Mục tiêu
Xây dựng công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng với hệ thống kiểm soát sẽ hỗ trợ sản xuất cây giống cấy mô sạch và chất lượng cao Công nghệ này có ứng dụng đa dạng trong việc sản xuất các loại cây như hoa cắt cành, lá kiểng, cây ăn trái và cây lấy gỗ, mang lại giá trị kinh tế cao.
Mục tiêu của dự án bao gồm việc xây dựng hệ thống vi nhân giống cho cây trồng với hộp nuôi lớn chứa 1000-2000 cây cấy mô, sử dụng môi trường nuôi cấy không đường và vitamin cho lan Dendrobium và hông Paulownia Hệ thống sẽ tăng cường khí CO2 bằng cách bơm khí trực tiếp và tự động kiểm soát các điều kiện nhiệt độ, ẩm độ, cường độ ánh sáng và nồng độ CO2 Dự án nhằm rút ngắn quy trình nhân giống in vitro xuống còn 3 giai đoạn, thay vì 4 giai đoạn như phương pháp truyền thống, đồng thời giảm thiểu công sức và thời gian chăm sóc trong giai đoạn ex vitro.
Nội dung
- Xác định ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy (loại khoáng, nồng độ đường) lên sự tăng trưởng của cây lan Dendrobium và Paulownia in vitro
Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố vật lý trong môi trường nuôi cấy, bao gồm tốc độ trao đổi khí của bình nuôi cấy, cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng và nồng độ, là rất quan trọng để tối ưu hóa quá trình phát triển của sinh vật nuôi cấy Những yếu tố này không chỉ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng mà còn quyết định hiệu suất sản xuất và chất lượng sản phẩm cuối cùng Việc hiểu rõ và điều chỉnh các yếu tố này sẽ giúp cải thiện điều kiện nuôi cấy, từ đó nâng cao hiệu quả nghiên cứu và ứng dụng trong thực tiễn.
CO 2 , loại giá thể) lên sự sinh trưởng của cây nuôi cấy trong giai đoạn in vitro và ex vitro
Bài viết so sánh sự tăng trưởng của cây in vitro nuôi cấy bằng phương pháp quang tự dưỡng và quang dị dưỡng trong hai hệ thống trao đổi khí: khuyếch tán qua màng Millipore và bơm khí trực tiếp vào hộp nuôi cấy Nghiên cứu được thực hiện ở các kích thước khác nhau trong giai đoạn in vitro và ex vitro, nhằm đánh giá hiệu quả của từng phương pháp trong việc tối ưu hóa sự phát triển của cây.
- Xây dựng các hệ thống nhân giống in vitro quang tự dưỡng với hộp nuôi cấy lớn có bơm khí trực tiếp với sức chứa 200-2000 cây cấy mô/hộp
Ứng dụng công nghệ tự động hóa trong việc lựa chọn chế độ tối ưu và kiểm soát quá trình nuôi cây cấy mô trong hộp nuôi cấy lớn bao gồm các hoạt động như đo nhiệt độ, độ ẩm, cũng như đo và điều khiển nồng độ CO2.
- Đánh giá hiệu quả kinh tế của việc sử dụng công nghệ mới lên giá thành cây cấy mô so với công nghệ vi nhân giống truyền thống
Sản phẩm của đề tài/dự án
- 2000 cây giống Paulownia, 2000 cây giống lan
- 2 quy trình nhân giống lan và paulownia
- 3 bài báo trong nước, 1 bài báo quốc tế
- 2 khóa luận tốt nghiệp đại học
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nội dung
2.1 Xác định ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy (loại khoáng, nồng độ đường) lên sự tăng trưởng của cây lan Dendrobium và Paulownia in vitro
2.1.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và nồng độ đường lên sự tăng trưởng chồi của cây lan Dendrobium Burana White
Mẫu cấy là cụm chồi lan Dendrobium Burana White có trọng lượng tươi 700 + 50 mg, chiều cao tối thiểu của cụm chồi là 1 cm, tối đa là 1,5 cm (Hình 2.1)
- Thí nghiệm có 2 yếu tố khác biệt là thành phần khoáng đa lượng: Knudson C (Knudson, 1946) hoặc MS 1/2 (Murashige & Skoog, 1962), và nồng độ đường
Thí nghiệm được thiết kế theo phương pháp 2 yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, bao gồm 6 nghiệm thức với 3 hộp cho mỗi nghiệm thức và thực hiện 3 lần lặp lại (Bảng 2.1) Mỗi hộp chứa 5 cụm chồi để tiến hành cấy.
Tên nghiệm thức Môi trường (khoáng đa lượng)
- Môi trường thí nghiệm: vi lượng MS, vitamin Morel, sắt EDTA MS
- Giá thể Agar (Cty Cổ phần thực phẩm đồ hộp Hạ Long) 7.5 g/l môi trường Hộp cấy bằng nhựa polypropylene hình trụ, chứa 65 ml môi trường pH môi trường
11 được điều chỉnh ở mức 5,8 trước khi khử trùng Môi trường được được khử trùng ở 121 o C, 1 atm, trong 20 phút
- Cường độ ỏnh sỏng: 50 àmol m -2 s -1 Thời gian chiếu sỏng 12 giờ/ngày Nhiệt độ phòng nuôi cây 25 ± 2 o C Ẩm độ tương đối 65 ± 5%
- Thời gian nuôi cấy: 45 ngày
* Chỉ tiêu theo dõi ở ngày thứ 45
- Gia tăng trọng lượng tươi (mg/cụm), gia tăng trọng lượng khô (mg/cụm)
- Tốc độ tăng trưởng tương đối (RGR/ngày)
2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường và giá thể lên sự tăng trưởng của cây lan Dendrobium Burana White
* Mẫu thí nghiệm: Chồi cây lan có 2 lá, không rễ và trọng lượng 150 ± 20 mg
- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với hai yếu tố khác biệt là giá thể
Nghiên cứu về môi trường nuôi cây cho thấy sự ảnh hưởng của dớn, perlite và agar, cùng với sự hiện diện của đường (20 g/l) và vitamin Morel, so với môi trường không có đường và vitamin Trong trường hợp môi trường thiếu đường, nắp hộp nuôi cây sẽ được gắn màng Millipore để đảm bảo điều kiện tối ưu cho sự phát triển của cây.
- Thí nghiệm có 6 nghiệm thức Số lượng mẫu cấy 5 cây/hộp Mỗi nghiệm thức gồm 9 hộp với 3 lần lặp lại
Bảng 2.2 Mô tả thí nghiệm
Tên nghiệm thức Giá thể Đường + vitamin Màng Millipore
- Môi trường thí nghiệm bao gồm đa lượng MS 1/2, vi lượng MS, vitamin Morel
(nếu môi trường có đường), sắt EDTA MS
Hộp nuôi cây Magenta (V70 ml) có thể được trang bị 2 màng Millipore hoặc không, chứa 70 ml môi trường mỗi hộp Thành phần bao gồm giá thể agar (7,5 g/l), perlite 10 g/hộp và dớn 5 g/hộp Độ pH của môi trường và quy trình khử trùng được thực hiện tương tự như trong thí nghiệm 1.
Cường độ ánh sáng trong quá trình nuôi cấy cây được duy trì ở mức 50 μmol m-2 s-1 từ ngày đầu tiên (ngày 0) đến ngày thứ 9, sau đó tăng lên 80 μmol m-2 s-1 từ ngày thứ 10 đến ngày thứ 60 Thời gian chiếu sáng là 12 giờ mỗi ngày, trong khi nhiệt độ phòng nuôi cây được giữ ở mức 25 ± 2 độ C và độ ẩm tương đối là 65 ±.
* Chỉ tiêu theo dõi vào ngày 60 sau cấy:
- Gia tăng trọng lượng tươi (mg/cây), gia tăng trọng lượng khô (mg/cây), số lá mở/cây, số rễ/cây, chiều dài rễ (mm/cây)
2.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự tăng trưởng quang tự dƣỡng của cây lan Dendrobium Burana White
- Cây lan Denrobium có 2 lá, không rễ và trọng lượng 270 ± 30 mg (Hình 2.2)
2.2 Dendrobium Burana White dùng trong thí nghiệm
- Thí nghiệm được bố trí theo kiểu 1 yếu tố với 2 nghiệm thức (môi trường Knudson C và môi trường MS 1/2)
- Số lượng mẫu cấy 4 cây/hộp Mỗi nghiệm thức gồm 15 hộp với 3 lần lặp lại
Môi trường nuôi cấy không chứa đường và vitamin, được pha chế với khoáng đa lượng MS 1/2 hoặc Knudson C, cùng với vi lượng MS và sắt EDTA MS, sử dụng giá thể agar với nồng độ 7,5 g/l pH của môi trường và quy trình khử trùng được thực hiện giống như trong thí nghiệm 1.
- Hộp nuôi cây Magenta (V70 ml) có gắn 2 màng Millipore chứa 70 ml môi trường/hộp
Cường độ ánh sáng trong quá trình nuôi cấy được chia thành ba giai đoạn: từ ngày 0 đến ngày 9 là 30 µmol m⁻² s⁻¹, từ ngày 10 đến ngày 20 là 50 µmol m⁻² s⁻¹, và từ ngày 20 đến ngày 45 là 80 µmol m⁻² s⁻¹ Thời gian chiếu sáng duy trì ở mức 12 giờ mỗi ngày Nhiệt độ trong phòng nuôi cây cũng cần được kiểm soát để đảm bảo sự phát triển tối ưu.
- Thời gian nuôi cấy 45 ngày
* Chỉ tiêu theo dõi ngày thứ 45:
- Số lá mở/cây, số rễ/cây, chiều dài rễ (mm/cây)
- Gia tăng trọng lượng tươi (mg/cây), gia tăng trọng lượng khô (mg/cây), phần trăm chất khô (%)
2.1.4 Ảnh hưởng của nồng độ đường trong lần nuôi cấy chồi trước lên sự tăng trưởng của cây lan Dendrobium Burana White nuôi cấy quang tự dưỡng
Giai đoạn in vitro : 60 ngày
Mẫu cấy là cây lan Dendrobium Burana White được cắt bỏ rễ, có trọng lượng tươi
200 + 50 mg và có 2 lá (Hình 2.3)
2.3 Dendrobium Burana White dùng trong thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện với yếu tố khác biệt là nồng độ đường saccharose (10, 20 hay 30 g/l) trong lần nuôi cấy trước khi chuyển sang môi trường nuôi cấy bao gồm khoáng đa lượng MS 1/2, vi lượng MS, vitamin Morel và sắt EDTA MS.
- Thí nghiệm có 3 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức có 5 hộp với 3 lần lặp lại, mỗi hộp cấy 5 cây Tổng số cây: 225 cây
Nồng độ đường (g/l) Vitamin Số màng
- Môi trường nuôi cấy bao gồm khoáng đa lượng MS 1/2, vi lượng MS, sắt EDTA
- Hộp cấy Magenta (V70 ml) chứa 70 ml môi trường/hộp pH môi trường và việc khử trùng môi trường giống thí nghiệm 1
Cường độ ánh sáng trong quá trình nuôi cấy được thiết lập như sau: từ ngày 0 đến ngày 9 là 50 µmol m⁻² s⁻¹, và từ ngày 10 đến ngày 60 là 80 µmol m⁻² s⁻¹ Thời gian chiếu sáng được duy trì 12 giờ mỗi ngày Nhiệt độ trong phòng nuôi cây được giữ ở mức 25 ± 2 °C, cùng với độ ẩm tương đối là 65 ± 5%.
- Thời gian nuôi cấy: 60 ngày
* Chỉ tiêu theo dõi: ở ngày thứ 60
- Gia tăng trọng lượng tươi (mg/cây), gia tăng trọng lượng khô (mg/cây), phần trăm chất khô (%), số chồi mới/cây
- Chlorophyll a, b (mg/g trọng lượng khô của lá), hiệu suất quang hợp thuần
- Giải phẫu thân để xác định thời điểm ra rễ ở ứ 3 và thứ 6
Giai đoạn ex vitro : 28 ngày
* Điều kiện trồng và chăm sóc: Thời gian theo dõi và chăm sóc: 28 ngày
- Số cây đem ra vườn ươm: 20 cây/nghiệm thức, với ba lần lặp lại
- Sử dụng giá thể là xơ dừa đã được ngâm với thuốc diệt nấm 24 giờ, phơi khô và làm tơi
Phun sương trong 1 tuần đầu Mỗi lần phun 2 lít nước/180 cây trong 5 phút vào lúc 8giờ sáng và 15giờ chiều mỗi ngày
Tưới nước trực tiếp: Từ tuần thứ 2 , tưới 2 lần/ngày, mỗi lần 1 phút/10 cây
- Phân bón được sử dụng sau 1 tuần ở vườn ươm Phân bón có nồng độ N-P-K là 30-10-10, bón 1 lần/tuần Phân có nồng độ 0,5 g/l nước, phun 1 lít/100 cây
- Ánh sáng tự nhiên được đo ở 3 thời điểm trong ngày: 8 giờ, 11 giờ và 15 giờ Cường độ 80 àmol m -2 s -1 trong thời gian thớ nghiệm
- Ẩm độ và nhiệt độ trung bình của vườn ươm được đo ở 3 thời điểm trong ngày:
88 % trong suốt thời gian thí nghiệm
* Chỉ tiêu theo dõi ở ngày thứ 28
- Gia tăng trọng lượng tươi (mg/cây), gia tăng trọng lượng khô (mg/cây), phần trăm chất khô (%)
- Số chồi mới/cây, số rễ mới/cây, chlorophyll a, b (mg/g trọng lượng khô của lá)
2.1.5 Ảnh hưởng của nồng độ đường và giá thể lên sự tăng trưởng của cây hông
( Paulownia spp.) nuôi cấy in vitro
Để tạo mẫu nuôi cấy ban đầu, đốt thân thứ 2 và 3 từ ngọn của cây hông (Paulownia spp.) nuôi cấy in vitro được sử dụng kèm theo một cặp lá (Hình 2.4).
Trọng lượng tươi ban đầu 150 ± 30 mg/mẫu
Hình 2.4 Mẫu cấy ban đầu
- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 yếu tố khác biệt: (1) nồng độ đường, và (2) giá thể Mỗi yếu tố có 2 mức độ khác biệt (Bảng 2.4)
- Thí nghiệm có 4 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức có 5 hộp, mỗi hộp cấy 2 cây, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần
Bảng 2.4 Mô tả thí nghiệm
Tên nghiệm thức Nồng độ đường (g/l) Màng Millipore Giá thể
Môi trường nuôi cấy sử dụng là môi trường cơ bản đa lượng MS 1/2 (Murashige và Skoog, 1962), kết hợp với vi lượng MS và sắt EDTA MS Nếu môi trường có đường, sẽ bổ sung vitamin Morel, trong khi các nghiệm thức không có đường sẽ không sử dụng vitamin.
- Cường độ ỏnh sỏng 100 àmol m -2 s -1 , thời gian chiếu sỏng 16 giờ/ngày
- Giá thể agar 7,5 g/l và perlite 10 g/hộp
- pH trước khi khử trùng = 5,8
Hộp nuôi cấy Magenta (V = 370 mL) có thể được trang bị 2 màng Millipore hoặc không có màng nào trên nắp Đối với hộp không có màng Millipore, tần suất trao đổi khí là 0,16 lần/giờ, trong khi hộp có 2 màng Millipore cho thấy tần suất trao đổi khí cao hơn, đạt 3,9 lần/giờ.
* Chỉ tiêu theo dõi ngày thứ 30:
- Gia tăng trọng lượng tươi (mg/cây), tỷ lệ trọng lượng khô thân lá/trọng lượng khô rễ, chiều dài rễ (mm/cây), phần trăm chất khô (%)
2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng các yếu tố vật lý của môi trường nuôi cấy (tốc độ trao đổi khí của bình nuôi cấy, cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng, nồng độ CO 2 , loại giá thể) lên sự sinh trưởng của cây nuôi cấy trong giai đoạn in vitro và ex vitro
Dendrobium Burana White nuôi cấy quang tự dƣỡng
Hình 2.5 Chồi lan dùng trong thí nghiệm
Bảng 2.5 Mô tả thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy không có đường và vitamin, chứa khoáng đa lượng MS 1/2, Micro MS, sắt EDTA MS Giá thể agar 7,5 g/l
- Bình nuôi cấy: hộp Magenta (V70ml) chứa 70 ml/hộp pH môi trường và việc khử trùng môi trường giống thí nghiệm 1
Cường độ ánh sáng trong giai đoạn nuôi cấy được chia thành ba giai đoạn: từ ngày 0 đến ngày 9 là 30 µmol m^-2 s^-1, từ ngày 10 đến ngày 20 là 50 µmol m^-2 s^-1, và từ ngày 20 đến ngày 60 là 80 µmol m^-2 s^-1 Nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy duy trì ở mức 25 ± 2 °C và độ ẩm tương đối đạt 65 ± 5%.
- Thời gian nuôi cấy 60 ngày
- (mg/cây), phần trăm chất khô (%)
- Giải phẫu mẫu cấy ở các ngày thứ 2 và thứ 4
2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của cường độ ánh sáng và độ thoáng khí của hộp nuôi cây lên sự tăng truởng của cây lan Dendrobium Burana White nuôi cấy quang tự dƣỡng
- Cây lan có 3 lá, không rễ và có trọng lượng tươi ban đầu 300 ± 30 mg
Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu 2 yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, bao gồm độ thoáng khí của hộp nuôi cây và cường độ ánh sáng Độ thoáng khí được thể hiện qua số lượng màng Millipore gắn trên nắp hộp, với 2 màng tương ứng với 3,5 lần trao đổi khí mỗi giờ, hoặc 3 màng tương ứng với 4,9 lần/giờ (Kozai và cộng sự, 1986) Cường độ ánh sáng được chia thành 3 mức: 50, 80 và 110 µmol m^-2 s^-1.
- Thí nghiệm có 6 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức có 6 hộp và được lặp lại 3 lần
Bảng 2.6 Mô tả thí nghiệm
Tờn nghiệm thức Số màng Millipore Cường độ ỏnh sỏng (àmol m -2 s -1 )
HH 3 110 Điều kiện thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy không có đường và vitamin, chứa khoáng đa lượng
Knudson C, vi lượng MS, sắt EDTA MS Giá thể perlite 12 g/hộp
- Bình nuôi cấy: hộp Magenta (V70ml) chứa 75 ml/hộp pH môi trường và việc khử trùng môi trường giống thí nghiệm 1
Phương pháp
2.6 Phương pháp đo và tính các chỉ tiêu
Chiều cao chồi (CCC): đo từ nách lá nơi hình thành chồi mới đến ngọn chồi
Số lá/cây: số lá mở hoàn toàn có trên cây
Số rễ/cây: số rễ hình thành từ gốc trên 1 cây
Chiều dài rễ (CDR): đo từ gốc cây đến chóp rễ của rễ dài nhất (mm/cây)
Số chồi mới/cây: Số chồi mới được tính bằng cách đếm tất cả các chồi mới tạo ra từ một chồi cấy ban đầu
Gia tăng trọng lượng tươi của cây:
Sự gia tăng trọng lượng tươi của cây được tính theo công thức (1):
GTTLT = FW t − FW 0 (mg/cây) (1) trong đó:
GTTLT: gia tăng trọng lượng tươi (mg/cây)
FW 0 : trọng lượng tươi ban đầu (mg/cây)
FW t : trọng lượng tươi ở ngày lấy số liệu (mg/cây)
Gia tăng trọng lượng khô của cây:
Sự gia tăng trọng lượng khô của cây được tính theo công thức (2):
GTTLK = DW t − DW 0 (mg/cây) (2) trong đó:
GTTLK: gia tăng trọng lượng khô (mg/cây)
DW 0 : trọng lượng khô ban đầu (mg/cây)
DW t : trọng lượng khô ở ngày lấy số liệu (mg/cây)
Trọng lượng khô ban đầu được xác định thông qua phương trình tuyến tính, bằng cách cân 10 mẫu, mỗi mẫu gồm 4 chồi hoặc đốt cây, và sấy khô ở nhiệt độ 80 độ C cho đến khi trọng lượng ổn định (sau 72 giờ) Sau khi có trọng lượng tươi và trọng lượng khô của các mẫu, phần mềm Excel được sử dụng để tính toán phương trình tuyến tính tương quan giữa trọng lượng tươi và khô Phương trình này sau đó được áp dụng để xác định trọng lượng khô ban đầu của mẫu cấy.
Phần trăm chất khô được tính theo công thức (3): t t
% CK: phần trăm chất khô
TLK t : Trọng lượng khô của cây đo được ở ngày kết thúc thí nghiệm
TLT t : Trọng lương tươi của cây đo được ở ngày kết thúc thí nghiệm
Tốc độ tăng trưởng tương đối /ngày
Tốc độ tăng trưởng tương đối được tính theo công thức (4): trong đó:
RGR/ngày: tốc độ tăng trưởng tương đối (/ngày)
W 2 : Trọng lượng khô ở ngày T2 (mg)
W 1 : Trọng luợng khô ở ngày T1 (mg)
T1: Ngày bắt đầu nuôi cấy
T2: Ngày kết thúc nuôi cấy
Mỗi nghiệm thức sử dụng 10 mẫu lá xanh tốt, mỗi mẫu nặng 25 mg và được cắt nhuyễn Sau đó, cho từng mẫu vào ống nghiệm và thêm 10 ml acetone 80% Đậy kín ống nghiệm, bọc bằng giấy bạc và để ở nơi tối trong 72 giờ.
Cân mỗi nghiệm thức 15 mẫu lá, mỗi mẫu có trọng lượng tươi 25 mg Sấy khô các mẫu ở nhiệt độ 80 o C trong 72 giờ cho đến khi trọng lượng khô không thay đổi, nhằm tính toán trọng lượng khô trung bình A của mỗi mẫu đo nghiệm thức chlorophyll.
- Sau 72 giờ tiến hành đo từng ống nghiệm của từng nghiệm thức ở 2 phổ hấp thu
645 nm và 663 nm bằng máy đo quang phổ
- Hàm lượng chlorophyll a và b được tính theo công thức (5) và (6):
Chl a: Chlorophyll a (àg/mg trọng lượng khụ lỏ)
Chl b: Chlorophyll b (àg/mg trọng lượng khụ lỏ)
Abs 645: giá trị mật độ quang ghi nhận ở bước sóng 645 nm
Abs 663: giá trị mật độ quang ghi nhận ở bước sóng 663 nm
A: trọng lượng khô trung bình của 25 mg lá đem đi sấy khô
- Chl a+b = Chl a + Chl b (àg/mg trọng lượng khụ lỏ)
Hiệu suất quang hợp thuần (Fujiwara và cs., 1987): Được tính theo công thức (7) ln(W 2 ) – ln(W 1 )
P n : hiệu suất quang hợp thuần (àmol CO 2 h -1 /cõy) k : hằng số chuyển đổi CO 2 từ thể tích sang khối lượng mol, (k = 40,9*10 -6 mol ml -1 ) ở nhiệt độ 25 o C
Số lần trao đổi khí (N) trong hộp Magenta 370 ml có sự khác biệt đáng kể giữa các loại Cụ thể, N đạt từ 3,5 đến 3,9 lần/giờ đối với hộp có 2 màng Millipore ở nắp, trong khi N chỉ đạt từ 0,14 đến 0,17 lần/giờ đối với hộp không có màng Millipore Các giá trị này được tính theo phương pháp của Kozai và cộng sự.
V: thể tích hộp nuôi cấy (ml)
C out : nồng độ CO 2 (μmol mol -1 ) đo được ở phòng nuôi cây vào thời điểm nhất định bằng máy sắc ký khí GC2010 của Cty Shimazu, Nhật Bản
C in : nồng độ CO 2 (μmol mol -1 ) đo được ở trong hộp nuôi cây vào thời điểm nhất định n: số cây nuôi trong 1 hộp
Số lần trao đổi khí của hộp nuôi cây bơm khí trực tiếp:
Số lần trao đổi khí (lần/giờ) được tính theo công thức (8)
F: tốc độ trao đổi khí (l/phút) là chỉ số đọc được trên các lưu lượng kế
V: thể tích (ml) hộp nuôi cấy sau khi đã trừ đi phần thể tích khay hay giá thể và thể tích môi truờng nuôi cấy
2.7 Quan sát hình thái giải phẫu của rễ
Để quan sát sự hình thành rễ trong quá trình nuôi cấy, gốc đốt thân cây hông hoặc chồi lan sẽ được cắt thành lát mỏng và nhuộm hai màu xanh iode và đỏ carmin.
- Ngâm mẫu cắt trong nước Javel trong 10 phút
- Rửa mẫu nhiều lần với nước cất để làm sạch Javel
- Ngâm mẫu 10 phút trong dung dịch acid acetic 20%
- Rửa mẫu nhiều lần với nước cất để làm sạch acid acetic
- Thấm khô mẫu, nhỏ lên mẫu 3 – 4 giọt thuốc nhuộm 2 màu, để nhuộm trong 10 phút
- Rửa mẫu nhiều lần với nước cất để làm sạch thuốc nhuộm
- Quan sát hình thái giải phẫu của mẫu cắt dưới kính hiển vi
Phần mềm MSTATC của Đại học Michigan, Mỹ, được sử dụng để xử lý số liệu, trong đó số liệu được phân tích bằng ANOVA 1 hoặc 2 yếu tố nhằm đánh giá sự khác biệt giữa các nghiệm thức Nếu sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê, sẽ được phân hạng theo trắc nghiệm Duncan's Multiple Range Test hoặc LSD-test.
