm2, và ủ ở 25 °C trong điều kiện không có CO2.
Khi tế bào E-11 đạt được lớp đơn liên tục (monolayer) chiếm 70 – 80% diện tích đĩa nuôi cấy, tiến hành bảo quản bằng cách hút bỏ môi trường cũ và rửa tế bào bằng PBS 1X.
Tế bào được ủ với Trypsin 1X (Sigma) trong 3 phút ở 37 o C, ly tâm 450 xg ở 25 o C trong
Trong 5 phút, tiến hành loại bỏ dịch nổi và huyền phù cặn tế bào từ môi trường đông lạnh DMSO 10% và FBS 90%, để đạt mật độ tế bào khoảng 10^6 tế bào/mL Sau đó, cho 1 mL dịch tế bào vào các ống cryotube và lưu trữ đông ở nitơ lỏng.
Nuôi cấy TiLV
Virus được nuôi cấy trên dòng tế bào E-11 từ cá lóc Ophicephalus striatus, tế bào nhạy cảm với TiLV, trong môi trường Liebovitz L-15 có bổ sung 10% huyết thanh bò và 2 mM L-glutamine, ủ ở 25°C không có CO2 Mẫu bệnh phẩm dương tính với TiLV được đồng nhất trong dung dịch HBSS và ly tâm ở 3.000 ×g trong 10 phút ở 4°C Dịch nổi thu được được lọc qua màng lọc 0,22 μm và bổ sung vào đĩa nuôi cấy 6 giếng chứa tế bào E-11, ủ ở 25°C trong 14 ngày Mật độ tế bào được quan sát hàng ngày, và khi có dấu hiệu ly giải tế bào (CPE), dịch nổi sẽ được cấy chuyền 2-3 lần sang các tế bào E-11 mới Virus sẽ được thu từ dịch nổi ở lần cấy chuyền thứ 2 và 3 với CPE rõ ràng, lọc qua màng lọc 0,22 μm và bảo quản ở -80°C.
2.5.2 Xác định mật độ virus TiLV (TCID 50 mL -1 )
Tế bào E-11 được đưa vào đĩa 96 giếng với mật độ 5.000 tế bào/giếng trong môi trường L-15 có 10% huyết thanh bũ và 2 mM L-glutamine, tổng thể tích là 100 µL Các tế bào này được ủ ở 25°C trong điều kiện không có CO2 trong một tuần Dịch virus được bảo quản ở -80°C, sau đó được rã đông và pha loãng bậc 10 từ 10³ đến 10¹⁰ trên đĩa 96 giếng trong môi trường L-.
15 Bổ sung 100 àL dịch virus sau khi pha loóng vào đĩa 96 giếng cú tế bào E-11 (tổng thể tớch là 200 àL) với 10 lần lặp lại Để kiểm tra nhiễm, đối với mỗi nồng độ virus pha loãng, hai dãy giếng chỉ chứa tế bào E-11 được dùng làm đối chứng Đĩa 96 giếng được ủ ở 25 o C trong điều kiện không có CO2 trong vòng hai tuần và quan sát hàng ngày TCID50 được tính theo phương pháp của Reed và Muench (Reed & Muench, 1938) với công thức như sau:
Thử nghiệm công độc TiLV trên cá rô phi đỏ
2.6.1 Cá rô phi dùng trong thử nghiệm
Cá rô phi đỏ (Oreochromis spp.) được cung cấp từ Trại giống Cổ Lịch và Trại giống Tư Tiến tại Cái Bè, Tiền Giang Sau đó, cá được ương nuôi trong các bể composite có dung tích 0,5 m³ tại Trung tâm CNSH Tp HCM cho đến khi đạt kích thước tối ưu.
Cá sẽ được nuôi với mật độ 30 con/bể trong vòng 2 tuần, mỗi con nặng khoảng 10 g Thức ăn công nghiệp Aquaxcel (Cargill, Vietnam) sẽ được cho ăn hàng ngày với tỷ lệ 5% khối lượng thân, chia làm 3 lần vào các giờ 8h00, 13h30 và 17h00 Các chỉ số chất lượng nước như nhiệt độ, hàm lượng oxy hòa tan, pH và NH3+/NH4+ sẽ được kiểm tra hàng ngày Nước trong bể sẽ được thay định kỳ từ 3-7 ngày/lần, mỗi lần thay 30% lượng nước Cá sẽ được nuôi cho đến khi đạt kích cỡ thích hợp từ 5-20 g để phục vụ cho thí nghiệm công độc với virus TiLV.
2.6.2 Khảo sát độc lực của TiLV trên cá rô phi đỏ
Trước khi thử nghiệm, 5 mẫu cá rô phi được chọn ngẫu nhiên để kiểm tra sự hiện diện của TiLV bằng phương pháp semi-nested PCR Để giảm stress cho cá, chúng được nhịn ăn một ngày trước khi tiến hành công độc Mỗi nghiệm thức bao gồm 20 cá/bể với hai lần lặp lại Cá rô phi đỏ (4,5 1,98 g) được gây mê bằng dung dịch benzocaine (50 mg mL -1 ) Nhóm đối chứng âm được tiêm dịch nổi của tế bào E-11, trong khi nhóm công độc được tiêm dịch nổi của tế bào E-11 đã nhiễm TiLV với tỷ lệ pha loãng 10 lần và 100 lần Thêm vào đó, một nhóm cá rô phi đỏ có trọng lượng trung bình 20,8 7,5 g cũng được tiêm dịch nuôi cấy TiLV nguyên để đánh giá khả năng gây bệnh của TiLV trên cá lớn Thử nghiệm diễn ra trong 21 ngày, cá được theo dõi hàng ngày để ghi nhận tỷ lệ cá chết.
Bệnh lý lâm sàng do nhiễm TiLV bao gồm các triệu chứng như chán ăn, sẫm màu, bơi lờ đờ, xung huyết và xuất huyết não, cùng với lở loét trên da, mang tái nhợt, mắt teo hoặc lồi, hiện tượng đục thủy tinh thể, bụng và hậu môn phình to, vẩy dựng lên và có thể bong tróc, cũng như đuôi bị ăn mòn Mẫu não của cá lờ đờ hoặc đã chết được bảo quản trong cồn 96 độ Để kiểm tra sự hiện diện của TiLV trong các mẫu mô cá, phương pháp RT-PCR được áp dụng Tất cả cá sống sau thử nghiệm ở các nghiệm thức đều được gây mê bằng benzocaine với liều 500 mg/mL và thu mẫu các cơ quan tương tự như cá đã chết trong quá trình theo dõi.
2.6.3 Công độc cá rô phi đỏ với TiLV để thu mẫu phân tích hệ gen phiên mã
Cá rô phi đỏ (5,02 1,56 g) được nhịn ăn một ngày trước khi bố trí 20 cá/bể, với mỗi nghiệm thức thực hiện hai lần lặp lại Quy trình công độc được tiến hành tương tự như mục 2.6.2, trong đó cá đối chứng âm được tiêm dịch nổi của tế bào E-11, trong khi cá ở nhóm công độc được tiêm dịch nuôi cấy TiLV với liều LD70 Thử nghiệm diễn ra trong 21 ngày, và cá được kiểm tra hai tiếng một lần để thu thập cá lờ đờ hoặc vừa chết, nhằm đảm bảo mẫu RNA tách chiết từ các mẫu cá được đồng đều.
Sau khi cá chết, có dấu hiệu bệnh lý lâm sàng của nhiễm TiLV như chán ăn, sẫm màu, bơi lờ đờ, và xuất huyết Mẫu cá được cân trọng lượng, lau khô bằng cồn 75 độ, và mổ để thu ruột, thận, gan, lách Các mẫu mô được bảo quản trong RNAlater ở -80 độ C cho việc phân tách RNA Mẫu não được kiểm tra sự hiện diện của TiLV bằng semi-nested RT-PCR Cá đối chứng cũng được thu mẫu mô tương tự và gây chết bằng dung dịch benzocaine liều cao Toàn bộ cá sống sau thử nghiệm cũng được gây mê và thu mẫu các cơ quan tương tự.
Giải trình tự và phân tích hệ gen phiên mã (transcriptome)
Mẫu mô từ ruột, thận trước, gan và lách của cá rô phi được thu thập trong quá trình công độc, sau đó được thấm RNAlater, cắt nhỏ và đồng nhất trong 500 µL TRISure (Bioline) có bổ sung 3-.
4 viên bi thủy tinh bằng máy Qiagen TissueLyserII ở tần số rung (Oscillation frequency)
Mẫu được xử lý ở tần số 50 Hz trong 2 phút tại 4°C cho đến khi không còn mô vụn Sau đó, mẫu được ủ trong 5 phút và bổ sung 100 µL Chloroform, lắc mạnh trong 15 giây và ủ tiếp 3 phút trên đá Mẫu được ly tâm ở 20.000 xg trong 5 phút tại 4°C để tách các pha, phần pha nổi được chuyển vào ống mới và bổ sung thêm 100 µL Chloroform, lắc mạnh và ly tâm lại để thu pha nổi khoảng 200 µL Tiếp theo, bổ sung 250 µL isopropanol lạnh để tủa RNA, đảo đều 5-7 lần, ủ trong đá 10 phút và ly tâm ở 20.000 xg trong 10 phút tại 4°C Cặn được rửa với 500 µL ethanol 75% lạnh và ly tâm lại, sau đó tiếp tục rửa với 500 µL ethanol 100% lạnh và ly tâm thêm một lần nữa Cuối cùng, cặn được phơi khô ở nhiệt độ phòng trong 5-10 phút và hòa tan trong 20 µL nước nuclease-free Hàm lượng và chất lượng RNA được kiểm tra bằng Nanodrop ND-1000.
DNA nhiễm sắc thể trong mẫu RNA được loại bỏ bằng bộ kit DNA-free TM (Ambion) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sau khi xử lý bằng DNase, hàm lượng và chất lượng RNA được xác định lại bằng máy Nanodrop ND-1000 và kiểm tra trên gel agarose 1% (Bioline) sử dụng dung dịch điện di TAE 0.5 X.
Các mẫu RNA đạt tỷ lệ 260/280 từ 1.8 đến 2.0 và có sự nguyên vẹn trên gel với hai vạch RNA 28S và 18S được điều chỉnh hàm lượng 1 µg với nồng độ 20 ng/mL và được bảo quản đông khô trong tuýp GenTegra®-RNA (GenTegra, Mỹ) trước khi gửi đi giải trình tự.
2.7.2 Giải trình tự mRNA Ở mỗi nghiệm thức, RNA tổng (total RNA) từ mỗi mẫu mô của 3 mẫu cá chết đầu tiên và 3 mẫu cá sống sót sau quá trình công độc với TiLV, cùng với 03 mẫu cá đối chứng thu vào thời điểm thu mẫu cá chết được dùng để giải trình tự (Hình 2.1) Các mẫu cá này được gom chung từ 2 bể lặp lại của mỗi nghiệm thức Các mẫu RNA tổng được gửi giải trình tự mRNA bằng hệ thống Illumina tại Trung tâm Ktest (thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam)
Hình 2 1 Sơ đồ phân bố các mẫu mô cá rô phi sau khi công độc với TiLV và các phân tích hệ gen phiên mã
Cá thử nghiệm (có tiêm virus)
Cá đối chứng (không tiêm virus)
Cá chết sau khi tiêm ở ngày 1-5
Cá sống sau khi tiêm virus ở ngày 21
Thu mẫu gan, ruột, lách và thận
Phát hiện SNPs và microsatellite phân biệt giữa nhóm cá sống và nhóm cá chết sau khi tiêm virus
Sấy khô RNA với tube GenTegra (https://gentegra.com/wp- content/uploads/2021/07/GenTegra-RNA-User-Guide- revH.pdf)
2.7.3 Phân tích kết quả giái trình tự mRNA
Sau khi giải trình tự bằng thiết bị Illumina tại Ktest, các đoạn trình tự được kiểm tra chất lượng bằng FASTQC và loại bỏ adapter cũng như tinh sạch qua SOAPnuke, với 50% tổng chiều dài read có Qscore < 20 và 10% nucleotide không xác định (N) Các đoạn RNA-seq tinh sạch sau đó được sắp xếp vào trình tự bộ gen tham chiếu Orenil1.0 bằng công cụ Star và lắp ráp de novo dựa trên trình tự tham chiếu phiên mã bằng Stringtie Các vùng gen hoặc transcript mới được chú giải theo tên gene từ cơ sở dữ liệu NCBI và UCSC, đồng thời số lượng read được phân loại vào các đặc trưng genome (exon, intron, intragenic) cũng được tính toán từ kết quả chú giải này, bao gồm các đặc trưng mới được phát hiện trong tất cả mẫu của dự án.
2.7.4 Xác định các SNP và microsatellite khác nhau giữa cá sống và chết sau khi công độc với virus TiLV từ cơ sở dữ liệu hệ phiên mã
Các trình tự đọc chất lượng cao được sắp xếp và căn chỉnh với trình tự gen tham chiếu Orenil 1.0 bằng công cụ Burrows-Wheeler Aligner (BWA) v0.7.10 Để tái sắp xếp các trình tự đọc, bộ công cụ phân tích genome (GATK) v3.8 được sử dụng Từ kết quả căn chỉnh với trình tự gen tham chiếu, các nucleotide sai biệt (biến thể) có chất lượng tốt sẽ được xác định bằng GATK v3.8 HaplotypeCaller.
Các thông số chất lượng sắp gióng cột, bao gồm độ phủ sâu tại từng vị trí biến thể và độ phủ sâu trung bình của một vùng gen mục tiêu, sẽ được xác định thông qua các công cụ Picard v1.119, SAMtools v1.1 (Li et al., 2009) và Bedtools v2.17 (Quinlan và Hall, 2010).
Các biến thể khác nhau giữa các nhóm nghiệm thực sẽ được phân tích thông qua nhóm gen chức năng bằng công cụ Blast2GO Chức năng gen được phân loại thành ba nhóm chính: Chu trình Sinh học, Chức năng Phân tử và Cấu trúc.
Tất cả các trình tự đặc trưng được sử dụng để tìm chỉ thị microsatellite (SSR) thông qua công cụ MIcroSAtellite, với mức độ lặp lại của các mô-típ DNA được xác định theo Bảng 2.2 Để thiết kế mồi, sự hiện diện của đoạn trình tự tối thiểu 100 bp ở hai đầu của các đoạn lặp lại microsatellite là điều kiện cần thiết.
Bảng 2 2 Thông số chỉ thị microsatellite (SSR)
Chiều dài mô-típ SSR Số lần lặp lại tối thiểu
KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
Tối ưu hóa quy trình RT-PCR chẩn đoán virus TiLV
Khi điều chỉnh phản ứng tổng hợp cDNA trong quy trình RT-PCR của Taengphu et al
Năm 2020, việc sử dụng cặp mồi Random hexamer/oligodT thay cho cặp mồi TiLV/nSeg1F và TiLV/nSeg1R đã cải thiện hiệu quả khuếch đại trong quy trình RT-PCR đối với mẫu TiLV-T11, như thể hiện trong Hình 3.1.
Hình 3.1 trình bày kết quả chẩn đoán virus TiLV trong mẫu T11 theo quy trình RT-PCR được mô tả bởi Taengphu et al (2020), với sự điều chỉnh trong phản ứng tổng hợp cDNA sử dụng cặp mồi Random hexamer/oligodT Mẫu thử được đánh dấu là M cho thang DNA O’Generuler (Thermo), 11 cho mẫu T11, (+) cho mẫu TiLV Thái Lan và (-) cho chứng âm Kích thước sản phẩm PCR1 và PCR2 được xác định lần lượt.
Khi so sánh khả năng chẩn đoán TiLV của quy trình RT-PCR trên đoạn trình tự số 3 và số 1 theo nghiên cứu của Dong et al (2017, 2020) và Taengphu et al (2020) với quy trình RT-PCR của Trung tâm CNSH Tp Hồ Chí Minh, kết quả cho thấy quy trình sử dụng bộ mồi Random hexamer/OligodT/Nested ext-1/ME1/7450/150R/ME2 cho khả năng phát hiện TiLV tốt nhất (Hình 3.2) Do đó, quy trình tối ưu này sẽ được áp dụng trong các kiểm tra TiLV tiếp theo của đề tài.
Dựa trên bộ gen TiLV, nhiều phương pháp PCR đã được phát triển, bao gồm RT-PCR, nested RT-PCR, semi-nested RT-PCR, RT-qPCR và RT-LAMP, chủ yếu tập trung vào đoạn trình tự 3 của TiLV Mặc dù Taengphu và cộng sự (2020) đã chỉ ra rằng quy trình RT-PCR với bộ mồi TiLV/nSeg1F, TiLV/nSeg1R, TiLV/nSeg1RN có độ nhạy cao hơn so với bộ mồi cho đoạn trình tự số 3, nhưng kết quả so sánh hiện tại lại cho thấy điều ngược lại Do đó, cần tiến hành khảo sát trên quy mô mẫu lớn hơn và với nồng độ mẫu khác nhau để xác minh độ nhạy và độ đặc hiệu của các quy trình RT-PCR đã được công bố cũng như quy trình đã được điều chỉnh tại Trung tâm CNSH Tp Hồ Chí Minh.
Kết quả chẩn đoán TiLV được thực hiện thông qua các quy trình RT-PCR dựa trên đoạn trình tự số 3 (Ex1/ME1) của Dong et al (2017) và đoạn trình tự số 1 (nSeq1F/R) của Taengphu et al (2020) Quá trình tổng hợp cDNA được điều chỉnh với cặp mồi random hexamer/oligodT từ Trung tâm CNSH Tp Hồ Chí Minh Mẫu RNA của TiLV-TL được tách bằng phương pháp Trizol, mẫu RNA của TiLV-TL Thái Lan được tách bằng QIAmp Viral RNA Mini, và mẫu TiLV-RIA2 cũng được phân tích Thang DNA 1kb (Thermo) được sử dụng làm tham chiếu.
Phân lập và nuôi cấy chủng TiLV Việt Nam
Trong nghiên cứu, nhóm đã nhận được tổng cộng 17 mẫu cá rô phi dương tính với virus TiLV từ các đơn vị chẩn đoán dịch bệnh thú y và khoa học trong nước Cụ thể, có 01 mẫu từ Chi cục Thú y Tp Hồ Chí Minh (tháng 06/2019), 11 mẫu từ Trung tâm chẩn đoán thú y Trung ương (tháng 10/2019), 01 mẫu từ Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II (tháng 12/2019) và 04 mẫu từ Học viện Nông nghiệp Việt Nam (tháng 03-08/2020) Đáng chú ý, 16 trong số 17 mẫu đã được bảo quản dưới dạng mẫu mô.
Tất cả 17 mẫu cá rô phi được bảo quản ở 80 độ C và 01 mẫu RIA2 trong cồn 96 độ đã được chẩn đoán dương tính với virus TiLV thông qua quy trình phát hiện TiLV bằng kỹ thuật semi-nested RT-PCR (TCCS 05:2017/TY-TS), áp dụng cho các đơn vị trực thuộc Cục Thú y Quy trình này được phát triển dựa trên nghiên cứu của Dong và cộng sự (Dong et al., 2017).
Nhóm nghiên cứu đã thu thập mẫu cá rô phi nghi ngờ nhiễm TiLV từ Quận 9, Tp Hồ Chí Minh (05 mẫu vào tháng 08/2019 và 02 mẫu vào tháng 06/2020) cũng như từ An Bình, Long Hồ, Vĩnh Long (29 mẫu vào tháng 03/2020 và 18 mẫu vào tháng 06/2020) Bè nuôi cá rô phi tại Quận 9 đã từng ghi nhận nhiễm TiLV vào tháng 5/2019 và đây cũng là nơi thu được mẫu cá dương tính TiLV của Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II.
Sau khi chuyển mẫu về Trung tâm CNSH Tp Hồ Chí Minh, sự hiện diện của virus TiLV trong 70 mẫu mô cá được kiểm tra bằng phương pháp RT-PCR Kết quả cho thấy chỉ có 7 mẫu (T11, RIA2, VL160, VL167, HB188, HB189 và HB196) dương tính với virus TiLV, trong khi các mẫu còn lại đều âm tính Điều này có thể do quá trình bảo quản và vận chuyển các mẫu từ ao nuôi cá rô phi hoặc từ các trung tâm khác đã làm giảm mật độ virus TiLV xuống dưới ngưỡng phát hiện của RT-PCR.
Hình 3 3 Kiểm tra sự hiện diện của TiLV trên mẫu mô cá do Chi cục Thú y Tp Hồ
Chí Minh đã cung cấp quy trình RT-PCR theo phương pháp của Dong et al (2017), sử dụng thang DNA 1kb từ New England Biolabs Các mẫu được phân tích bao gồm: mẫu TiLV từ Thái Lan, mẫu TY trước khi nhiễm tế bào E-11, mẫu TY sau khi nhiễm tế bào E-11 trong 17 ngày, và một chứng âm Kích thước sản phẩm PCR1 và PCR2 lần lượt là 415 bp và 250 bp.
Kiểm tra sự hiện diện của virus TiLV trên mẫu mô cá T1-T11 được thực hiện bởi Trung tâm chẩn đoán thú y Trung ương thông qua quy trình RT-PCR theo phương pháp của Dong et al (2020) Kết quả cho thấy mẫu TiLV từ Thái Lan (+) và chứng âm (-) với kích thước sản phẩm PCR1 là 620 bp và PCR2 là 274 bp, sử dụng thang DNA O’Generuler (Thermo) làm chuẩn.
Hình 3.5 minh họa quá trình kiểm tra sự hiện diện của virus TiLV trên mẫu mô cá do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II (RIA2) cung cấp, sử dụng phương pháp RT-PCR theo quy trình của Dong et al (2020) Thang DNA Hyperladder 1kb (Bioline) được sử dụng làm chuẩn trong phân tích.
Hình 3 6 Kiểm tra sự hiện diện của TiLV trên mẫu mô cá nghi nhiễm TiLV thu tại
Tp Hồ Chí Minh bằng quy trình semi nested RT-PCR M: thang DNA Hyperladder 1kb (Bioline); 1: Q3; 2: Q4; 3: Q130; 4: Q134; 5, 6: Chứng âm; 7: mẫu virus TiLV-TL
Hình 3.7 cho thấy quá trình kiểm tra sự hiện diện của virus TiLV trong các mẫu mô cá nghi nhiễm TiLV thu thập tại Vĩnh Long (VL156 – VL173) bằng phương pháp semi-nested RT-PCR Mẫu đối chứng dương là virus TiLV-RIA2, trong khi mẫu đối chứng âm được sử dụng để xác nhận tính chính xác của kết quả.
Hình 3.8 cho thấy việc kiểm tra sự hiện diện của virus TiLV trên các mẫu mô cá M1, HB188, HD189 và HB196 do Học viện Nông nghiệp Việt Nam cung cấp thông qua quy trình RT-PCR Mẫu DNA Hyperladder 1kb (Bioline) được sử dụng làm thang chuẩn, với các mẫu được đánh số: 1 cho M1, 2 cho mẫu virus TiLV Thái Lan, và 3 cho chứng âm.
Nuôi cấy virus TiLV bằng dòng tế bào E-11
Sau khi kiểm tra các mẫu cá dương tính với TiLV bằng RT-PCR tại Trung tâm CNSH Tp Hồ Chí Minh, các mẫu TY, T1-T11 và M1 đã được cảm nhiễm trên dòng tế bào E-11 để phân lập và nuôi cấy virus TiLV Những mẫu này có kết quả RT-PCR dương tính tại các Trung tâm/đơn vị cung cấp nhưng âm tính tại Trung tâm CNSH Nhóm nghiên cứu áp dụng phương pháp nuôi cấy tế bào để tăng hàm lượng virus nhằm chẩn đoán Sau 01 đến 04 ngày cảm nhiễm, mẫu T3, T6 và T11 cho thấy sự ly giải tế bào với các dấu hiệu đặc trưng do virus TiLV, trong đó mẫu T11 có khả năng ly giải tế bào mạnh nhất, đạt 100% sau 4 ngày, trong khi mẫu T3 và T6 ly giải hoàn toàn sau 4 và 6 ngày.
Kết quả cấy chuyền cho thấy dịch nuôi cấy T3, T6 và T11 mất dần hoạt tính ly giải tế bào ở lần cấy chuyền thứ 1, 1 và 3, trong khi dịch nuôi cấy T11 vẫn duy trì khả năng ly giải tế bào tốt sau 2 ngày cảm nhiễm ở lần cấy chuyền thứ 1 Đến lần cấy chuyền thứ 2, T11 bắt đầu có dấu hiệu ly giải tế bào vào ngày thứ 7, nhưng ở lần cấy chuyền thứ 3, tế bào E-11 không bị ly giải bởi dịch nuôi cấy T11 và tự bong tróc vào ngày thứ 20 Điều này cho thấy virus trong các mẫu này có thể không duy trì được trên dòng tế bào E-11 do hoạt lực yếu và không ổn định hơn dòng virus TiLV đối chứng của Thái Lan Mặc dù các dịch nuôi cấy sau mỗi lần cấy chuyền đều được bảo quản ở -80 o C, nhưng tất cả các mẫu đều cho kết quả âm tính với phản ứng RT-PCR chẩn đoán TiLV.
Các nghiên cứu cho thấy việc cảm nhiễm tế bào E-11 với dịch đồng nhất mẫu cá nghi nhiễm TiLV có độ chính xác tương đương với phản ứng nested RT-PCR (Kembou Tsofack et al., 2017) Nhiều dòng tế bào khác cũng được sử dụng để nuôi cấy TiLV, bao gồm tế bào não cá rô phi ban sơ (Eyngor et al., 2014a), OmB, TmB (Kembou Tsofack et al., 2017), CFF (Behera et al., 2018b), OnlB, OnlL (Thangaraj et al., 2018) Đặc biệt, Thangaraj và cộng sự (2018) đã thành công trong việc duy trì virus TiLV qua 20 đợt cấy chuyền trên dòng tế bào não (OnlB) và gan (OnlL) của cá rô phi Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu chưa đề cập đến tỷ lệ mật độ virus TiLV so với mật độ tế bào nuôi cấy, điều này rất quan trọng để đảm bảo quá trình ly giải diễn ra hiệu quả, cũng như thời điểm thu virus tối ưu (dựa trên phần trăm tế bào bị ly giải từ 50 - 90%) trước khi cấy chuyền để thu được lượng virus cao nhất.
Dựa trên các kết quả từ các mẫu TY, T1-T11 và M1, chúng tôi đưa ra ba lý do cho sự phát hiện virus TiLV: 1) Hàm lượng virus TiLV thấp hơn ngưỡng phát hiện của bộ kit RT-PCR; 2) Thời điểm thu mẫu virus ở mốc CPE 100% không phù hợp, vì lượng virus có thể giảm nhanh do thiếu vật chủ để xâm nhiễm; do đó, dịch virus nên được thu ở mốc CPE 50%-80%; 3) Có thể có sự hiện diện của các loại virus khác trong mẫu mô cá, cần khảo sát thêm để khẳng định sự đồng nhiễm giữa TiLV và các virus khác Chúng tôi đã tiến hành nghiền năm mẫu cá dương tính với TiLV và kết quả cho thấy mức độ ly giải tế bào khoảng 50%-80% trong 1 đến 8 ngày sau cảm nhiễm Qua các đợt cấy chuyền, bốn chủng VL160, VL167, HB188 và HD189 dần mất khả năng ly giải tế bào, trong khi chủng HB196 duy trì khả năng này ổn định đến lần cấy chuyền thứ 6 Kết quả semi-nested RT-PCR xác nhận sự tồn tại của TiLV trong dịch ly giải tế bào ở tất cả các mẫu.
Hình 3 9 Hình ảnh sau 1-8 ngày cảm nhiễm tế bào E-11 với dịch đồng nhất mẫu
Các dòng tế bào VL160, VL167, HB188, HD189 và HB196 cho thấy dấu hiệu ly giải tế bào đặc trưng khi quan sát ở vật kính 4X, với vệt tan trên tế bào Ở vật kính 20X, tế bào biểu hiện sự co tròn và bong tróc Thời gian dpi (số ngày sau khi cảm nhiễm virus vào tế bào) là yếu tố quan trọng trong nghiên cứu này.
Khả năng ly giải tế bào của các mẫu virus TiLV VL160, VL167, HB188, HD189 và HB196 đã được khảo sát qua các đợt cấy chuyển Các kết quả cho thấy, mũi tên xanh dương biểu thị khả năng ly giải từ 40% đến 80% tế bào, trong khi mũi tên màu cam chỉ ra khả năng ly giải từ 0% đến 40% Thời gian sau khi cảm nhiễm virus vào tế bào được ghi nhận bằng số ngày (dpi).
Hình 3 11 Kiểm tra sự hiện diện của TiLV trong các dịch nuôi cấy mẫu mô đồng nhất
VL160-P1, VL167-P1, HB188-P2, HD189-P2 và HB196-P3 bằng quy trình semi-nested RT-PCR M: thang DNA O’Generuler 1kb (Thermo); (+): mẫu virus TiLV- RIA2
Các mẫu VL160, VL167, HB188 và HD189 có mức độ nhiễm TiLV từ yếu đến trung bình, chỉ phát hiện ở bước 2 của quy trình semi-nested RT-PCR Mặc dù chủng TiLV ở các mẫu này được nuôi cấy thành công trên tế bào E-11, hàm lượng virus giảm dần qua các đợt cấy chuyền Ngược lại, mẫu HB196 cho kết quả semi-nested PCR dương tính ở cả hai bước, cho thấy mức độ nhiễm TiLV mạnh và được nuôi cấy ổn định qua 6 đợt cấy chuyền Điều này nhấn mạnh tầm quan trọng của mật độ virus trong mẫu mô ban đầu cho việc phân lập và duy trì virus TiLV trên dòng tế bào E-11 Chủng TiLV HB196 sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo liên quan đến giải trình tự bộ gen virus và công độc cá rô phi đỏ.
Bộ gen virus TiLV Việt Nam
3.4.1 Dữ liệu bộ gen TiLV sau khi giải trình tự NGS và Sanger
Trong quá trình phân lập chủng virus TiLV, chúng tôi đã thu được hai mẫu cá nhiễm TiLV nặng là RIA2 và HB196 Do đó, chúng tôi tiến hành giải trình tự gen TiLV từ hai mẫu này Các cặp mồi đã được sử dụng để khuếch đại 10 đoạn trình tự gen TiLV và được kiểm tra bằng PCR trên hai mẫu TiLV Việt Nam (RIA2 và HB196) Kết quả PCR cho thấy 10 đoạn trình tự được khuếch đại đúng kích thước dự kiến.
Sản phẩm PCR khuếch đại 10 đoạn trình tự (S1-S10) của bộ gen TiLV Việt Nam (RIA2) và TiLV Thái Lan (TiLV_TL) được trình bày trong hình 3.12 Thang DNA Hyperladder 1kb (Bioline) được sử dụng làm chuẩn, với các mẫu được đánh số: 1 là TiLV_RIA2, 2 là chứng (-), và 3 là TiLV_TL.
Hình 3 13 Sản phẩm PCR khuếch đại 10 đoạn trình tự (S1-S10) của bộ gen TiLV
HB196 M: Thang DNA Hyperladder 1kb (Bioline); 1: TiLV_RIA2; 2: Chứng (-); 3: TiLV_TL
Bảng 3.1 trình bày các thông số giải trình tự NGS của hai mẫu RIA2 và HB196, với tổng số trình tự đọc lần lượt là 472.124 cho mẫu RIA2 và 2.215.636 cho mẫu HB196 Sự chênh lệch này xuất phát từ loại DNA được sử dụng, trong đó mẫu RIA2 là cDNA và mẫu HB196 là sản phẩm PCR tinh sạch Các thông số đánh giá chi tiết, bao gồm độ phủ trung bình trên toàn bộ gen, số trình tự đọc sắp gióng cột và kết quả sắp gióng cột trên từng đoạn trình tự của TiLV, được trình bày trong Phụ lục 4 Kết quả giải trình tự cho thấy bộ gen của RIA2 và HB196 có kích thước lớn hơn 10.324 bp, cùng với các phân tích quan hệ di truyền được thực hiện trên vùng trình tự tương đồng.
Chủng TiLV Việt Nam có 8862 bp và được so sánh với 23 bộ gen TiLV khác, cho thấy sự tương đồng trình tự nucleotide giữa RIA2 hoặc HB196 với các bộ gen TiLV tham khảo đạt từ 92,2 – 93,5% và 94,8 – 96,2% Trong khi đó, 21 bộ gen tham khảo có sự tương đồng cao hơn, từ 95,2 – 99,4% Trong 10 đoạn gen, đoạn số 6 có sự thay đổi nucleotide nhiều nhất (88,7 – 95%), tiếp theo là đoạn số 5 (90,3 – 96,0%) và đoạn số 3 (90,8 – 95,9%), trong khi đoạn số 9 là đoạn bảo toàn nhất (94,6 – 99%) Nghiên cứu của Pulido et al (2019) cũng ghi nhận sự khác biệt cao ở đoạn số 6 và trình tự nucleotide bảo tồn hơn ở đoạn số 9 khi so sánh chủng TiLV F3-4 của Peru với các chủng khác từ Thái Lan và Israel.
Chủng TiLV tham khảo có trình tự nucleotide tương đồng với chủng RIA2 (AD-2016, Israel) và EC-2012 (Ecuador) ở 7/10 đoạn gen, trong khi với chủng HB196 là các chủng Thái Lan ở 9/10 đoạn gen Điều này gợi ý rằng hai chủng TiLV tại Việt Nam có nguồn gốc khác nhau.
Bảng 3 1 Thông tin trình tự bộ gen TiLV chủng RIA2 và HB196 sau khi giải bằng hệ thống NGS
Vật chủ Cá rô phi vằn
Cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus) Địa điểm thu mẫu Tp Hồ Chí Minh Hòa Bình
Loại mẫu DNA giải trình tự NGS cDNA Sản phẩm PCR tinh sạch
Công cụ lắp ráp BWA v0.7.17 BWA v0.7.17
(read) sau tinh sạch 131 bp 100-151 bp
Phần trăm GC (%) 46 46 Độ phủ (X) 5662,5 28892,28
Số lượng trình tự đọc
Mã truy cập Genbank ON376572-ON376581 ON376582-ON376591
Bảng 3.2 trình bày độ dài từng đoạn gen của TiLV Việt Nam, cùng với độ tương đồng cao nhất của mỗi đoạn so với 21 chủng TiLV tham khảo Cột “Mã truy cập Genbank” và “Nguồn gốc” cung cấp thông tin về chủng tham khảo có độ tương đồng cao nhất với chủng RIA2 và HB196 Các đoạn gen được cắt gọn để phân tích quan hệ di truyền, giúp hiểu rõ hơn về sự tương đồng giữa các chủng.
Nguồn gốc Chiều dại vùng đọc mở sau khi chỉnh (nt)
Khoảng cách trung bình giữa 23 bộ gen TiLV cho thấy gen số 8, 9, 10 có mức độ bảo tồn cao ở trình tự nucleotide Tuy nhiên, sự đa dạng trong trình tự amino acid giữa các đoạn này lại có sự khác biệt rõ rệt.
9 là một trong ba đoạn có sự đa dạng về trình tự amino acid cao nhất, cùng với đoạn số
Đoạn số 1-4 có nhiều đột biến nucleotide hơn nhưng lại thuộc nhóm có trình tự amino acid bảo toàn cao, điều này được thể hiện qua các cây quan hệ di truyền với giá trị bootstrap thấp hơn khi so với cây dựa trên trình tự nucleotide Kết quả cho thấy đa số đột biến điểm ở trình tự nucleotide của đoạn số 1-4, 8 và 10 là đột biến lặn, tương tự như nghiên cứu của Chaput et al (2020) về bảy bộ gen TiLV từ nhiều quốc gia, cho thấy sự đa dạng amino acid không đủ lớn để phân tích mối quan hệ di truyền do giá trị bootstrap thấp.
Khoảng cách nucleotide và amino acid trung bình giữa các vị trí được phân tích dựa trên sự tương đồng của các vùng đọc mở trong 23 bộ gen TiLV từ các quốc gia như Việt Nam, Israel, Thái Lan, Ecuador, Peru, Mỹ và Bangladesh Thanh lỗi biểu thị sự khác biệt ước tính thông qua 1000 lần lặp lại bootstrap của đoạn gen TiLV.
Hiện tượng tái tổ hợp là yếu tố quan trọng trong sự tiến hóa của virus, giúp tạo ra các tổ hợp gen mới nhanh chóng và thích nghi với áp lực chọn lọc tự nhiên (Lowen, 2018b; McDonald et al., 2016; Pérez-Losada et al., 2015; Vijaykrishna et al., 2015) Các nghiên cứu gần đây về TiLV cũng nhấn mạnh tầm quan trọng của hiện tượng tái tổ hợp (Chaput et al., 2020; Thawornwattana et al., 2021) Nghiên cứu của chúng tôi đã áp dụng bảy thuật toán để phát hiện hiện tượng tái tổ hợp giữa 23 bộ gen TiLV, dựa trên trình tự vùng đọc mở ở 10 đoạn gen nối lại, và phát hiện bảy sự kiện tái tổ hợp tiềm năng, bao gồm sự kiện ở đoạn số 2 giữa chủng HB196 và RIA2.
Có sự tương đồng giữa các chủng virus như sau: 1) giữa tổ tiên của chủng TH-2013 và TH-2016-CU; 2) giữa tổ tiên của chủng TH-2013 và TH-2015; 3) giữa tổ tiên của chủng Til-4-2011 và EC-2012; 4) giữa tổ tiên của chủng TH-2017 và chủng TiLV chưa xác định; 5) giữa tổ tiên của chủng TV1 và chủng TiLV chưa xác định.
7) ở đoạn số 5-10 giữa (tổ tiên của) chủng TH-2015 and chủng TiLV chưa xác định (Hình 3.15) Vị trí bắt đầu và kết thúc của các đoạn tái tổ hợp phù hợp với vị trí đầu và cuối của các đoạn gen Sự tái tổ hợp ở đoạn số 2 giữa hai chủng TiLV Việt Nam cho thấy sự vận chuyển cá giữa các vùng khác nhau ở Việt Nam (RIA2 ở miền Nam và HB196 ở miền Bắc) có thể dẫn đến sự trộn lẫn vật liệu di truyền giữa các chủng Một số hiện tượng tái tổ hợp ở đoạn số 3 giữa TH-2013 và TH-2016-CU, đoạn số 5-6 giữa Til- 4-2011 và EC-2012 lần lượt đã được Lowen (2018a), Chaput et al (2020) và Thawornwattana et al (2021) báo cáo trước đây và gợi ý về sự chuyển dịch của các đoạn gen giữa các chủng TiLV để hình thành nên các biến thể mới Chaput et al (2020) từng đề cập đến sự liên quan của đoạn số 5 và 6 (có thể cả đoạn số 1 và 2) đến lịch sử tái tổ hợp của chủng TiLV Tương tự như phát hiện của Chaput et al (2020), chúng tôi cũng ghi nhận đoạn số 6 là nơi diễn ra nhiều sự kiện tái tổ hợp, với năm trong bảy hiện tượng được tìm thấy xảy ra ở đoạn gen này
Hiện tượng tái tổ hợp ảnh hưởng đến quần thể virus TiLV toàn cầu vẫn chưa được làm rõ do dữ liệu dịch tễ về TiLV còn hạn chế ở nhiều khu vực Hiện tại, hơn 43 quốc gia nghi ngờ có sự hiện diện của TiLV (Dong et al., 2017b), nhưng thông tin vẫn còn thiếu.
Mười bảy quốc gia, bao gồm Việt Nam, đã công khai dữ liệu về virus TiLV Việc tiến hành các nghiên cứu bổ sung với số lượng virus lớn hơn từ nhiều vùng và thời điểm khác nhau sẽ giúp hiểu rõ hơn về sự tiến hóa, độc lực, lây lan và chọn lọc tự nhiên của TiLV, đồng thời xác định các đoạn gen quan trọng để phát triển vaccine phòng ngừa bệnh này (Chaput et al., 2020; Pérez-Losada et al., 2015).
Hình 3 15 Hiện tượng tái tổ hợp ở 10 đoạn trình tự của 23 bộ gen TiLV Số đoạn trình tự được ghi bên dưới
Bảy cây quan hệ di truyền được xây dựng dựa trên các đoạn trình tự đơn 2, 3, 5, 6,
Trong nghiên cứu di truyền, hai chủng Việt Nam đã hình thành nhóm với giá trị bootstrap 100% trong cây di truyền của đoạn số 2 Trong khi đó, chủng RIA2 cho thấy mối quan hệ di truyền xa với tất cả 22 chủng còn lại, ngược lại, chủng HB196 lại gần gũi hơn với các chủng Thái Lan.
Khảo sát độc lực của TiLV trên cá rô phi đỏ
3.5.1 Nuôi cấy và xác định mật độ virus (TCID 50 ) của chủng TiLV HB196
Chủng TiLV HB196 sau khi được phân lập và cấy chuyền đến P3 trong bình 25 cm² đã được chuyển sang 4 bình 75 cm², thu được tổng thể tích dịch nuôi cấy virus là 52 mL Lượng virus này được bảo quản trong cryotube 2 mL (400 μL/ống) ở nhiệt độ -80°C Dịch gốc virus HB196 sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo, bao gồm xác định TCID50 và công độc của cá rô phi đỏ.
Quy trình xác định mật độ virus HB196 được lặp lại ba lần, với công thức tính TCID50 mL -1 được trình bày trong Phụ lục 7 Kết quả cho thấy mật độ trung bình của virus HB196 là 1,82 x 10^6 TCID50 mL -1.
Kết quả nuôi cấy chủng TiLV HB196 trên dòng tế bào E-11 cho thấy dấu hiệu ly giải đặc trưng (CPE) được quan sát rõ ràng sau khi cảm nhiễm, với hình ảnh được chụp ở vật kính 4x và 20x Đối chứng cho thấy mẫu HB196 ở nồng độ pha loãng 10^-5 sau 14 ngày sau khi nhiễm (dpi) cũng được ghi nhận.
Bài viết mô tả bố trí thí nghiệm để xác định mật độ virus HB196 trên đĩa 96 giếng với ba lần lặp lại Tại các giếng, tỷ lệ phần trăm tế bào ly giải được ghi chú rõ ràng, cùng với hệ số pha loãng của virus.
Lần 2 Đối chứng (-), 17 dpi, 10x HB196 (pha loãng 10 -5 ), 17 dpi, 10x
Lần 3 Đối chứng (-), 17 dpi, 10x HB196 (pha loãng 10 -5 ), 17 dpi, 10x ghi chú ở cột cuối cùng (dilution factor) trong bảng Hình ảnh tế bào ly giải được chụp lại và đánh dấu bằng hình ngôi sao () dpi: số ngày sau khi cảm nhiễm virus vào tế bào (day(s) post infection)
3.5.2 Công độc cá rô phi đỏ với chủng TiLV HB196
Cá ở bể tiêm TiLV HB196 bắt đầu chết từ ngày thứ 2, với tỷ lệ tử vong cao nhất từ ngày thứ 6 đến thứ 10 Trong khoảng thời gian từ ngày 1 đến ngày 5, cá chết thường không có triệu chứng bệnh rõ ràng, trong khi từ ngày thứ 8 trở đi, cá xuất hiện dấu hiệu như chán ăn, bơi lờ đờ, xuất huyết và lở loét trên da Nghiệm thức cá ~5 g tiêm virus với mật độ 1,82 x 10^5 TCID50 cá -1 có tỷ lệ chết cao nhất (92,5%), tiếp theo là 1,82 x 10^4 TCID50 cá -1 (47,5%) và 1,82 x 10^3 TCID50 cá -1 (27,5%) Đối với cá lớn hơn (~20 g) tiêm với nồng độ virus 1,82 x 10^5 TCID50 cá -1, tỷ lệ chết thấp nhất chỉ là 12,5% Tỷ lệ chết ở hai bể lặp lại với nghiệm thức 1,82 x 10^4 TCID50 cá -1 có sự chênh lệch lớn, phản ánh sự không ổn định của độc lực virus, thao tác tiêm hoặc chất lượng cá giữa hai bể.
Nghiên cứu cho thấy trọng lượng cá ảnh hưởng đến khả năng xâm nhiễm và gây bệnh của virus TiLV, với cá rô phi từ 1-10 g nhạy cảm hơn so với cá lớn hơn 100 g Tỷ lệ chết do TiLV trên cá nhỏ (1-50 g) dao động từ 20-90% Các thử nghiệm trong phòng thí nghiệm cho thấy tỷ lệ chết từ 45% đến 100% ở cá rô phi vằn và cá rô phi đỏ từ 10-15 g Gần đây, Roy và cộng sự (2021) đã tiêm virus TiLV vào cá rô phi đỏ với kích cỡ 5 g, 25 g và 65 g, ghi nhận tỷ lệ chết lần lượt là 85%, 55% và 51,67%.
Sự hiện diện của TiLV trong các mẫu cá chết đã được xác định qua phản ứng semi-nested PCR, cho thấy cá tiêm TiLV đều cho kết quả PCR dương tính, trong khi cá đối chứng lại cho kết quả PCR âm tính (Hình 3.22).
Hình 3 20 Tỷ lệ chết của cá rô phi đỏ với kích cỡ ~5g và ~20 g sau khi công độc với chủng TiLV HB196 bằng phương pháp tiêm (100 μL cá -1 )
Hình 3 21 Biểu hiện bệnh lý của cá tiêm TiLV (A) so với cá đối chứng (B) trong quá trình công độc với chủng HB196 bằng phương pháp tiêm
Bảng 3 3 Bố trí thí nghiệm công độc cá rô phi đỏ với chủng TiLV HB196
Liều virus Số bể Kích cỡ cá (g) Tỷ lệ cá chết (%)
Tỷ lệ chết trung bình (%)
Hình 3.22 trình bày kết quả kiểm tra sự hiện diện của virus TiLV ở các mẫu cá tiêm virus và cá đối chứng sau quá trình công độc Các giếng thí nghiệm bao gồm: Giếng 1, 2 chứa cá ~20 g tiêm HB196 với liều 1,82 x 10^5 TCID50 cá -1; Giếng 3, 4 chứa cá ~5 g tiêm HB196 với liều 1,82 x 10^5 TCID50 cá -1; Giếng 5, 6 có cá tiêm HB196 với liều 1,82 x 10^4 TCID50 cá -1; Giếng 7, 8 chứa cá ~5 g tiêm HB196 với liều 1,82 x 10^3 TCID50 cá -1; và Giếng 9, 10 là cá đối chứng âm Kết quả cho thấy mẫu TiLV chứng dương (+) và chứng âm (-) được xác định rõ ràng.
Công độc cá rô phi đỏ với TiLV HB196 để thu mẫu phân tích hệ gen phiên mã
Kết quả từ nghiên cứu cho thấy liều gây chết 70% cá rô phi đỏ với chủng TiLV HB196 được xác định là khoảng 9,2 x 10^4 TCID50 cá -1 Sau khi tiêm virus, cá bắt đầu chết từ ngày thứ 5, với tỷ lệ chết tích lũy đạt 80% ở bể 1 và 85% ở bể 2 sau 21 ngày theo dõi Trong thử nghiệm, 12 mẫu cá được thu thập, bao gồm 3 mẫu cá chết đầu tiên, 3 mẫu cá đối chứng và 3 mẫu cá sống sau 21 ngày cùng 3 mẫu đối chứng Kiểm tra sự hiện diện của TiLV bằng phản ứng semi-nested RT-PCR cho thấy tất cả 6 mẫu cá tiêm TiLV đều dương tính, trong khi 6 mẫu đối chứng âm tính Bốn mẫu mô cơ quan từ cá sẽ được tách chiết RNA và giải trình tự để phân tích hệ gen phiên mã.
Bảng 3 4 Bố trí thí nghiệm công độc cá rô phi đỏ với chủng TiLV HB196
Liều virus Số bể Kích cỡ cá
Tỷ lệ chết trung bình (%)
Bể 2 4,5±1,14 85 Đối chứng âm Bể1 5,11±1,84 0
Hình 3 23 Tỷ lệ chết của cá rô phi đỏ với kích cỡ ~5g sau khi công độc với chủng TiLV HB196 ở mật độ 9,2 x 10 4 TCID50 cá -1 bằng phương pháp tiêm (100 μL cá -1 )
Kiểm tra sự hiện diện của virus TiLV ở mẫu cá tiêm và cá đối chứng đã được thực hiện sau quá trình công độc Sử dụng thang DNA 1kb từ Thermo, các mẫu cá tiêm TiLV chết vào ngày thứ nhất, thứ ba và thứ năm đã được phân tích.
5 và 6; 2, 4, 6: cá đối chứng thu cùng thời điểm cá tiêm TiLV chết; 7, 9, 11: cá tiêm TiLV còn sống ngày 21; 8, 10, 12: cá đối chứng thu ngày 21
Giải trình tự hệ gen phiên mã cá rô phi sau khi công độc với virus TiLV
Ba mươi sáu mẫu RNA được tách chiết từ mô gan, ruột, lách và thận đã được kiểm tra chất lượng với tỷ lệ 260/280 nằm trong khoảng 1.8-2.0, đảm bảo độ nguyên vẹn cao Đặc biệt, kết quả điện di trên gel agarose cho thấy các mẫu đều có vạch 28S và 18S nguyên vẹn.
Hình 3 25 Kiểm tra độ nguyên vẹn (28S và 18S) của các mẫu RNA tách từ mô cá rô phi sau khi đã xử lý DNase
3.7.2 Kết quả giải trình tự và phân tích hệ gen phiên mã
Gan là một trong những cơ quan chủ yếu bị ảnh hưởng bởi virus TiLV, do đó, việc phân tích hệ gen phiên mã của gan sau khi tiếp xúc với TiLV sẽ cung cấp thông tin quan trọng về cách tác nhân gây bệnh này xâm nhập vào cá, cũng như khả năng chống chịu của gan đối với TiLV (Sood et al, 2022).
Trong khoảng thời gian từ giữa tháng 03/2022 đến cuối tháng 04/2022, chúng tôi đã gửi 36 mẫu RNA tổng tách chiết từ mô cá đến Trung tâm Ktest để giải trình tự RNA Hiện tại, chúng tôi đã nhận được 25 dữ liệu RNA-seq hoàn chỉnh (9 mẫu từ mô gan, 8 mẫu từ mô ruột và 8 mẫu từ mô lách) Thêm vào đó, 09 mẫu RNA từ mô thận vừa được giải trình tự xong vào ngày 29/6/2022 và dự kiến sẽ hoàn tất lắp ráp vào ngày 06/07/2022 Hai mẫu RNA còn lại (một từ mô ruột và một từ mô lách) vẫn đang trong quá trình giải trình tự và chưa có dữ liệu phân tích Do đó, báo cáo hiện tại chỉ phân tích 25 mẫu RNA đã hoàn thiện, và chúng tôi sẽ bổ sung dữ liệu của các mẫu còn lại trong thời gian tới.
Tổng số trình tự đọc từ ba lần lặp lại của mẫu gan ở nhóm cá chết, cá sống và cá đối chứng lần lượt là 61.109.616, 61.078.888 và 61.080.693 Tỷ lệ phần trăm trình tự sắp gióng với bộ gen tham chiếu Orenil1.0 cho nhóm cá chết là 80,52 – 89,29%, nhóm cá sống là 83,57 – 86,54% và nhóm cá đối chứng là 85,41 – 86,42% Tỷ lệ phần trăm trình tự sắp gióng vào vùng exon của nhóm cá chết đạt 94,87 – 95,17%, nhóm cá sống là 90,32 – 95,14% và nhóm cá đối chứng là 95,38 – 95,65% Mặt khác, tỷ lệ trình tự sắp gióng vào vùng rRNA đều thấp ở tất cả các mẫu.
So với bộ gen tham chiếu Orenil1.0, nghiên cứu đã phát hiện 1302 SNP đặc trưng chỉ xuất hiện ở nhóm cá sống trong mẫu mô gan của cá rô phi đỏ, không có mặt ở nhóm cá chết và nhóm cá đối chứng, như được trình bày trong Bảng 3.6.
Trong nghiên cứu, có tổng cộng 599 SNP được xác định nằm trên các gen thuộc nhóm chức năng về chu trình sinh học, 585 SNP liên quan đến gen thuộc nhóm chức năng phân tử, 109 SNP ở gen có chức năng về cấu trúc tế bào, và 9 SNP thuộc nhóm gen chưa rõ chức năng (Phụ lục 9).
Trong nghiên cứu về hệ gen phiên mã mẫu mô gan của cá rô phi đỏ, đã phát hiện tổng cộng 81 chỉ thị microsatellite chỉ có ở nhóm cá sống, không xuất hiện ở nhóm cá chết và nhóm cá đối chứng Cụ thể, trong số đó có 12 chỉ thị liên quan đến gen chức năng về chu trình sinh học, 57 chỉ thị thuộc nhóm chức năng phân tử, 11 chỉ thị liên quan đến gen có chức năng cấu trúc tế bào, và 1 chỉ thị thuộc nhóm gen chưa xác định chức năng.
Bảng 3.5 trình bày thống kê thông tin về trình tự hệ gen phiên mã của mô gan ở nhóm cá chết, cá sống và cá đối chứng sau khi tiếp xúc với virus TiLV.
Tổng số cặp trình tự đọc (total read)
Số cặp trình tự sắp gióng được với bộ gen tham chiếu
Tỷ lệ (%) trình tự sắp gióng được với bộ gen tham chiếu
Tỷ lệ (%) trình tự sắp gióng được vào vùng exon
Tỷ lệ (%) trình tự sắp gióng được vào vùng rRNA cá chết 1 20.336.756 48,50 94,30 18.041.947 88,72% 94,94% 16S:0.38%, 18S:2.46%, 23S:1.96, 28S:2.94% cá chết 2 20.360.779 49,50 94,80 16.394.299 80,52% 94,87% 16S:0.71%, 18S:4.65%, 23S:3.72, 28S:6.46% cá chết 3 20.412.081 49,40 94,90 18.226.069 89,29% 95,17% 16S:0.33%, 18S:1.80%, 23S:1.94, 28S:2.70% cá sống 1 20.360.372 48,90 94,90 17.015.866 83,57% 95,14% 16S:0.64%, 18S:4.02%, 23S:3.24, 28S:5.63% cá sống 2 20.358.982 49,60 94,70 17.619.664 86,54% 91,79% 16S:0.53%, 18S:3.36%, 23S:2.65, 28S:4.11% cá sống 3 20.359.534 48,50 94,60 17.541.726 86,16% 90,32% 16S:0.53%, 18S:3.31%, 23S:2.30, 28S:3.50% cá ĐC 1 20.360.769 49,90 94,70 17.594.874 86,42% 95,41% 16S:0.53%, 18S:3.29%, 23S:2.63, 28S:4.18% cá ĐC 2 20.360.057 50,40 94,80 17.390.031 85,41% 95,38% 16S:0.57%, 18S:3.54%, 23S:2.64, 28S:4.84% cá ĐC 3 20.359.867 50,20 94,70 17.468.328 85,80% 95,65% 16S:0.58%, 18S:3.54%, 23S:2.84, 28S:4.63%
Bảng 3 6 Số lượng và đặc điểm các SNP tìm thấy ở hệ gen phiên mã mẫu mô gan của cá rô phi đỏ
Xóa base làm lệch khung đọc
Chèn base làm lệch khung đọc
Xóa base không làm lệch khung đọc
Chèn base không làm lệch khung đọc
Làm thay đổi amino acid
Không làm thay đổi amino acid
Tổng cộng cá chết 1 44 130 97 63 5.788 9.242 19 10 42.388 57.781 cá chết 2 53 169 106 92 7.280 11.973 27 10 51.665 71.375 cá chết 3 60 135 93 60 5.320 8.675 20 7 38.011 52.381 cá sống 1 63 161 97 93 5.849 9.569 25 13 46.429 62.299 cá sống 2 60 183 133 88 7.664 12.828 27 12 53.436 74.431 cá sống 3 91 232 201 158 14.414 20.029 51 19 84.793 119.988 cá ĐC 1 50 140 77 55 4.618 7.945 18 8 38.661 51.572 cá ĐC 2 53 135 101 62 5.619 9.507 22 9 40.913 56.421 cá ĐC 3 60 135 93 60 5.320 8.675 20 7 38.011 52.381
Bảng 3 7 Số lượng chỉ thị microsatellite tìm thấy ở hệ gen phiên mã mẫu mô gan của cá rô phi đỏ
Loại cá Số lượng chỉ thị microsatellite tìm thấy cá chết 1 118.124 cá chết 2 121.213 cá chết 3 121.346 cá sống 1 124.024 cá sống 2 124.533 cá sống 3 129.288 cá ĐC 1 120.717 cá ĐC 2 126.264 cá ĐC 3 119.310
Mô lympho gắn với ruột ở động vật có xương là một đặc tính cố định, mặc dù cá không có cấu trúc Peyer rõ ràng như động vật có vú, chim và bò sát Mô lympho của cá bao gồm sự kết hợp giữa các tế bào miễn dịch và tế bào lympho phân tán, bao gồm bạch cầu ái toan, bạch cầu trung tính và đại thực bào trong lớp đệm ruột Globulin miễn dịch IgM từ huyết thanh được vận chuyển vào niêm mạc ruột khi có tác nhân gây bệnh, trong khi các kháng thể IgM, IgT/IgZ được sản xuất tại chỗ bởi tế bào huyết tương tương tự GALT Đoạn ruột sau là vị trí chính để hấp thu và xử lý kháng nguyên vi khuẩn, góp phần vào phản ứng miễn dịch của cả hệ thống và niêm mạc đối với tác nhân gây bệnh trong ruột.
Tổng số trình tự giải được từ 2-3 lần lặp lại của mẫu ruột ở nhóm cá chết (n=2), cá sống (n=3) và cá đối chứng (n=3) lần lượt đạt 41.890.829.
Tỷ lệ phần trăm số trình tự sắp gióng được so với bộ gen tham chiếu Orenil1.0 cho thấy nhóm cá chết đạt 85,43 – 90,07%, nhóm cá sống đạt 81,55 – 87,07%, và nhóm cá đối chứng đạt 83,75 – 86,08% Đặc biệt, tỷ lệ phần trăm số trình tự sắp gióng vào vùng exon của nhóm cá chết là 93,36 – 94,92%, nhóm cá sống là 90,02 – 91,94%, và nhóm cá đối chứng là 89,18 – 94,3% Tuy nhiên, tỷ lệ trình tự sắp gióng vào vùng rRNA đều thấp ở tất cả các mẫu.
So với bộ gen tham chiếu Orenil1.0, nghiên cứu đã phát hiện 276 SNP chỉ có ở nhóm cá sống, không có ở nhóm cá chết và nhóm cá đối chứng, như trình bày trong Bảng 3.9 Trong số này, 141 SNP liên quan đến gen chức năng về Chu trình sinh học, 106 SNP thuộc nhóm Chức năng phân tử, 28 SNP liên quan đến cấu trúc tế bào, và 1 SNP thuộc nhóm gen chưa xác định chức năng (Phụ lục 11).
Trong nghiên cứu này, tổng cộng 95 chỉ thị microsatellite đã được phát hiện trong hệ gen phiên mã mẫu mô ruột của cá rô phi đỏ sống, như trình bày trong Bảng 3.10 Những chỉ thị này không có mặt ở nhóm cá chết và nhóm cá đối chứng Cụ thể, có 34 chỉ thị liên quan đến gen chức năng về Chu trình sinh học, 16 chỉ thị thuộc nhóm Chức năng phân tử, và 45 chỉ thị ở gen có chức năng về Cấu trúc tế bào (Phụ lục 12).
Bảng 3.8 trình bày thống kê thông tin về trình tự hệ gen phiên mã của mô ruột ở nhóm cá chết, cá sống và cá đối chứng sau khi tiếp xúc với virus TiLV.
Tổng số cặp trình tự đọc (total read)
Số cặp trình tự sắp gióng được với bộ gen tham chiếu
Tỷ lệ (%) trình tự sắp gióng được với bộ gen tham chiếu
Tỷ lệ (%) trình tự sắp gióng được vào vùng exon
Tỷ lệ (%) trình tự sắp gióng được vào vùng rRNA cá chết 1 20.901.871 48,50 94,50 18.826.920 90,07% 94,92% 16S:0.30%, 18S:2.03%, 23S:1.81, 28S:2.66% cá chết 2 20.988.958 47,40 94,60 17.931.551 85,43% 93,36% 16S:0.51%, 18S:3.15%, 23S:2.35, 28S:3.62% cá chết 3 - - - - - - - cá sống 1 20.358.355 48,60 94,70 16.602.011 81,55% 94,02% 16S:%, 18S:%, 23S:, 28S:% cá sống 2 20.362.028 47,90 94,60 17.728.921 87,07% 90,95% 16S:0.52%, 18S:3.31%, 23S:2.31, 28S:3.53% cá sống 3 20.361.039 49,80 94,80 17.168.643 84,32% 91,94% 16S:0.60%, 18S:3.79%, 23S:2.91, 28S:5.22% cá ĐC 1 20.360.422 48,50 95,00 17.490.134 85,90% 90,21% 16S:0.54%, 18S:3.38%, 23S:2.56, 28S:4.11% cá ĐC 2 20.360.937 49,90 94,70 17.526.593 86,08% 94,30% 16S:0.51%, 18S:3.05%, 23S:2.70, 28S:4.34% cá ĐC 3 21.057.818 48,10 94,50 17.635.217 83,75% 89,18% 16S:0.58%, 18S:3.40%, 23S:2.57, 28S:4.08%
Xóa base làm lệch khung đọc
Chèn base làm lệch khung đọc
Xóa base không làm lệch khung đọc
Chèn base không làm lệch khung đọc
Làm thay đổi amino acid
Không làm thay đổi amino acid
Tổng cộng cá chết 1 46 147 91 78 6.135 9.656 17 11 45.291 61.472 cá chết 2 80 214 158 123 11.103 16.032 49 15 77.056 104.830 cá chết 3 - - - - cá sống 1 80 214 158 123 11.103 16.032 49 15 73.954 73.954 cá sống 2 78 257 175 144 12.620 17.668 45 24 78.049 109.060 cá sống 3 43 108 84 70 5.326 8.694 19 11 41.759 56.114 cá ĐC 1 69 188 151 114 9.623 13.915 38 16 62.337 86.451 cá ĐC 2 91 250 166 125 12.044 17.449 43 21 79.819 110.008 cá ĐC 3 93 246 164 122 12.317 17.265 42 14 90.861 121.124
Bảng 3 10 Số lượng chỉ thị microsatellite tìm thấy ở hệ gen phiên mã mẫu mô ruột của cá rô phi đỏ
Loại cá Số lượng chỉ thị microsatellite tìm thấy cá chết 1 118.754 cá chết 2 125.658 cá chết 3 - cá sống 1 129.711 cá sống 2 129.411 cá sống 3 125.346 cá ĐC 1 127.613 cá ĐC 2 130.268 cá ĐC 3 130.107
Lách, một cơ quan quan trọng có mặt ở hầu hết động vật có xương sống, thực hiện nhiều chức năng như lọc máu, phá hủy hồng cầu, biểu diễn kháng nguyên và sản xuất kháng thể (Zapata, 1982; Castro and Taffala, 2015) Cấu trúc lách ở cá có xương sống và động vật có vú tương tự nhau, bao gồm mạch máu cùng với phần củi đỏ và trắng khác biệt (Secombes and Wang, 2012; Castro and Taffala, 2015) Lách còn có thể chứa dịch bệnh chủ yếu, và so với các cơ quan khác như da, cơ, mang và gan, lách và thận thường chứa lượng tác nhân gây bệnh (virus và vi khuẩn) cao, có khả năng ức chế hệ thống miễn dịch (Orieux et al.).
