THÔNG TIN CHUNG
1 Tên nhiệm vụ: “Nghiên cứu tạo chế phẩm Nisin từ các chủng vi khuẩn lactic làm phụ gia bảo quản thực phẩm”, (Mã số: TP01/15-16)
2 Đơn vị chủ trì: Tổ CNSH Thực phẩm – Trung Tâm Công nghệ Sinh học TP HCM
3 Chủ nhiệm nhiệm vụ: ThS Nguyễn Thị Dung
5 Cán bộ tham gia thực hiện: ThS Nguyễn Đặng Hải Đăng, KS Lê Thị Huyền
6 Thời gian thực hiện: 24 tháng (từ tháng 1/2015 đến 12/2016)
- Kinh phí đã sử dụng: 327.500.000 đồng
Nghiên cứu thu nhận Nisin ứng dụng làm phụ gia bảo quản thực phẩm Nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp Nisin
Tuyển chọn được các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp Nisin có hoạt tính cao
Khảo sát các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp Nisin của các chủng vi khuẩn lactic
Xây dựng quy trình thu nhận hợp chất Nisin thô
Đánh giá hiệu quả chế phẩm trên các nền mẫu thực phẩm
9 Các nội dung công việc đã thực hiện được so với đăng ký
STT Nội dung đăng ký
1 Nội dung 1: Phân lập, tuyển chọn các chủng lactic khả năng kháng khuẩn
2/2015- 6/2015 Đã phân lập và định danh được 4 chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn, trong đó có 2 chủng
Lactococcus lactis subsp lactis là
Enterococcus spp là SB07 và LN23 Các chủng đều có khả năng đối kháng với các chủng gây hư hỏng thực phẩm là S aureus và B.cereus Đúng tiến độ
Khảo sát môi trường và các điều kiện nuôi cấy là rất quan trọng, vì chúng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp Nisin của các chủng vi khuẩn lactic được phân lập Việc hiểu rõ các yếu tố này sẽ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất Nisin, từ đó nâng cao hiệu quả và chất lượng sản phẩm.
Từ tháng 7 đến tháng 12 năm 2015, chúng tôi đã khảo sát và lựa chọn chủng HT235 với các điều kiện nuôi cấy tối ưu Môi trường nuôi cấy là CM, thời gian nuôi cấy là 24 giờ, nhiệt độ 30 độ C và pH ban đầu là 6,8, tất cả đều tạo ra điều kiện thuận lợi cho sự tổng hợp Nisin.
Hoạt tính Nisin theo khảo sát đạt 1338,8 IU/ml Đúng tiến độ
Từ tháng 1 đến tháng 4 năm 2016, chúng tôi đã tiến hành khảo sát và lựa chọn phương pháp tủa ethanol với tỉ lệ 70% ethanol và 30% dịch nổi cho chủng HT235, đạt được hoạt tính thu nhận Nisin cao nhất là 1574.74 IU/ml, đúng theo tiến độ đã đề ra.
4/2006- 7/2016 Đã định tính Nisin thu nhận được bằng phương pháp phân tích điện di Tricine –SDS page Đúng tiến độ
5 Nội dung 5: Khảo sát tính chất bacteriocin thu nhận được
Từ tháng 7 đến tháng 10 năm 2016, nghiên cứu đã được thực hiện để khảo sát độ bền của bacteriocin từ chủng HT235 Kết quả cho thấy bacteriocin này rất bền với nhiệt độ, gần như không bị phá hủy ở 70 độ C, chỉ giảm khoảng 40% hoạt tính khi tiếp xúc với nhiệt độ cao.
121 o C trong thời gian 15 phút và có dải hoạt động khá rộng từ pH 3-7, hoạt tính nisin thu được còn lại khá cao Đúng tiến độ
6 Nội dung 6: Bước đầu đánh giá hiệu quả chế phẩm trên các nền mẫu thực phẩm
Từ tháng 10 đến tháng 12 năm 2016, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm hiệu quả của Nisin trên mẫu sữa và thịt Kết quả cho thấy Nisin thu được từ chủng HT235 có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm, đúng theo tiến độ dự kiến.
NỘI DUNG KHOA HỌC
VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các chủng vi sinh vật
- Chủng Lactococcus lactis subsp lactis ATCC® 11454 được mua từ công ty của Nhật Bản
Chủng Lactobacillus plantarum LS13, được phân lập từ nguồn mẫu trong nghiên cứu, là một chủng kháng acid và nhạy cảm với Bacteriocin Chủng này được cung cấp từ bộ chủng của Tổ CNSH Thực phẩm - Trung tâm công nghệ sinh học, và được sử dụng để kiểm định khả năng tổng hợp Bacteriocin.
- Chủng Staphylococus aureus ATCC® 25923 được mua của công ty thiết bị khoa học Lan Oanh
- Chủng chỉ thị Bacillus cereus, được cung cấp từ bộ giống tại Trung tâm Công Nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh dùng làm chủng chỉ thị
Các nguyên vật liệu khác
- Nisin thương mại từ hãng Sigma chứa 2,5% Nisin
Các mẫu thực phẩm được sử dụng để phân lập vi khuẩn lactic bao gồm nước kim chi, nước dưa cải muối chua, sữa tươi Long Thành, sữa tươi Familk, sữa đậu nành, sữa bò tươi và phô mai, tất cả đều được mua từ chợ và siêu thị tại TP.Hồ Chí Minh.
- Các mẫu sữa tươi, thịt dùng để thử nghiệm hiệu quả của bacteriocin thu nhận được được mua từ cơ sở sản xuất sữa và thịt
Môi trường nuôi cấy: Sử dụng môi trường MRS, TSB, MRS cải tiến, Elliker, CM (phụ lục)
Trong phương pháp nhuộm Gram, các hóa chất cơ bản đóng vai trò quan trọng, bao gồm thuốc thử và các phản ứng sinh hóa cần thiết Ngoài ra, các kỹ thuật điện di như Tricine SDS-PAGE và quy trình tách chiết DNA cũng sử dụng các hóa chất đặc hiệu để đảm bảo kết quả chính xác và hiệu quả.
2.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng có hoạt tính sinh tổng hợp bacteriocin
2.1.1 Đối tượng lấy mẫu và phương pháp lấy mẫu Đối tượng lấy mẫu: Nước kim chi, nước dưa cải muối chua, sữa tươi Long Thành, sữa tươi familk, sữa đậu nành, sữa bò tươi, phô mai Địa điểm lấy mẫu:
- Một số chợ và siêu thị ở TP.HCM, công ty sữa, nhà máy
- Số lượng mẫu lấy: 10 mẫu kim chi, 10 mẫu cải muối, 5 mẫu sữa
Các mẫu dưa cải muối và kim chi được mua từ chợ hoặc siêu thị cần được vận chuyển về và bảo quản ở nhiệt độ mát Sau khi lấy trực tiếp nước lên men, các mẫu này sẽ được cho vào lọ vô trùng và ghi rõ tên mẫu cùng ngày lấy Việc bảo quản ở nhiệt độ mát là rất quan trọng để đảm bảo chất lượng của sản phẩm.
Sữa được mua trực tiếp từ trại bò sữa và được bảo quản mát trước khi chuyển đến trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM Tại đây, sữa sẽ được ly tâm để tách béo và tiến hành tự lên men ở nhiệt độ 28°C trong 18-24 giờ Quá trình lên men tự nhiên này giúp sữa đông tụ nhờ các enzyme và acid do vi khuẩn lactic sản sinh ra, tạo ra dịch đông tụ chất lượng để phân lập.
Phân lập vi khuẩn lactic được thực hiện bằng phương pháp pha loãng giới hạn, trong đó mẫu được pha loãng trong dung dịch nước muối sinh lý 0.9% đã khử trùng Sau đó, mẫu được cấy trải trên môi trường MRS có 1.5% agar và nuôi ở nhiệt độ 30°C trong 24 giờ với các nồng độ pha loãng cần thiết như 10^-3, 10^-4 Các khuẩn lạc đặc trưng được chọn lựa, tiếp tục cấy truyền để làm thuần và giữ giống trên thạch nghiêng.
2.1.3 Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn
Số lượng tế bào sống vi khuẩn trong mẫu được xác định thông qua phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa thạch, được biểu thị bằng CFU/g hoặc CFU/ml, dựa trên nồng độ pha loãng tính theo công thức.
N: số tế bào vi khuẩn trong 1g hay 1 ml mẫu
C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn (số khuẩn lạc khoảng từ 25-250 khuẩn lạc/đĩa) ni: Số hộp petri cấy tại độ pha loãng thứ i di: Hệ số pha loãng tương ứng v: thể tích mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa
2.1.4 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái và sinh hóa
Các chủng phân lập được nuôi cấy trên môi trường MRS thạch và sau 18 - 24 giờ, hình dạng khuẩn lạc được quan sát trên môi trường thạch đĩa Hình thái tế bào được kiểm tra trên tiêu bản nhuộm Gram bằng kính hiển vi quang học với độ phóng đại cao.
1000 lần Chủng vi khuẩn lactic khi nhuộm Gram sẽ có màu tím
Chúng tôi tiến hành khảo sát các đặc tính sinh lý và sinh hóa của các chủng lactic sinh bacteriocin nhằm định danh và phân loại theo khóa phân loại của Bergey Các phản ứng được thực hiện bao gồm: catalase, tính di động, phản ứng sinh khí từ glucose, khả năng sinh acid lactic và phân giải CaCO3.
Bảng 1 Một số phản ứng sinh hóa đối với chủng vi khuẩn lactic Phản ứng sinh hóa Kết quả
- Khả năng sinh axit lactic +
- Khả năng phân giải CaCO3 +
- Khả năng lên men đường +
2.1.5 Phương pháp khảo sát khả năng kháng khuẩn Để khảo sát khả năng kháng khuẩn của các chủng phân lập được, chúng tôi sử dụng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Phương pháp được tính bằng đường kính vòng kháng khuẩn (đơn vị là mm) Các chủng vi khuẩn lactic được thử kháng khuẩn với các chủng chỉ thị là Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, L plantarum ở nồng độ pha loãng từ 10 -1
Chủng vi khuẩn lactic phân lập được được nuôi trên môi trường MRS lỏng ở nhiệt độ
Ở nhiệt độ 30 o C trong 18 – 24 giờ, tiến hành ly tâm ở 10000 rpm tại 4 o C trong 15 phút để loại bỏ sinh khối Sau đó, điều chỉnh pH về mức trung tính bằng dung dịch NaOH Các chủng chỉ thị được nuôi trong môi trường TSB lỏng, với điều kiện nhiệt độ và thời gian phù hợp cho từng chủng Cuối cùng, dịch nuôi cấy được cấy lên môi trường TSA với các nồng độ 10 -1 để thực hiện thí nghiệm.
Để kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn, cho 7 mm, nhỏ 0,1 ml dịch vi khuẩn vào giếng thạch và đặt các hộp petri vào tủ lạnh ở nhiệt độ 4°C trong 4 giờ để bacteriocin thẩm thấu đều Sau đó, ủ ở 30°C trong 18 - 24 giờ để chủng chỉ thị phát triển Kết quả được ghi nhận sau 18 - 24 giờ, với khả năng kháng khuẩn được xác định bằng đường kính vòng kháng khuẩn xung quanh lỗ thạch Nếu đường kính này lớn hơn hoặc bằng 6 mm, vi khuẩn được xem là có khả năng ức chế tích cực Đường kính vòng kháng khuẩn được tính bằng công thức: r = D – d (mm), trong đó r là đường kính vòng kháng khuẩn.
D: đường kính vòng kháng khuẩn (bao gồm đường kính lỗ) (mm) d: đường kính lỗ (mm)
2.1.6 Phương pháp tách DNA tổng số
Sau khi phân lập và tuyển chọn các chủng, chúng tôi sẽ tách DNA tổng số bằng cách cấy khuẩn lạc vào môi trường MRS Broth (Difco) và nuôi ở 30°C trong 16 giờ Sau đó, chúng tôi sẽ ly tâm ở 13000 rpm trong 7 phút để loại bỏ môi trường nuôi cấy Cuối cùng, chúng tôi sử dụng bộ QIA quick PCR purification kit (QIAGEN, Hilden, Germany) theo hướng dẫn của nhà sản xuất để tách DNA tổng số.
KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
1 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic
Chúng tôi đã thu thập mẫu thực phẩm len men từ chợ và siêu thị tại Thành phố Hồ Chí Minh, bao gồm nước kim chi, nước dưa cải muối chua, sữa tươi Long Thành, sữa tươi Familk, sữa đậu nành, sữa bò tươi và phô mai Sau khi xử lý, các mẫu được cấy trên môi trường MRS (1.5% agar) và nuôi ở nhiệt độ 30°C trong 24 giờ với các nồng độ pha loãng cần thiết (10^-3, 10^-4, ) Các khuẩn lạc đặc trưng được chọn dựa trên đặc điểm phân loại của Bergey Qua quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi, chúng tôi đã xác định được 10 chủng vi khuẩn có đặc điểm tương đồng với Lactococcus lactic, với khuẩn lạc tròn, nhỏ, màu trắng sữa, Gram dương và tế bào xếp thành cặp hoặc chuỗi ngắn Ngoài ra, chúng tôi cũng đã mua thêm một chủng Lactococcus lactis subsp lactis thương mại ATCC 11454 từ Nhật Bản Các thông tin về nguồn mẫu, ký hiệu các dòng phân lập và đặc điểm hình thái của 10 dòng vi khuẩn cùng với chủng thương mại được trình bày trong bảng 5.
Bảng 5 Đặc điểm hình thái các chủng lactic phân lập được
Kí hiệu Đặc điểm hình thái vi khuẩn
Hình ảnh khuẩn lạc Hình ảnh tế bào
NT2.1 Khuẩn lạc tròn, nhỏ, màu trắng sữa
Tế bào Gram dương, hình cầu, phân bố theo cụm
NC20 Khuẩn lạc đơn tròn, kích thước nhỏ, màu trắng sữa
Tế bào hình cầu, Gram dương, phân bố theo cặp và cụm nhỏ
SB07 Khuẩn lạc tròn, kích thước nhỏ, có màu trắng, bề mặt bóng
Tế bào hình cầu, Gram dương, phân bố theo cụm
SF21 Khuẩn lạc đơn, nhỏ, màu trắng sữa
Tế bào hình cầu Gram dương, phân bố theo cụm
SF24 Khuẩn lạc đơn, nhỏ, màu trắng trong
Tế bào hình cầu, Gram dương, đứng riêng rẽ
SF27 Khuẩn lạc tròn, nhỏ, màu trắng sữa
Tế bào hình cầu, Gram dương, đứng riêng rẽ hoặc bắt cặp tạo song cầu hoặc liên cầu
LN23 Khuẩn lạc nhỏ, tròn, màu trắng trong
Tế bào hình cầu, Gram dương, phân bố theo cụm hoặc bắt cặp đôi
SM05 Khuẩn lạc tròn, nhỏ, màu trắng sữa
Tế bào hình cầu, Gram dương, đứng độc lập hoặc theo cụm
HT235 Khuẩn lạc tròn, nhỏ, màu trắng sữa,
Tế bào Gram dương, hình cầu, tập trung thành từng cụm nhỏ
DT248 Khuẩn lạc tròn, nhỏ, màu trắng sữa, mép trơn bóng
Tế bào Gram dương, hình cầu, xếp thành từng chuỗi ngắn hoặc tập trung thành từng cụm nhỏ
Khuẩn lạc tròn, kích thước nhỏ, màu trắng trong
Tế bào hình cầu, sắp xếp thành chuỗi hoặc thành cụm
Chúng tôi tiếp tục tiến hành các thử nghiệm sinh hóa đặc trưng đối với 10 chủng vi khuẩn phân lập được Kết quả được trình bày ở bảng 6
Bảng 6 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 10 chủng nghi ngờ vi khuẩn Lactococcus lactic
Chú thích: (+) dương tính, (-) âm tính
Kết quả thử nghiệm sinh hóa cho thấy trong 10 chủng vi khuẩn lactic phân lập, có 6 chủng (SF4, NT2.1, NC20, SM05, SF29 và SF21) không có khả năng sinh acid, dẫn đến việc loại bỏ chúng Chúng tôi tiếp tục khảo sát khả năng đối kháng của 4 chủng còn lại với các chủng chỉ thị.
2 Đánh giá khả năng đối kháng với một số vi khuẩn chỉ thị của các chủng lactic phân lập được
Một trong những đặc điểm quan trọng để phân loại vi khuẩn lactic là khả năng kháng lại các vi sinh vật kiểm định Trong nghiên cứu này, bốn chủng vi khuẩn lactic đã được tuyển chọn thông qua quá trình nuôi cấy trên môi trường MRS dịch thể trong 24 giờ, sau đó tiến hành ly tâm để thu dịch Các chủng này đã được thử nghiệm khả năng đối kháng với ba vi sinh vật kiểm định là B.cereus, S aureus và L plantarum, và kết quả được trình bày trong bảng 7.
Kết quả nghiên cứu cho thấy cả bốn chủng vi khuẩn đều có khả năng ức chế các vi sinh vật B.sereus và S aureus, tuy nhiên, hoạt tính kháng khuẩn của hai chủng HT235 và DT248 mạnh hơn Hai chủng này cũng kháng được với chủng chỉ thị L plantarum, trong khi hai chủng SB07 và LN23 chỉ kháng được với B.sereus và S aureus mà không có tác dụng với L plantarum Điều này cho thấy hai chủng HT235 và DT248 có khả năng thuộc về nhóm L.lactic nhờ vào khả năng ức chế sự phát triển của L plantarum.
Bảng 7 Khả năng kháng lại một số chủng chỉ thị của các chủng lactic phân lập được
Khả năng đối kháng với các chủng chỉ thị
3 Kết quả định danh, giải trình tự
Sau khi thu nhận các kết quả thử nghiệm sinh hóa, khả năng kháng khuẩn, bộ gen của
Bốn chủng tuyển chọn đã được tách chiết và trình tự 16S rRNA trên bộ gen được nhân bản bằng phương pháp PCR Kết quả được kiểm tra thông qua quá trình điện di trên gel agarose 1%.
Hình 1 Kết quả điện di trên gel Agarose 1% sản phẩm PCR vùng 16S rRNA chủng 11454, HT235 và DT248; Thang DNA
Chúng tôi đã gửi mẫu giải trình tự nucleotide đến Công ty Macrogen tại Hàn Quốc Sau khi hoàn tất giải trình tự, bộ gen được so sánh độ tương đồng di truyền với các loài khác trong ngân hàng gen NCBI thông qua công cụ BLAST.
Hai chủng vi khuẩn HT235 và DT248 có trình tự gen 16S rRNA tương đồng đến 99% với các chủng Lactococcus lactis trên Genbank Cụ thể, trình tự gen của chủng HT235 đạt độ tương đồng 99% với Lactococcus lactis subsp lactis JCM 7638, trong khi chủng DT248 có độ tương đồng 99% với Lactococcus subsp lactis Ni185.
Hai chủng vi khuẩn có trình tự gen 16S rRNA tương đồng 99% với các chủng Enterococcus trên Genbank là LN23 và SB07, trong đó LN23 tương đồng 99% với Enterococcus faecalis LD33 và Enterococcus sp BAB-3539 Hiện nay, chỉ có chủng Lactococcus lactic được WHO công nhận là có khả năng sinh Nisin cao và an toàn Vì vậy, mục tiêu chính của nghiên cứu này là tập trung vào chủng Lactococcus lactic, và chúng tôi đã chọn hai chủng HT235 và DT248 để tiếp tục nghiên cứu về sinh tổng hợp bacteriocin trong các thí nghiệm tiếp theo.
Chúng tôi đã xây dựng đường chuẩn Nisin bằng cách pha loãng trong dung dịch đệm photphate, với nồng độ Nisin chuẩn được thiết lập ở các mức: 0, 50, 100, 1000, 2500, 3500, 5000 và 70000 IU/ml.
Kết quả thu được phương trình đường chuẩn hoạt tính Nisin:
Hình 2 Đường chuẩn hoạt tính Nisin
5 Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến sinh tổng hợp Nisin
5.1 Khảo sát điều kiện của môi trường đến sinh tổng hợp Bacteriocin
Kết quả khảo sát cho thấy, trong các môi trường CM, Elliker, MRS và MRS cải tiến, cả hai chủng HT235 và DT248 đều đạt được mức sinh tổng hợp bacteriocin cao nhất.
Trong nghiên cứu, đường kính vòng kháng khuẩn trên môi trường CM cho thấy chủng HT235 đạt 16,9mm và chủng DT248 đạt 15,5mm, cho thấy khả năng kháng khuẩn cao Hoạt tính bacteriocin của chủng HT235 là 1203,08 IU/ml, gần tương đương với chủng ATCC11454, trong khi chủng DT248 đạt 821,28 IU/ml Sau 24 giờ nuôi cấy ở 30 o C, mật độ vi sinh vật của chủng HT235 là 2,8 x 10^9 CFU/ml và DT248 là 1,62 x 10^9 CFU/ml Mặc dù chủng DT248 có sự sinh trưởng tốt trong môi trường MRS, Elliker và CM, nhưng khả năng tổng hợp bacteriocin lại thấp, cho thấy sự khác biệt trong khả năng sinh trưởng và tổng hợp giữa các chủng lactic trong các môi trường khác nhau.
Bảng 8 Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng kháng khuẩn của các chủng khảo sát
(mức ý nghĩa: * tức là α= 0,05; ** tức là α= 0,01; ns tức là α> 0,05) (các chữ cái a,b,c,d, e biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê, Ducan’s test ( P< 0,01)) a b
Mối tương quan giữa môi trường và hoạt tính tổng hợp bacteriocin rất quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng của vi khuẩn Các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ và thành phần dinh dưỡng có thể tác động đến khả năng tổng hợp bacteriocin, từ đó ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn của chúng Việc hiểu rõ mối liên hệ này giúp tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để nâng cao hiệu quả sản xuất bacteriocin.
MRS TH MRS cải tiến Elliker CM
MRS MRS cải tiến Elliker CM
H oạt tí nh N ISI N ( IU /m l)
Môi trường khảo sát MRS (P1) MRS Cải tiến (P2) Elliker (P3) CM (P4)
Hình 4 Đường kính vòng kháng khuẩn của các chủng khảo sát trên các môi trường
Dựa trên kết quả khảo sát, chúng tôi quyết định chọn môi trường CM cho các nghiên cứu tiếp theo, vì đây là môi trường phù hợp nhất cho quá trình sinh tổng hợp bacteriocin Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Chan Li và cộng sự vào năm 2002 về môi trường tối ưu cho chủng ATCC 11454.
5.2 Ảnh hưởng thời gian và nhiệt độ nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp bacteriocin Để xác định được thời gian, nhiệt độ nuôi cấy thích hợp cho sự sinh tổng hợp bacteriocin, các chủng khảo sát được nuôi cấy trên môi trường lỏng CM với tỷ lệ giống 10% thời gian nuôi cấy 24h, 48h, 72h, ở 3 khoảng nhiệt độ 25 o C, 30 o C, 37 o C Kết quả được trình bày ở hình
Nghiên cứu cho thấy thời gian nuôi cấy kéo dài làm giảm hoạt tính bacteriocin Cả hai chủng HT235 và DT248 đều sản xuất bacteriocin hiệu quả nhất ở điều kiện nuôi cấy 24 giờ và 30 độ C, với hoạt tính lần lượt đạt 1269,7 IU/ml và 961,89 IU/ml, gần tương đương với chủng thương mại ATCC 11454 (1338,8 IU/ml) Mặc dù ở nhiệt độ 37 độ C có sự gia tăng khối lượng tế bào của chủng lactic, nhưng hoạt tính sinh tổng hợp bacteriocin lại yếu, gần như không có Do đó, điều kiện nuôi cấy 24 giờ và 30 độ C được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 5 Ảnh hưởng thời gian và nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt tính bacteriocin
5.3 Ảnh hưởng của pH đến sự sinh tổng hợp bacteriocin
ĐÁNH GIÁ CHUNG
Dựa vào mục tiêu và nội dung nghiên cứu, trong thời gian 2 năm nghiên cứu (từ tháng 1/2015-12/2016) chúng tôi đã thu được một số kết quả như sau:
- Đã phân lập và định danh được 4 chủng vi khuẩn lactic, trong đó có 2 chủng
Lactococcus lactis subsp lactis HT235 và DT248, cùng với hai chủng Enterococcus spp SB07 và LN23, đều có khả năng kháng lại các vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm như S aureus và B cereus.
Đã tiến hành khảo sát các yếu tố môi trường như pH, thời gian và nhiệt độ nuôi cấy cho quá trình sinh tổng hợp bacteriocin của hai chủng HT235 và DT248 Kết quả cho thấy, điều kiện nuôi cấy tối ưu là môi trường CM, thời gian 24 giờ, nhiệt độ 30°C và pH 6,8 Ngoài ra, chủng HT235 cho thấy khả năng sinh tổng hợp bacteriocin với hoạt tính cao hơn so với chủng DT248 Do đó, chủng HT235 với hoạt tính bacteriocin đạt 1338,8 IU/ml đã được chọn để thu nhận bacteriocin.
- Đã khảo sát và lựa chọn tỉ lệ tủa 7:3 (70% ethanol: 30% dịch nổi) của chủng HT235 để thu nhận bacteriocin cho hoạt tính cao nhất, đạt 1574.74 IU/ml
Kết quả phân tích điện di Tricine – SDS page cho thấy bacteriocin thu được có kích thước khoảng 3,4 kDa, tương đồng với kích thước của Nisin chuẩn.
- Đã đưa ra quy trình thu hồi sản phẩm bacteriocin thô, tuy nhiên hoạt tính bacteriocin thu được còn khá thấp, hiệu suất chưa cao
Nghiên cứu về độ bền của bacteriocin từ chủng HT235 cho thấy rằng bacteriocin này rất bền với nhiệt độ, gần như không bị phá hủy ở 70 o C và chỉ giảm gần 40% hoạt tính khi xử lý ở 121 o C trong 15 phút Bacteriocin có dải pH hoạt động rộng từ 3 đến 7, với hoạt tính còn lại khá cao Tuy nhiên, ở pH 8 và pH 9, hoạt tính gần như mất hoàn toàn Trong điều kiện xử lý kết hợp pH và nhiệt độ, ở pH từ 3-5, bacteriocin vẫn giữ được hoạt tính, với hơn 35% hoạt tính còn lại ở pH 3 khi xử lý ở 70 o C - 90 o C và trên 50% ở pH 5 Ngược lại, hoạt tính giảm mạnh ở pH 8, đặc biệt khi xử lý ở 121 o C, gần như mất hoàn toàn.
Kết quả thử nghiệm cho thấy bacteriocin từ chủng HT235 với nồng độ 800 IU/ml có khả năng ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn Gram dương gây hại trong sữa và thịt.
34 hư hỏng thực phẩm Điều này cho thấy, bacteriocin thu nhận được từ chủng HT235 có khả năng ứng dụng làm phụ gia bảo quản thực phẩm.
ĐỀ NGHỊ
Trong quá trình thực hiện đề tài, nhóm nghiên cứu đã đạt được một số kết quả quan trọng và từ đó đưa ra một số đề nghị nhằm cải thiện và phát triển hơn nữa nội dung nghiên cứu.
- Khảo sát thêm các phương pháp thu nhận bacteriocin
- Tối ưu hóa điều kiện thu nhận và tinh sạch bacteriocin
- Khảo sát thành phần và tỉ lệ phối trộn các nguyên liệu tạo sản phẩm bacteriocin
- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm bacteriocin thu nhận được
- Thử nghiệm hiệu quả của sản phẩm trên các loại thực phẩm khác.
SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
STT Tên sản phẩm Số lượng Yêu cầu khoa học dự kiến đạt được
Enterococcus spp có khả năng ứng dụng trong vi sinh thực phẩm
Trong đó chủng Lactococcus lactisHT235 có khả năng ứng dụng sinh tổng hợp bacteriocin
2 Quy trình thu nhận chế phẩm 1 quy trình
Quy trình cơ bản, có khả năng áp dụng thực tế để nghiên cứu và sản xuất
Sản phẩm đóng gói dạng bột, nồng độ bacteriocin đạt 1000IU/g
4 Sinh viên thực tập 5 sinh viên Thực tập đạt loại khá
5 Sinh viên làm luận văn tốt nghiệp 3 sinh viên Luận văn đạt loại khá
