Nghiên cứu tạo hydro h2 từ bã mía bằng phương pháp lên men kỵ khí

i TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Đề tài “Nghiên cứu tạo khí hydro từ bã mía bằng phương pháp lên men kỵ khí” nằm trong xu thế "sản xuất năng lượng xanh từ chất thải" có ý nghĩa vừa bảo vệ

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO NGHIỆM THU

PHÁP LÊN MEN KỴ KHÍ

Chủ nghiệm đề tài: NGUYỄN DƯƠNG TÂM ANH

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 05/2016

i

TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Đề tài “Nghiên cứu tạo khí hydro từ bã mía bằng phương pháp lên men kỵ khí” nằm trong xu thế "sản xuất năng lượng xanh từ chất thải" có ý nghĩa vừa bảo vệ môi trường và vừa tạo ra nguồn nhiên liệu sạch Nội dung nghiên cứu gồm có thu nhận các hỗn hợp vi sinh vật có khả năng lên men kỵ khí sinh khí hydro (H2) từ các nguồn bùn và phân động vật, tiền xử lý bã mía thành nguồn cơ chất dễ lên men bằng phương pháp hóa

lý và khảo sát khả năng tạo khí H2 từ bã mía của các hỗn hợp vi sinh vật (VSV) kỵ khí trong ở qui mô phòng thí nghiệm sử dụng chai serum 120 ml và fermenter 3l

15 hỗn hợp vi sinh vật có khả năng lên men tạo H2 được thu nhận từ 15 mẫu bùn thải kỵ khí gồm bùn thải từ các cống rãnh sinh hoạt thuộc nội đô thành phố, bùn sản xuất

từ nhà máy, từ bể biogas, phân động vật và bùn từ các nhà máy xử lý thải Trong việc tiền

xử lý nguồn thải nhằm gia tăng khả năng thu nhận VSV lên men tạo H2, phương pháp sốc nhiệt cho kết quả tốt hơn so với phương pháp ngâm acid Nhiệt độ 80oC trong 15 - 30 phút là điều kiện xử lý nhiệt thích hợp cho đa số các mẫu bùn (9/15 mẫu) với hàm lượng

H2 là 435 - 877 ml/l và hiệu suất sinh H2 đạt 1,02 - 1,60 mol H2/mol glucose Tất cả 15 hỗn hợp chủng VSV cho hiệu quả sinh H2 cao nhất sau 48h lên men ở nhiệt độ phòng (28

- 32oC), pH 6,5 với nồng độ glucose ở nồng độ 5 - 7,5 g/l và cao nấm men ở nồng độ 1,5 g/l Hàm lượng H2 tích lũy của các hỗn hợp vi sinh vật dao động từ 400 - 900 ml H2/l với hiệu suất sinh H2 đạt 0,84 - 1,60 mol H2/mol glucose Các loài vi khuẩn chiếm ưu thế hiện diện trong các hỗn hợp vi sinh vật được xác định bằng phương pháp PCR – DGGE -

1-giải trình tự DNA có thể là Enterococcus, Escherichia/Shigella và Clostridium

Thành phần hóa học của bã mía điều kiện nghiên cứu này có chất rắn tổng 93,01%, độ ẩm 6,99%, carbohydrate 89,13%, 1,55 % tro và thành phần khác 2,79% Phương pháp tiền xử lý bã mía thành cơ chất dễ lên men sử dụng H2SO4 loãng thích hợp hơn so với dùng NaOH ở các điều kiện xử lý: tỉ lệ bã mía : H2SO4 2% (w/v) = 1:10, 15 phút, 121oC, 1 atm

CMS là chủng hỗn hợp có khả năng lên men tốt nhất trên dịch bã mía đã qua tiền

xử lý bằng H2SO4 với hàm lượng H2 tích lũy và hiệu suất sinh H2 là 300,136 ± 3,964 ml

H2/l môi trường Kết quả tối ưu điều kiện nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt đáp ứng

ii

RSM đã đưa ra được giá trị tối ưu cho các thông số có ảnh hưởng quan trọng lên quá trình lên men sinh H2 gồm: nồng độ đường: 17,75 g/l, pH ban đầu: 6,3; tỉ lệ nạp giống 6,6 ml/ 40 ml môi trường (16,5%) với sự sai khác trong kết quả hàm lượng H2 tích lũy lý thuyết và thực nghiệm là 4%

Kết quả lên men trên hệ thống fermentor 3l với thể tích môi trường 2l với những giá trị tối ưu của các thông số nuôi cấy thu được hàm lượng H2 tích lũy là 2,444 l H2/l môi trường

iii

SUMMARY OF RESEARCH CONTENT

The topic “Biohydrogen production from sugarcane bagasse (SCB) by anaerobic dark fermentation” in trend "green energy production from waste" means both to protect the environment and to create sustainable fuel sources Research contents include obtaining microbial mixtures capable of anaerobically producing hydrogen (H2) from the sludge and animal sources, pretreating SCB into fermentable carbon sources by easy physicochemical methods and investigating the potential of fermetative H2 production from bagasse by the anaerobic microbial mixtures in laboratory scale using 120 ml serum bottles and 3l fermenter

Fifteen microbial mixtures capable of fermenting H2 were collected from 15 samples including anaerobic sludge from the municipal sewage sludge, production plants, biogas digester, animal manure and wastewater treatment plants In the pretreatment of waste source to increase the ability to obtain the H2-producing mixtures, heat shock method gives better results than the acid soaking method In the method, 80oC for 15 to

30 minutes is suitable processing conditions for the majority of the sludge (9/15 samples) with H2 concentration is 435 - 877 ml/l and H2 yield of 1,02 - 1,60 mol H2/mol glucose All 15 mixed strains showed the highest efficiency of H2 production after 48 hours of fermentation at room temperature (28 - 32oC), pH 6,5 at a glucose concentration of 5 - 7,5 g/l and yeast extract of 1-1,5 g/l Accumulated H2 contents of the mixtures ranged from 400 - 900 ml H2/l with H2 yield of 0,84 to 1,60 mol H2/mol glucose The predominant bacteria present in the mixture of microorganisms was determined by PCR-

DGGE method-sequencing DNA can be Enterococcus, Escherichia/Shigella and

Clostridium

The chemical composition of SCB in this study is 93,01% of total solids, 6,99% of moisture, 89,13% of carbohydrate, ash of 1,55% and other components of 2,79% Pretreatment methods of SCB into fermentable substrate using dilute H2SO4 is more effective than using sodium hydroxide with the treatment conditions of the ratio of SCB:

H2SO4 2% (w/v) = 1:10, 15 minutes, 121oC, 1 atm in a autoclve

iv

CMS is the mixed strain capable of the best H2 production from H2SO4-pretreated SCB with the highest accumulate H2 content of 300,136 ± 3,964 ml H2/l The optimization of cultivation conditions by reponse surface methodology has shown optimal values of the parameters which have very importantly influence on H2fermentation including the glucose concentration of 17,75 g/l, initial pH of 6,3; inoculum ratio of 6,6 ml/40 ml medium (16,5%) with differences in the theorical and experiment levels of H2 results accumulated of 4%

Result of H2 fermentation in 3l fermentor with the medium volume of 2l in the optimized cultivation conditions is 2,444 l H2/l

v

MỤC LỤC

TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU i

SUMMARY OF RESEARCH CONTENT iii

MỤC LỤC v

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xii

DANH SÁCH BẢNG xiv

DANH SÁCH HÌNH xvi

DANH SÁCH ĐỒ THỊ xvii

PHẦN MỞ ĐẦU 1

1 Thông tin đề tài 1

2 Mục tiêu 1

3 Nộidung 1

3.1 Nội dung thực hiện 1

3.2 Sản phẩm 4

4 Kinh phí quyết toán .5

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 Hiện trạng về nguồn năng lượng sinh khối từ bã mía ở Việt Nam 6

1.2 Đặc điểm lý hoá của bã mía 7

1.3 Các phương pháp tiền xử lý bã mía 9

1.3.1 Phương pháp vật lý 9

1.3.2 Phương pháp hóa học 9

1.3.2.1 Thủy phân bằng base 9

1.3.2.2 Thủy phân bằng acid 10

1.3.3 Phương pháp thủy nhiệt 12

1.3.4 Phương pháp sinh học 12

1.4 Tạo khí hydro (H2)nhiên liệu từ bã mía bằng phương pháp lên men tối 14

1.4.1 Khí H2 sinh học 14

1.4.2 Sản xuất hydro bằng phương pháp lên men tối 15

vi

1.4.2.1 Cơ chế của quá trình lên men tối tạo hydro 15

1.4.2.2 Các vi sinh vật sản xuất H2 bằng con đường lên men tối 17

1.4.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tối 18

1.5 Tình hình nghiên cứu tạo H2 từ bã mía 19

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Nội dung 1 Chọn lọc các hỗn hợp giống vi khuẩn kỵ khí từ các mẫu bùn thải có khả năng tạo H2 bằng phương pháp lên men kỵ khí 21

2.1.1 Mô tả nội dung 21

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.1.2.1 Thu nhận mẫu bùn làm nguồn vi sinh vật có khả năng tạo H2 bằng phương pháp lên men kỵ khí 21

2.1.2.2 Xác định độ ẩm, pH, carbohydrate tổng của các mẫu bùn thải làm nguồn thu nhận hỗn hợp giống vi sinh vật 21

2.1.2.3 Xác định điều kiện xử lý mẫu bùn thích hợp để thu nhận các hỗn hợp giống vi sinh vật có khả năng tạo H2 bằng phương pháp lên men 22

2.1.3 Các chỉ tiêu theo dõi 26

2.1.4 Sản phẩm nội dung cần đạt 26

2.2 Nội dung 2 Khảo sát các thông số sinh - động học trong sự tăng trưởng và lên men H2 của các hỗn hợp giống vi khuẩn phân lập được như thời gian tăng trưởng, nhiệt độ, pH môi trường, các loại cơ chất khác nhau, nồng độ cơ chất, hàm lượng H2 sinh ra 26

2.2.1 Mô tả nội dung 26

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.2.1 Xác định thời gian tăng trưởng, nhiệt độ, pH môi trường thích hợp 26

2.2.2.2 Xác định nguồn C và nồng độ C thích hợp 27

2.2.2.3 Xác định nguồn N và nồng độ N thích hợp 27

2.2.3 Các chỉ tiêu theo dõi 27

2.2.4 Sản phẩm nội dung cần đạt 28

2.3 Nội dung 3 Xác định chủng vi khuẩn chiếm ưu thế trong các hỗn hợp giống bằng phương pháp điện di trên gel có khuynh độ biến tính (DGGE) 28

vii

2.3.1 Mô tả nội dung 28

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.3.2.1 Tách chiết và thu nhận DNA tổng số của 15 chủng hỗn hợp VSV 28

2.3.2.2 Khuếch đại trình tự 16S tổng số của chủng hỗn hợp VSV bằng phương pháp PCR 29

2.3.2.3 Khuếch đại trình tự 16S chọn lọc của chủng hỗn hợp VSV bằng phương pháp PCR 30

2.3.2.4 Phân tách các trình tự 16S của chủng hỗn hợp VSV bằng phương pháp DGGE 31

2.3.2.5 Phân tích BLAST và dự đoán một số chủng vi sinh vật chiếm ưu thế hiện diện trong hỗn hợp vi sinh vật 32

2.3.3 Các chỉ tiêu theo dõi 33

2.3.4 Sản phẩm nội dung cần đạt 33

2.4 Nội dung 4 Khảo sát một số thành phần hóa học của bã mía 33

2.4.1 Mô tả nội dung 33

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu 33

2.4.2.1 Xác định carbohydrate 33

2.4.2.2 Xác định hàm lượng tro 34

2.4.2.3 Xác định độ ẩm 34

2.4.2.4 Tổng chất rắn 34

2.4.3 Các chỉ tiêu theo dõi 34

2.4.4 Sản phẩm nội dung cần đạt 34

2.5 Nội dung 5 Khảo sát một số phương pháp xử lý bã mía để tăng cường hàm lượng carbohydrate dễ lên men trong dịch bã mía sau xử lý sử dụng cho lên men 34

2.5.1 Mô tả nội dung 34

2.5.2 Phương pháp nghiên cứu 34

2.5.2.1 Tiền xử lý bã mía bằng dung dịch acid H2SO4 loãng kết hợp với nhiệt độ cao 34

2.5.2.2 Tiền xử lý bằng dung dịch NaOH loãng 35

viii

2.5.3 Các chỉ tiêu theo dõi 35

2.5.4 Sản phẩm nội dung cần đạt 35

2.6 Nội dung 6 Sử dụng hỗn hợp giống có hiệu suất cao nhất để lên men tạo H2 trên nguồn cơ chất phế thải giàu carbohydrate là bã mía ở điều kiện lên men mẻ trong các bình serum dung tích 120 ml 35

2.6.1 Mô tả nội dung 35

2.6.2 Phương pháp nghiên cứu 36

2.6.2.1 Xác định hiệu suất sử dụng đường trong dịch 36

2.6.2.2 Xác định hiệu suất sử dụng đường trong bã 36

2.6.3 Các chỉ tiêu theo dõi 37

2.6.4 Sản phẩm nội dung cần đạt 37

2.7 Nội dung 7 Tối ưu hóa một số điều kiện lên men sinh H2 trong chai serum dung tích 120 ml 37

2.7.1 Mô tả nội dung 37

2.7.2 Phương pháp nghiên cứu 37

2.7.2.1 Khảo sát các thông số ảnh hưởng tới khả năng sinh H2 37

2.7.2.2 Sàng lọc các yếu tố chính ảnh hưởng tới hàm lượng H2 bằng thiết kế Plackett - Burman 38

2.7.2.3 Thiết kế BBD tối ưu các yếu tố 39

2.7.3 Các chỉ tiêu theo dõi 39

2.7.4 Sản phẩm nội dung cần đạt 39

2.8 Nội dung 8 Thiết kế hệ thống bioreactor để lên men tạo H2 ở qui mô phòng thí nghiệm (1 – 3l) 39

2.8.1 Mô tả nội dung 39

2.8.2 Phương pháp nghiên cứu 40

2.8.3 Các chỉ tiêu theo dõi 40

2.8.4 Sản phẩm nội dung cần đạt 40

2.9 Nội dung 9 Khảo sát khả năng lên men sinh H2 từ nguồn bã mía trên hệ thống bioreactor 40

ix

2.9.1 Mô tả nội dung 40

2.9.2 Phương pháp nghiên cứu 40

2.9.3 Các chỉ tiêu theo dõi 40

2.9.4 Sản phẩm nội dung cần đạt 41

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 42

3.1 Kết quả nội dung 1 Chọn lọc các hỗn hợp giống vi khuẩn kỵ khí từ các mẫu bùn thải có khả năng tạo H2 bằng phương pháp lên men kỵ khí 42

3.1.1 Kết quả xác định độ ẩm, pH, carbohydrate tổng và giá trị COD của các mẫu bùn thải làm nguồn thu nhận hỗn hợp giống vi sinh vật 42

3.1.2 Kết quả xác định điều kiện xử lý mẫu bùn thích hợp để thu nhận các hỗn hợp giống vi sinh vật có khả năng lên men kỵ khí tạo H2 43

3.1.2.1 Điều kiện xử lý các mẫu bùn thải tốt nhất bằng phương pháp sốc nhiệt 43

3.1.2.2 Điều kiện xử lý tốt nhất bằng phương pháp ngâm acid 44

3.1.2.3 So sánh hiệu quả giữa hai phương pháp xử lý 46

3.2 Kết quả nội dung 2 Khảo sát các thông số sinh-động học trong sự tăng trưởng và lên men H2 của các hỗn hợp giống vi khuẩn phân lập được như thời gian tăng trưởng, nhiệt độ, pH môi trường, các loại cơ chất khác nhau, nồng độ cơ chất, hàm lượng H2 sinh ra 47 3.2.1 Khảo sát thời gian nuôi cấy đến khả năng tích lũy H2 ở các chủng hỗn hợp VSV 47

3.2.2 Khảo sát pH môi trường ban đầu 48

3.2.4 Ảnh hưởng của nguồn C đến khả năng lên men sinh H2 49

3.2.5 Ảnh hưởng của nồng độ glucose đến khả năng lên men sinh H2 50

3.2.6 Ảnh hưởng của các nguồn N lên khả năng sinh H2 của các hỗn hợp VSV 51

3.2.7 Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến khả năng lên men sinh H2 của hỗn hợp VSV 52

3.2.8 Kết quả khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình lên men và hàm lượng H2 tích lũy của 15 chủng hỗn hợp VSV thu nhận từ các nguồn khác nhau được tổng kết trong bảng sau 53

x

3.3 Kết quả nội dung 3 Xác định chủng vi khuẩn chiếm ưu thế trong các hỗn hợp giống

bằng phương pháp điện di trên gel có khuynh độ biến tính (DGGE) 54

3.3.1 Kết quả ly trích và thu nhận bộ gen DNA của hỗn hợp vi khuẩn 54

3.3.2 Kết quả nhân bản vùng gen 16S rDNA của 15 chủng hỗn hợp 54

3.3.3 Kết quả nhân bản vùng gen V3 của 15 chủng hỗn hợp 55

3.3.4 Kết quả phân tích cộng đồng vi khuẩn bằng kỹ thuật DGGE 55

3.3.5 Kết quả giải trình tự (phụ lục) 56

3.3.6 Xây dựng cây phân loài 56

3.4 Kết quả nội dung 4 Xác định một số thành phần hóa học của bã mía 59

3.5 Kết quả nội dung 5 Xác định phương pháp xử lý tiền xử lý phù hợp với bã mía 60

3.5.1 Tiền xử lý bã mía bằng acid H2SO4 loãng kết hợp với nhiệt độ cao 60

3.5.1.1 Kết quả xác định tỉ lệ xử lý (bã mía : H2SO4 2%, w/v) thích hợp 60

3.5.1.2 Kết quả xác định nồng độ acid H2SO4 thích hợp 60

3.5.1.3 Kết quả khảo sát thời gian tiền xử lý thích hợp 61

3.5.2 Xử lý bã mía bằng dung dịch NaOH loãng 62

3.5.2.1 Khảo sát thời gian xử lý 62

3.5.2.2 Khảo sát nhiệt độ xử lý 63

3.5.2.3 Khảo sát nồng độ kiềm 63

3.5.2.4 Khảo sát tỉ lệ giữa bã mía và tác nhân xử lý NaOH 64

3.5.3 So sánh giữa hai tác nhân xử lý NaOH và H2SO4 64

3.6 Kết quả nội dung 6 Xác định hỗn hợp giống có hiệu suất cao nhất để lên men tạo H2 trên nguồn cơ chất carbohydrate là bã mía ở điều kiện lên men mẻ trong các bình serum dung tích 120 ml 67

3.7 Kết quả nội dung 7 Tối ưu hóa lên men sinh H2 trên môi trường Chen sử dụng nguồn C là bã mía sau xử lý trong các chai serum dung tích 120 ml 69

3.7.1 Xác định vùng cực trị của các thông số ảnh hưởng tới đến sự men sinh H2 bằng phương pháp RSM 69

3.7.2 Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng chính tới hàm lượng H2 bằng thiết kế Blackett - Burman 71

xi

3.7.3 Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng chủ yếu bằng thiết kế Box-Behnken (BBD) 74

3.8 Kết quả nội dung 8 Thiết kế hệ thống fermentor phù hợp với sản phẩm thu nhận là chất khí 79

3.9 Kết quả nội dung 9 Xác định khả năng lên men sinh H2 từ nguồn bã mía trên hệ thống bioreactor 80

4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 84

4.1 Kết luận 84

4.2 Đề nghị 85

TÀI LIỆU THAM KHẢO 87

PHỤ LỤC 90

xii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT

BCT Mẫu bùn đất nông nghiệp Cần Thơ

BHH Mẫu bùn thu ở nhà máy Hòa Hưng

BLS Mẫu bùn thu ở lòng sông Sài Gòn

BLV Mẫu bùn thu ở ao cá tra Lai Vung

BPH Mẫu bùn thu bãi rác xã Phước Hiệp, Củ Chi BPL Mẫu bùn thu ở khu công nghiệp Phước Long BPM Mẫu bùn thu ở bồn biogas Phú Mỹ

Dịch thải rỉ đường sau lên men

COD (Chemical oxygen demand) Nhu cầu oxy hóa học

CTAB Cetyltrimethyl ammonium bromide

DCP (Department of Crop Production) Cục trồng trọt

DGGE (Denaturing Gradient Gel

Fdox Ferredoxin oxy hóa

FHL Enzyme formate hydrogen lyase

HMF Hydroxymethyl furfural

NCT Mẫu bùn thu ở đường Nguyễn Cư Trinh NN&PTNT Nông nghiệp & Phát triển nông thôn

NPK Mẫu bùn thu ở đường Nguyễn Phi Khanh

PB Mẫu phân bò Củ Chi

PCR (Polymerase Chain Reaction) Phản ứng chuỗi trùng hợp

PFL Enzyme pyruvate formate lyase

PFOR Enzyme pyruvate ferredoxin oxidoreductase

xiv

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1.1 Sản phẩm ức chế sau khi tiền xử lí các loại lignocelluloses khác nhau 11 Bảng 1.2 Ưu và nhược điểm của các phương pháp xử lí sinh khối lignocellulose 13 Bảng 1.3 Một số nghiên cứu lên men sinh H2 từ bã mía 20 Bảng 2.1 Cách chuẩn bị các nồng độ glucose chuẩn 22 Bảng 2.2 Thành phần môi trường Chen cải biên 23 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR 16S rDNA 29 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR vùng V3 với cặp mồi 357F_GC và 517R 30 Bảng 2.5 Cách pha gel polyacrylamide biến tính 31 Bảng 2.6 Tỉ lệ phối trộn gel polyacrylamine vào 2 ống xilanh 32 Bảng 2.7 Thiết kế ma trận Plackett - Burman cho 5 yếu tố 38

Bảng 3.1 Thông số độ ẩm, pH, carbohydrate tổng và giá trị COD của các mẫu

Bảng 3.2 Điều kiện tiền xử lý các mẫu bùn thải bằng phương pháp sốc nhiệt để

thu nhận nguồn giống vi sinh vật lên men sinh H2 tốt nhất 44

Bảng 3.3 Điều kiện tiền xử lý các mẫu bùn thải bằng phương pháp ngâm acid để

thu nhận nguồn giống vi sinh vật lên men sinh H2 tốt nhất 45

Bảng 3.4 Tổng hợp kết quả điều kiện tiền xử lý thích hợp nhất đối với 15 mẫu

Bảng 3.5 Điều kiện lên men sinh H2 thích hợp của 15 chủng hỗn hợp 53 Bảng 3.6 Thành phần hóa học của bã mía (%, w/w) 59 Bảng 3.7 Kết quả sau lên men của hai phương pháp tiền xử lý 65

Bảng 3.8 Kết quả xác định vùng cực trị của các yếu tố nuôi cấy ảnh hưởng đến

hàm lượng H2 tích lũy 71 Bảng 3.9 Ma trận thiết kế thí nghiệm theo Placket-Burman cho 5 yếu tố 71 Bảng 3.10 Kết quả các thí nghiệm theo thiết kế ma trận Plackett- Burman 72

xv

Bảng 3.11 Phân tích thống kê theo thiết kế Plackett- Burman 73

Bảng 3.12 Phân tích ANOVA của phương trình hồi quy theo phương pháp

Bảng 3.13 Kết quả hàm lượng H2 bằng thiết kế ma trận Box-Behnken 74 Bảng 3.14 Phân tích ANOVA theo thiết kế BBD 75 Bảng 3.15 Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm 76 Bảng 3.16 Hàm lượng H2 tích lũy trước và sau khi tối ưu 78 Bảng 3.17 Kết quả lên men trên hệ thống fermentor 82

xvi

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc lignocellulose 7 Hình 1.2 Cấu trúc của cellulose 8 Hình 1.3 Phản ứng hình thành furfural 11 Hình 1.4 Phản ứng tạo thành HMF 11 Hình 1.5 Sự tạo thành Acetyl CoA được xúc tác bởi enzyme PFOR 16 Hình 2.1 Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại 16S rDNA 30 Hình 2.2 Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại vùng V3 31 Hình 3.1 Kết quả điện di DNA bộ gen của 15 chủng hỗn hợp 54 Hình 3.2 Kết quả điện di 16S rDNA của 15 chủng hỗn hợp 54 Hình 3.3 Kết quả điện di vùng V3 của 15 chủng hỗn hợp 55 Hình 3.4 Kết quả điện di DGGE của 15 chủng hỗn hợp 55 Hình 3.5 Mối quan hệ phát sinh loài của chủng 1_357 56 Hình 3.6 Mối quan hệ phát sinh loài của chủng 2_357 57 Hình 3.7 Mối quan hệ phát sinh loài của các chủng 3_357, 4_357, 5_357 58

Hình 3.8 Hệ thống lên men khuấy trộn liên tục kỵ khí dùng để thu nhận

khí H2 (A) Sơ đồ thiết kế; (B) Hình ảnh hệ thống thực tế 79

Sơ đồ 3.1 Quy trình tiền xử lý bã mía bằng phương pháp thủy nhiệt kết

Sơ đồ 3.2 Quy trình lên men sinh H2 từ bã mía ở qui mô bioreactor 2l 83

xvii

DANH SÁCH BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ

Biểu đồ 1.1 Diện tích trồng mía ở Việt Nam trong năm 2007 - 2014 6

Biểu đồ 1.2 Tổng sản lượng mía của Việt Nam trong năm 2007 - 2014 7

Đồ thị 3.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên hàm lượng H2 tích lũy 47

Đồ thị 3.2 Ảnh hưởng của pH nuôi cấy ban đầu lên hàm lượng H2 tích

Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của nguồn carbon khác nhau lên hàm lượng H2

Đồ thị 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ glucose lên hàm lượng H2 tích lũy 50

Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ khác nhau lên hàm lượng H2 tích

Đồ thị 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men lên hàm lượng H2 tích

Biểu đồ 3.7 Ảnh hưởng của tỉ lệ xử lý (bã mía : H2SO4 2%, w/v) lên hàm

lượng đường trong dịch và bã sau xử lý 60

Biểu đồ 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ H2SO4 (%, w/v) lên hàm lượng

đường trong dịch và bã sau xử lý 61

Biểu đồ 3.9 Ảnh hưởng của thời gian xử lý với H2SO4 2% (w/v) lên hàm

lượng đường trong dịch và bã sau xử lý 62

Biểu đồ 3.10 Ảnh hưởng của thời gian xử lý bởi NaOH 2% (w/w) lên hàm

lượng H2 tích lũy và hiệu suất sinh H2

62

Biểu đồ 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý bởi NaOH 2% (w/w) lên hàm

lượng H2 tích lũy và hiệu suất sinh H2 63

Biểu đồ 3.12 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH lên hàm lượng H2 tích lũy và

hiệu suất sinh H2 64 Biểu đồ 3.13 Ảnh hưởng của tỉ lệ xử lý (bã mía : NaOH 2%, w/v) lên hàm 64

xviii

lượng H2 tích lũy và hiệu suất sinh H2

Biểu đồ 3.14 Hàm lượng H2 sinh ra và hiệu suất sử dụng đường trong môi

trường Chen với nguồn C là dịch bã mía sau xử lý 67

Đồ thị 3.15 Đường cong tăng trưởng của 4 hỗn hợp VSV trên dịch bã mía 68

Biểu đồ 3.16

Kết quả khảo sát miền cực trị của các thông số nồng độ đường (A), pH nuôi cấy ban đầu (B), nhiệt độ (C), tỉ lệ giống (D) và thời gian nuôi cấy (E) được đánh giá thông qua khả năng sinh H2 của chủng CMS

1

PHẦN MỞ ĐẦU

1 Thông tin đề tài

Tên đề tài: Nghiên cứu tạo hydro (H2) từ bã mía bằng phương pháp lên men kỵ khí Chủ nhiệm: TS Nguyễn Dương Tâm Anh

Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học quốc gia TP.HCM Thời gian đăng ký trong hợp đồng: 24 tháng (từ 09/2013 đến 09/2015)

Thời gian thực hiện giai đoạn 1: 14 tháng (từ tháng 09/2013 đến tháng 11/2014) Tổng kinh phí được duyệt: 570 triệu đồng

Kinh phí cấp giai đoạn 1: 300 triệu đồng theo thông báo số 159/TB-KHCN ngày 06/09/2013

Kinh phí cấp giai đoạn 2: 215 triệu đồng theo thông báo số 130/TB-KHCN ngày 08/07/2015

2 Mục tiêu

Sử dụng hỗn hợp giống vi sinh vật có khả năng lên men sinh hydro cao tạo hydro từ

bã mía bằng phương pháp lên men kị khí

3 Nội dung

3.1 Nội dung thực hiện

STT Các nội dung công việc đăng ký Các nội dung công việc

đã thực hiện

1 Nội dung 1 Chọn lọc các hỗn hợp giống vi

khuẩn kỵ khí từ các mẫu bùn thải có khả năng

tạo H2 bằng phương pháp lên men kỵ khí

15 hỗn hợp giống vi khuẩn kỵ khí có khả năng tạo H2

1.1 Thu nhận và xác định những đặc điểm hóa học

cơ bản của các nguồn thải kỵ khí dùng trong

việc thu nhận các hỗn hợp vi sinh vật có khả

năng lên men tạo H2

pH: 5,3 – 7,8 (ngoại trừ mẫu CMS có pH 3,6)

Độ ẩm: 34 – 86%

Carbohydrate tổng: 4 – 9 mg/g (ngoại trừ mẫu CMS 39 mg/g và BPH 20 mg/g)

1.2 Áp dụng các biện pháp xử lý với các tác nhân Điều kiện xử lý bằng tác nhân

2

nhiệt, acid, base, sục khí trên các nguồn bùn

thải để xác định hiệu quả xử lý trong việc thu

nhận các hỗn hợp giống vi sinh vật thu có khả

năng lên men tạo H2

nhiệt: 60 – 80oC, 30 – 120 phút Điều kiện xử lý bằng tác nhân acid: pH 1 – 3, 30 – 60 phút

2 Nội dung 2 Khảo sát các thông số sinh-động

học trong sự tăng trưởng và lên men H2 của các

hỗn hợp giống vi khuẩn phân lập được như thời

gian tăng trưởng, nhiệt độ, pH môi trường, các

loại cơ chất khác nhau, nồng độ cơ chất, hàm

lượng H2 sinh ra

Thời gian nuôi cấy: 48h

pH 6,5 – 7 Nhiệt độ: nhiệt độ phòng - 40 oC Glucose: 5,0 – 7,5 g/l

Cao nấm men: 1,0 – 1,5 g/l

2.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian tăng

trưởng, nhiệt độ, pH môi trường lên sự tăng

trưởng và lên men H2 của các hỗn hợp giống vi

khuẩn phân lập

Thời gian nuôi cấy: 48h pH: 6,5 – 7

Nhiệt độ: nhiệt độ phòng - 40 oC

2.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của các nguồn C khác

nhau lên sự tăng trưởng và lên men H2 của các

hỗn hợp giống vi khuẩn phân lập

Glucose: 5,0 – 7,5 g / l môi trường

2.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của các nguồn N khác

nhau lên sự tăng trưởng và lên men H2 của các

hỗn hợp giống vi khuẩn phân lập

Cao nấm men: 1,0 – 1,5 g/l

3 Nội dung 3 Xác định chủng vi khuẩn chiếm ưu

thế trong các hỗn hợp giống bằng phương pháp

điện di trên gel có khuynh độ biến tính

(DGGE)

Các chủng VSV chiếm ưu thế

gồm Enterococcus, Escherichia hoặc Shigella, Clostridium

3.1 Tách chiết DNA bộ gen của 15 chủng hỗn hợp

3

hỗn hợp VSV bằng phương pháp DGGE các trình tự 16S rDNA

3.4 Giải trình tự của các gen 16S của chủng hỗn

hợp và định danh các loài VSV trong chủng

% Tro 1,5 % Thành phần khác 2,8 %

5 Nội dung 5 Khảo sát một số phương pháp xử

lý bã mía để tăng hàm lượng carbohydrate dễ

lên men trong dịch bã mía sau xử lý

Hiệu suất thu hồi carbohydrate cao nhất

6 Nội dung 6 Chọn lọc hỗn hợp giống có hiệu

suất cao nhất để lên men tạo H2 trên nguồn cơ

chất phế thải giàu carbohydrate là bã mía ở

điều kiện lên men mẻ trong các bình serum

dung tích 120 ml

Chủng hỗn hợp CMS

7 Nội dung 7 Tối ưu hóa một số điều kiện lên

men sinh H2 trong chai serum dung tích 120 ml

Tỉ lệ nạp giống: 6,6 ml giống /

40 ml môi trường

pH ban đầu: 6,3 Nồng độ đường: 17,75 (g/l) tương đương 20,3 g bã mía/l

8 Nội dung 8 Thiết kế hệ thống bioreactor để lên

men tạo H2 ở qui mô phòng thí nghiệm (1-3L)

Sơ đồ thiết kế và hệ thống lên men thực tế hoàn chỉnh

9 Nội dung 9 Khảo sát khả năng lên men sinh H2

từ nguồn bã mía trên hệ thống bioreactor

2445 ml H2/l môi trường

H2 tích lũy 51 %

15 Đặc tính sinh trưởng (nhiệt

độ, pH, thời gian nuôi cấy, hiệu suất tạo H2)

Hiệu suất tạo H2 ≥ 1 mol H2/mol glucose

2 Quy trình tiền xử lý bã

mía làm cơ chất lên

men H2

1 Hàm lượng carbohydrate dễ lên men sau khi tiền xử lý

Hiệu suất thu hồi carbohydrate >90%

3 Quy trình lên men tạo

b Dạng sản phẩm 2: Bài báo khoa học và đào tạo

TT Tên tài liệu Số lượng Ghi chú

1 Bài báo khoa học

- 530

2 Đào tạo 02 Cử nhân khoa học

01 Thạc sĩ Hóa sinh học

5

4 Kinh phí quyết toán

Thời gian thực hiện: 24 tháng (từ tháng 09/2013 đến tháng 09/2015), gia hạn thêm 06 tháng (từ tháng 9/2015 đến tháng 03/2016)

Tổng kinh phí được duyệt: 570 triệu đồng

Kinh phí cấp giai đoạn 1 là 300 triệu đồng theo theo thông báo số 159/TB-KHCN ngày 06/09/2013 và giai đoạn 2 là 215 triệu đồng theo thông báo số 130/TB-KHCN ngày 08/07/2015

Chi tiết tình hình sử dụng kinh phí đề tài (đính kèm minh chứng)

6

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Hiện trạng về nguồn năng lượng sinh khối từ bã mía ở Việt Nam

Cây mía hiện nay có diện tích trồng lớn nhất thế giới với khoảng 23,8 triệu ha trên hơn 90 quốc gia, chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Sản lượng trung bình là 1,69 tỷ tấn mía mỗi vụ thu hoạch Trong công nghiệp sản xuất đường, mía chiếm hơn 80% nguyên liệu đầu vào, phần lớn còn lại là củ cải đường Các quốc gia sản xuất mía đường lớn nhất đồng thời cũng tiêu thụ đường lớn nhất thế giới là Brazil, Ấn Độ và Trung Quốc Trong những năm 1990, ngành công nhiệp sản xuất mía đường tại Việt Nam phát triển mạnh mẽ, tăng mạnh về qui mô và diện tích trồng Tính đến năm 2012, Việt Nam có 40 nhà máy mía đường chủ yếu ở quy mô nhỏ Sản lượng khai thác mía của Việt Nam hiện nay đang đứng ở vị trí thứ 21 trong tổng số các quốc gia sản xuất đường trên thế giới Năng suất khai thác cao nhất là ở đồng bằng song Cửu Long [1]

Theo báo cáo của Cục trồng trọt (DCP), Bộ Nông nghiệp và phá triển nông thôn (MARD), vụ mía 2012-2013 vừa qua, sản lượng mía ép công nghiệp đạt 16,6 triệu tấn, sản xuất được 1,53 triệu tấn đường So với vụ trước, công suất thiết kế tăng 3,3%, lượng mía ép tăng 14,5%, sản lượng đường tăng 17% (Đồ thị 1.1 và 1.2) [1]

Biểu đồ 1.1: Diện tích trồng mía ở Việt Nam trong năm 2007 – 2014 [1]

7

Đồ thị 1.2: Tổng sản lượng mía của Việt Nam trong năm 2007 – 2014 [1]

Với sản lượng mía hằng năm vào khoảng 16 triệu tấn, điều này có nghĩa lượng bã mía thải ra sẽ khoảng 4,5 triệu tấn/năm Khoảng 80% bã được đốt để nạp nồi hơi nhằm sản xuất điện và nhiệt cho việc vận hành máy ép mía [2] Phần còn lại sẽ được đốt bỏ như phế thải, điều này gây ảnh hưởng đến môi trường Một hướng tái sử dụng phần bã mía còn lại (20%) chính là sản xuất điện từ sinh khối cho mạng lưới điện quốc gia, tuy nhiên,

vì còn nhiều bất cập về chính sách nên hướng đi này chưa hiệu quả Hướng nghiên cứu tạo khí H2 sinh học từ bã mía sẽ là một trong các giải pháp mới xanh, sạch để tận dụng nguồn năng lượng sinh khối từ bã mía

1.2 Đặc điểm lý hoá của bã mía

Trung bình mỗi 10 tấn mía nguyên liệu sau khi sản xuất sẽ tạo ra khoảng 3 tấn bã mía tươi Bã mía tươi có độ ẩm khá lớn khoảng 40 – 50%, thành phần còn lại là xơ 48%

và chất hòa tan 2%

Hình 1.1 Cấu trúc lignocellulose [4]

8

Thành phần xơ trong bã mía bao gồm: cellulose 45-55%, hemicellulose 20-25%, lignin 18 - 24 %, tro 1-4% và sáp < 1% [3] Là một trong những nguồn sinh khối lignocellulose, bã mía cũng có các bó sợi với cấu trúc ligniocellulose được cấu tạo từ ba loại polymer sinh học cellulose, hemicellulose và lignin (Hình 1.1)

Cellulose là thành phần chính của cấu trúc lignocelluloses được bao quanh bởi hemicellulose và lignin Cellulose là một polymer có cấu tạo từ các monomer là các D-glucose liên kết với nhau bởi liên kết β-(1,4)-glycosidic tạo thành chuỗi dài, các chuỗi liên kết với nhau bằng liên kết hydro và Van der Waals, mỗi chuỗi dài khoảng 5000 –

10000 phân tử glucose Cellulose trong sinh khối tồn tại ở hai dạng cấu trúc: cấu trúc tinh thể (chiếm 2/3 cellulose tổng) không tan trong nước, khó bị khử polymer và cấu trúc vô định hình chiếm tỉ lệ thấp, dễ bị phân giải (Hình 1.2)

Hình 1.2 Cấu trúc của cellulose [4]

Hemicellulose có phân tử khối nhẹ hơn cellulose Cấu trúc hemicellulose phân nhánh với các nhánh ngắn gồm các pentoses (xylose, rhamnose, arabinose), hexoses (glucose, mannose, galactose) và các uronic acid (D-glucuronic, D-galactouronic acid, 4-omethylglucuronic) nối với nhau bằng liên kết β-(1,4)-glycosidic hay liên kết β-(1,3)-glycosidic Các polymer trong hemicellulose dễ bị phân giải hơn các polymer trong cellulose

Lignin là một polymer có cấu trúc phức tạp, phân tử khối lớn, được hình thành từ các monomer là 3 rượu phenyl propionic: coniferyl alcohol (guaiacyl propanol), coumaryl alcohol (p-hydroxyphenyl propanol), và sinapyl alcohol (syringyl alcohol) Tỉ

lệ của các monemer này khác nhau ở những mô và cơ quan mô khác nhau

Ngoài thành phần bó sợi lignocelluloses, bã mía còn có cấu trúc mô xốp [5] Chính cấu trúc này là nhược điểm của bã mía trong việc tận dụng nguồn thải này để làm giấy Thành phần hoá học của mô xốp cũng là cellulose, hemicelluloses và lignin với tỉ lệ

1.3 Các phương pháp tiền xử lý bã mía

Tiền xử lí là bước rất quan trọng trong lên men sinh H2 trên nguồn cơ chất lignocellulose Độ kết tinh của cellulose, mức độ trùng hợp, độ ẩm, diện tích tiếp xúc giữa VSV và đơn phân trong lignocellulose thấp, hàm lượng lignin… là những yếu tố cản trở hoạt động của các VSV lên men Mục tiêu của tiền xử lí là tách lignin và phá vỡ cấu trúc lignocelluloses, được thực hiện bằng các phương pháp nhiệt, cơ, hóa học, sinh học Đây là một trong những bước tốn kém trong phương pháp lên men Có nhiều phương pháp tiền xử lí được nghiên cứu, trong đó các phương pháp như phương pháp cơ học, phương pháp hóa học (thủy phân bằng acid hoặc kiềm), thủy phân bằng nước ở nhiệt độ cao, phương pháp sinh học được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong lên men công nghiệp

Vì vậy, phương pháp này chỉ thật sự hiệu quả khi kết hợp với những phương pháp xử lí khác

1.3.2 Phương pháp hóa học

1.3.2.1 Thủy phân bằng base

Đây là phương pháp được nghiên cứu nhiều vì có thể loại bỏ lignin trong sinh khối, đồng thời có thể loại bỏ nhóm acetyl và các hợp chất acid hữu cơ thay thế khác nhau trên hemicellulose Cơ chế của quá trình thủy phân bằng base là phản ứng ester xà phòng hóa giữa các phân tử liên kết chéo hemicellulose xylan và các thành phần khác như lignin [7] Các base thường được sử dụng để thủy phân lignocelluloses là NaOH, ammonia,

10

Ca(OH)2 [8] Sau khi tiền xử lí bằng NaOH 10% (w/w chất khô), việc xử lý tiếp theo bã mía bởi cellulase cho thấy có 50% và 41% cellulose và hemicelluloses được thủy phân thành các đơn phân đường tương ứng [9] Nhược điểm của phương pháp này là thời gian thủy phân thường kéo dài, không thu hồi được muối tạo thành

1.3.2.2 Thủy phân bằng acid

Có hai phương pháp tiền xử lí bã mía bằng acid là sử dụng acid đậm đặc thủy phân

bã mía trong thời gian ngắn ở nhiệt độ thấp và sử dụng acid loãng thủy phân bã mía trong thời gian dài ở nhiệt độ cao Acid sulfuric (H2SO4) được dùng phổ biến trong tiền xử lí bã mía [10] Bên cạnh đó, HCl, HNO3 hay H3PO4 cũng có thể được sử dụng [11, 12] Việc

sử dụng kết hợp acid acetic và H2O2 nhằm loại bỏ lignin trong bã mía trước khi thủy phân bằng enzyme cũng được áp dụng [13] Theo Chen và cộng sự, xử lý bằng H2SO4 loãng là phương pháp hiệu quả nhất trong tiền xử lí bã mía [10] Hỗn hợp sinh khối và acid loãng thường được kiểm soát ở nhiệt độ vừa phải, hoặc trong nồi hấp nhiệt độ cao Binod và cộng sự đã thực hiện tiền xử lí bã mía bằng cách kết hợp sử dụng lần lượt NaOH 1%,

H2SO4 1% và enzyme thu được kết quả là 0,83 g đường/g bã mía [14] Zhicheng Lai và các cộng sự sử dụng H2SO4 2,3% để thủy phân bã mía trong 114,2 phút ở 115oC, khi cho lên men sinh H2 thì hiệu suất sinh H2 đạt 1,86 mol/ mol đường và tốc độ sản xuất H2 đạt 0,52 l/l.h [15] Trong nghiên cứu của Fangkum trên bã mía tại địa phương Chaiyaphum, Thái Lan, bã mía được xử lý bằng acid H2SO4 với các nồng độ trong khoảng từ 0,25 – 5% (v/v), ở 121oC, trong 60 phút thì nồng độ 1% có tổng lượng đường là 11,28 g/l và lượng furfural là 0,02 g/l [16] Còn trong nghiên cứu của Sakchai trên bã mía tại địa phương Khonkaen ở Thái Lan, bã mía được xử lý bằng H2SO4 với tỷ lệ 0,25 – 7%, trong các khoảng thời gian từ 15 - 240 phút, ở 121oC Kết quả thu được lượng đường là 23 g/l khi

xử lý ở nồng độ 1%, trong 60 phút với lượng furfural là 0,12 g/l Các sản phẩm phụ này thường là các chất ức chế sự sinh trưởng của hỗn hợp vi sinh vật, giảm hiệu suất của các quá trình lên men Tuy nhiên, có thể sử dụng than hoạt tính để loại bỏ các nhân tố ức chế này [6]

Trong quá trình tiền xử lí bằng acid loãng, các polysaccharides được thủy phân, chủ yếu là hemicelluloses Các sản phẩm đường tự do bị thoái hóa dưới điều kiện pH acid sẽ hình thành nên các hợp chất như furfural (từ đường pentose), hydroxyl- methyl- furfural

11

(HMF- sản phẩm thoái hóa từ đường hexoses), các acid yếu như acid acetic hay acid formic, hợp chất phenolic (bảng 1.1, hình 1.3 và 1.4) [11] Trong giới hạn nồng độ nhất định, VSV có thể chịu đựng và sinh trưởng trên môi trường có các hợp chất biến dưỡng này Tuy nhiên, khi nồng độ vượt quá ngưỡng cho phép của VSV, những hợp chất này sẽ

ức chế hoạt động của các VSV, đồng thời làm giảm lượng đường cần cho quá trình lên men

Hình 1.4 Phản ứng tạo thành HMF Bảng 1.1 Sản phẩm ức chế sau khi tiền xử lí các loại lignocelluloses khác nhau [8]

Sinh khối Điều kiện tiền xử lí

Chất ức chế (g/l)

Hợp chất phenolic

Hợp chất furan Acid yếu 5- HMF Furfural Acetic

acid

Formic acid Rơm lúa mì H2SO4 0,5% (170oC,

Thân bắp H2SO4 1,69%

(121oC, 117 phút) 0,41 _ 1,35 _ 0,04 Cuống hướng

Hình 1.3 Phản ứng hình thành furfural

12

Mục tiêu của quá trình tiền xử lí bã mía là thu được lượng đường dễ lên men nhiều nhất có thể, đồng thời giảm thiểu sự tạo thành các hợp chất ức chế, sản phẩm phụ trong quá trình thủy phân Rõ ràng, không có biện pháp ngăn chặn hoàn toàn quá trình sản xuất các hợp chất ức chế này Tuy nhiên, có thể hạn chế thông qua quá trình kiểm soát và tối

ưu các điều kiện tiền xử lí: nhiệt độ, nồng độ acid sử dụng, thời gian,… nhằm đảm bảo nồng độ chất ức chế nằm trong khoảng chấp nhận được [8]

1.3.3 Phương pháp thủy nhiệt

Đây là phương pháp tiền xử lí bã mía bằng nước ở nhiệt độ cao Mức nhiệt độ dùng trong phương pháp này ở khoảng 170 - 230o

C và áp suất cao hơn Phương pháp tiền xử lí này có hiệu suất thu hồi đường cao và tỷ lệ các sản phẩm ức chế thấp Hamelinck và cộng

sự (2005) báo cáo rằng, khi sử dụng phương pháp này để thủy phân bã mía, hiệu suất thu hồi đường cao, khoảng từ 88 - 98% đồng thời không tạo ra các acid biến dưỡng khác trong sản phẩm [17] Allen và cộng sự (1996), mô tả quá trình xử lí bã mía bằng phương pháp thủy nhiệt ở nhiệt độ 190 - 230oC với thời gian tăng từ 45 giây đến 4 phút với kết quả hơn 50% sinh khối được thủy phân Lượng hemicelluloses được thủy phân thành monomeric khoảng 80%, sản phẩm ức chế furfural tạo ra ít hơn 5% [18]

để phân hủy cellulose và hemicellulose Cellulase gồm ba nhóm chính: endoglucanase (1,4-β-D-glucan glucanohydrolase), exoglucanase (1,4-β-D glucan cellobiosehydrolase)

và β-glucosidase (β-D-glucoside glucohydrolase) [14] Vi sinh vật được nghiên cứu

nhiều là các nấm trắng (white-rot fungi) như: Phanerochaete chrysosporium, Trametes

Bã mía H2SO4 2% (121

o

, 60

13

versicolor, Trametes hirsute, Phlebia radiata và Pleutorus sp Các loại nấm này tiết ra

các enzyme phân hủy lignin như peroxidase, manganese peroxidase, laccase [19, 20] Tuy nhiên, các loài nấm này cần nhiều tuần để có thể phân hủy lignin Ưu điểm của phương áp này là điều kiện phản ứng bình thường, không nghiêm ngặt, hiệu suất thu hồi đường cao, ít tạo ra các sản phẩm phụ, nhu cầu năng lượng thấp, các thiết bị ít bị ăn mòn Hơn hết, phương pháp này thân thiện với môi trường Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp này là tốc độ thủy phân chậm Đây cũng là một phương pháp tiền xử lí nhận được nhiều quan tâm, nghiên cứu

Ngoài ra còn một số phương pháp tiền xử lí khác như: điện trường, nổ hơi amon, nổ hơi CO2, phân giải ozon,…Những phương pháp này có ưu điểm là không tạo các sản phẩm ức chế, chất độc, đồng thời gia tăng bề mặt tiếp xúc giữa VSV và cơ chất Tuy nhiên, nhược điểm chung của những phương pháp này là không thích hợp với sinh khối

có hàm lượng lignin cao, tốn kém chi phí đầu tư trang thiết bị nên ít được nghiên cứu, ứng dụng trong lên men sinh H2 công nghiệp

Tóm lại, một phương pháp xử lý hiệu quả phải đảm bảo các yêu cầu như làm giảm kích thước sinh khối, tạo nhiều monosaccharide hoặc oligosaccharide dễ lên men, không ảnh hưởng đến đường tạo thành, hạn chế sự hình thành các sản phẩm ức chế ngăn cản sự phát triển của vi sinh vật lên men và phải ít tiêu tốn năng lượng cũng như chi phí Do đặc điểm sinh lý hoá của các nguồn sinh khối lignocellulose rất khác nhau nên không có một phương pháp tiền xử lý chung hiệu quả Ưu và nhược điểm của từng phương pháp tiền xử

lý sinh khối được xem xét, cân nhắc và tận dụng trong sự phát triển các phương pháp tiền

xử lý kết hợp (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Ưu và nhược điểm của các phương pháp xử lí sinh khối lignocellulose [4]

Cơ học

Giảm cấu trúc tinh thể cellulose Năng lượng tiêu thụ cao

hơn năng lượng vốn có của sinh khối

14

Thủy phân bằng acid

-Thủy phân hemicellulose thành xylose và các đường khác

-Thay đổi cấu trúc lignin

-Gia tăng bề mặt tiếp xúc

-Thời gian dài

-Không thu hồi được muối tạo thành

Sinh học

-Phân giải lignin, hemicellulose

-Năng lượng thấp Tốc độ thủy phân chậm

1.4 Tạo khí hydro (H 2 ) nhiên liệu từ bã mía bằng phương pháp lên men tối

15

và thân thiện với môi trường Các phương pháp sinh học sản xuất H2 bao gồm quang giải trực tiếp, quang giải gián tiếp, lên men sáng và lên men tối

1.4.2 Sản xuất hydro bằng phương pháp lên men tối

1.4.2.1 Cơ chế của quá trình lên men tối tạo hydro

Quá trình tạo H2 bằng con đường lên men tối là một bước trung gian trong chuỗi chuyền điện tử trong quá trình dị hóa kỵ khí các cơ chất hữu cơ [22] Khi trong môi trường thiếu chất nhận electron cuối cùng, H2 sẽ được tạo ra để duy trì sự cân bằng electron Lên men tối xảy ra trong điều kiện thiếu oxy hoặc không có sự hiện diện của oxy (môi trường kỵ khí), lúc này vi sinh vật oxy hóa chất hữu cơ để tạo năng lượng cung cấp cho sự phát triển của chúng Quá trình oxy hóa tạo ra điện tử tự do trong tế bào Trong điều kiện không có O2, proton bị khử tạo thành phân tử H2

Carbohydrate, đặc biệt glucose, là nguồn cơ chất ưu tiên cho quá trình lên men tối

H2 và CO2 là hai sản phẩm chính Ngoài ra, quá trình này còn tạo ra một số khí khác như:

CH4 và H2S [22] Theo lý thuyết, glucose bị oxy hóa hoàn toàn sẽ sinh 12 mol hydro/mol glucose (Phản ứng 1.1) Tuy nhiên, tùy thuộc vào sản phẩm cuối tạo thành mà số mol H2sinh ra sẽ khác nhau

C6H12O6 + 6H2O → 12H2+ 6CO2 (G0= +3,2 kJ) (Phản ứng 1.1)

Với cơ chất là glucose, có thể sinh tối đa 4 mol H2/mol glucose khi sản phẩm cuối

là acetic acid (Phản ứng 1.2)

C6H12O6 + 2H2O → 2CH3COOH + 4H2 + 2CO2 (G0= -206kJ) (Phản ứng 1.2) Khi sản phẩm cuối là butyrate, thì quá trình sinh tối đa 2 mol hydro/mol glucose (phản ứng 1.3)

C6H12O6 + 2H2O →CH2CH2CH2COOH + 2H2 + 2CO2 (G0= -254kJ) (1.3)

Trong thực tế, khó có thể đạt được hiệu suất 4 mol H2/mol glucose vì sản phẩm cuối có mặt cả hai sản phẩm acetate và butyrate [23]

Hình 1.5 cho thấy một vài con đường chuyển hóa xảy ra trong quá trình lên men

có thể tạo ra H2 hoặc không sinh ra H2 (ví dụ như con đường tạo ethanol) Trong trường hợp sự lên men kỵ khí có tạo ra H2, enzyme pyruvate ferredoxin (flavodoxin) oxidoreductase (PFOR) xúc tác chuyển pyruvate thành acetyl CoA, làm giảm lượng

16

ferredoxin (Fdred) – chất nhận electron, lúc này, H2 được hình thành từ ferredoxin (Fdred)

được xúc tác bởi enzyme hydrogenase (Phản ứng 1.4) [24]

Hình 1.5 Sự tạo thành Acetyl CoA được xúc tác bởi enzyme PFOR [21]

© Pyruvate ferredoxin (flavodoxin) oxidoreductase (PFOR): enzyme này có

chủ yếu ở vi khuẩn kị khí bắt buộc (Clostridium), kị khí tùy ý và ở cả Cyanobacter [25]

Pyruvate + CoA + Fdox ßàacetyl CoA + CO2 + Fdred (G’0= - 19, 2kJ/mol) (Phản

ứng 1.4)

© Ferredoxin: Fd khử sẽ bị oxi hóa bởi enzyme hydrogenase để tạo Fd oxi

hóa và phóng thích electron để tạo H2 (Phản ứng 1.5)

2 Fdred→ 2 Fdox + H2 (Phản ứng 1.5)

© Pyruvate formate lyase (PFL): enzyme này có trong vi khuẩn Enterobacter

như E aerogenes và E coli và Clostridium Enterobacter tạo formate bằng enzyme PFL

và chuyển hoá formate thành H2 và CO2 bằng enzyme formate hydrogen lyase (FHL)

(Phản ứng 1.6 và 1.7) [25]

Pyruvate + CoA ßà Acetyl CoA + formate (G’0= -16,3kJ/mol) (Phản ứng 1.6)

Formate ßà H2 + CO2 (Phản ứng 1.7) Thông thường, hiệu suất sinh hydro của lên men kỵ khí thấp, nguyên nhân là do vi

sinh vật kỵ khí có enzyme tiêu thụ khí H2 và làm giảm hiệu suất sinh H2 Để tăng hiệu

17

suất, con đường chuyển hóa cơ chất phải theo hướng sinh ra các acid béo dễ bay hơi (VFAs) không có alcohol hoặc giảm các sản phẩm biến dưỡng acid hữu cơ [14] Bên cạnh đó, các yếu tố khác ảnh hưởng đến sự sinh H2 như: áp suất riêng phần hydro, nồng độcơ chất, nồng độ ion kim loại và pH

1.4.2.2 Các vi sinh vật sản xuất H 2 bằng con đường lên men tối

Một số chủng vi sinh vật thường được nghiên cứu là Baccillus, Caldicellulosiruptor,

Clostridium, Enterobacter và Escherichia Trong đó, vi khuẩn kỵ khí bắt buộc như Clostridium, vi khuẩn dạ cỏ, vi khuẩn sinh methane, cổ vi khuẩn, vi khuẩn ưa nhiệt là

những loài phổ biến thường được sử dụng trong các nghiên cứu về lên men tối trong việc sản xuất H2 [22]

· Vi khuẩn kỵ khí bắt buộc

Vi khuẩn kỵ khí bắt buộc có tốc độ sản xuất cao và có thể sử dụng đa dạng nguồn

carbohydrate, đặc biệt là các nguồn thải Các loài Clostridium là loại vi khuẩn sinh acid

bằng cách lên men carbohydrate sinh acetate, butyrate, CO2 và các dung môi hữu cơ [18]

Clostridium butyricum, C acetobutyricum, C beijerinckii, C thermolacticum, C saccharoper-butylacetonicum, C tyrobutyricum, C thermocellum và C paraputrificum

là những ví dụt rong sản xuất H2 trong điều kiện kỵ khí và hình thành bào tử Tất cả các

loài Clostridia sinh H2 có thể sử dụng đa dạng các carbohydrate như xylose, arabinose, galactose, cellobiose, sucrose với hiệu suất sinh H2 trong khoảng 1,47 - 2,81 mol H2/mol glucose [25]

· Vi khuẩn kỵ khí tùy ý

Vi khuẩn kỵ khí tùy ý ít nhạy cảm với oxy hơn so với vi khuẩn kỵ khí bắt buộc

Enterobacter là vi khuẩn gram âm tiêu biểu cho nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy ý có khả năng

tạo H2 tốt vì chúng có tốc độ sinh trưởng cao, khả năng sử dụng đa dạng nguồn cơ chất, không bị ảnh hưởng bởi áp suất H2 [26] Một số loài E coli, Citrobacter cũng có khả

năng lên men sinh H2 E coli phân lập từ bùn thải lên men sinh H2 với năng suất 0,84 mol H2/mol glucose ở pH 6,8 và nhiệt độ 30oC [27]

· Hỗn hợp vi sinh vật

Theo Yokoi và cộng sự, trên môi trường lên men kết hợp Clostridium butyricum (vi khuẩn kỵ khí bắt buộc) và Enterobacter aerogenes (vi khuẩn kỵ khí tùy ý) thì sẽ có sự

18

tạo thành lượng lớn H2 ở vi khuẩn kỵ khí bắt buộc và có sự tiêu thụ oxy bởi vi khuẩn kỵ khí tùy ý Với môi trường kết hợp này, hiệu suất sinh hydro có thể đạt 2 mol H2/glucose [28]

1.4.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tối

Nhiệt độ

Lên men tối có thể thực hiện ở nhiều điều kiện nhiệt độ khác nhau từ nhiệt độ ôn hòa (25 – 40oC), nhiệt độ cao (40 – 50oC), đến nhiệt độ cực cao (65 – 80oC), siêu cao (>80oC) Nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều thuận lợi cho sự tạo thành H2 [28]

pH

Quá trình lên men tạo H2 rất nhạy với pH và sản phẩm cuối, vì khi các acid hữu cơ tạo ra sẽ làm giảm pH môi trường qua đó ức chế sự phát triển của vi sinh vật và hoạt động của enzyme hydrogenase pH hoạt động của quá trình lên men tạo H2 trong khoảng

5,5 – 7,0 Levin và công sự cũng đã nghiên cứu sự lên men từ Clostridium thermocellum,

pH < 6,8 cho thấy sản phẩm lên men chuyển từ acetate sang lactate [25]

Áp suất riêng phần của H 2 (pH 2 )

Áp suất riêng phần của H2 là một trong những yếu tố chính ảnh hưởng đến việc tạo H2 Khi nồng độ H2 trong pha lỏng tăng thì ferrodoxin bị khử H2 trong pha lỏng sẽ oxy hóa proton làm giảm lượng H2 tạo ra Trong môi trường hỗn hợp, sục khí trơ làm tăng lượng H2 sinh ra so với ở điều kiện không sục khí H2 tạo ra tăng 20 – 70% khi sục khí bằng N2 [14]

Nồng độ acid hữu cơ

Sự sinh H2 bởi vi khuẩn lên men cũng đi kèm với sự hình thành các acid hữu cơ, vi khuẩn kỵ khí không có khả năng tiếp tục phân cắt các acid này Acid tích lũy gây ra sự giảm mạnh pH môi trường và dẫn đến ức chế sản xuất H2 ở vi khuẩn [25] Nồng độ các acid hữu cơ cao sẽ làm mất đi khuynh độ pH xuyên màng và ức chế hoàn toàn con đường biến dưỡng bên trong tế bào Khi có sự tích tụ các acid hữu cơ, tế bào thường ưu tiên tạo thành dung môi [26]

Cơ chất ban đầu

Vật liệu chứa lignocellulose đóng vai trò quan trọng là làm cơ chất cho sản xuất

H2 vì chúng là nguồn nguyên liệu tái tạo và dồi dào [17] Đường thủy phân từ sinh khối

19

lignocellulose chủ yếu là glucose và xylose là cơ chất hiệu quả và thuận lợi trong việc lên men sinh [27]

Ion kim loại

Các ion kim loại như: Mg, Na, Zn, Fe là các kim loại quan trọng tham gia vào quá trình tạo H2, do chúng ảnh hưởng lên hoạt động của enzyme và các hoạt động sinh học của tế bào vi sinh vật H2 tạo ra từ con đường sinh học có liên quan chặt chẽ với 2 nhóm enzyme chính là hydrogenase và nitrogenase Trong đó, Fe, thành phần của enzyme hydrogenase, là nhân tố tối quan trọng trong việc tạo H2 [28]

1.5 Tình hình nghiên cứu tạo H 2 từ bã mía

Nguồn sinh khối lignocellulose dồi dào và đa dạng được xem là một thuận lợi lớn cho việc nghiên cứu tạo H2 sinh học, điều này đem đến những hy vọng mới cho các nước nông nhiệp, trong đó có Việt Nam Tuy nhiên, những nghiên cứu về sản xuất H2 sinh học

ở Việt Nam vẫn còn khá mới và rất ít nhóm nghiên cứu làm về vấn đề này Hướng nghiên cứu tận dụng bã mía để tạo khí H2 sinh học bằng con đường lên men kỵ khí lần đầu tiên được thực hiện trong đề tài này

Dù chưa có nhiều nghiên cứu về quá trình lên men H2 từ bã mía nhưng trong những năm gần đây, một số nghiên cứu đã cho thấy, bã mía là nguồn cơ chất tiềm năng cho lên men sinh H2 Trên thế giới, hiện nay chỉ có hai báo cáo về nghiên cứu tận dụng bã mía để tạo khí H2 sinh học bằng con đường lên men kỵ khí và đều của các nhóm nghiên cứu người Thái Lan (Bảng 1.3) Trong nghiên cứu của Sakchai (2008), chủng vi khuẩn được dùng để sản xuất khí H2 từ bã mía là Clostridium butyricum Điều kiện tiền xử lý bã mía

trước khi cho lên men tối ưu ở điều kiện 0,5% H2SO4, 60 phút ở 121oC cho kết quả tạo

H2 là 1611 ml H2/L/ngày đạt hiệu suất 1,73 mol/mol đường tổng tại pH 5,5 và nồng độ đường ban đầu 20 g COD/L [8] Nhóm nghiên cứu của Fangkum (2009) lại sử dụng chủng hỗn hợp vi sinh vật thu nhận từ phân bò để lên men tạo H2 [13] Điểu kiện tiền xử

lý bã mia trong nghiên cửu này đạt tối ưu ở điều kiện 1% H2SO4, 60 phút ở 121oC Kết quả tạo H2 tốt nhất là 109,55 ml H2/L/ngày đạt hiệu suất 0,85 mol/mol đường tổng tại pH 6,5 và nồng độ đường ban đầu 10 g/L

Tốc độ sinh H2(ml H2/L/ngày)

Hiệu suất sinh H2(mol

H2/mol đường)

121oC, 60 phút,

1% H2SO4

Hỗn hợp vi khuẩn từ phân

bò

109,55 0,85 Fangkum

(2009) [13]

21

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung 1 Chọn lọc các hỗn hợp giống vi khuẩn kỵ khí từ các mẫu bùn thải có khả năng tạo H 2 bằng phương pháp lên men kỵ khí

2.1.1 Mô tả nội dung

- Thu nhận được 15 hỗn hợp giống vi khuẩn có khả năng tạo H2 bằng phương pháp lên men kỵ khí

- Xác định độ ẩm, pH, carbohydrate tổng của các mẫu bùn thải làm nguồn thu nhận hỗn hợp giống vi sinh vật

- Xác định điều kiện xử lý mẫu bùn thích hợp để thu nhận các hỗn hợp giống vi sinh vật có khả năng tạo H2 bằng phương pháp lên men

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu

2.1.2.1 Thu nhận mẫu bùn làm nguồn vi sinh vật có khả năng tạo H 2 bằng phương pháp lên men kỵ khí

Các mẫu bùn thải từ các hoạt động nạo vét cống rãnh và kênh rạch định kỳ, bùn thải

từ các trạm/nhà máy xử lý nước thải, nước rỉ rác từ bãi rác, bùn thải từ hệ thống thoát nước thải công nghiệp được thu nhận ngay sau khi được lấy ra khỏi nguồn thải và được cho vào bọc ni lông cột kín hoặc chai thủy tinh đậy kín

Các mẫu bùn thải được lưu trữ ở 4oC

2.1.2.2 Xác định độ ẩm, pH, carbohydrate tổng của các mẫu bùn thải làm nguồn thu nhận hỗn hợp giống vi sinh vật

a Phương pháp xác định độ ẩm

Cân 2 g mẫu bùn, sấy khô đến khối lượng không đổi ở tủ sấy ở 105oC

Công thức tính độ ẩm mẫu

(2.1)

Trong đó: m1: khối lượng mẫu ban đầu

m2 : khối lượng mẫu sau sấy

b Phương pháp đo pH

Cân 5 g mẫu vào erlen thêm vào 50 ml nước cất khuấy đều Tiến hành đo pH bằng máy pH Mettler Toledo