THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI
1 Tên đề tài: Tạo kháng thể đơn dòng kháng CD45 của người hướng đến ứng dụng trong xét nghiệm các bệnh về máu (Mã số: YD01/13-15)
2 Cơ quan quản lý: Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM Địa chỉ: 176, Hai Bà Trưng, Quận 1, TP Hồ Chí Minh Điện thoại: 38 22 52 02
3 Đơn vị chủ trì: Phòng CNSH Y Dược- Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM Địa chỉ: km 1900, Quốc lộ 1A, P Trung Mỹ Tây, Q 12, Tp HCM
4 Cơ quan phối hợp chính: Bộ môn Di truyền – Khoa Sinh – Đại học Khoa học Tự nhiên
5 Chủ nhiệm đề tài: ThS Tạ Hương Giang
6 Cán bộ/Nhóm thực hiện:
ThS Nguyễn Thị Phương Thảo
7 Thời gian thực hiện: 30 tháng (1/2013 – 6/2015)
8 Kinh phí được duyệt: 500.000.000 VNĐ
9 Kinh phí đã sử dụng: 500.000.000 VNĐ
10 Các nội dung nghiên cứu đã thực hiện được so với kế hoạch nghiên cứu 2014
STT Nội dung đăng ký Thời gian (bắt đầu – kết thúc) Kết quả thực hiện Đánh giá
Nội dung 2: Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp huCD45RO biểu hiện từ
Thu nhận được kháng nguyên tái tổ hợp độ tinh sạch >90% Đạt
Nội dung 3: Tạo các plasmid biểu hiện protein tái tổ hợp huCD45RABC trên tế bào E coli
Plasmid có mang gene mã hóa huCD45RABC Đạt
Nội dung 4: Gây đáp ứng miễn dịch ở chuột
Chuột có đáp ứng kháng thể Đạt
Nội dung 5: Tạo và sàng lọc dòng tế bào hybridoma tiết kháng thể kháng CD45
Có được dòng hybridoma tiết kháng thể kháng CD45 Đạt
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
The cDNA sequence of the extracellular region of huCD45RO was obtained from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database (accession number NM_080921.3) and synthesized by IDT.
IV.1.2 Các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR
Cặp mồi pCD45RO (BamHI-CD45RO-F và XhoI-CD45RO-R) được sử dụng để khuếch đại cDNA phần ngoại bào từ vector tổng hợp pUCIDT-AMP Cả mồi xuôi và mồi ngược đều có trình tự nhận biết của enzyme BamHI và XhoI ở đầu 5’ tương ứng.
- Cặp mồi pJET (pJET1.2 F và pJET1.2 R) dùng kiểm tra việc chèn sản phẩm PCR vào vector pJET1.2/blunt
- Cặp mồi pET28a+ (T7 promoter và T7 terminator) dùng kiểm tra việc chèn gene huCD45exRO vào vector pET28a+ bằng phương pháp PCR khuẩn lạc và giải trình tự gene
Bảng 1 Thông tin các cặp mồi
Tên Trình tự pCD45RO
CD45RO-R 5-GGGACTCGAGCTTAGAATTATAAGATGTTGAATG-3 pJET pJET1.2 F 5’ CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC 3’ pJET1.2 R 5’ AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG 3’ pET28a+ T7 promoter 5’ TAATACGACTCACTATAGGG 3’
CD45-Exon7-F 5’ GAT GCC TAC CTT AAT GCC TCT G 3’
R 5’ CAG AGG CAT TAA GGT AGG CAT C 3’
- Plasmid tạo dòng đầu bằng pJET1.2/blunt (Thermo scientific)
- Plasmid biểu hiện pET28a(+) (Novagen)
IV.1.4 Chủng vi sinh vật
- E.coli DH5α được dùng tạo dòng và lưu trữ plasmid tái tổ hợp
- E.coli BL21(DE3) được dùng biểu hiện protein tái tổ hợp
Hình 5 Thang DNA 1kb (ThermoScientific); Thang protein từ bio basic.
Hóa chất
IV.2.1 Hóa chất cho tạo dòng và biểu hiện
- Lysis buffer: Tris- HCl 50mM, NaCl 200mM, DTT 5mM, PMSF 1mM (DTT và PMSF bổ sung trước khi sử dụng)
- PBS (Phosphate buffered saline) 1X: KH 2 PO 4 (1,47 mM), Na 2 HPO 4 2H 2 O (10 mM), KCl (2,7 mM), NaCl (137 mM)
- Môi trường LB broth tổng hợp từ LabM
- Kháng sinh kanamycin 50mg/ml, ampicillin 50mg/ml
IV.2.2 Hóa chất cho phân tích protein
IV.2.2.1 Hóa chất cho SDS-PAGE
- Dung dịch Tris base- glycine buffer 10X (pH 8.3): 30.2g/l Tris base , 144.2g /l glycine
- Ammonium persulphate 10% (APS) (bảo quản ở 4 0 C)
- TEMED (N, N, N’, N’ – tetramethylethylene diamine) (bảo quản ở 4 0 C)
- Dung dịch chạy điện di: 100 ml Tris base – glycine 10X, 10ml SDS 10%, pha trong 1l nước cất
- Dung dịch nạp mẫu 5X: 4ml Tris-HCl (pH 6.8) 1.5M , 10ml glycerol, 5ml β- mercaptoethanol, 2g SDS, 1ml bromophenol blue 1%
- Dung dịch nhuộm coomassie blue
1 Dung dịch nhuộm: 0,1 % Coomassie Blue R250 (w/w), 30 % methanol, 5% acetic acid
2 Dung dịch giải nhuộm: methanol 455ml/l, acetic acid 90ml/l
1 Dung dịch cố định mẫu Fixing: 40% ethanol, 10% acetic acid, 50% nước
4 Dung dịch hiện màu sodium carbonate 3%
5 Dung dịch ngừng phản ứng acetic acid 5%
IV.2.2.2 Hóa chất cho lai Western Blot
- Dịch chuyển màng: 100ml/l Tris base – glycine 10X, 100ml/l methanol
- TBST: 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20
- Dung dịch khóa màng: 5% skim milk pha trong TBST
- Kháng thể sơ cấp anti His probe h15 từ Santa Cruz Biotechnology
- Kháng thể thứ cấp goat anti rabbit IgG-HRP từ Santa Cruz Biotechnology
- Skim milk, DAB từ Sigma-aldrich
IV.2.2.3 Hóa chất cho hòa tan protein bằng urea 8M
- Tris/CaCl2 (pH 7.8-8): Tris base 50mM, CaCl 2 1mM.
IV.2.3 Hóa chất cho tinh sạch protein trên cột HisTrap HP 1ml
- Dung dịch đệm sodium phosphate 1M (pH 7.4): 77.4 ml/l Na2HPO4 1 M, 22.6 ml/l NaH2PO4 1 M.
- Dung dịch gắn cột (pH 7.4):Sodium phosphate buffer 20mM, Glycerol 10%,
Glucose 15mM, NaCl 0.5M, Imidazole 20mM, Urea 4M
- Dung dịch tái gấp cuộn (pH 7.4): Sodium phosphate buffer 20mM, Glycerol 10%,
Glucose 15mM, NaCl 0.5M, Imidazole 20mM, Arginine 0.4M
- Dung dịch thôi giải (pH 7.4): Sodium phosphate buffer 20mM, Glycerol 10%, Glucose 15mM, NaCl 0.5M, Imidazole 500mM, Arginine 0.2M
IV.2.4 Hóa chất cho quá trình gây đáp ứng miễn dịch trên chuột
- Tá chất: CFA (Complete Freund’s Adjuvant), IFA (Incomplete Freund’s
- Hóa chất cho phản ứng ELISA
2 PBS – BSA 1 %: PBS 1X + bovine serum albumin (BSA) (Sigma) 1 %
3 Khỏng nguyờn huCD45exRO nồng độ 5àg/ml
4 Kháng thể đa dòng kháng IgG chuột đánh dấu alkaline phosphatase (Invitrogen)
5 Cơ chất của enzyme alkaline phosphatase được pha trong dung dịch pha cơ chất (pH 9,8) có thành phần : Diethanolamine (Merck) 48,5 ml, MgCl2 4M 62,5 μl, ddH2O 500 ml
IV.2.5 Hóa chất cho quá trình xử lý dịch môi trường thu nhận từ quá trình nuôi cấy hybridoma
IV.2.5.1 Hóa chất cho tủa miễn dịch sử dụng hạt protein A
IV.2.5.2 Hóa chất cho quá trình tinh sạch kháng thể kháng huCD45 từ dịch nuôi cấy hybridoma
- Binding buffer: 20mM sodium phosphate, pH 7.0
- Elution buffer: 0.1M glycine –HCl, pH 2.7
- Neutrolizaion buffer: 1M tris –HCl, pH 9
Phương pháp nghiên cứu
IV.3.1 Phương pháp tạo plasmid biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp huCD45exRO trên dòng tế bào E coli BL21 (DE3)
- Đoạn gene mã hóa vùng ngoại bào huCD45exRO được khuếch đại từ pUCIDT- AMP bằng phản ứng PCR với pfu polymerase và cặp mồi pCD45RO
Sản phẩm PCR tinh sạch được kết nối với vector pJET1.2/blunt thông qua bộ CloneJET PCR Cloning Kit, sau đó được chuyển vào vi khuẩn E.coli DH5α Vi khuẩn này được nuôi cấy trên môi trường thạch LB có chứa kháng sinh Ampicillin với nồng độ 50ug/ml.
Sau 16 giờ, các khuẩn lạc được kiểm tra bằng phương pháp PCR với cặp mồi pJET1.2, sử dụng hai enzyme BamHI và XhoI để cắt, cùng với phương pháp giải trình tự gene Mục tiêu là tăng sinh khuẩn lạc mang plasmid pJET_hCD45RO bằng kit EZ-10spin column plasmid DNA từ Biobasic Canada.
Gene huCD45RO được chiết xuất từ plasmid pJET_huCD45exRO thông qua phản ứng cắt bằng enzyme BamHI và XhoI Tương tự, plasmid pET28a+ cũng được cắt mở vòng bằng các enzyme này Các phản ứng cắt diễn ra ở nhiệt độ 37⁰C trong 3 giờ.
Gene huCD45RO được nối vào plasmid pET28a+ bằng T4 ligase ở nhiệt độ 22⁰C trong 2 giờ Sau đó, hỗn hợp phản ứng nối được chuyển vào E.coli DH5α và được chọn lọc trên môi trường thạch LB có kháng sinh Kanamycin với nồng độ 50ug/ml.
- Sau 16 giờ, các khuẩn lạc được kiểm tra bằng phương pháp PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi pET28a+, và phản ứng cắt sử dụng 2 enzyme BamHI, XhoI
- Khuẩn lạc mang plasmid pET28a+_huCD45exRO mong muốn được tăng sinh thu plasmid pET28a+_huCD45RO, sau đó hóa biến nạp plasmid này vào E.coli BL21 (DE3)
Bảng 2 Thành phần phản ứng PCR
Thành phần phản ứng Nồng độ cuối Thể tích cho 1 phản ứng
Polymerase buffer 10X 1X 5.0 àl dNTPs 10mM 0,2 mM 1àl
Mồi xuụi 10 àM 0,5 àM 2.5 àl
Mồi ngược10 àM 0,5 àM 2.5 àl
Bảng 3 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR
Bước Thời gian/ chu kỳ Số chu kỳ
Bảng 4 Phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn ở 37 0 C, 3 giờ
Thành phần phản ứng Nồng độ cuối Thể tích cho 1 phản ứng
Plasmid/ sản phẩm PCR 5àg
Enzyme BamHI(NEB) 1U/1 àg DNA 0.25àl
Enzyme XhoI (NEB) 1U/1 àg DNA 0.25àl
Bảng 5 Thành phần phản ứng nối ở 22 0 C, 2 giờ
Thành phần Nồng độ phản ứng Thể tích cho 1 phản ứng
2X buffer phản ứng 1X 10 àl huCD45exRO 0.15 pmol ends 1àl pET28a+ 0.05 pmol ends 1àl
T4 DNA ligase (5u/àl) 0.25u/àl 1 àl
IV.3.2 Phương pháp biểu hiện và thu nhận kháng nguyên tái tổ hợp huCD45exRO từ hệ thống E coli BL21 (DE3)
Plasmid tái tổ hợp chứa gene mã hóa cho vùng ngoại bào của huCD45exRO đã được chuyển vào dòng tế bào biểu hiện E coli BL21 (DE3) và được kích thích biểu hiện bằng IPTG.
- Hoạt hóa qua đêm một khuẩn lạc E Coli BL21 (DE3) mang plasmid biểu hiện pET28a+/huCD45exRO trong 5ml mụi trường LB-Kana (50àg/ml) Lắc 37 0 C, 250 vòng/phút
- Tăng sinh biểu hiện: hỳt 50àl (1%) giống hoạt húa vào 5ml mụi trường LB-Kana, lắc 37 0 C, 250 vòng/phút
- Khi OD600 đạt 0,6 – 1, bổ sung IPTG đạt nồng độ cuối 1mM
- Tiếp tục nuôi cấy biểu hiện ở nhiệt độ và thời gian khảo sát
- Ly tâm dịch biểu hiện ở 6000 vòng/phút, 5 phút Bỏ dịch nổi
- Tái huyền phù cặn tế bào trong 1ml PBS 1X Lặp lại bước này 2 -3 lần
- Ly tâm 6000 vòng/phút, 5 phút, bỏ dịch nổi
- Trữ cặn tế bào ở -80 0 C đến khi sử dụng
- Cho vào eppendorf mẫu 1ml lysis buffer Vortex Kĩ
- Tiến hành sonicate mẫu theo chu kì: 3 phút, 15 giây đánh, 15 giây nghỉ, 12- 15W Lặp lại 2 -3 lần
- Ly tâm dịch sau sonicate ở 13000 vòng/phút, 10 phút, 4 0 C Hút dịch nổi chuyển sang một eppendorf mới
- Rửa cặn sau ly tâm với PBS 1X, 2 lần Thêm 1 thể tích PBS, vortex kĩ
- Trữ mẫu ở -20 0 C/ -80 0 C đến khi sử dụng
IV.3.3 Phương pháp tạo plasmid biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp huCD45exRABC trên dòng tế bào E coli BL21 (DE3)
Bảng 6 PCR 1: Thu nhận đoạn exon 3, 4, 5, 6, và 20 Nu exon 7
Thành phần Nồng độ cuối Thể tích cho 1 phản ứng
Pfu buffer 10X 1X 5.0 àl dNTPs 10mM 0,2 mM 1àl
Mồi CD45-Exon7-R 10àM 0,5 àM 2.5 àl
Bảng 7 PCR 2: Thu nhận đoạn exon 7-15
Thành phần Nồng độ cuối Thể tích cho 1 phản ứng
Pfu buffer 10X 1X 5.0 àl dNTPs 10mM 0,2 mM 1àl
Mồi CD45-Exon7-R 10àM 0,5 àM 2.5 àl
Bảng 8 PCR 3: PCR overlap sản phẩm PCR 1 và PCR 2
Thành phần Nồng độ cuối Thể tích cho 1 phản ứng
(539Nu) Tính V của mỗi template để số lượng phân tử như nhau
Pfu buffer 10X 1X 5.0 àl dNTPs 10mM 0,2 mM 1àl
60º 30 giây 5 chu kỳ (không sử dụng primers)
Bảng 9 PCR 4: Khuếch đại đoạn gene thu nhận từ PCR overlap
Thành phần Nồng độ cuối Thể tích cho 1 phản ứng
Template DNA (PCR3 product)
