Nghiên cứu tạo chế phẩm thảo dược bổ sung vào thức ăn chăn nuôi giúp phòng ngừa tiêu chảy và cải thiện tăng trưởng trên heo gà

Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người kể cả chủ nhiệm Nội dung tham gia chính Sản phẩm chủ yếu đạt được Ghi chú* - Chủ nhiệm n

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM THẢO DƯỢC BỔ SUNG VÀO THỨC ĂN CHĂN NUÔI GIÚP PHÒNG NGỪA TIÊU CHẢY VÀ CẢI THIỆN TĂNG

TRƯỞNG TRÊN HEO, GÀ

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2020

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN

I THÔNG TIN CHUNG

1 Tên nhiệm vụ: Nghiên cứu tạo chế phẩm thảo dược bổ sung vào thức ăn chăn nuôi giúp phòng ngừa tiêu chảy và cải thiện tăng trưởng trên heo, gà (TP03/18-20)

Thuộc: Chương trình/lĩnh vực (tên chương trình/lĩnh vực): Nếu có

2 Chủ nhiệm nhiệm vụ:

Họ và tên: Nguyễn Thị Dung

Ngày, tháng, năm sinh: 10/02/1986 Nam/ Nữ: Nữ

- Điện thoại: 028 37153792 Fax: 028 38916997

- E-mail : ttcnsh.snn@tphcm.gov.vn Website: hcmbiotech.com.vn

- Địa chỉ : 2374, Quốc Lộ 1, Khu phố 2, Phường Trung Mỹ Tây, Q.12, Tp HCM

- Họ và tên thủ trưởng tổ chức:

- Số tài khoản: 3714.0.100.7645

- Kho bạc Nhà nước/Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước TP.HCM

- Tên cơ quan chủ quản đề tài : Sở Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn

TP.HCM

1 Thời gian thực hiện nhiệm vụ :

- Theo Hợp đồng đã ký kết : từ tháng 07 năm 2018 đến tháng 6 năm2020

- Thực tế thực hiện : từ tháng 7 năm 2018 đến tháng 12 năm 2020

- Được gia hạn (nếu có) : 6 tháng (từ tháng 6/2020 đến tháng 12/2020)

Thời gian

(Tháng,

năm)

Kinh phí (Tr.đ)

Thời gian (Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:

Đối với đề tài:

- Lý do thay đổi (nếu có):

- Lý do thay đổi (nếu có):

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án:

(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xét duyệt, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện nếu có); văn bản của tổ chức chủ trì nhiệm vụ (đơn, kiến nghị điều chỉnh nếu có)

Số

TT

Số, thời gian ban

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1

2

…

- Lý do thay đổi (nếu có):

5 Cá nhân tham gia thực hiện nhiệm vụ:

5 Chi khác 197,858 197,858 0 137,669 137,669 0

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người kể cả chủ nhiệm)

Nội dung tham gia

chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

- Chủ nhiệm nhiệm vụ

- Viết đề cương và các

kế hoạch thực hiện

- Tạo cao chiết từ một

số cây thảo dược

- Thực hiện các thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết thảo dược

và nghiên cứu tác động cộng gộp của cao dược liệu tạo chế phẩm thảo dược có hoạt lực kháng khuẩn tốt

- Xây dựng quy trình bào chế chế phẩm thảo dược

- Xây dựng tiêu chuẩn

cơ sở của chế phẩm

- Đánh giá hiệu quả chế phẩm thảo dược trên heo, gà

- Báo cáo đề cương

- Đã thu nhận được

18 mẫu cao chiết

- Đã đánh giá được hoạt tính kháng khuẩn của một số cao chiết thảo dược

và lựa chon , đánh giá tác động cộng gộp của cao chiết hoạt tính kháng khuẩn

- Xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm và quy trình báo chế sản phẩm

- Đánh giá được hiệu quả của chế phẩm thảo được trên heo,

gà ở mô hình thí nghiệm tại Củ Chi

nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết thảo dược

và nghiên cứu tác động cộng gộp của cao dược liệu tạo chế

- Đã thu nhận được

18 mẫu cao chiết

- Đã đánh giá được hoạt tính kháng khuẩn của một số cao chiết thảo dược

và lựa chon , đánh giá tác động cộng

Nghỉ việc

phẩm thảo dược có hoạt lực kháng khuẩn tốt

- Xây dựng quy trình bào chế chế phẩm thảo dược

- Xây dựng tiêu chuẩn

cơ sở của chế phẩm

- Đánh giá hiệu quả chế phẩm thảo dược trên heo, gà

gộp của cao chiết hoạt tính kháng khuẩn

- Xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm và quy trình báo chế sản phẩm Đánh giá được hiệu quả của chế phẩm thảo được trên heo, gà ở mô hình thí nghiệm tại Củ Chi và TP.HCM

3 ThS Lê

Thị

Huyền

ThS Lê Thị Huyền

- Thực hiện thí nghiệm tách chiết thu nhận cao chiết từ một số cây thảo dược

- Xây dựng quy trình bào chế chế phẩm thảo dược và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm

-

- Đã thu nhận được

18 mẫu cao chiết

- Xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm và quy trình báo chế sản phẩm

- Lý do thay đổi (nếu có): Thay đổi và thêm một số thành viên do thành viên thực hiện nhiệm vụ chuyển công tác và tạm ngưng hợp đồng

6 Tình hình hợp tác quốc tế:

Số

TT

Theo kế hoạch

(Nội dung, thời gian, kinh

phí, địa điểm, tên tổ chức

người tham gia )

Ghi chú*

1

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

Số

(Nội dung, thời gian, kinh

phí, địa điểm )

(Nội dung, thời gian,

kinh phí, địa điểm )

1

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

1

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA NHIỆM VỤ

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

Thực tế đạt được

1 Mẫu cao chiết thảo

Thực tế đạt được

- Lý do thay đổi (nếu có):

1 Bài báo khoa học

2 Hội nghị, hội thảo

khoa học trong và

ngoài nước

Hội nghị sinh học tại Quy Nhơn

2020, Hội nghị quốc tế tại Đại học Mở TP.HCM

2019

báo cáo poster

- Lý do thay đổi (nếu có):

d) Kết quả đào tạo:

Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

1 Cử nhân công nghệ sinh

- Lý do thay đổi (nếu có):

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp:

Theo

kế hoạch

Thực tế đạt được

e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế

Kết quả

sơ bộ

1

2

2 Đánh giá về hiệu quả do nhiệm vụ mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

- Kết quả đề tài giúp giải quyết được bài toán về việc lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi giúp tăng hiệu quả chăn nuôi, tăng giá trị kinh tế cho người chăn nuôi

- Kết quả nghiên cứu góp phần đa dạng hóa chế phẩm thảo dược bổ sung vào thức ăn gia súc, gia cầm, nhằm giúp kích thích tăng trưởng, giảm tỷ lệ mắc các bệnh đường tiêu hóa, bệnh đường hô hấp ở vật nuôi, giúp giảm chi phí thú

y

- Ứng dụng và phát triển ứng dụng KH&CN để tạo ra nguyên liệu trong sản xuất sản phẩm bổ sung ccho chăn nuôi có hiệu quả cao, góp phần nâng cao vai trò của khoa học công nghệ sinh học trong đời sống xã hội

- Ứng dụng nguồn nguyên liệu dồi dào của Việt Nam để tạo được sản phẩm có giá trị ứng dụng cao

- Từ kết quả nghiên cứu về ứng dụng cây thảo dược sẽ mở ra con đường phát triền mạnh trồng cây thảo dược, giúp bà con nông dân có thêm hướng canh tác, nâng cao thu nhập từ nguồn cây thảo dược

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của nhiệm vụ:

Lần 1 01/10/2019

Được đánh giá đạt 5/5, được tiếp tục thực hiện đề tài

- Bổ sung thêm kết quả ở nội dung 3

- Nội dung còn lại của nhiệm vụ còn khá nhiều và quan trọng, vì vậy, nhóm nghiên cứu cần đẩy nhanh tiến độ thực hiện

- Nhóm tác giả chỉnh sửa lại báo cáo tiến độ theo góp ý của các thành viên Hội đồng

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

I MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 3

1.3 Tiềm năng ứng dụng và phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu 3

1.4 Ý nghĩa khoa học và lợi ích mang lại của kết quả nghiên cứu 3

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tình hình nghiên cứu chế phẩm thảo dược bổ sung vào thức ăn vật nuôi trên thế giới 4

2.2 Tình hình nghiên cứu tác dụng của chế phẩm thảo dược đối với vật nuôi tại Việt Nam 7

2.3 Chất chiết thảo dược 10

2.4 Cơ chế tác dụng của thảo dược trong cơ thể vật nuôi 12

2.5 Một số bệnh thường gặp ở gia súc, gia cầm do vi khuẩn gây ra 14

2.5.1 Bệnh do vi khuẩn Salmonella 14

2.5.2 Bệnh do vi khuẩn E coli: 15

III VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Vật liệu 16

3.2 Phương pháp nghiên cứu 17

3.2.1 Phương pháp tách chiết cao thảo dược 17

3.2.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết thảo dược 19 3.2.3 Phương pháp khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) 20

3.2.4 Nghiên cứu tác động cộng gộp của cao dược liệu tạo chế phẩm thảo

dược có hoạt lực kháng khuẩn tốt 22

3.2.5 Phương pháp xác định độc tính cấp đường uống 22

3.2.6 Phương pháp xác định hàm lượng phenolic tổng (Total phenolic content (TPC)) 24

3.2.7 Phương pháp xác định hàm lượng độ ẩm 24

3.2.8 Phương pháp xác định hàm lượng khoáng tổng tro (độ tro toàn phần) 25 3.2.9 Phương pháp đánh giá hiệu quả chế phẩm thảo dược trên heo, gà 26

3.2.10 Phương pháp xử lý số liệu 30

IV KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 31

4.1 Tách chiết và thu nhận cao chiết thảo dược 31

4.2 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của các mẫu cao chiết 34

4.3 Kết quả khảo sát hàm lượng polyphenol (TPC) của các cao chiết thảo dược 37

4.4 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC- minimum inhibitory concentration) và nồng độ diệt khuẩn MBC 39

4.5 Nghiên cứu tác động cộng gộp của cao dược liệu tạo chế phẩm thảo dược có hoạt lực kháng khuẩn tốt 42

4.6 Quy trình bào chế chế phẩm 48

4.6.1 Thuyết minh quy trình 50

4.7.1 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho chế phẩm thảo dược 51

4.8 Kết quả khảo sát độc tính cấp đường uống của chế phẩm thảo dược 53

4.9 Kết quả thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm thảo dược trên heo, gà 54

4.9.1 Kết quả thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm thảo dược trên heo 54

4.9.2 Thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm thảo dược trên gà 57

V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61

5.1 Kết luận 61

5.2 Kiến nghị 63

Tài liệu tham khảo 64PHỤ LỤC

Concentration Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu

MIC Minimum inhibitory

concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

TPC Total phenolic content Hàm lƣợng phenolic tổng

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần dinh dưỡng của thức ăn hỗn hợp cho heo 26

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm trên heo 27

Bảng 3.3 Thành phần dinh dưỡng của thức ăn hỗn hợp cho gà ở 4 tuần đầu 28

Bảng 3.4 Thành phần dinh dưỡng của thức ăn hỗn hợp cho gà ở 2 tuần sau 28

Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm trên gà 28

Bảng 4.1 Tên mẫu và địa điểm thu nhận mẫu 31

Bảng 4.2 Hiệu suất thu hồi cao chiết 33

Bảng 4.3 Đường kính vòng kháng khuẩn của các cao thảo dược (mm) 34

Bảng 4.4 Hàm lượng polyphenol của các cao chiết thảo dược 38

Bảng 4.6 Sáu mẫu cao được phối trộn theo mô hình thí nghiệm 42

Bảng 4.7 Các công thức thí nghiệm được bố trí theo ma trận Plackett – Burman trên phần mềm JMP cho sáu loại cao chiết 42

Bảng 4.8 Nồng độ ức chế tối thiểu MIC theo các các công thức của ma trận ma trận Plackett –Burman 43

Bảng 4.9 Kết quả Parameter Estimates trên chủng Salmonella 44

Bảng 4.10 Kết quả Parameter Estimates trên chủng E.coli 44

Bảng 4.11 Kết quả Effect Summary trên chủng Salmonella 45

Bảng 4.12 Kết quả Effect Summary trên chủng E.coli 46

Bảng 4.13 Công thức đánh giá tỷ lệ phối trộn cao chiết 46

Bảng 4.14 Kết quả MIC của công thức đánh giá tỷ lệ phối trộn cao chiết 47

Bảng 4.15 Một số chỉ tiêu cơ sở của sản phẩm chế phẩm thảo dược BIOHEVI 51

Bảng 4.16 Kết quả khảo sát độc tính cấp đường uống của mẫu CPTD 53

Bảng 4.17 Trọng lượng trung bình của đàn heo mỗi tuần ở 3 nghiệm thức 55

Bảng 4.18 Chỉ tiêu tăng trọng của đàn heo mỗi tuần ở 3 nghiệm thức 55

Bảng 4.19 Lượng thức ăn thu nhận (LTATN) và hệ số chuyển hóa thức ăn FCR 56

Bảng 4.20 Trọng lƣợng trung bình của đàn gà mỗi tuần ở 3 nghiệm thức 58

Bảng 4.21 Chỉ tiêu tăng trọng của đàn gà mỗi tuần ở 3 nghiệm thức 58

Bảng 4.22 Lƣợng thức ăn thu nhận (LTATN) và hệ số chuyển hóa thức ăn

FCR 59 59Bảng 4.23 Tỷ lệ gà nhiễm bệnh và tỷ lệ nuôi sống ở gà (%) 59

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Một số loại thảo dược trong tự nhiên (nguồn Internet 8

Hình 1.2 Sơ đồ các bước cơ bản tách chiết thảo dược 12

Hình 3.1 Chuột nhắt trắng đực (chủng Swiss albino) 16

Hình 3.3 Heo giống (Duroc x Yorkshire x Landrace) 17

Hình 3.4 Quy trình tách chiết cây dược liệu bằng phương pháp chiết ngâm 19

Hình 4.1 Các mẫu bột thảo dược nghiên cứu 32

Hình 4.2 Nồng độ ức chế tối thiểu của các mẫu cao chiết trên các chủng vi sinh vật khảo sát 40

Hình 4.3 Mẫu cao chiết thảo dược trên đĩa 96 giếng sau khi ủ và bổ sung resazurin 41

Hình 4.4 Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa hiệu quả kháng khuẩn theo MIC thu được trên thực tế và mô hình dự đoán 44

Hình 4.5 Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm thảo dược 49

Hình 4.6 Hình ảnh sản phẩm BIOHEVI 51

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành nhiệm vụ này, chúng tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của Ban Giám đốc Trung tâm, các thầy, cô giáo, các cô chú hộ chăn nuôi cùng các anh chị em đồng nghiệp

Trước hết, chúng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Dương Hoa Xô, TS Nguyễn Đăng Quân, TS Hà Thị Loan đã quan

tâm, góp ý về mặt chuyên môn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để nhóm hoàn thành nhiệm vụ

Chúng tôi xin gửi lời cảm ơn tới chú Nguyễn Văn Khúc và chị Huỳnh Lợi và các anh chị công ty TNHH Tam Nông đã tạo điều kiện cho chúng tôi tiến hành thử nghiêm hiệu quả của chế phẩm thảo dược trên mô hình heo và gà

Chúng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh, chị, em hiện đang công tác tại các phòng CNSH Thực phẩm, phòng Vi sinh, phòng Tài chính - Kế Toán, phòng QLKH & HTQT đã hỗ trợ nhiệt tình, tạo mọi điều kiện giúp đỡ nhóm trong suốt thời gian thực hiện nhiệm vụ

đó, các khuyến cáo đã được thực hiện để theo dõi sự xuất hiện của các vi khuẩn kháng thuốc và các chương trình giám sát đã được thiết lập ở các nước châu Âu, việc sử dụng kháng sinh như các chất kích thích tăng trưởng ở các loài động vật đã bị cấm ở các nước này

Một nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Thị Nhung và cs về dư lượng

kháng sinh và khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn Samonella thu thập từ

các loại thịt ở siêu thị và chợ truyền thống tại thành phố Hồ Chí Minh, cho thấy ở 117 mẫu thịt gà, bò và heo có đến 80 mẫu (68,4%) bị nhiễm vi

khuẩn Salmonella Trong đó có đến 71,8% (gà), 70,7% (heo) và 62,2% (bò) Trong các mẫu nhiễm khuẩn có 52,2% các chủng Salmonella đa kháng thuốc,

nghĩa là kháng với ít nhất ba (03) nhóm kháng sinh (Nguyen Thi Nhung và cs, 2018) Điều này cho thấy tình trạng nhiễm khuẩn trong thịt ở gia súc, gia cầm rất lớn và tình trạng lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi dẫn đến kháng kháng sinh hiện nay rất đáng lo ngại

Ở Việt Nam, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã ban hành Thông tư 20/2017/TT-BNNPTNT hướng dẫn chi tiết một số nội dung của Nghị định số 39/2017/NĐ-CP ngày 4/4/2017 của Chính phủ về quản lý thức ăn chăn

2

nuôi, thủy sản Trong đó quy định về việc sử dụng thuốc thú y có thành phần kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm Theo Thông tư, thuốc thú y được sử dụng trộn vào thức ăn chăn nuôi nhằm mục đích phòng bệnh, trị bệnh cho gia súc, gia cầm phải có tên trong danh mục thuốc thú y được phép lưu hành tại Việt Nam hoặc được Cơ quan có thẩm quyền cấp phép sử dụng.Từ đầu năm 2018, Việt Nam đã dừng sử dụng các loại kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi và thủy sản, chỉ cho phép sử dụng trong sản xuất con giống, đến năm 2020, Việt Nam sẽ dừng hẳn việc sử dụng kháng sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi và thủy sản

Thực tế chứng minh đã có hàng loạt những giải pháp thay thế kháng sinh trong khẩu phần như: sử dụng các chế phẩm sinh học probiotic và nấm men,

sử dụng axit hữu cơ, thảo dược Hiện nay, Trung tâm Công nghệ Sinh học TPHCM đã có bộ sưu tập cây dược liệu thu thập từ vùng bảy núi ở An Giang

và một số vùng ở khu vực phía Nam, đa dạng về chủng loại và giàu hợp chất sinh học, là nguồn dược liệu tiềm năng để phát triển và thương mại hóa các sản phẩm chế biến từ thảo dược Trong chăn nuôi, thảo dược có chứa các hợp chất sinh học có khả năng kích thích sinh trưởng, cải thiện hệ tiêu hóa hỗ trợ hấp thu thức ăn, tăng cường sức khỏe của hệ vi sinh vật ruộttăng cường chức năng miễn dịch cho vật nuôi đã được nghiên cứu ở một số nước trên thế giới

và đang được nghiên cứu nhiều ở Việt Nam Trước thực trạng trên, việc nghiên cứu tìm ra những chiết xuất thảo dược bổ sung vào thức ăn chăn nuôi ứng dụng trong phòng trị bệnh, cải thiện năng suất vật nuôi tăng hiệu quả chăn nuôi sẽ góp phần giải quyết từng bước những mặt trái của thuốc kháng sinh là việc làm rất có ý nghĩa cho hiện tại và về sau để nâng cao chất lượng cuộc sống

Mặt khác từ những tổng quan về tình hình nghiên cứu các loại cây thảo dược, nhận thấy tiềm năng ứng dụng các loại thảo dược như: cây sài đất, tỏi, gừng, nghệ, cam thảo, hương thảo, lá chùm ngây, xuyên tâm liên, lá cây xuân

1.2 Mục tiêu của đề tài

- Xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở của chế phẩm;

- Thử nghiệm và đánh giá được hiệu quả của chế phẩm thảo dược bổ sung vào thức ăn của heo và gà

1.3 Tiềm năng ứng dụng và phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu

Sản phẩm của nghiên cứu được ứng dụng vào thực tiễn, sử dụng bổ sung trực tiếp vào khẩu phần ăn của gia súc, gia cầm, giúp kích thích tăng trưởng, phòng ngừa các bệnh đường tiêu hóa Quy trình tạo chế phẩm thảo dược có thể chuyển giao kết quả nghiên cứu cho các đơn vị sản xuất và thương mại hóa sản phẩm

1.4 Ý nghĩa khoa học và lợi ích mang lại của kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu như một nền dữ liệu bổ sung cung cấp thêm nhiều tài liệu về ứng dụng của những cây thảo dược trong phòng ngừa bệnh trên vật

Bên cạnh đó, từ những nghiên cứu về ứng dụng thảo dược sẽ mở ra con đường canh tác mới nhằm phát triển mạnh việc trồng thảo dược, giúp bà con nông dân từ đó nâng cao thu nhập và cải thiện đời sống từ nguồn cây thảo dược

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình nghiên cứu chế phẩm thảo dược bổ sung vào thức ăn vật nuôi trên thế giới

Trong chăn nuôi, các bệnh thông thường trên heo chủ yếu liên quan đến nhiễm khuẩn đường ruột, gây tiêu chảy hay nhiễm khuẩn đường hô hấp, gây

ho sốt và bỏ ăn Các bệnh này khiến heo kém tăng trưởng, ảnh hưởng đến năng suất chăn nuôi Vì vậy người chăn nuôi lâu nay vẫn lệ thuộc vào thuốc kháng sinh để phòng trị bệnh và kích thích tăng trưởng cho heo Tuy nhiên, tình trạng lạm dụng thuốc, làm tồn dư kháng sinh ở gia súc, gia cầm dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh ở người do hấp thu thông qua quá trình tiêu thụ, cho nên hiện nay việc sử dụng kháng sinh trộn vào thức ăn gia súc đã bị cấm hoàn toàn ở các nước Châu Âu (Namkung, 2004) Do đó, bài toán cho các nhà khoa học là phải không ngừng tìm kiếm và lựa chọn biện pháp thay thế kháng sinh để đảm bảo sức khỏe và góp phần tăng hiệu quả chăn nuôi Trong những năm gần đây, việc sử dụng phụ gia thức ăn từ thảo dược như một tiềm năng thay thế kháng sinh đã và đang có nhiều sự quan tâm nghiên cứu và ứng dụng

có một tiềm năng lớn trong các ứng dụng thực tế (Liu và cs, 2008) Paschma (2004) đã nghiên cứu được hiệu quả của thảo dược như các chất bổ sung trên heo nái Szewczyk và cs (2006), Hanczakowska và cs (2007) đã ghi nhận tác dụng của thảo dược khi thêm vào thức ăn hỗn hợp cho gia súc giúp tăng cân

và tăng chất lượng thịt Nhiều nghiên cứu khác cũng đã ghi nhận rằng các loại thảo dược có nhiều tác dụng như tăng cường tăng trưởng, chống viêm, chống oxy hóa (Ao và cs, 2011; Cho và cs, 2006; Huang và cs, 2010; Windisch và

cs, 2008) và có thể kích thích sự thèm ăn và điều hòa sự tiêu hóa và chuyển hóa thức ăn cho vật nuôi (Grela và Semeniuk, 2006; Kołacz và cs, 1997) Kết quả nghiên cứu của Gilsene và cs (2000) cho thấy các cao chiết dược liệu từ đinh hương, húng quế, cỏ xạ hưởng, lá ổi, hương thảo, xô thơm, trâm vối cho khả năng kháng khuẩn tốt với các vi khuẩn Gram âm và Gram dương, tốt nhất

là cao chiết từ cây đinh hương và cây trâm vối (Gilsene va cs, 2000) Yuan và

cs (2001) đã nghiên cứu bổ sung các loại vỏ cam, quýt, bột hạt quả thông trong thức ăn của heo con sau cai sữa đã cải thiện 15,4 tăng trọng, 4,5 hiệu quả chuyển hóa thức ăn Một thí nghiệm được tiến hành ở Đan mạch bổ

6

sung hỗn hợp chế phẩm thảo dược vào khẩu phần heo thịt đã cải thiện 19 tăng trọng và 16 chuyển hóa thức ăn so với đối chứng (Chatterjee và Agrawala, 2004) Nhiều nghiên cứu về tinh dầu trong thảo dược cho thấy tinh dầu có thể cải thiện hiệu quả trong chăn nuôi heo (Cho và cs, 2006, Kroismayr và cs, 2008a), khả năng tiêu hoá chất dinh dưỡng (Yan và cs, 2010), tình trạng miễn dịch (Nofrarias và cs, 2006) và hệ sinh thái ruột (Manzanilla và cs, 2009)

Nhiều tác giả đã nghiên cứu và cho thấy cao chiết từ lá cây chùm ngây

có hoạt tính kháng khuẩn tốt với vi khuẩn Gram dương: Bacillus cereus,

Bacillus subtilis Staphylococcus aureus, Sarcina lutea và Gram âm: Escherichia coli và Mycobacterium phlei (Saroj và cs, 1995; Lar và cs, 2011)

Một nghiên cứu khác của nhóm tác giả Vieira và cs về cây chùm ngây và mãng cầu gai cũng cho thấy các cao chiết này có hoạt tính kháng khuẩn phổ

rộng với Staphylococcus aureus, Escherichia coli và Vibrio cholerae (Vieira

và cs, 2010)

Cỏ xạ hương được trồng rộng rãi và cũng được nhiều tác giả nghiên cứu

về khả năng kháng khuẩn và chống oxy hóa Sienkiewicz và cs đã nghiên cứu tinh dầu từ cây cỏ xạ hương và cây oải hương trong việc đối kháng với các chủng Staphylococcus, Enterococcus, Escherichia và Pseudomonas.(Sienkiewicz và cs, 2011; Dorman và Deans, 2000) Một

nghiên cứu củaNzeako và cs về tác dụng của cao chiết từ cây cỏ xạ hương và cây đinh hương cũng cho thấy khả năng kháng khuẩn tốt đối với các chủng vi

khuẩn này và cả nấm Candida albicans (Nzeako và cs, 2006)

Rehana và Nagarajan đã nghiên cứu kiểm tra các hoạt tính kháng khuẩn

và kháng nấm của cao chiết từ cây sài đất Nghiên cứu cho thấy, cao chiết từ cây sài đất sử dụng dung môi methanol cho hiệu quả kháng khuẩn cao với

nhiều chủng vi sinh vật, nhưng mạnh nhất là 2 chủng Streptococcus faecalis

và Candida albicans(Rehana và Nagarajan,2012) Darah và cs đã nghiên cứu

7

ảnh hưởng của chiết xuất methanol của cây sài đất chống lại vi khuẩn gây

bệnh trên vi khuẩn Bacillus cereus (Darah và cs, 2013).Các kết quả của các

tác giả cho thấy cao chiết từ cây sài đấtcó thể là một tác nhân kháng khuẩn

hữu hiệu để điều trị nhiễm khuẩn trên vật nuôi

Tuy nhiên, tác động của chiết xuất từ thảo dược trong chăn nuôi mang lại hiệu quả không giống nhau do tác động cộng gộp của các loại thảo dược có sự tương tác qua lại với nhau Sự phối hợp tiêu đen và nghệ, thử nghiệm trên người và chuột cho hiệu quả gấp 1,5 lần (Guido và cs,1998), một hỗn hợp chiết xuất từ nhiều loài thảo dược có hoạt tính sinh học mạnh hơn chiết xuất dạng đơn lẻ từ một loại thảo dược (Wagner và Ulrich-Merzenich, 2009) Vì thế, sử dụng chế phẩm hỗn hợp thảo dược bổ sung vào thức ăn gia súc, gia cầm nhằm phòng ngừa bệnh cho vật nuôi, gia cầm giúp tăng trọng, đảm bảo

Do đó, từ đầu năm 2018, Việt Nam sẽ dừng sử dụng các loại kháng sinh trong bổ sung vào thức ăn trong chăn nuôi và thủy sản, chỉ cho phép sử dụng trong sản xuất con giống Trong lộ trình đến năm 2020, Việt Nam sẽ dừng hẳn việc sử dụng kháng sinh bổ sung vào thức ăn trong chăn nuôi và thủy sản Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi ở Việt Nam đã quan tâm đến việc sử dụng các chất kích thích tăng trưởng nguồn gốc tự nhiên bổ sung vào thức ăn của vật nuôi

8

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng Theo các nhà phân loại thực vật, nước ta có khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao, trong đó có khoảng 3.948 loài được dùng làm dược liệu (Viện dược liệu, 2007) Nhiều loại thảo dược chứa các hoạt chất có khả năng kháng khuẩn đã được dân gian sử dụng từ lâu đời để phòng trị nhiều bệnh ở trâu bò, heo gà thay thế cho sự hiện diện của các chất hóa học và các chất kháng sinh Nghiên cứu áp dụng kinh nghiệm của y học cổ truyền để bào chế các chế phẩm từ thảo dược (tỏi, gừng, cam thảo, sài đất, quế, đinh hương, kinh giới, hồi, cỏ xạ hương, xuyên tâm liên, vỏ cam, quýt…) có chứa chất kháng khuẩn, chất kích thích tăng trưởng để thay thế sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi là một hướng có triển vọng đối với nước ta

Hình 1.1 Một số loại thảo dược trong tự nhiên (nguồn Internet

a Gừng, b lá chùm ngây, c tỏi, d cây xạ hương, e cây xuyên tâm liên,

f cây cam thảo

Theo nhóm nghiên cứu của tác giả Lâm Minh Thuận và cs qua thử nghiệm trộn gừng, nghệ và tỏi dạng bột bổ sung trong thức ăn của gà giống và

gà đẻ cho thấy tỷ lệ đẻ trứng của gà liên tục được cải thiện và tăng từ 4,5 - 6,3 (Lâm Minh Thuận và cs, 2006) Trong khi đó, nếu trộn 4 gram chế phẩm thảo dược vào 1 kg thức ăn cho gà, kết quả cho thấy tỷ lệ đẻ của gà đã tăng lên đến 92 so với đàn gà đối chứng Tỏi, gừng, nghệ bổ sung vào khẩu phần heo thịt giúp giảm tỷ lệ tiêu chảy và ho, giảm tổn thương nhu mô phổi,

9

giúp tăng trọng tốt (Nguyễn Thị Kim Loan, 2010) Tác giả Bùi Thị Lê Minh

và cs đã nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết tỏi lên sự tăng trưởng của gà, kết quả cho thấy sử dụng tỏi tươi vào khẩu phần ăn của gà

phòng được bệnh tiêu chảy do E coli gây ra (Bùi Thị Lê Minh và cs, 2015)

Tác giả Lê Thị Mến và cs đã cho thấy việc bổ sung bột tỏi vào khẩu phần ở mức độ 0,12 đã giúp heo tăng mức tăng trọng, hiệu quả sử dụng thức ăn và

kinh tế; cũng như hạn chế sự bài thải vi khuẩn E.coli ra môi trường (Lê Thị

Mến và Nguyễn Hiếu Nghĩa, 2016)

Nguyễn Tài Năng và Nguyễn Thị Quyên đã nghiên cứu chọn lọc một số loại thảo dược trên địa bàn tỉnh Phú Thọ thay thế kháng sinh bổ sung thức ăn cho heo, kết quả cho thấy cỏ sữa, rẻ quạt, riềng cho hiệu quả kháng khuẩn cao, khả năng tăng trọng tốt nhất, hiệu quả sử dụng thức ăn cao nhất và tỷ lệ nhiễm bệnh thấp nhất Phạm Sỹ Tiệp và cs đã nghiên cứu điều chế chế phẩm thảo dược làm chất bổ sung vào thức ăn cho heo nâng cao năng suất chăn nuôi

và giảm thiểu ô nhiễm môi trường Kết quả cho thấy tăng trọng heo thịt/ngày cao hơn 4,42 và chi phí thức ăn giảm 7.89 (Phạm Sỹ Tiệp và cs, 2008) Nhận thấy tác dụng của việc sử dụng thảo dược thay thế kháng sinh trong thức ăn để phòng và trị bệnh vật nuôi, nhóm nghiên cứu của tác giả Lã Văn Kính và cs đã triển khai nghiên cứu chiết xuất từ các loài thực vật như cỏ sữa, vàng đắng, xuyên tâm liên, cam thảo, dây cóc, gừng và ứng dụng các loại thảo dược này trong chăn nuôi heo, gà từ năm 2003 đến năm 2016 mang lại hiệu quả cao (Lã Văn Kính, 2017)

Trong những năm 2007 - 2017, nhóm tác giả Huỳnh Kim Diệu đã nghiên cứu đánh giá hiệu quả phòng bệnh và khả năng tác động trên tăng trọng của lá xuân hoa Kết quả thu được cho thấy lá xuân hoa ở dạng bột sấy khô có khả năng tác động trên vi khuẩn Gram âm và cả Gram dương, tác động mạnh trên

vi khuẩn Gram âm (MIC = 256 µg/ml) hơn vi khuẩn Gram dương (MIC = 512 µg/ml) Lá và bột xuân hoa được sử dụng điều trị tiêu chảy heo con cho hiệu

10

quả cao nhất tương đương với Cotrimoxazol liều 0,1g/kg thể trọng hoặc Norgent liều 0,1g/kg thể trọng Để phòng ngừa bệnh cho vật nuôi, có thể trộn bột lá xuân hoa vào thức ăn vật nuôi như dạng thức ăn bổ sung, hiệu quả tương đương với các loại kháng sinh (Huỳnh Kim Diệu, 2008, Huỳnh Kim Diệu và Ngô Thành Tâm, 2017) Bùi Thị Nho và Nguyễn Thành Trung cũng

Coli-đã khảo sát khả năng kháng vi khuẩn Salmonella và E coli và thử nghiệm

hiệu quả điều trị trên 62 con lợn tiêu chảy với số lượng khỏi là 60 con, tỉ lệ khỏi ở các dạng chế phẩm là 87,51 – 100 , thời gian khỏi bình quân là 2,3 – 3,08 (ngày) (Bùi Thị Nho và Nguyễn Thành Trung, 2011)

Võ Thị Kiều Ngân và cs đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa và

kháng khuẩn đối với vi khuẩn E coli và Bacillus subtilis của cao chiết từ lá và

thân rễ cây cỏ tranh Kết quả chỉ ra rằng cao chiết bằng ethanol từ lá cây cỏ tranh cho hiệu quả chống oxy hóa tốt nhất, còn cao chiết bằng methanol từ lá cây cỏ tranh cho hiệu quả kháng khuẩn cao (Võ Thị Kiều Ngân và cs, 2017)

Do đó, xu hướng chế phẩm thảo dược bổ sung vào thức ăn nhằm đảm bảo ngày càng triệt để vệ sinh an toàn thực phẩm, nâng cao tính cạnh tranh của sản phẩm chăn nuôi, nhất là các sản phẩm xuất khẩu Các chế phẩm thảo dược cho kết quả rất triển vọng trong việc thay thế kháng sinh kích thích tăng trưởng, chúng không những cho kết quả tốt về sinh trưởng, chuyển hóa thức

ăn của heo thịt mà còn không có tồn dư các kháng sinh thảo dược trong tất cả các mẫu sản phẩm là thịt, gan và thận heo, giúp ngành chăn nuôi phát triển bền vững, thân thiện với môi trường

2.3 Chất chiết thảo dược

Chất chiết thảo dược là các hợp chất hữu cơ được chiết ra từ thực vật tự nhiên, sử dụng điều trị hay hỗ trợ điều trị bệnh hoặc được bổ sung vào khẩu phần ăn của vật nuôi nhằm cải thiện năng suất và chất lượng chăn nuôi (Lã Văn Kính, 2017) Những sản phẩm này là sự kết hợp theo các công thức nhất định của các thành phần lấy từ bất cứ phần nào trên thảo dược (hoa, quả, lá,

11

cành, rễ ) ở dạng tươi hoặc đã qua sơ chế, chế biến hay chiết xuất bao gồm: Acid béo, sterol, alkaloid, flavonoid, glycosid, saponin Tuy vậy, không phải chất chiết thảo dược nào cũng giống nhau cho dù chúng có nguồn gốc từ cùng một loại thảo dược Hiệu quả phòng bệnh hay hỗ trợ điều trị bệnh cũng như

độ an toàn của các chế phẩm vì thế không hoàn toàn giống nhau Ngoài ra, chất lượng chất chiết thảo dược bị ảnh hưởng bởi nguồn nguyên liệu, bộ phận của cây (hạt, lá, thân, rễ hoặc vỏ cây), nguồn gốc địa lý, giai đoạn trưởng thành, phương pháp bảo quản và sử dụng (Windisch và cs, 2007)

Cùng với xu hướng sử dụng sản phẩm thuần tự nhiên và nhờ vào sự tiến

bộ của y dược học hiện đại, các loại thực phẩm chức năng có chiết xuất thảo dược cũng ngày một phát triển mạnh mẽ Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), 80 dân số thế giới đã và đang sử dụng sản phẩm có nguồn gốc thảo dược để chăm sóc sức khỏe ban đầu và lợi nhuận thu được từ thị trường này trên toàn cầu hàng năm rất lớn

Tách chiết thảo dược là quá trình dùng dung môi thích hợp để có thể hòa tan các chất, hợp chất tan có trong thảo dược (dịch chiết), sao cho chọn lọc được các chất, hợp chất có tác dụng điều trị/hỗ trợ điều trị tách ra khỏi phần không cần thiết, không có khả năng không tan của thảo dược (bã)

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết thảo dược như: bản chất của chất tan, dung môi chiết xuất, nhiệt độ chiết xuất, áp suât trong quá trình chiết xuất, cấu tạo của vách tế bào, kích thước của tiểu phân bột dược liệu Khi nắm được các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất chúng ta có thể tối ưu hóa quá trình chiết xuất dược liệu để thu được kết quả tách chiết cao

Tách chiết thảo dược gồm các bước cơ bản như sau :

12

Hình 1.2 Sơ đồ các bước cơ bản tách chiết thảo dược

2.4 Cơ chế tác dụng của thảo dược trong cơ thể vật nuôi

Các hoạt chất trong thảo dược hoạt động như các chất kháng những vi khuẩn đường ruột (Dorman và Deans, 2000); tăng tiêu hóa và hấp thụ chất dinh dưỡng (Oetting và cs, 2006a); tăng cường hấp thu nitơ (Alçiçek và cs, 2004); cải thiện đáp ứng miễn dịch (Namkung và cs, 2004); thay đổi hình thái

và mô học của đường tiêu hóa (Utiyama và cs, 2006); và hoạt động chống oxy hóa (Botsoglou và cs, 2002; 2004) Nó có khả năng ức chế nhiều loại vi khuẩn Gram âm và Gram dương kể cả vi khuẩn đã kháng với nhiều loại kháng sinh Các nghiên cứu dựa trên phương pháp nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đã chứng minh rằng chiết xuất thảo dược có tác dụng tương tự với hầu hết các thuốc kháng sinh thương mại (Kamel, 2000); Điều này là do hoạt chất thảo dược hoạt động ở trong cấu trúc vách tế bào vi khuẩn, làm biến tính và làm đông tụ protein Các tinh dầu trong thảo dược hoạt động làm thay đổi tính thấm của màng tế bào chất đối với các ion H+ và K+ Sự thay đổi này dẫn đến

sự gián đoạn các chu trình chủ yếu ở tế bào như chuyển vận điện tử, chuyển

vị protein, oxy hóa, phosphoryl hóa và các phản ứng enzyme khác, dẫn đến sự

Chuẩn bị dược liệu và dung môi

Joseph và Priya (2011) đã khảo sát dịch chiết lá ổi tác dụng kháng khuẩn

và kháng nấm bằng cách sử dụng kỹ thuật khuếch tán thạch đối

với Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, và nấmCandida albicans Theo nhóm tác giả, dịch chiết ổi có khả năng tác động

vào màng tế bào vi sinh vật, các hoạt chất trong dịch chiết thẩm thấu vào màng tế bào gây ức chế sự trao đổi chất qua màng (Joseph và Priya, 2011) Dịch chiết lá ổi có chứa nhiều flavonoid, đặc biết là quercetin có hoạt tính kháng khuẩn cao Ngoài ra quercetin còn có thể ức chế phóng thích acetylcholine để điều trị bệnh tiêu chảy cấp tính Vì vậy đa số nhiều nghiên cứu đều chỉ ra rằng dịch chiết xuất từ lá ổi có thể sự dụng trong phương pháp điều trị các trường hợp tiêu chảy cấp thay thế kháng sinh ( Sugannya và cs, 2007)

Chế phẩm thảo dược có đặc điểm là chỉ ức chế những vi khuẩn có hại và không ảnh hưởng đến vi sinh vật có lợi trong đường ruột, ngoài ra còn có tác dụng kích thích tính thèm ăn, tăng sự tiết dịch tiêu hóa, cải thiện tỷ lệ tiêu hóa hấp thu thức ăn Thảo dược còn giúp cải thiện phản ứng miễn dịch của vật nuôi (Namkung và cs, 2004), kích thích tăng trưởng, giảm chi phí thức ăn

14

Bên cạnh đó các chế phẩm thảo dược thường chứa những hợp chất như saponin (steroid saponin, triterpenoid saponin) có tác dụng kiểm soát ammonia và mùi hôi của chất thải, chống lại các bệnh gây ra bởi protozoa, nâng cao khả năng tiêu hóa, hấp thu thức ăn, nâng cao đáp ứng miễn dịch, cải thiện năng suất sinh sản, hạn chế tỷ lệ đẻ non ở heo

Hiện nay sử dụng thảo dược làm làm chất bổ sung vào thức ăn chăn nuôi được coi là một hướng đi mới và đúng đắn của chăn nuôi sạch, thân thiện với môi trường

2.5 Một số bệnh thường gặp ở gia súc, gia cầm do vi khuẩn gây ra

2.5.1 Bệnh do vi khuẩn Salmonella.

Ở gà và các loại gia cầm khác, Salmonella là yếu tố chính gây bệnh tiêu

chảy, nhiễm trùng ruột, viêm gan… Khi vi khuẩn xâm nhập, vật nuôi còn nhỏ

có thể chết ngay khi mởi nở, vật nuôi đã lớn có triệu chứng sụt sản lượng trứng, vỡ trứng trong dạ con, viêm xoang bụng, viêm khớp, tiêu chảy Để phòng bệnh cần phải vệ sinh chuồng trại sạch sẽ, đồ ăn thức uống đảm bảo vệ sinh, chọn giống sạch bệnh Ngoài ra, điều trị bệnh bằng kháng sinh tetracycline, cloramphenicol, sulfamid, nitrofuran…

Vi khuẩn Salmonella gây phó thương hàn ở heo Thường thấy ở heo từ

1-4 tháng tuổi, heo sau cai sữa nhưng phổ biến nhất là giai đoạn từ 2 tháng tuổi trở lên Heo trưởng thành cũng mắc bệnh nhưng ít hơn Triệu chứng chung heo bỏ ăn, uể oải, ho khan và sốt cao Bệnh có tính lây lan mạnh Thời gian ủ bệnh khoảng 2-3 ngày, heo sốt cao, lúc tiêu chảy, lúc táo bón, heo gầy yếu và chết trong khoảng 15-20 ngày do suy nhược Có thể phòng bệnh bằng vaccin ở những vùng an toàn dịch Heo con sau khi đẻ 4-5 tuần ngày có thể tiêm vaccin, những nơi có dịch đe dọa có thể tiêm sớm hơn Điều trị bệnh

bằng kháng sinh cloramphenicol hoặc tetracycline

15

2.5.2 Bệnh do vi khuẩn E coli :

Có nhiều chủng E.coli gây bệnh với những đặc điểm khác nhau ở heo nhưng quan trọng nhất là bệnh tiêu chảy phân trắng ở heo con E Coli tác

động lên heo con ở ba giai đoạn: giai đoạn đầu đời, giai đoạn 25 ngày tuổi, và

giai đoạn 35 ngày tuổi Bệnh tiêu chảy do E coli không có bệnh tích đặc

trưng Mổ khám heo có thể thấy sung huyết ở ruột non, dạ dày Dạ dày có thể phồng to do sữa, thức ăn không tiêu hóa Tình trạng tiêu chảy lỏng nhưng hơi sệt, không lẫn máu, lây lan chậm, xảy ra chỉ trên một số heo trong bầy, đàn Tình trạng tiêu chảy kéo dài trong 2 – 3 ngày, điều trị dễ dàng bằng kháng sinh thích hợp, kết hợp biện pháp bù nước, điện giải, ủ ấm Một trong những cách phòng bệnh tiêu chảy cho heo đó là tăng cường khả năng tiêu hóa ở heo con (bổ sung chế phẩm thảo dược hoặc chế phẩm chứa enzyme tiêu hóa, vi sinh vật có lợi)

Vi khuẩn E.coli, thường có sẵn ở ruột gia cầm khỏe mạnh, trong môi

trường chăn nuôi bị ô nhiễm, khi thời tiết thay đổi, điều kiện chăm sóc nuôi

dưỡng không tốt… sẽ tạo điều kiện cho E.coli phát triển và gây bệnh Trên gia cầm, E.coli gây nhiều chủng bệnh khác nhau như viêm đường tiêu hóa

(colibacillosis), nhiễm trùng huyết (colisepticemia), viêm tích tụ tế bào bạch cầu (coligranuloma), viêm màng bụng (peritonitis), viêm vòi trứng

(salpingitis), viêm màng hoạt dịch, viêm khớp (synovitis) E.coli còn được

biết đến là một vi khuẩn cơ hội, gây bệnh kế phát khi gia cầm bị stress hay

nhiễm những bệnh khác làm cho hệ miễn dịch suy yếu Kế phát E.coli thường

làm bệnh trầm trọng hơn nhiều và gây thiệt hại kinh tế lớn trong chăn nuôi công nghiệp Dùng một trong các loại thuốc kháng sinh sau: APA Oxytetra 10

P, APA Colis 10 L… liều theo hướng dẫn sử dụng của hãng thuốc Kết hợp

bổ sung vitamin, men tiêu hóa, thuốc trợ sức, trợ lực cho gia cầm như: APA Antistress P, APA Amino… Tăng cường chăm sóc nuôi dưỡng, cải thiện môi trường chăn nuôi, vệ sinh, phun khử trùng trong và ngoài chuồng nuôi

- Chủng VSV: Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Bacillus

cereus, E coli từ ngân hàng chủng VSV Trung tâm Công nghệ sinh học

TP.HCM và được cung cấp bởi hãng Microbiologics - Mỹ

- Hóa chất: ethanol, ampicillin, Môi trường nuôi cấy BHI lỏng, MHA

- Động vật thử nghiệm: Chuột nhắt trắng đực (chủng Swiss albino, 5-6 tuần tuổi, 20 ± 2 g) được cung cấp bởi Viện Vắcxin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang và được để ổn định ít nhất một tuần trước khi thử nghiệm

- Gà Ri: 7 ngày tuổi được cung cấp bởi Trang tại Tam Nông Quận 12 và được để ổn định ít nhất 1 tuần trước khi thử nghiệm

Hình 3.1 Chuột nhắt trắng đực (chủng Swiss albino)

17

Hình 3.2 Gà Ri 7 ngày tuổi

- Heo (Duroc x Yorkshire x Landrace): 30 ngày tuổi vừa được tách khỏi

mẹ được cung cấp bởi hộ dân thử nghiệm

Hình 3.3 Heo giống (Duroc x Yorkshire x Landrace)

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp tách chiết cao thảo dược

Để chiết được nhóm chất chứa đối tượng nghiên cứu phải xây dựng được các quy trình chiết xuất thích hợp Có rất nhiều phương pháp và kỹ thuật chiết xuất dược liệu khác nhau Nhằm hướng đến tính ứng dụng cao và chi phí đầu tư thấp, các hoạt chất trong dịch chiết không bị phân hủy bởi nhiệt độ cao, chúng tôi sử dụng quy trình chiết xuất thảo dược bằng phương pháp chiết ngâm Hiệu quả tách chiết ( ) được xác định dựa vào tỷ lệ % khối lượng giữa lượng dịch chiết thu được sau khi đã làm khô so với khối lượng mẫu ban đầu

Nguyên liệu thảo dược sau khi được thu hái về được rửa sạch, phơi và sấy khô

18

ở nhiệt độ dưới 60ºC Mẫu khô được xay thành bột để tăng diện tích tiếp xúc với dung môi ethanol Sau đó xác định độ ẩm Mẫu được đựng trong túi ni lông kín và bảo quản Ký hiệu các mẫu theo tên gọi khoa học và địa điểm lấy mẫu,

bộ phận thu mẫu để thuận tiện lưu mẫu và sử dụng

Mẫu thảo dược sau khi xử lý được cho vào bình ngấm kiệt với dung môi ethanol 96o (tỉ lệ 1:10), để yên cho dịch ngấm kiệt, cứ sau 24h lọc mẫu thu dịch chiết và tiếp tục bổ sung dung môi ethanol 96o chiết tiếp, thời gian chiết khoảng 72 giờ Sau 72 giờ, lọc mẫu thu dịch chiết, bã dược liệu được chiết tiếp tục với ethanol 72o trong nhiều lần Tổng thời gian chiết khoảng 7 ngày Gom tất cả dịch chiết ở các lần tách chiết, lọc qua giấy lọc Whatman, và tiến hành loại dung môi dưới áp suất thấp, nhiệt độ 40oC ở máy cô quay chân không để thu nhận cao toàn phần Mẫu sau đó được đông khô hoặc sấy khô Cân cao chiết và tính hiệu suất tách chiết Bảo quản cao chiết trong các lọ đựng cao thô theo tiêu chuẩn bảo quản mẫu để phục vụ sàng lọc và lưu trữ lâu dài

Quy trình tách chiết thảo dược có thể tóm tắt như sau:

19

Hình 3.4 Quy trình tách chiết cây dược liệu bằng phương pháp chiết ngâm

3.2.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết thảo dược

Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng giữa hoạt tính kháng khuẩn trong cao chiết thảo dược và vi khuẩn chỉ thị

Cách tiến hành:

- Các chủng vi khuẩn chỉ thị (Escherichia coli ATCC 25922, Samonella

typhi ATCC13311) được nuôi cấy lỏng trên các môi trường đặc trưng và điều

kiện sinh trưởng riêng của từng chủng Mật độ vi khuẩn sau khi nuôi cấy

nồng độ 100mg/ml Pha loãng ở các nồng độ khác nhau

- Chuẩn bị đĩa thạch chứa môi trường vô trùng, cấy trải sinh khối vi khuẩn ở mật độ 106CFU/ml Đục lỗ tạo giếng thạch với đường kính 7 mm Sau đó bổ sung dịch chiết với các nồng độ khác nhau vào giếng thạch, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, thao tác được thực hiện trong điều kiện vô trùng Tiến hành thao tác tương tự cho lô đối chứng, chứng âm là ethanol 50o, đối chứng dương là kháng sinh Streptomycin nồng độ 100 mg/ml Sau đó đem tất

cả các đĩa nuôi cấy ở điều kiện 37oC trong 24 giờ, quan sát và đo đường kính

vòng kháng khuẩn xuất hiện xung quanh giếng thạch

Đường kính vòng kháng khuẩn được tính như sau:

r = D – d (mm) Trong đó:

21

với hàm lượng thuốc thử cao hơn Sự sinh trưởng của các chủng vi sinh vật được quan sát thông qua việc giảm nồng độ các nhân tố kháng khuẩn trong đĩa thạch Đồng thời, nồng độ thấp nhất của yếu tố kháng khuẩn có khả năng

ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật được ghi nhận

Cách thực hiện:

Phương pháp pha loãng các cao chiết thực vật (broth dilution) trên đĩa

96 giếng và chất chỉ thị màu resazurin được sử dụng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC (Minimum Inhibitory Concentration) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC (Minimum Bactericidal Concentration) (Ngan, 2012; Mak, 2013) Vi khuẩn được nuôi cấy lắc trong môi trường LB qua đêm, dịch sinh khối được hiệu chỉnh về mật độ 108 CFU/mL tương đương với độ đục chuẩn 0,5 Mc Farland Sau đó pha loãng với môi trường LB về nồng độ 106 CFU/mL Cao chiết thảo dược được pha loãng bằng ethanol ở các nồng độ khác nhau theo tỉ lệ 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 Các giếng đối chứng chứa dịch vi khuẩn, môi trường và ethanol 50o Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Bổ sung 50µl dịch chiết và 50 µl dịch khuẩn vào mỗi giưỡng ủ 37ᴼC trong 24 giờ Sau 24 giờ, bổ sung 20 µl thuốc thử resazurin 0,01% vào mỗi giếng ủ 37ᴼC trong 30 phút Quan sát sự thay đổi màu, ghi nhận giá trị MIC Các giếng có sự đổi màu của dung dịch resazurin từ màu xanh sang màu hồng cho thấy có sự tăng trưởng của vi khuẩn trong giếng Nồng độ ức chế tối thiểu MIC được định nghĩa là nồng độ thấp nhất trong dãy nồng độ thử nghiệm của các cao chiết có thể ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn (không làm đổi màu resazurin) Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC đươc xác định bằng phương pháp trải đĩa: hút 100 µL dịch thử nghiệm trên các giếng không có sự đổi màu của resazurin được trải lên các đĩa môi trường thạch MHA và được ủ ở 37 oC, sau 24 giờ quan sát sự sống sót của vi khuẩn Giá trị MBC là nồng độ thấp nhất trong dãy nồng độ của các dịch cao chiết có thể tiêu diệt 99,9% vi khuẩn