Nhân giống và xây dựng mô hình trồng nhằm thu nhận nguồn nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị ung thư từ cây bìm bịp clinacanthus nutans

Khảo nghiệm ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên khả năng phát triển cây từ chồi.. Khảo nghiệm ảnh hưởng của lượng phân bón, kiểu trồng đến khả năng sinh trưởng và tích l

Trang 1

i

ỦY BAN NHÂN DÂN VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CÔNG NGHỆ

NHÂN GIỐNG VÀ XÂY DỰNG MÔ HÌNH TRỒNG NHẰM THU NHẬN NGUỒN NGUYÊN LIỆU ĐỂ SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ TỪ CÂY BÌM BỊP

(Clinacanthus nutans)

Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Viện Sinh học nhiệt đới

Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS Bùi Đình Thạch

Thành phố Hồ Chí Minh - 2019

TpHCM, 2019

Trang 2

i

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH xii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xvi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 4

1.1 Tổng quan về cây Bìm bịp 4

1.1.1 Phân loại thực vật 4

1.1.2 Đặc điểm thực vật học 4

1.1.3 Thành phần hóa học 6

1.1.4 Công dụng 9

1.2 Nhân giống in vitro 13

1.2.1 Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro 13

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 14

1.2.2.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 14

1.2.2.2 Ảnh hưởng của mẫu nuôi cấy 16

1.2.2.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 19

1.2.3 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng 19

1.2.4 Một số kết quả ghi nhận ứng dựng nuôi cấy mô một số loài Clinacanthus nutans 20

1.3 Một số yếu tố tự nhiên ảnh hưởng cây trồng 21

1.3.1 Yếu tố khí hậu – thời tiết 21

Trang 3

ii

1.3.2 Yếu tố đất đai 23

1.4 Tổng quan cao dược liệu 25

1.4.1 Định nghĩa 25

1.4.2 Phương pháp điều chế 26

1.4.3 Tiêu chuẩn chất lượng cao dược liệu 27

1.4.4 Bảo quản 33

1.5 Tiêu chuẩn chất lượng viên nén 33

1.5.1 Tiêu chuẩn chất lượng viên nén theo DĐVN V 33

1.5.2 Tiêu chuẩn nhà sản xuất 35

1.5.3 Bảo quản 35

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.1 Mục tiêu 36

2.2 Nội dung nghiên cứu 36

2.3 Vật liệu nghiên cứu 36

2.4 Phương pháp nghiên cứu 36

2.4.1 Nội dung 1: Khảo sát thực vật học và sơ bộ thành phần hóa thực vật của cây Bìm bịp 36

2.4.1.1 Khảo sát thực vật học Cây Bìm bịp 36

2.4.1.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 37

2.4.2 Nội dung 2: Nhân nhanh cây Bìm bịp bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 40

2.4.2.1 Khảo nghiệm ảnh hưởng thời gian khử trùng lên khả năng tạo mẫu vô trùng in vitro 40

Trang 4

iii

2.4.2.2 Khảo nghiệm ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực

vật lên khả năng tạo chồi từ mẫu cấy 41

2.4.2.3 Khảo nghiệm ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên khả năng phát triển cây từ chồi 43

2.4.2.4 Khảo nghiệm ảnh hưởng của cơ chất và tỉ lệ cơ chất lên khả năng thích nghi cây in vitro khi đưa ra vườn ươm 44

2.4.3 Nội dung 3: Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và tích lũy hoạt chất từ cây Bìm bịp 45

2.4.3.1 Khảo nghiệm ảnh hưởng kỹ thuật nhân giống đến sự phát triển của cây Bìm bịp 46

2.4.3.2 Khảo nghiệm ảnh hưởng của lượng phân bón, kiểu trồng đến khả năng sinh trưởng và tích lũy hoạt chất của cây Bìm bịp 47

2.4.3.3 Khảo nghiệm ảnh hưởng mật độ cây trồng đến sự phát triển của cây Bìm bịp 48

2.4.4 Nội dung 4: Trồng mô hình cây Bìm bịp 49

2.4.5 Nội dung 5: Chiết cao, tiêu chuẩn hóa cao chiết cây Bìm bịp

50

2.4.5.1 Chiết cao 50

2.4.5.2 Tiêu chuẩn hoá cao Bìm bịp 50

2.4.5.3 Thẩm định quy trình định lượng shaftoside, orientin, vitexin và isovitexin trong cao Bìm bịp 54

2.4.6 Nội dung 6: Khảo sát hoạt tính của cao chiết cây Bìm bịp 56

2.4.6.1 Xác định hoạt tính kháng oxi hóa của các cao chiết từ cây Bìm bịp 56

Trang 5

iv

2.4.6.2 Xác định hoạt tính apoptosis của các cao chiết trên mô hình tế

bào ung thư vú 58

2.4.7 Nội dung 7 Thử nghiệm độc tính của cao chiết cây Bìm bịp 62

2.4.7.1 Kiểm tra độc tính cấp của cao chiết cây Bìm bịp trên mô hình động vật. 62

2.4.7.2 Kiểm tra độc tính bán trường diễn của cao chiết cây Bìm bịp trên mô hình động vật. 63

2.4.8 Nội dung 8 Thử nghiệm điều chế viên nén chứa cao chiết cây Bìm bịp 64

2.4.8.1 Điều chế viên nén 64

2.4.8.2 Nâng cấp cỡ lô điều chế và xác định thông số quy trình 70

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 74

3.1 Nội dung 1: Khảo sát thực vật học và sơ bộ thành phần hóa thực vật của cây Bìm bịp 74

3.1.1 Khảo sát thực vật học Cây Bìm bịp 74

3.1.2 Phân tích sơ bộ thành phần hoá học 84

3.1.2.1 Thử tinh khiết 84

3.1.2.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 84

3.2 Nội dung 2 Nhân nhanh cây Bìm Bịp bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 86

3.2.1 Khảo nghiệm ảnh hưởng chất khử trùng lên khả năng tạo mẫu vô trùng in vitro 86

Trang 6

v

3.2.2 Khảo nghiệm ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật

lên khả năng tạo chồi từ mẫu cấy 89

3.2.3 Khảo nghiệm ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên khả năng tái sinh cây từ chồi 92

3.2.4 Khảo nghiệm ảnh hưởng của cơ chất và tỉ lệ cơ chất lên khả năng thích nghi cây in vitro khi đưa ra vườn ươm 95

3.2.5 Quy trình nuôi cấy mô cây Bìm bịp 99

3.3 Nội dung 3 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và tích lũy hoạt chất từ cây Bìm bịp. 100

3.3.1 Khảo nghiệm ảnh hưởng nguồn giống (kỹ thuật nhân giống) đến sự phát triển của cây Bìm bịp 100

3.3.2 Khảo nghiệm ảnh hưởng của lượng phân bón, kiểu trồng đến khả năng sinh trưởng và tích lũy hoạt chất của cây Bìm bịp 104

3.3.3 Khảo nghiệm ảnh hưởng mật độ cây trồng đến sự phát triển của cây Bìm bịp 115

3.4 Nội dung 4 Trồng mô hình cây Bìm bịp 119

3.5 Nội dung 5 Chiết cao, tiêu chuẩn hóa cao chiết cây Bìm bịp 122

3.5.1 Tối ưu hoá quy trình ly trích thu nhận cao chiết Bìm bịp 122

3.5.2 Tiêu chuẩn hoá cao Bìm bịp 126

3.5.2.1 Mô tả 126

3.5.2.2 Mất khối lượng do làm khô 126

3.5.2.3 Tỉ lệ tro 126

3.5.2.4 Giới hạn nhiễm khuẩn 127

3.5.2.5 Hàm lượng kim loại nặng 128

Trang 7

vi

3.5.2.6 Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật 128

3.5.2.7 Định tính các thành phần trong cao chiết Bìm bịp bằng TLC

130

3.5.2.8 Định lượng các thành phần trong cao chiết cây Bìm bịp bằng phương pháp HPLC 131

3.5.3 Thẩm định quy trình định lượng shaftoside, orientin và isovitexin trong cao chiết Bìm bịp 134

3.5.3.1 Tính phù hợp hệ thống 134

3.5.3.2 Tính chọn lọc 136

3.5.3.3 Tính tuyến tính và miền giá trị 137

3.5.3.4 Độ chính xác 138

3.5.3.5 Thẩm định độ đúng 138

3.6 Nội dung 6 Xác định hoạt tính cao chiết Bìm bịp 140

3.6.1 Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết từ cây Bìm bịp 140

3.6.2 Kiểm tra độc tế bào 141

3.6.3 Đánh giá sự phân mảnh của nhân tế bào 143

3.6.4 Xác định khả năng ức chế tế bào ung thư vú thông qua biểu hiện gen bax và bcl-2 146

3.7 Nội dung 7 Thử nghiệm độc tính của cao chiết Bìm bịp 149

3.7.1 Kiểm tra độc tính cấp của cao chiết Bìm bịp trên mô hình động vật 149

3.7.2 Kiểm tra độc tính bán trường diễn của cao chiết cây Bìm bịp trên mô hình động vật 151

Trang 8

vii

3.8 Nội dung 8 Thử nghiệm điều chế viên nén chứa cao chiết Bìm bịp

158

3.8.1 Điều chế viên nén 158

3.8.1.1 Sàng lọc công thức 158

3.8.1.2 Tối ưu hóa công thức 163

3.8.2 Nâng cỡ lô điều chế và xác định thông số quy trình 170

3.8.2.1 Thiết lập thời gian sấy cốm ướt 172

3.8.2.2 Xác định cỡ lưới xát hạt và lưới sửa hạt 173

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 180

4.1 Kết luận 180

4.2 Kiến nghị 182

TÀI LIỆU THAM KHẢO 183

Trang 9

viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các hoạt chất được xác định trong cây Bìm bịp 7

Bảng 1.2 Giới hạn hoá chất bảo vệ thực vật theo DĐVN V 30

Bảng 1.3 Yêu cầu độ lặp lại và độ tái lặp của phương pháp phân tích 33

Bảng 1.4 Độ lệch cho phép của các dạng bào chế 34

Bảng 2.1 Phân tích sơ bộ thành phần hoá học 39

Bảng 2.2 Mồi xuôi và mồi ngược được sử dụng trong phản ứng Real time PCR 62

Bảng 3.1 Độ ẩm của mẫu thử dược liệu 84

Bảng 3.2 Tro toàn phần của mẫu thử dược liệu 84

Bảng 3.3 Chất chiết được trong mẫu thử dược liệu bằng phương pháp chiết nóng với EtOH 96% 84

Bảng 3.4 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 85

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến hiệu quả tạo mẫu cây Bìm bịp vô trùng 88

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tạo chồi cây Bìm bịp sau 6 tuần nuôi cấy 91

Bảng 3.7 Ảnh hưởng NAA lên sự phát triển cây hoàn chỉnh từ chồi 94

Bảng 3.8 Ảnh hưởng cơ chất đến khả năng thích nghi và phát triển cây Bìm bịp 98

Bảng 3.9 Chỉ tiêu sinh trưởng và phát triển cây Bìm bịp sau 3 tháng trồng 100 Bảng 3.10 Hàm lượng hoạt chất được tính theo tổng trọng lượng khô của cây sau 3 tháng trồng 101

Bảng 3.11 Chỉ tiêu sinh trưởng và phát triển cây Bìm bịp sau 6 tháng trồng. 103

Trang 10

ix

Bảng 3.12 Hàm lượng hoạt chất được tính theo tổng trọng lượng khô của cây

sau 6 tháng trồng 103

Bảng 3.14 Hàm lượng hoạt chất được tính theo tổng trọng lượng khô của cây sau 3 tháng trồng 107

Bảng 3.21 Chỉ tiêu sinh trưởng và phát triển cây Bìm bịp trồng mô hình 120

Bảng 3.22 Khảo sát dung môi ly trích 122

Bảng 3.23 Khảo sát tỉ lệ mẫu/dung môi 123

Bảng 3.24 Khảo sát thời gian ly trích 123

Bảng 3.25 Khảo sát số lần ly trích 123

Bảng 3.26 Tối ưu hóa các điều kiện ly trích thu nhận cao chiết cây Bìm bịp 124

Bảng 3.27 Hiệu suất thu hồi cao chiết nước cây Bìm bịp 124

Bảng 3.28 Kết quả mất khối lượng do làm khô cao bìm bịp 126

Bảng 3.29 Kết quả tro toàn phần cao Bìm bịp 127

Trang 11

x

Bảng 3.30 Kết quả phân tích giới hạn nhiễm khuẩn 127 Bảng 3.31 Kết quả phân tích dư lượng thuốc bảo vệ thực vật 129 Bảng 3.32 Hàm lượng shaftoside, orientin, vitexin và isovitexin trong mẫu

shaftoside, orientin, isovitexin 138

Bảng 3.37 Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình định lượng shaftoside,

orientin, vitexin và isovitexin trong cao chiết 139

Bảng 3.38 Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của các cao chiết Bìm bịp 140 Bảng 3.39 Ảnh hưởng của cao chiết Bìm bịp lên sự tăng sinh của tế bào

Bảng 3.44 Trọng lượng trung bình của các cơ quan nội tạng chuột thí nghiệm

sau 28 ngày thử cao chiết 153

Bảng 3.45 Ảnh hưởng của cao chiết tới các chỉ số huyết học của chuột thí

nghiệm 154

Trang 12

xi

Bảng 3.46 Ảnh hưởng của cao chiết tới các chỉ số sinh hóa của chuột thí

nghiệm 156

Bảng 3.47 Ảnh hưởng của cao chiết tới các chỉ số sinh hóa của chuột thí nghiệm (tt) 157

Bảng 3.48 Đánh giá khả năng tải cao của hai loại tá dược hút 159

Bảng 3.49 Thành phần công thức một viên nén trong thủ nghiệm sàng lọc tá dược rã (mg) 160

Bảng 3.50 Đánh giá thời gian rã viên trung bình của CT1-CT6 161

Bảng 3.51 Thành phần công thức viên nén trong thử nghiệm sàng lọc tá dược độn (g) 162

Bảng 3.52 Đánh giá cốm bán thành phẩm và viên nén tạo thành từ CT7 và CT8 162

Bảng 3.53 Không gian thực nghiệm đề xuất bởi Design Expert 164

Bảng 3.54 Thành phần công thức 1 viên 164

Bảng 3.55 Đánh giá thời gian rã viên (phút) và chỉ số nén của cốm bán thành phẩm (%) 165

Bảng 3.56 Kết quả phân tích mô hình hồi quy 165

Bảng 3.57 Thành phần công thức tối ưu đề xuất bởi phần mềm 170

Bảng 3.58 Công thức lô nâng cấp (8000 viên) 171

Bảng 3.59 Dữ liệu độ ẩm của cốm 172

Bảng 3.60 Phần trăm các phân đoạn kích thước hạt (%) 174

Bảng 3.61 Thành phần công thức điều chế 8000 viên nén chứa cao Bìm bịp 175

Bảng 3.62 Kết quả kiểm nghiệm viên nén chứa cao định chuẩn Bìm bịp 179

Trang 13

xii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Đặc tính thực vật cây Bìm bịp 5

Hình 1.2 Đặc điểm hoa của cây Bìm bịp 5

Hình 2.1 Quy trình chiết xuất định tính sơ bộ thành phần hóa học 38

Hình 2.2 Phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất kháng oxy hóa 57

Hình 2.3 Quy trình điều chế viên trong sàng lọc tá dược rã 65

Hình 2.4 Lưu đồ điều chế viên nén chứa cao bìm bịp ở quy mô 8000 viên 71 Hình 3.1 Cành và lá của mẫu dược liệu phân tích 77

Hình 3.2 Đặc điểm hình thái thân và lá cây 78

Hình 3.3 Đặc điểm giải phẫu thân cây 79

Hình 3.4 Đặc điểm giải phẫu lá cây 80

Hình 3.5 Đặc điểm giải phẫu lá cây và cuống lá 81

Hình 3.6 Đặc điểm bột toàn cây và cấu tử bột toàn cây 82

Hình 3.7 Cấu tử bột toàn cây 83

Hình 3.8 Mẫu cây Bìm bịp 4 tuần nuôi sau khi khử trùng 88

Hình 3.9 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến mẫu cấy cây Bìm bịp 89

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA tới khả năng nhân nhanh chồi của cây Bìm bịp 91

Hình 3.11 Ảnh hưởng NAA, IBA lên sự phát triển cây Bìm bịp hoàn chỉnh từ chồi sau 4 tuần nuôi 93

Hình 3.12 Ảnh hưởng NAA, IBA lên sự phát triển rễ cây Bìm bịp hoàn chỉnh từ chồi sau 4 tuần nuôi 93

Hình 3.13 Ảnh hưởng cơ chất đến khả năng thích nghi cây Bìm bịp nuôi cấy mô 97

Hình 3.14 Quy trình nuôi in vito cây Bìm bịp 99

Hình 3.15 Cây Bìm bịp trồng thí nghiệm 2 tuần tuổi 101

Hình 3.16 Cây nhân giống bằng giâm hom sau 3 tháng trồng 102

Trang 14

xiii

Hình 3.17 Cây nhân giống bằng nuôi cấy mô sau 3 tháng trồng 102

Hình 3.19 Cây nhân giống bằng nuôi cấy mô sau 6 tháng trồng 104

Hình 3.21 Cây Bìm bịp trồng với nghiệm thức bón phân lượng 15 tấn/ha sau 3 tháng 108

Hình 3.29 Cây Bìm bịp trồng với nghiệm thức bón phân hữu cơ lượng 20 tấn/ha và tủ rơm sau 3 tháng 117

Hình 3.30 Cây Bìm bịp trồng với nghiệm thức bón phân hữu cơ lượng 20 tấn/ha và tủ rơm sau 6 tháng 119

Hình 3.31 Chuẩn bị đất trồng mô hình cây Bìm bịp 121

Hình 3.32 Trồng cây Bìm bịp mô hình 121

Hình 3.33 Cây Bìm bịp trồng mô hình sau 3 tháng trồng 121

Hình 3.34 Cây Bìm bịp trồng mô hình sau 6 tháng trồng 122

Trang 15

xiv

Hình 3.36 Kết quả TLC cao chiết cây Bìm bịp 130 Hình 3.37 Kết quả HPLC chuẩn shaftoside, orientin, vitexin và isovitexin131 Hình 3.38 Kết quả HPLC mẫu cao chiết Bìm bịp 132 Hình 3.39 Sắc ký đồ khảo sát tính chọn lọc phương pháp định lượng

shaftoside, orientin, isovitexin trong cao chiết Bìm bịp 136

Hình 3.40 Hình ảnh tế bào MCF-7 nhuộm Hoechst 33342 dưới tác động của

cao chiết Bìm bịp 143

Hình 3.41 Ảnh hưởng của cao chiết Bìm bịp lên apoptosis của tế bào MCF-7

bằng cytometry flow 145

Hình 3.42 Tỉ lệ tế bào MCF-7 đi vào quá trình apoptosis sau khi xử lý với

cao chiết Bìm bịp sau 24h, 48h và 72h 145

Hình 3.43 Tỉ lệ tế bào MCF-7 đi vào quá trình necrosis sau khi xử lý với cao

Hình 3.46 Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng của các biến độc lập đến

thời gian rã viên 166

Hình 3.47 Hình biểu diễn bề mặt đáp ứng của thời gian rã viên trong không

gian thực nghiệm 167

Hình 3.48 Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng của các biến độc lập đến

cốm BTP 168

Hình 3.49 Hình biểu diễn bề mặt đáp ứng của chỉ số nén cốm BTP trong

không gian thực nghiệm 169

Hình 3.50 Biến thiên hàm ẩm cốm chứa cao Bìm bịp theo thời gian sấy 173 Hình 3.51 (a) Biểu đồ biểu diễn phần trăm phân đoạn kích thước hạt; (b)

biểu đồ phần trăm tích lũy phân đoạn kích thước hạt của 4 mẻ khảo sát 175

Trang 16

xv

Hình 3.52 Lưu đồ sản xuất viên nén chứa cao định chuẩn bìm bịp (cỡ lô

8000 g) 178

Trang 17

High performance liquid chromatography

Classification of Chemicals)

Trang 18

1

MỞ ĐẦU

Hiện nay, ung thư đã trở thành một trong ba nhân tố chính đe dọa nghiêm trọng đối với sức khỏe con người Ung thư đang là nguyên nhân tử vong hàng đầu ở Trung Quốc và nhiều nước khác Trong năm 2012 khoảng 14,1 triệu trường hợp ung thư xảy ra trên toàn cầu (tổ chức sức khỏe thế giới, 2014) Nó gây ra khoảng 8,2 triệu ca tử vong hay 14,6% của tất cả các trường hợp tử vong, ước tính mỗi năm sẽ có khoảng 40% các trường hợp ung thư mới được phát hiện Ở trẻ em, bệnh bạch cầu và u não cấp tính là phổ biến nhất, năm 2012 có khoảng 165.000 trẻ em dưới 15 tuổi được chẩn đoán mắc bệnh ung thư Nguy cơ ung thư tăng đáng kể với độ tuổi và nhiều loại ung thư thường xảy ra ở các nước đang phát triển Các chi phí để điều trị ung thư đã được ước tính khoảng 1,16 triệu USD mỗi năm kể từ năm 2010 (ghi nhận của

tổ chức ung thư thế giới, 2014)

Việc điều trị ung thư trong y học hiện đại bao gồm hóa trị, xạ trị, phẫu thuật, liệu pháp miễn dịch, … Hạn chế lớn nhất của các phương pháp hiện đại trong điều trị ung thư sẽ đưa đến phá vỡ hoặc suy giảm hệ thống miễn dịch của cơ thể (Devasagayam và Sainis, 2002), mà cuối cùng có thể ảnh hưởng đến các tế bào bình thường ở bệnh nhân ung thư (Mascarenhas, 1994) Vì vậy, ứng dụng các sản phẩm tự nhiên đã trở thành một định hướng trong nghiên cứu những năm gần đây để điều trị bệnh ung thư

Nhiều sản phẩm từ tự nhiên đã được sử dụng rộng rãi cho điều trị bệnh ung thư (Shan và cs., 2005) Các sản phẩm từ tự nhiên chứa các flavonoid (Motoo và Sawabu, 1994; Stehelin và cs., 1976) và terpenoid (Dembitsky và Takashi, 2007), đã trở thành nguồn quan trọng cho việc nghiên cứu tạo ra các loại thuốc mới (Newman và Cragg, 2007) Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng thuốc chống ung thư có nguồn gốc tự nhiên không chỉ có tác dụng kháng

Trang 19

Catharanthus roseus G Don (Apocynaceae) có hoạt tính kháng ung thư vú,

ung thư phổi (Cragg và Newman, 2005); paclitaxel từ vỏ cây thông đỏ, Taxus

brevifolia Nutt (Taxaceae) kháng ung thư vú, ung thư phổi (Rowinsky và cs.,

1992); Camptothecin từ cây Camptotheca acuminate Decne (Nyssaceae) kháng ung thư phổi, ung thư buồng trứng (Creemers và cs 1996; Bertino, 1997); Homoharringtonine được phân tách từ cây Cephalotaxus harringtonia var drupacea (Sieb và Zucc.) (Cephalotaxaceae) kháng bệnh bạch cầu dòng tủy và bệnh bạch cầu tủy mãn tính (Cragg và Newman, 2005); Elliptinium có nguồn gốc từ cây Bleekeria vitensis A.C Sm kháng ung thư vú (Cragg và

Newman, 2005) Tuy nhiên, việc xác định và nghiên cứu các hoạt chất từ các nguồn tự nhiên khác nhau nhằm khai thác tiềm năng hiện có, tăng tính hiệu quả, an toàn vẫn đang là định hướng được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm Trong đó, cây Bìm bịp đã được nhiều nước Châu Á quan tâm và sử dụng

Theo y học cổ truyền, lá cây Bìm bịp được sử dụng để điều trị phát ban

da, bỏng, viêm niêm mạc và tổn thương do virus herpes simplex (HSV) và virus varicella-zoster (VZV) (Putwatana và cs., 2009, Sakdarat và cs., 2009)

Lá cũng được sử dụng như một phương thuốc chống lại độc do rắn cắn, bọ cạp và côn trùng (Uawonggul và cs., 2006, Globinmed, 2015), điều trị ung thư (Shim và cs., 2013), điều trị bệnh tiểu đường và bệnh lỵ (Tiew và cs.,

2014, Lusia Barek và cs., 2015)

Dịch ly trích từ lá có khả năng kháng oxi hóa (Direkbusarakom và cs.,

1998; Pannangpetch và cs., 2007; Yuann và cs., 2012), kháng khuẩn: Bacillus

cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Typhimurium và Candida

Trang 20

3

albicans (Arullappan và cs., 2014), kháng viêm (Sangkitporn và cs., 1993;

Thongrakard và cs., 2010), kháng bệnh tiểu đường thông qua ức chế glucosidase (Satayavivad và cs., 1996), kích thích tính kháng thông qua việc tăng hàm lượng IL-4 (Sriwanthana và cs., 1996)

α-Hoạt tính kháng ung thư của cây Bìm bịp cũng đã được ghi nhận: bột ly trích chloroform từ lá cây Bìm bịp ở hàm lượng 100 µg/ml có hoạt tính kháng

sự phân chia tế bào ở dòng K-562 và Raji sau 72 giờ sử dụng với hiệu quả lần lượt là 91,3% (IC50: 47,70µg/ml) và 89,0% (IC50: 47,31µg/ml) (Yong và cs., 2013) Ở hàm lượng 100 µg/ml biểu hiện ức chế trên 50% khả năng phân chia

tế bào ở dòng tế bào ung thư phổi (NCI-32: 55,8% và HeLa: 56,7%) sau 72 giờ sử dụng (Yong và cs., 2013) Bột ly trích petroleum ether từ lá cây Bìm bịp có hoạt tính gây độc cho tế bào HeLa và K-562 sau 72 giờ sử dụng với

IC50 là 18 và 20 µg/ml (Arullappan và cs., 2014) Ngoài ra, cây Bìm bịp còn

có hoạt tính ức chế nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau: HepG2, IMR32,

NCL-H23, SNU-1, LS-174T và IMR32 (Pannangpetch và cs., 2007) Hiệu quả ức chế tế bào ung thư của dịch ly trích ethanol từ lá cây Bìm bịp được chứng minh tác động lên IFN-γ/TNF-α gây ra quá trình chết theo chương trình của tế bào HaCaT (Thongrakard và Tencomnao, 2010) Dịch chiết methanol lá của cây Bìm bịp gây độc tế bào D24 melanoma (EC50: 0,77 mg/ml) (Fong, 2015)

Nhằm đánh giá và tạo cơ sở khoa học cho việc triển khai, ứng dụng nguồn dược liệu này vào thực tế, đề tài “Nhân giống và xây dựng mô hình trồng nhằm thu nhận nguồn nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng hỗ

trợ điều trị ung thư từ cây Bìm bịp (Clinacanthus nutans)” được thực hiện

Trang 21

Cây Bìm bịp còn được gọi là cây xương khỉ, cây mảnh cộng với tên khoa

học là Clinacanthus nutans thuộc họ Ô rô Cây thuộc loại cây nhỏ, mọc thành

bụi, có thể cao tới 3m Cây thường có hoa màu đỏ hay hồng rủ xuống ở ngọn, bao phấn vàng xanh Lá cây là loại lá nguyên, phiến lá hình mác hay thuôn, cuống ngắn, mặt lá hơi nhăn, mềm, bóng, màu xanh thẫm Cây có quả hình trùy dài khoảng 1,5cm, cuống ngắn, chứa 4 hạt

Cây Bìm bịp có nguồn gốc từ các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới, bao gồm Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Việt Nam và Trung Quốc (Hu và Daniel,

Trang 22

5

2011, Chelyn và cs., 2014) Ở Việt Nam, cây Bìm bịp mọc hoang ở rất nhiều vùng nông thôn (http://thaoduocsinhphuong.com)

Hình 1.1 Đặc tính thực vật cây Bìm bịp: A cây dạng bụi, B đoạn thân

mang lá; C lá đơn; D lá mọc đối (Fong, 2015)

Hình 1.2 Đặc điểm hoa của cây Bìm bịp A hoa được sắp xếp bằng

nhiều hoa thành cụm hoa; B hoa có chứa bao hoa (mũi lên đứt quản), cánh

Trang 23

6

hoa với môi dưới (dấu sao) và môi trên (chữ thập); C nhị hoa (mũi tên trắng)

và vòi nhị (mũi tên đen) (Fong, 2015)

1.1.3 Thành phần hóa học

Nhiều thành phần hoạt chất trong cây cũng đã được ghi nhận gồm: nhóm triterpen, nhóm C-Glycosyl flavon (shaftoside, vitexin, isovitexin, orientin, isoorientin và isomollupentin -7-O-β-D-glucosid (Teshima và cs., 1997)); flavonoid (catechin, kaempferol, luteolin, quercetin (Ghasemzadeh và cs., 2014)); phenolic (caffeic acid, gallic acid (Ghasemzadeh và cs., 2014)); một

số glucoside chứa sulfur (clinacosid A, clinacosid B, clinacosid C, cycloclinacosid A1 và cycloclinacosid A2 (Teshima và cs., 1998; Tu và cs., 2014)) Ngoài ra, nhiều hoạt chất khác nhau cũng được xác định: lupeol, β-sitosterol có ở trong thân (Wanikiat và cs., 2008), betulin, lupeol và β-sitosterol có trong rễ khô (Dampawan và cs., 1977) 2 glycoglycerolipids (1,2-Odilinolenoyl-3-O-β-D-galactopyranosyl-glycerol và 1-O-palmitoyl-2-Olinolenoyl-3-O-[α-D-galactopyranosyl-(1’’-6’)-O-β-D-galacctopyranosyl]-glycerol từ lá (Satakhum và cs.,2001) 9 cerebrosid )1-O-b-D-glucosid) và monoacylmonogalatosylglycerol từ lá (Tuntiwachwuttikul và cs., 2004) 8 hợp chất có liên quan đến chlorophyll a và chlorophyll b (132-hydroxy-(132-S)-phaeophytin a, 132-hydroxy-(132-R)-chlorophyll a, phaeophorbid a, 132-hydroxy-(132-S)-chlorophyll b, 132-hydroxy-(132-R)-chlorophyll b, 132-hydroxy-(132-S)-phaeophytin b, 132-hydroxy-(132-R)-phaeophytin b và purpurin-18-phytyl ester) (Sakdarat và cs., 2006)

Trong thành phần hoạt chất có hoạt tính sinh học (kháng oxy hóa, kháng ung thư) ở lá cây Bìm bịp, nhóm phenolic và flavonoid được xem là 2 nhóm hoạt chất chính (Fong, 2015; Kumar và Pandey, 2013) Theo đó, hàm lượng hoạt chất có trong cây chịu ảnh hưởng vùng phân bố: hàm lượng phenolic và flavonoid trong lá cây Bìm bịp phân bố ở Thái Lan (vùng Chiang Dao) cao

Trang 24

7

nhất (phenolic: tương đương 72,16 mg gallic acid/g mẫu trích khô và flavonoid: tương đương 58,38 mg quercetin/g mẫu trích khô) so với các mẫu được phân bố ở vùng khác: Thái Lan (vùng: Map Khae, Salaya, San Sai), Malaysia (vùng: Seremban, Sandakan, Tawau, Kota Kinabalu) và Việt Nam (Tp Hồ Chí Minh) (Fong, 2015) Ngoài ra, 5 flavonoid: shaftoside, orientin, isoorientin, vitexin và isovitexin được xác định là các hoạt chất marker của cây Bìm bịp (Chelyn và cs., 2014; Danmin Huang và cs., 2015)

Bảng 1.1 Các hoạt chất được xác định trong cây Bìm bịp

Nhóm hoạt

Bộ phận thực vật

Dung môi ly trích Tài liệu

và cs (1977) Lin và cs (1983)

Triterpenoi

ds

Lupeol Betulin

Thân

Dampawan

và cs (1977) Lin và cs (1983) Phenolic

acids

Caffeic acid Gallic acid

Lá Chồi lá Methanol

Ghasemzadeh

và cs (2014)

Flavonoids

Catechin Kaempferol Luteolin

Lá Chồi lá Methanol

Ghasemzadeh

và cs (2014)

Trang 25

Isomollupentin

7-O-ϐ-glucopyranoside Orientin

Isoorientin

Thân

Lá

Butanol và nước

Teshima và

cs (1997) Chelyn và cs (2014)

Clinamide B Clinamide C

2-cis-entadamide A

Thân

Lá

Butanol và nước Ethanol

Teshima và

cs (1998)

Tu và cs (2014)

Glycerides

Digalactosyl diglycerides Trigalactosyl diglycerides

định

Janwitayanuchit và cs (2003) Cerebroside

galactopyranosylglycerol

Lá Ethyl acetate

Tuntiwachwuttikul và cs (2004)

Trang 26

132-hydroxy-(132-phaeophorbide a

Hexane

Shuyprom (2004) Sakdarat và

cs (2008) Sakdarat và

cs (2009) Sittiso và cs (2010)

Benzenoids

benzenedicarboxylic acid, mono(2-

Trang 27

10

chứng đau nhức xương khớp do thoái hóa và hỗ trợ chữa gãy xương Trong dân gian, tại một số địa phương người ta dùng lá Bìm bịp non để nấu canh, lá khô dùng làm bánh Bìm bịp (bánh mảnh cộng)

1.1.5 Tác dụng dược lí của cây Bìm bịp

Cây Bìm bịp là cây dược liệu được báo cáo có nhiều tác dụng như kháng oxy hoá, ức chế tăng sinh, ức chế khối u, kháng khuẩn, kháng virus, kháng viêm

Kháng oxy hoá

Chất kháng oxy hoá là những chất có khả năng trung hoà các tác nhân oxy hoá – là nguyên nhân gây ra các vấn đề sức khoẻ như ung thư, các bệnh liên quan tới tim mạch và các rối loạn liên quan đến quá trình lão hoá Pannangpetch (2017) báo cáo cao chiết Bìm bịp có tác dụng làm giảm các gốc

tự do trên mô hình chuột kích thích quá trình đại thực bào bằng phorbol myristate 13-acetate (PMA) Ngoài ra, cao chiết còn thể hiện hoạt tính ức chế tan máu mạnh (98%) trên mô hình phân rã tế bào được kích thích bằng 2,2′-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) - nguyên nhân gây ra phân rã tế bào hồng cầu thông qua quá trình oxy hoá lipid và protein của màng tế bào máu Pannangpetch (2007) cho biết IC50 của cao chiết methanol cây Bìm bịp dựa trên khả năng kháng oxy hóa là 110 µg/ml Khoo (2015) cũng đã báo cáo cao chiết lá Bìm bịp tại nồng độ 5000ppm cho khả năng kháng oxy hoá 37,34 ± 0,49%

12-Hoạt động chống tăng sinh và gây độc tế bào

Thử nghiệm tế bào nguyên bào sợi gây phân rã tế bào hoàn toàn trong 20

phút bằng nọc độc Heterometrus laoticus, kết quả cho thấy: sau 30 phút thử

nghiệm, nồng độ cao chiết 706 µg/ml tăng tỉ lệ sống của tế bào đến 50%, đồng thời với nồng độ cao chiết 406 µg/ml cho khả năng phục hồi tế bào nhỏ hơn 10% Tuy nhiên, liều 706 µg/ml hoặc 406 µg/ml trên tế bào nguyên bào sợi bình thường cho kết quả tỉ lệ sống của tế bào lần lượt là 28 và 41%, do đó

Trang 28

11

có thể kết luận cao chiết nước Bìm bịp có khả năng gây độc tế bào

Các hợp chất được sử dụng để ức chế sự phát triển của tế bào có thể được ứng dụng trong hỗ trợ điều trị ung thư Cao chiết lá Bìm bịp đã được báo cáo

có khả năng ức chế tăng sinh của một số loại tế bào như HeLa Yong (2013)

đã cho biết cao chiết nước thể hiện khả năng ức chế mạnh sự tăng sinh tế bào HeLa và K-562 (36 và 41% ở liều 100 µg/ml), ngoài ra cao chiết chloroform cho hiệu quả ức chế tăng sinh cao nhất trên dòng tế bào K-562 và Raji với

IC50 tương ứng cho từng dòng tế bào lần lượt là 48 µg/ml và 47 µg/ml tại nồng độ 100 µg/ml Một báo cáo khác của Arullappan (2014), Cao chiết ete dầu hoả lá cho hiệu qủa ức chế K-562 và Hela với IC50 lần lượt là 18 µg/ml và

20 µg/ml

Ức chế tế bào gan in vivo: Huang (2015) đã báo cáo cao chiết ethanol Bìm

bịp có hiệu quả làm giảm kích thước và trọng lượng khối u trong sau 10 ngày được uống cao chiết (giảm 8,2% và 58,6% ở liều 3 và 10 mg/kg), mặt khác

còn tăng biểu hiện Bax và caspase 3, giảm biểu hiện của Bcl-2 và p-AKT

Hoạt tính kháng ung thư của cây Bìm bịp cũng đã được ghi nhận: bột ly trích chloroform từ lá cây Bìm bịp ở hàm lượng 100 µg/ml có hoạt tính ức chế sự phân chia tế bào ở dòng K-562 và Raji sau 72 giờ sử dụng với hiệu quả lần lượt là 91,3% (IC50: 47,70µg/ml) và 89% (IC50: 47,31µg/ml) (Yong và cs., 2013) Ở nồng độ 100 µg/ml biểu hiện ức chế trên 50% khả năng phân chia tế bào ở dòng tế bào ung thư phổi (NCI-32: 55,8% và HeLa: 56,7%) sau 72 giờ

sử dụng (Yong và cs., 2013) Bột ly trích petroleum ether từ lá cây Bìm bịp có hoạt tính gây độc cho tế bào HeLa và K-562 sau 72 giờ sử dụng với IC50 là 18

và 20 µg/ml (Arullappan và cs., 2014) Ngoài ra, cây Bìm bịp còn có hoạt tính

ức chế nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau: HepG2, IMR32, NCL-H23,

SNU-1, LS-174T và IMR32 (Pannangpetch và cs., 2007) Hiệu quả ức chế tế bào ung thư của dịch ly trích ethanol từ lá cây Bìm bịp được chứng minh tác

Trang 29

12

động lên IFN-γ/TNF-α gây ra quá trình chết theo chương trình của tế bào HaCaT (Thongrakard và Tencomnao, 2010) Dịch chiết methanol lá của cây Bìm bịp gây độc tế bào D24 melanoma (EC50: 0,77 mg/ml) (Fong, 2015)

ức chế sự giải phóng elastase từ bạch cầu trung tính tại nồng độ 10 µg/ml lên đến 68,33% Mai và cs (2016) đã báo cáo các cao chiết lá Bìm bịp ức chế sự hình thành nitric oxide mạnh với IC50NO = 18,9 ± 3,6 μg/ml và ức chế các cytokine khác (TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL12p40 và IL-17)

Độc tính

Cao chiết Bìm bịp được đánh giá là cao dược liệu có độc tính thấp Báo cáo của Chavalittumrong (1995) cho biết cao chiết ethanol không có dấu hiệu gây độc ở liều cao 1,3g/kg trên mô hình chuột thí nghiệm, đồng thời không có

sự khác biệt mô bệnh học giữa nhóm đối chứng và nhóm thử nghiệm Tương

tự, cao chiết methanol Bìm bịp không có dấu hiệu gây độc dựa trên các thông

số sinh hoá, trọng lượng các cơ quan, trọng lượng cơ thể, lượng nước và thức

ăn tiêu thụ (P’ng, 2013), cao chiết nước không có dấu hiệu gây độc trên các thông số sinh hoá và mô bệnh học trong thời gian thử nghiệm 28 và 90 ngày

Trang 30

13

1.2 Nhân giống in vitro

Nhân giống in vitro là một trong 4 lĩnh vực ứng dụng chính của công nghệ

tế bào thực vật và đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất (Lê Trần Bình, 1997)

Kỹ thuật nhân nhanh in vitro nhằm phục vụ các mục đích sau:

Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm và làm vật liệu cho công tác tạo giống

Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, các loại cây rau, cây hoa, cây cảnh, cây dược liệu thuộc nhóm thân thảo

Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm cây thân gỗ

Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus

Bảo quản các tập đoàn giống nhân vô tính và các loại cây giao phấn trong ngân hàng gen

1.2.1 Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro

Tính toàn năng của tế bào (totipotency), từ năm 1902 nhà khoa học người Đức HaberLandt đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào thực vật Theo ông, mỗi tế bào được lấy từ bất kỳ cơ quan sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Khả năng này do mỗi tế bào đều chứa bộ gen mang thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể, khi được đặt vào môi trường thích hợp tế bào này sẽ có khả năng giống như một hợp tử ban đầu

Một đặc tính quan trọng khác, làm cơ sở cho nuôi cấy mô tế bào thực vật

là khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào Khả năng biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ tế bào phôi thành toàn bộ các tế bào chức năng trong các cơ quan của cơ thể Ngược lại, khi được đặt vào môi trường thích hợp, các tế bào

Trang 31

14

chuyên hóa của cơ thể có thể trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên sinh ra nó –

tế bào phôi Tuy nhiên, thực tế nghiên cứu đã chứng minh, khả năng phản biệt hóa của các tế bào là khác nhau, các tế bào chuyên hóa sâu như tế bào của hệ thống mạch dẫn thực vật, tế bào thần kinh động vật, khả năng biệt hóa rất khó xảy ra Đối với thực vật, khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể giảm dần theo chiều từ ngọn xuống gốc (Galson, 1986; Murashige, 1974)

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.2.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy được coi là vấn đề quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy Theo Street (1973), môi trường nuôi cấy như là phần “đệm” để cung cấp các chất cần thiết cho sự tăng trưởng và phân hoá của mô trong suốt

quá trình nuôi cấy in vitro Môi trường nuôi cấy của hầu hết các loài thực vật

bao gồm các muối khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn carbon, các amino acid, các chất điều hoà sinh trưởng và một số phụ gia khi cần, tuỳ vào từng loài, giống, nguồn gốc mẫu cấy, cơ quan khác nhau trên cùng cơ thể mà dinh dưỡng cần cho sự sinh trưởng tối ưu của chúng khác nhau

Khoáng đa lượng: nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là N, P, K, Ca, Mg và Fe

Khoáng vi lượng: là các nguyên tố được sử dụng với nồng độ dưới 30 ppm, gồm có: Fe, Cu, Mn, Zn, Mo, Bo… Tuy chỉ cần một lượng nhỏ trong môi trường nuôi cấy nhưng chúng là thành phần không thể thiếu cho sự sinh trưởng và phát triển của mô Nếu thiếu Fe quá trình phân chia của tế bào bị rối loạn, thiếu Bo mô nuôi cấy phát triển mô sẹo rất nhanh, nhưng có hiệu suất tái sinh thấp Hàm lượng các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi lượng phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy và các đối tượng nuôi cấy

Carbon và nguồn năng lượng: trong nuôi cấy in vitro thực vật, nguồn

carbon giúp mô và tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ để tế bào

Trang 32

15

phân chia, tăng sinh khối không phải từ quá trình quang hợp mà chính là nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới dạng đường Hai dạng đường thường gặp nhất là glucose và sucrose Các nguồn carbonhydrate khác cũng được tiến hành thử nghiệm như lactose, galactose, rafinose, maltose và tinh bột nhưng các carbonhydrate này có hiệu quả kém hơn so với glucose và sucrose Sucrose là một nguồn carbon quan trọng đối với mô và tế bào nuôi cấy Nồng độ sucrose ban đầu có thể ảnh hưởng đến một số tham số nuôi cấy như tốc độ tăng trưởng và sản lượng hợp chất thứ cấp trong tế bào nuôi cấy

Vitamin: Mô và tế bào thực vật khi nuôi cấy in vitro vẫn có khả năng tự

tổng hợp được một số vitamin cần thiết nhưng không đáp ứng đủ nhu cầu sinh trưởng và phát triển nhanh của chúng Vì vậy, phải bổ sung thêm các vitamin cần thiết vào môi trường nuôi cấy để góp phần tạo các co – enzyme xúc tác cho các phản ứng sinh hóa trong tế bào Các vitamin thường được sử dụng như: B1, B2, B3, B5 với nồng độ phổ biến là 0,5 – 1 mg/L Myo – inositol cũng hay được sử dụng vì nó có vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp thành

tế bào thực vật

Các chất điều hòa sinh trưởng có vai trò hết sức quan trọng đến kết quả

nuôi cấy in vitro, quyết định sự thành công của toàn bộ quá trình nuôi cấy Nó

ảnh hưởng đến sự phân hóa, phản phân hóa và sinh trưởng của tế bào, đặc biệt

là sự biệt hóa các cơ quan như chồi và rễ Nhu cầu về chất điều hòa sinh trưởng đối với từng loài cây và từng giai đoạn nuôi cấy là khác nhau Vì vậy,

để tiến hành nuôi cấy in vitro thành công cần phải tiến hành nghiên cứu cụ thể

để tìm ra nồng độ cũng như tỷ lệ các chất điều hòa sinh trưởng phù hợp Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thường sử dụng 5 nhóm chất điều hoà

quan trọng trong nuôi cấy mô in vitro: auxin, gibberellin, cytokinin, abscisic

acid và ethylene

Các hợp chất hữu cơ không xác định: bổ sung nhiều chất trích hữu cơ khác nhau vào môi trường nuôi cấy thường mang lại kết quả thuận lợi cho sự

Trang 33

16

tăng trưởng của mô Các chất bổ sung này là: protein hydrolysate, nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết lúa mạch, chuối, nước cam, nước cà chua Tuy nhiên, chỉ có nước dừa và protein hydrolysate được sử dụng rộng rãi

Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác: mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các amino acid cần thiết nhưng sự bổ sung các amino acid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của tế bào Amino acid cung cấp cho tế bào thực vật nguồn amino acid sẵn sàng cho nhu cầu của tế bào và nguồn nitơ này được tế bào hấp thu nhanh hơn so với nitơ

vô cơ Các nguồn nitơ hữu cơ thường sử dụng là hỗn hợp amino acid như casein hydrolysate, L – glutamine, L – asparine và adenine

Ảnh hưởng của pH: pH của môi trường nuôi cấy thường được điều chỉnh

từ 5,5 – 6,0 pH, dưới 5,5 thì agar không đông thành dạng gel hoàn toàn và trên 6 thì gel lại quá cứng pH của môi trường thường giảm từ 0,6 – 1,3 đơn vị sau khi hấp khử trùng Có một số trường hợp, sau một thời gian nuôi cấy, pH của môi trường giảm dần do sự hình thành một số acid hữu cơ trong môi trường Điều chỉnh pH bằng cách dùng HCl hay NaOH 1N hoặc 0,1N và nhỏ từng giọt vào trong môi trường, khuấy đều môi trường rồi mới đo Luôn nhớ phải điều chỉnh pH trước khi thêm agar Giá trị pH của môi trường thích hợp cho sinh trưởng và phát triển của nhiều loài thực vật biến đối từ 5,0 – 6,0 Độ

pH cao hơn sẽ làm cho môi trường rất rắn trong khi pH thấp lại giảm khả năng đông đặc của agar đồng thời hoạt hóa các enzyme hydrolase, dẫn tới kìm hãm sự sinh trưởng, kích thích sự già hóa của tế bào trong mô nuôi cấy

1.2.2.2 Ảnh hưởng của mẫu nuôi cấy

Kiểu di truyền: khả năng tái sinh của thực vật rất đa dạng Những cây hai

lá mầm thông thường có khả năng tái sinh mạnh hơn cây một lá mầm và cây hạt trần rất khó tái sinh (trừ khi chúng còn non) Trong số các cây hai lá mầm, Solanaceae, Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriaceae, Cruciferae là những

họ thực vật dễ tái sinh nhất Nếu một loài dễ tái sinh cơ quan trong môi

Trang 34

17

trường tự nhiên (các giống lai Saintpaulia ionantha, Begonia rex,

Streptocarpus) thì chúng hầu như dễ tái sinh in vitro Cũng có những trường

hợp ngoại lệ như những đoạn cắt từ lá của Kalanchoe farinacea hầu như không có khả năng hình thành chồi bất định in vivo nhưng có thể thực hiện trong điều kiện in vitro, điều này có thể do sự hấp thu các chất điều hòa sinh

trưởng có trong môi trường nuôi cấy

Tuổi của cây: các mô phôi thường có khả năng tái sinh cao do đó ở ngũ cốc người ta thường dùng phôi và hạt làm vật liệu nuôi cấy mô Khi cây già

đi, khả năng tái sinh của chúng cũng giảm theo và các bộ phận của cây non dễ tái sinh hơn như trong trường hợp cây bụi Một vài ví dụ cụ thể chỉ ra sự khác

nhau về khả năng tái sinh và phân chia tế bào giữa cây già và cây non in vitro:

Hedera helix, Lunaria annua và Anthurium andreanum Khi mô phân sinh và

chồi đỉnh được tách khỏi cây mẹ thì chúng vẫn giữ những đặc tính già hay

non trong điều kiện in vitro tùy vào điều kiện ban đầu Đôi khi qua nhiều lần

cấy chuyền, mô phân sinh già từng bước được trẻ hóa do tăng khả năng tái sinh và phân chia tế bào Điều này được chứng minh trên những đối tượng

như Pinus vinifera, Malus sylvestris, Cryptomeria japonica

Tuổi của mô và cơ quan: những mô còn non và mềm thường dễ nuôi cấy hơn những mô cứng nhưng cũng có nhiều trường hợp ngoại lệ Các mẫu cấy

từ cuống lá còn non tái sinh tốt hơn những mẫu cấy từ cuống lá già do cơ quan của chúng già hơn nên khả năng tái sinh và phân chia tế bào giảm Khả năng tái sinh của những loài khác nhau tăng lên trong suốt giai đoạn ra hoa: các bộ phận của phát hoa còn non đôi khi tái sinh rất mạnh, ví dụ như

Freesia, Lunaria annua, Primula obconica

Tình trạng sinh lý: tình trạng sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả năng tái

sinh và phân chia tế bào in vitro Thông thường các bộ phận của cây trong

giai đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh hơn trong giai đoạn sinh sản Các chồi của

cây trong giai đoạn ngủ đông (cuối thu đầu đông) khó nuôi cấy in vitro hơn

Trang 35

18

chồi của những cây đã vượt qua được giai đoạn này (vào mùa xuân trước khi chúng bắt đầu phát triển)

Vị trí của mẫu cấy trên cây: có sự ảnh hưởng của vị trí mẫu cấy lên sự

sinh trưởng và phát triển in vitro Theo đó, những chồi ban đầu được tách từ những vị trí thấp trên cây phát triển trong môi trường in vitro tốt hơn và chồi

gốc tăng trưởng nhanh hơn chồi nách Sự hình thành các giả hành bất định của mẫu cấy lan dạ hương được tách ra từ phần gốc của vảy hành tốt hơn từ phần đỉnh Điều đáng lưu ý là những mô sẹo phát sinh từ những mẫu cấy có nguồn gốc từ các phần khác nhau của cây như rễ, chồi, cuống lá đều có phản

ứng in vitro giống nhau

Kích thước mẫu cấy: các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mô phân sinh khó cảm ứng để tăng trưởng hơn những cấu trúc lớn như thân, lá, củ Các phần được tách rời khỏi cây tự nó cung cấp chất dinh dưỡng và hormone, do

đó mẫu cấy có kích thước càng lớn càng dễ tái sinh và phát triển Các bộ phận của cây có chứa nhiều chất dinh dưỡng dự trữ như củ, thân hành thường dễ tái

sinh trên môi trường in vitro hơn những cơ quan ít chất dự trữ Đối với những

mẫu bị cắt, phần trăm bề mặt bị tổn thương cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh Ảnh hưởng của vết thương lên sự tái sinh của các mẫu cấy từ vảy hành lily đã được chứng minh

Vết thương: sự tổn thương trên bề mặt mẫu cấy đóng vai trò quan trọng trong sự tái sinh mẫu cấy Bề mặt tổn thương tăng lên làm gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng và các chất điều hòa đồng thời ethylene được tạo ra nhiều hơn Ngoài ra, có thể tăng cường sự hình thành rễ bất định bằng vết thương Phương pháp cấy: các mẫu cấy có thể được đặt trên môi trường theo nhiều cách khác nhau: có cực (thẳng đứng với phần gốc cắm xuống môi trường) hoặc không cực (cắm phần ngọn xuống môi trường) Chồi và rễ thường tái sinh dễ và nhanh khi mẫu được cấy không cực Mẫu tái sinh tốt khi được cung cấp đầy đủ oxy nhưng những nhân tố khác cũng đóng vai trò quan

Trang 36

19

trọng Phần gốc của mẫu cấy không cực có các chất dự trữ không có khả năng khuếch tán vào trong agar do nó không tiếp xúc với môi trường Như ở trường hợp tất cả các cây thuộc họ Amaryllidaceae sự tái sinh chỉ xảy ra ở phần gốc của vảy hành, do đó phương pháp cấy không cực dẫn đến sự hình thành thân hành bất định tốt hơn phương pháp cấy có cực

1.2.2.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

Nhiệt độ: là nhân tố quan trọng ảnh hưởng rõ rệt tới sự phân chia tế bào

và quá trình trao đổi chất trong các mô nuôi cấy, đồng thời nó ảnh hưởng đến hoạt động của auxin do đó ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng ra rễ của cây nuôi cấy mô Nhiệt độ nuôi cấy cần được giữ ổn định trong khoảng 25 –

27oC

Ánh sáng: có ảnh hưởng mạnh đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, bao gồm cường độ, chu kì và thành phần quang phổ ánh sáng Cường độ ánh sáng từ 1000 – 2500 lux được dùng phổ biến trong nuôi cấy nhiều loại mô Với cường độ ánh sáng lớn hơn thì sinh trưởng của chồi chậm lại nhưng sẽ thúc đẩy quá trình tạo rễ

1.2.3 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật có vai trò quan trọng trong kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật Bằng cách cung cấp các chất kích thích sinh trưởng ở một mức độ thích hợp, chúng ta có thể điều khiển được chiều hướng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy Auxin và cytokinin là hai chất kích thích sinh trưởng được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy mô

Auxin là chất kích thích sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của

mô sẹo, huyền phù tế bào và sự điều hòa sự phát sinh hình thái đặc biệt là khi

nó được sử dụng với cytokinin Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên

Trang 37

20

cứu, hàm lượng auxin nội sinh của mẫu nuôi cấy, sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng

và kéo dài tế bào Cùng với cytokinin các nhóm auxin kích thích sự phân chia

tế bào Các hormone của nhóm này có hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng, tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, kích thích ra rễ và phân hóa mạch dẫn Tác động của các auxin thường liên quan đến độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ… Đối với nuối cấy mô và tế bào thực vật, auxin được sử dụng để kích thích phân chia tế bào và phân hóa rễ Những auxin thường dùng là: IBA, IAA, NAA, 2,4 – D

Cytokinin là dẫn xuất của adenine, hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô

và tế bào thực vật Các cytokinin thường xuyên được sử dụng nhất là BA, kinetin (N – 2 – furfurylamin) – 1 – H – 6 – amin), zeatin (6 – (4 – hydroxyl –

3 metyl – trans – 2 butanylamin) purin) Hàm lượng sử dụng các loại cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy

Ngoài 2 nhóm chính là auxin và cytokinin, trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật người ta còn sử dụng thêm gibberellin để kích thích sự kéo dài tế bào, qua đó làm tăng kích thước của chồi nuôi cấy…GA3 là loại được sử dụng nhiều nhất

Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc cytokinin, tuy nhiên người ta hay dùng phối hợp cả auxin và cytokinin ở tổ hợp tỷ lệ khác nhau sẽ cho hiệu quả tốt hơn

1.2.4 Một số kết quả ghi nhận ứng dựng nuôi cấy mô một số loài

Clinacanthus nutans

Nhân nhanh loài cây dược liệu Clinacanthus nutans bằng nuôi cấy mô:

môi trường MS bổ sung 1,0 mg/L BA, 0,02 mg/L NAA cho tỷ lệ chồi 3,9

Trang 38

Môi trường MS bổ sung 2% cơ chất nuôi nấm sò, 1,0 mg/L BA cho hiệu quả tạo chồi cao nhất 4,59 chồi, chiều cao chồi 1,6 cm và số lá 10,33 lá/cây (Hashim và cs., 2017)

Nghiên cứu kích thích tạo callus và nhân nhanh cây Bìm bịp (Gunasekaran, 2014)

Tăng cường hiệu quả của compost trồng nấm và chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA trong nuôi cấy mô cây Bìm bịp (Hashim và cs., 2017)

1.3 Một số yếu tố tự nhiên ảnh hưởng cây trồng

1.3.1 Yếu tố khí hậu – thời tiết

 Ánh sáng

Ánh sáng có ảnh hưởng trực tiếp đối với sự quang hợp của cây Lượng ánh sáng cây nhận được phải lớn hơn điểm bù ánh sáng thì cây mới có thể sinh trưởng được Sự quang hợp thường tăng theo tỷ lệ thuận với cường độ ánh sáng cho đến mức bão hòa Điểm bão hòa càng cao thì năng suất cây trồng càng cao Khi ánh sáng không đầy đủ thì thời gian sinh trưởng của cây kéo dài ra, cây yếu, nhánh và chồi ít, màu sắc bị vàng, cây vươn dài ra, yếu

ớt

Độ dài ngày (quang kỳ) có ảnh hưởng quan trọng ở giai đoạn cây thay đổi từ trạng thái tăng trưởng (sinh trưởng dinh dưỡng) sang sinh sản (sinh trưởng sinh thực) hay còn gọi là giai đoạn ra hoa

 Giáng thủy

Trang 39

22

Nước ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng và là thành phần cấu tạo lớn nhất của cơ thể sinh vật Nước có nhiều chức năng trong cây trồng như:

- Một chất phản ứng tham gia trong nhiều phản ứng sinh học

- Nằm trong cấu trúc của nhiều phân tử sinh học

- Môi trường vận chuyển chất dinh dưỡng và các chất khác trong cây

- Giúp duy trì nhiệt độ thích hợp cho cây

Nước mưa ảnh hưởng đến quá trình canh tác như làm đất, thu hoạch Mưa ít hoặc mưa nhiều quá so với yêu cầu đều làm ảnh hưởng tới thời vụ gieo trồng và thu hoạch

 Nhiệt độ không khí

Tất cả các tiến trình hóa học, sinh lý và sinh học trong cây đều bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ Cây có thể sinh trưởng trong một khoảng nhiệt độ khá rộng, vì vậy các loại cây trồng khác nhau thì tồn tại những điểm nhiệt độ tối thấp và tối cao cũng khác nhau

Trong giới hạn nhiệt độ sinh trưởng của cây thì có nhiệt độ tối thích cho

sự sinh trưởng, ở nhiệt độ đó sự sinh trưởng của cây xảy ra thuận lợi nhất, trên dưới nhiệt độ tối thích thì tốc độ sinh trưởng sẽ giảm Nhiệt độ tối thấp và nhiệt độ tối cao cho sự sinh trưởng của cây đó là điểm nhiệt độ mà ở đó cây ngừng sinh trưởng Quá 45 – 50oC, sự quang hợp thường ngừng hẳn Cây bị chết vì ngừng hô hấp, quang hợp hay vì thoát hơi quá mau, cây mất hết nước

và héo

Sinh trưởng ở các cơ quan khác nhau của cây cũng nằm trong khoảng nhiệt độ khác nhau Những cơ quan ở trên mặt đất thích nghi với nhiệt độ không khí cao hơn so với những cơ quan ở dưới mặt đất, vì vậy ở nhiệt độ cao

sự sinh trưởng của rễ kém hơn thân và cành

Sự chênh lệch nhiệt độ giữa ban ngày và ban đêm có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng của cây Ban ngày nhiệt độ cao thuận lợi cho cây quang

Trang 40

23

hợp và tích lũy chất hữu cơ, ban đêm nhiệt độ hạ thấp sẽ hạn chế hô hấp và tiêu phí chất hữu cơ, giảm sự thoát hơi nước nên sinh trưởng nhanh hơn Sự chênh lệch nhiệt độ giữa ngày và đêm tạo điều kiện thuận lợi cho sự tích lũy tinh bột trong các cơ quan sinh sản và dự trữ

 Gió

Ảnh hưởng cơ học: Gió mạnh hay bão tố thường làm cây trồng rụng hạt, gãy đổ thậm chí bật gốc Các loại giống cây trồng có khả năng chống chịu gió khác nhau

Ảnh hưởng lí học: Gió ảnh hưởng đến sự thoát hơi nước của cây trồng và làm bốc hơi nước của bề mặt đất canh tác Gió mạnh cũng gây khó khăn cho quá trình thụ phấn, làm giảm nồng độ khí CO2 cục bộ

Ảnh hưởng sinh học: Gió làm lan tràn hột cỏ dại, các bào tử nấm gây bệnh

 Ẩm độ không khí

Ẩm độ không khí có ý nghĩa quan trọng trong lĩnh vực sản xuất nông nghiệp vì nó trực tiếp ảnh hưởng đến sự phát triển của sâu và bệnh hại cây trồng Một số tác nhân gây bệnh như nấm gây bệnh mốc sương, phấn trắng cần một ẩm độ nhất định để phát triển

Ẩm độ không khí cao sẽ không có lợi cho sự sinh trưởng của cây trồng (kéo dài chu kỳ sinh trưởng, việc lan truyền phấn hoa cho thụ phấn bị hạn chế) Đồng thời nếu ẩm độ không khí thấp (khô hanh) sẽ làm tăng lượng nước cây trồng bị mất đi thông qua hiện tượng thoát hơi, có thể gây héo cây nếu cây không được cung cấp nước đầy đủ và kịp thời

1.3.2 Yếu tố đất đai

Đất là môi trường sinh sống cung cấp chất dinh dưỡng, độ ẩm và đồng thời là điểm tựa giúp cây đứng vững, do đó đóng góp một vai trò rất quan trọng cho sự sinh trưởng của cây và sản xuất cây trồng

 Đặc tính vật lý của đất

Tiêu đề	Nhân giống và xây dựng mô hình trồng nhằm thu nhận nguồn nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị ung thư từ cây bìm bịp (clinacanthus nutans)
Tác giả	TS. Bùi Đình Thạch
Trường học	Viện Sinh học Nhiệt đới
Thể loại	báo cáo tổng hợp
Năm xuất bản	2019
Thành phố	Thành phố Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	205
Dung lượng	10 MB