Nghiên cứu sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định thường gặp phục vụ công tác kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng

Do đặc tính mẫu chứa vi khuẩn gây bệnh, sống trong các dạng mẫu bệnh phẩm khác nhau, thời gian, số lượng sử dụng mẫu khác nhau, vấn đề an toàn sinh học, bệnh cảnh của từng vùng, từng quố

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ Y TẾ TP.HCM

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRUNG TÂM KIỂM CHUẨN XÉT NGHIỆM TP.HCM

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP THÀNH PHỐ

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT MẪU BỆNH PHẨM GIẢ ĐỊNH THƯỜNG GẶP PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

XÉT NGHIỆM VI SINH LÂM SÀNG

TS TRẦN HỮU TÂM

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

N H N ỨU SẢN UẤT ẪU ỆNH PHẨ Ả ĐỊNH THƯỜN ẶP PHỤ VỤ N T Ể TR HẤT

3

TÓ TẮT NỘ DUN N H N ỨU

Để có một kết quả xét nghiệm vi sinh lâm sàng tin cậy, cần phải tiến hành kiểm tra chất lượng, mẫu kiểm chuẩn là vật liệu không thể thiếu trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm Vi sinh lâm sàng Do đặc tính mẫu chứa vi khuẩn gây bệnh, sống trong các dạng mẫu bệnh phẩm khác nhau, thời gian, số lượng sử dụng mẫu khác nhau, vấn đề an toàn sinh học, bệnh cảnh của từng vùng, từng quốc gia, chưa có đơn vị sản xuất,….Vì vậy, Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm TP.HCM được cấp ngân sách nghiên cứu khoa học

của thành phố để thực hiện đề tài “Nghiên cứu sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định thường gặp phục vụ công tác kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng”, đề

tài được thực hiện trong vòng 30 tháng tại phòng thí nghiệm Vi sinh đạt tiêu chuẩn An toàn Sinh học cấp II của Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm TP.HCM

Nội dung và kết quả đề tài bao gồm 5 chuyên đề từ việc khảo sát và lựa chọn được

05 dạng mẫu bệnh phẩm thường gặp ở các Phòng xét nghiệm Vi sinh là Đàm, Máu, Mủ, Nước tiểu, Phân với 10 chủng vi khuẩn đặc trưng cho những dạng mẫu này; xây dựng quy trình cụ thể với 04 giai đoạn sản xuất mẫu; nghiên cứu thành phần môi trường qua các bước sàng lọc 11 yếu tố, thí nghiệm tối ưu theo đường dốc nhất và tối ưu bề mặt RSM-CCD để đạt mức tối ưu hàm lượng vi khuẩn gây bệnh sống sót ≥ 103 trong khoảng thời gian 15 ngày ở điều kiện phòng thí nghiệm; áp dụng quy trình sản xuất ở quy mô pilot và đánh giá độ đồng nhất và ổn định; kiểm tra tác động môi trường qua quá trình vận chuyển đến các phòng xét nghiệm ở các khoảng cách địa lý khác nhau Qua kết quả nghiên cứu và áp dụng thực tế, quy trình nghiên cứu đã tạo ra được mẫu bệnh phẩm giả định hoàn toàn thích hợp cho việc sử dụng đánh giá chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng, tập huấn nâng cao tay nghề nhân viên xét nghiệm, góp phần đảm bảo chất lượng xét nghiệm Vi sinh lâm sàng

4

SUMMARY OF RESEARCH CONTENT

External quality control (EQC) material is essential especially in Clinical Microbiology quality assessment to have a reliable result Due to specifications of EQC material as vital bacteria with different type of microbiological samples, different shelf-life, different using purposes, biology safety issues, suitable with region and country epidemiology, Center for Standardization and Quality Control in Medical laboratory of

Ho Chi Minh city (CSQL of HCMC) have been approved by Department of Science and

Technology in using budget for doing research to carry-out the study “Research in manufacture of common stimulating samples using for quality assessment in clinical microbiology” lasting period of 30 months in Biosafety level II laboratory of CSQL of

HCMC

The content and result of study have 05 specific subjects included from investigation and selection of 05 types of specimen presenting frequently in microbiology laboratory such as sputum, blood, pus, urine, and feces with 10 strains of bacteria specified in those samples; making plan for detailed process of 04 stages of sample manufacturing; doing research of medium ingredients based on screening experiments of

11 factors then optimize them following the Plackett-Burman matrix, the steepest descent method, response surface methodology–central composite design (RSM-CCD) in order

to achieve maximally malignant bacteria surviving ≥ 103 during 15 days in laboratory condition; applying manufacturing process in pilot and assess homogeneity and stability

of these samples; evaluation the effect of environment on, by the route to delivery to the medical laboratories in various distances Throughout the study results and practical application, the study process makes stimulated samples quite suitable for using in quality assessment of clinical microbiological testing, in training for laboratory staffs, contribution in quality assurance Clinical microbiology

5

MỤC LỤC

TÓ TẮT NỘ DUN N H N ỨU 2

D NH Ụ HỮ V ẾT TẮT 7

D NH Ụ ẢN 8

D NH Ụ HÌNH 13

HƯƠN 1 Ở ĐẦU 15

1.1.Mục tiêu tổng quát 15

1.2.Mục tiêu cụ thể 15

1.3.Nội dung nghiên cứu 15

1.4.Đối tượng được thực hiện 16

1.5.Bảng quyết toán kinh phí 16

HƯƠN 2 TỔN QU N 19

2.1.Xét nghiệm Vi sinh lâm sàng 19

2.2.Kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng 23

2.3.Tình hình triển khai ngoại kiểm tra xét nghiệm (EQAs) vi sinh lâm sàng 24

2.4.Mẫu ngoại kiểm Vi sinh 25

2.5.Tối ưu hóa 28

2.6.Tính cấp thiết của đề tài 30

2.7.Ý nghĩa và tính mới về khoa học và thực tiễn 32

HƯƠN 3 NỘ DUN N H N ỨU 33

3.1.Vật liệu và điều kiện cơ sở vật chất để thực hiện nghiên cứu 33

3.2.Trang thiết bị và cơ sở vật chất 34

3.3.Nội dung 1: Khảo sát và lựa chọn các dạng mẫu bệnh phẩm vi sinh thường gặp 35

3.4.Nội dung 2: Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định ở quy mô phòng thí nghiệm 39

3.5.Nội dung 3: Tối ưu hóa điều kiện sản xuất, sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định ở qui mô phòng thí nghiệm, đánh giá độ đồng nhất và độ ổn định của mẫu 42

3.6.Nội dung 4: Sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định ở qui mô pilot, đánh giá độ đồng nhất và độ ổn định của mẫu 48

3.7.Nội dung 5: Đánh giá tác động của môi trường thực tế (nhiệt độ, độ ẩm, điều kiện vận chuyển) 49

6

HƯƠN 4 ẾT QUẢ V N LUẬN 51

4.1.Nội dung 1: Khảo sát bệnh phẩm và vi khuẩn gây bệnh thường gặp tại các PXN Vi sinh lâm sàng 51

4.2.Nội dung 2: Xây dựng quy trình sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định ở quy mô phòng thí nghiệm 62

4.3.Nội dung 3: Tối ưu hóa điều kiện sản xuất, sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định ở qui mô phòng thí nghiệm, đánh giá độ đồng nhất và độ ổn định của mẫu 65

4.4.Nội dung 4: Sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định quy mô pilot và đánh giá độ đồng nhất, độ ổn định của mẫu 126

4.5.Nội dung 5: đánh giá tác động của môi trường thực tế (nhiệt độ, độ ẩm, điều kiện vận chuyển) 141

HƯƠN 5 ẾT LUẬN V ẾN N HỊ 145

5.1.KẾT LUẬN 145

5.2.KIẾN NGHỊ 149

T L ỆU TH HẢO 152

PHỤ LỤ 155

7

D NH Ụ HỮ V ẾT TẮT

ATCC Americal Type Culture Collection Chủng vi khuẩn tiêu chuẩn Hoa Kỳ

EQAs External Quality Assessment schemes Chương trình ngoại kiểm tra chất lượng IQC Internal Quality Control Nội kiểm tra chất lượng

ISO International Standard Organization Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

8

D NH Ụ ẢN

Bảng 2.1 Thiết kế ma trận Plackett-Burman 11 yếu tố 28

Bảng 3.1 Tổng hợp các thành phần môi trường chuyên chở 43

Bảng 3.2 Mười một yếu tố khảo sát cho thiết kế sàng lọc yếu tố thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman 44

Bảng 3.3 Thí nghiệm thiết kế sàng lọc 11 yếu tố thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman 44

Bảng 3.4 Bố trí 20 thí nghiệm theo CCD 46

Bảng 4.1 Bảng thống kê số lượng các loại mẫu bệnh phẩm 51

Bảng 4.2 Thống kê số lượng phòng xét nghiệm thường gặp các chủng vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm 54

Bảng 4.3 Chủng vi khuẩn cho từng mẫu bệnh phẩm giả định 61

Bảng 4.4 Nội dung công việc, thời gian và các hồ sơ liên quan đến sản xuất mẫu 63

Bảng 4.5 Bảng chỉ tiêu kiểm tra vi khuẩn 64

Bảng 4.6 Các chỉ tiêu kiểm tra môi trường cơ chất bệnh phẩm 64

Bảng 4.7 Các chỉ tiêu kiểm tra mẫu thành phẩm 65

Bảng 4.8 Kết quả thí nghiệm sàng lọc theo Plackett-Burman đối với mẫu Đàm chứa Pseudomonas aeruginosa 67

Bảng 4.9 Kết quả phân tích mức ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát của mẫu Đàm chứa Pseudomonas aeruginosa 68

Bảng 4.10 Kết quả tính bước nhảy mới cho 03 yếu tố ảnh hưởng đến Pseudomonas aeruginosa 69

Bảng 4.11 Bước nhảy mới của 03 yếu tố ảnh hưởng đến Pseudomonas aeruginosa 70

Bảng 4.12 Bước nhảy mới của 03 yếu tố ảnh hưởng đến Acinetobacter baumannii 70

Bảng 4.13 Kết quả thí nghiệm sàng lọc theo Plackett-Burman đối với mẫu Máu chứa Acinetobacter baumannii 72

Bảng 4.14 Kết quả phân tích mức ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát của mẫu Máu chứa Acinetobacter baumannii 72

Bảng 4.15 Kết quả tính bước nhảy mới cho 03 yếu tố ảnh hưởng đến Acinetobacter baumannii 74

Bảng 4.16 Bước nhảy mới của 03 yếu tố ảnh hưởng đến Acinetobacter baumannii 74

9

Bảng 4.17 Bước nhảy mới của 03 yếu tố ảnh hưởng đến Staphylococcus

epidermidis 75

Bảng 4.18 Kết quả thí nghiệm sàng lọc theo Plackett-Burman đối với mẫu

Phân chứa Shigella sonnei 76

Bảng 4.19 Kết quả phân tích mức ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát của mẫu

Phân chứa Shigella sonnei 77 Bảng 4.20 Kết quả tính bước nhảy mới cho 03 yếu tố ảnh hưởng đến Shigella

sonnei 78

Bảng 4.21 Bước nhảy mới của 03 yếu tố ảnh hưởng đến Shigella sonnei 79 Bảng 4.22 Bước nhảy mới của 03 yếu tố ảnh hưởng đến Salmonella paratyphi

A 79

Bảng 4.23 Kết quả thí nghiệm sàng lọc theo Plackett-Burman đối với mẫu Mủ

chứa Staphylococcus aureus 80

Bảng 4.24 Kết quả phân tích mức ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát của mẫu

Mủ chứa Staphylococcus aureus 81

Bảng 4.25 Kết quả tính bước nhảy mới cho 03 yếu tố ảnh hưởng đến

Bảng 4.28 Kết quả thí nghiệm sàng lọc theo Plackett-Burman đối với mẫu

Nước tiểu chứa Proteus vulgaris 84

Bảng 4.29 Kết quả phân tích mức ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát của mẫu

Nước tiểu chứa Proteus vulgaris 85 Bảng 4.30 Kết quả tính bước nhảy mới cho 03 yếu tố ảnh hưởng đến Proteus

vulgaris 86

Bảng 4.31 Bước nhảy mới của 03 yếu tố ảnh hưởng đến Proteus vulgaris 87 Bảng 4.32 Bước nhảy mới của 03 yếu tố ảnh hưởng đến Enterococcus

faecalis 87

Bảng 4.33 Thiết kế thí nghiệm leo dốc của mẫu Đàm chứa P aeruginosa 87

Bảng 4.34 Phạm vi nghiên cứu của 3 yếu tố dùng trong RSM-CCD đối với

mẫu đàm chứa Pseudomonas aeruginosa 88 Bảng 4.35 Thiết kế thí nghiệm leo dốc của mẫu Máu chứa Acinetobacter

baumannii 88

Bảng 4.36 Phạm vi nghiên cứu của 3 yếu tố dùng trong RSM-CCD đối với

mẫu Máu chứa Acinetobacter baumannii 89

10

Bảng 4.37 Thiết kế thí nghiệm leo dốc của mẫu mủ chứa Staphylococcus

aureus 89

Bảng 4.38 Phạm vi nghiên cứu của 3 yếu tố dùng trong RSM-CCD đối với

mẫu mủ chứa Staphylococcus aureus 90 Bảng 4.39 Thiết kế thí nghiệm leo dốc của mẫu Phân chứa Shigella sonnei 90

Bảng 4.40 Phạm vi nghiên cứu của 3 yếu tố dùng trong RSM-CCD đối với

mẫu Phân chứa Shigella sonnei 91 Bảng 4.41 Thiết kế thí nghiệm leo dốc của mẫu Nước tiểu chứa Proteus

vulgaris 92

Bảng 4.42 Phạm vi nghiên cứu của 3 yếu tố dùng trong RSM-CCD đối với

mẫu nước tiểu chứa Proteus vulgaris 92

Bảng 4.43 Kết quả CCD của 20 thí nghiệm đối với mẫu đàm chứa

Pseudomonas aeruginosa 93

Bảng 4.44 Mật độ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong mẫu bệnh phẩm

đàm giả định ở 100 ml và 500 ml môi trường tối ưu 96Bảng 4.45 Kết quả CCD của 20 thí nghiệm đối với mẫu máu chứa

Acinetobacter baumannii 97

Bảng 4.46 Mật độ vi khuẩn Acinetobacter baumannii trong mẫu bệnh phẩm

máu giả định ở 100 ml và 500 ml môi trường tối ưu 99

Bảng 4.47 Kết quả CCD của 20 thí nghiệm đối với mẫu mủ chứa Staphylococcus

aureus 100

Bảng 4.48 Mật độ vi khuẩn Staphylococcus aureus trong mẫu bệnh phẩm mủ

giả định ở 100 ml và 500 ml môi trường tối ưu 103

Bảng 4.49 Kết quả CCD của 20 thí nghiệm đối với mẫu phân chứa Shigella

sonnei 104

Bảng 4.50 Mật độ vi khuẩn Shigella sonnei trong mẫu bệnh phẩm phân giả

định ở 100 ml và 500 ml môi trường tối ưu 106Bảng 4.51 Kết quả CCD của 20 thí nghiệm đối với mẫu nước tiểu chứa

Proteus vulgaris 107

Bảng 4.52 Mật độ vi khuẩn Proteus vulgaris trong mẫu bệnh phẩm nước tiểu

giả định ở 100 ml và 500 ml môi trường tối ưu 110

Bảng 4.53 Mật độ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong mẫu đàm giả định

để đánh giá độ đồng nhất ở quy mô phòng thí nghiệm 111

Bảng 4.54 Mật độ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong mẫu đàm giả định

trong 15 ngày bảo quản ở quy mô phòng thí nghiệm 113 Bảng 4.55 Mật độ vi khuẩn Acinetobacter baumannii trong mẫu máu giả định

để đánh giá độ đồng nhất ở quy mô phòng thí nghiệm 115

11

Bảng 4.56 Mật độ vi khuẩn Acinetobacter baumannii trong mẫu máu giả định

trong 15 ngày bảo quản ở quy mô phòng thí nghiệm 116 Bảng 4.57 Mật độ vi khuẩn Staphylococcus aureus trong mẫu mủ giả định để

đánh giá độ đồng nhất ở quy mô phòng thí nghiệm 118

Bảng 4.58 Mật độ vi khuẩn Staphylococcus aureus trong mẫu mủ giả định

trong 15 ngày bảo quản ở quy mô phòng thí nghiệm 119 Bảng 4.59 Mật độ vi khuẩn Shigella sonnei trong mẫu phân giả định để đánh

giá độ đồng nhất ở quy mô phòng thí nghiệm 120

Bảng 4.60 Mật độ vi khuẩn Shigella sonnei trong mẫu phân giả định trong 15

ngày bảo quản ở quy mô phòng thí nghiệm 122 Bảng 4.61 Mật độ vi khuẩn Proteus vulgaris trong mẫu nước tiểu giả định để

đánh giá độ đồng nhất ở quy mô phòng thí nghiệm 124

Bảng 4.62 Mật độ vi khuẩn Proteus vulgaris trong mẫu nước tiểu giả định

trong 15 ngày bảo quản ở quy mô phòng thí nghiệm 125 Bảng 4.63 Mật độ Pseudomonas aeruginosa mẫu đàm giả định để đánh giá độ

đồng nhất ở quy mô Pilot 127

Bảng 4.64 Mật độ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong mẫu đàm giả định

trong 15 ngày bảo quản ở quy mô pilot 128 Bảng 4.65 Mật độ Acinetobacter baumannii mẫu máu giả định để đánh giá độ

đồng nhất ở quy mô phòng thí nghiệm 130

Bảng 4.66 Mật độ vi khuẩn Acinetobacter baumannii trong mẫu máu giả định

trong 15 ngày bảo quản ở quy mô pilot 131 Bảng 4.67 Mật độ Staphylococcus aureus mẫu mủ giả định để đánh giá độ

đồng nhất ở quy mô phòng thí nghiệm 133

Bảng 4.68 Mật độ vi khuẩn Staphylococcus aureus trong mẫu mủ giả định

trong 15 ngày bảo quản ở quy mô pilot 134 Bảng 4.69 Mật độ Shigella sonnei mẫu phân giả định để đánh giá độ đồng

nhất ở quy mô phòng thí nghiệm 136

Bảng 4.70 Mật độ vi khuẩn Shigella sonnei trong mẫu phân giả định trong 15

ngày bảo quản ở quy mô pilot 137 Bảng 4.71 Mật độ Proteus vulgaris mẫu nước tiểu giả định để đánh giá độ

đồng nhất ở quy mô phòng thí nghiệm 139

Bảng 4.72 Mật độ vi khuẩn Proteus vulgaris trong mẫu nước tiểu giả định

trong 15 ngày bảo quản ở quy mô pilot 140

Bảng 4.73 Kết quả đánh giá chỉ tiêu màu s c của các mẫu phản hồi từ các

PXN 142Bảng 4.74 Kết quả đánh giá chỉ tiêu về tính chất mẫu từ các PXN tham gia 143

12

Bảng 4.75 Kết quả định danh vi khuẩn gây bệnh trong mẫu 144Bảng 5.1 Mô tả sơ đồ sản xuất mẫu 146Bảng 5.2 Thành phần công thức tối ưu hóa môi trường bảo quản vi khuẩn 147Bảng 5.3 Kết quả đánh giá độ đồng nhất của 5 loại mẫu bệnh phẩm giả định ở

quy mô pilot 148Bảng 5.4 Kết quả đánh giá độ đồng nhất của 5 loại mẫu bệnh phẩm giả định

trong thời gian 15 ngày ở quy mô pilot 148

13

D NH Ụ HÌNH

Hình 2.1 Tổng quan kỹ thuật chung thực hiện tại phòng xét nghiệm vi sinh 23

Hình 3.1 Trang thiết bị thực hiện nghiên cứu đề tài tại Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm TP.HCM 35

Hình 3.2 Mẫu phiếu khảo sát 38

Hình 4.1 Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ phần trăm từng loại mẫu bệnh phẩm 53

Hình 4.2 Biểu đồ chủng vi khuẩn hiện diện trong mẫu bệnh phẩm đàm 56

Hình 4.3 Biểu đồ chủng vi khuẩn hiện diện trong mẫu bệnh phẩm máu 57

Hình 4.4 Biểu đồ chủng vi khuẩn hiện diện trong mẫu bệnh phẩm mủ 58

Hình 4.5 Biểu đồ chủng vi khuẩn hiện diện trong mẫu bệnh phẩm phân 59

Hình 4.6 Biểu đồ chủng vi khuẩn hiện diện trong mẫu bệnh phẩm nước tiểu 60

Hình 4.7 Quy trình tổng quát sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định 62

Hình 4.8 Khuẩn lạc Pseudomonas aeruginosa trên môi trường Cetrimide 67

Hình 4.9 Môi trường bảo quản mẫu bệnh phẩm máu giả định chứa A baumannii và B cepacia trong thí nghiệm sàng lọc yếu tố 71

Hình 4.10 Khuẩn lạc Acinetobacter baumannii trên môi trường MacConkey 71

Hình 4.11 Khuẩn lạc Shigella sonnei trên môi trường Urea Agar 76

Hình 4.12 Khuẩn lạc Staphylococcus aureus trên môi trường MSA 80

Hình 4.13 Khuẩn lạc Proteus vulgaris trên môi trường HE 84

Hình 4.14 Mặt đáp ứng nồng độ Pseudomonas aeruginosa theo tỷ lệ Sodium thioglycolate, Sodium glycerolphosphate và K2HPO4 95

Hình 4.15 Mặt đáp ứng nồng độ Acinetobacter baumannii theo tỷ lệ Sodium glycerolphosphate, Glycerol và pH 98

Hình 4.16 Mặt đáp ứng nồng độ Staphylococcus aureus theo tỷ lệ Glycerol, pH và CaCl2.2H2O 102

Hình 4.17 Mặt đáp ứng nồng độ Shigella sonnei theo tỷ lệ NaCl, Cao nấm men và Sodium thioglycolate 105

Hình 4.18 Mặt đáp ứng nồng độ Proteus vulgaris theo tỷ lệ CaCl2.2H2O, Sodium glycerophosphate và pH 109

Hình 4.19 Mẫu bệnh phẩm đàm giả định chứa vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa sau khi phân phối vào lọ ở quy mô phòng thí nghiệm 112

Hình 4.20 Biểu đồ Pseudomonas aeruginosa trong mẫu bệnh phẩm đàm giả định trong thời gian bảo quản 15 ngày 114

14

Hình 4.21 Mẫu bệnh phẩm máu giả định chứa vi khuẩn Acinetobacter

baumannii sau khi phân phối vào lọ ở quy mô phòng thí nghiệm 115

Hình 4.22 Acinetobacter baumannii trong mẫu bệnh phẩm đàm giả định trong

thời gian bảo quản 15 ngày 117

Hình 4.23 Biểu đồ mật độ vi khuẩn Staphylococcus aureus trong mẫu bệnh

phẩm mủ giả định trong thời gian bảo quản 15 ngày 119

Hình 4.24 Mẫu bệnh phẩm phân giả định chứa vi khuẩn Shigella sonnei sau

khi phân phối vào lọ ở quy mô phòng thí nghiệm 121

Hình 4.25 Mật độ Shigella sonnei trong mẫu phân giả định trong 15 ngày bảo

quản ở quy mô phòng thí nghiệm 123 Hình 4.26 Mẫu bệnh phẩm nước tiểu giả định chứa vi khuẩn Proteus vulgaris

sau khi phân phối vào lọ ở quy mô phòng thí nghiệm 124

Hình 4.27 Mật độ vi khuẩn Proteus vulgaris trong mẫu nước tiểu giả định

trong 15 ngày bảo quản ở quy mô phòng thí nghiệm 126 Hình 4.28 Mẫu bệnh phẩm đàm giả định chứa vi khuẩn Pseudomonas

aeruginosa sau khi phân phối vào lọ ở quy mô pilot 127

Hình 4.29 Mật độ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong mẫu đàm giả định

trong 15 ngày bảo quản ở quy mô pilot 129

Hình 4.30 Mẫu bệnh phẩm máu giả định chứa vi khuẩn gây bệnh

Acinetobacter baumannii sản xuất ở quy mô pilot 130

Hình 4.31 Mẫu bệnh phẩm máu giả định chứa vi khuẩn Acinetobacter

baumannii sau khi phân phối vào lọ ở quy mô pilot 131

Hình 4.32 Mật độ vi khuẩn Acinetobacter baumannii trong mẫu máu giả định

trong 15 ngày bảo quản ở quy mô pilot 132 Hình 4.33 Mẫu bệnh phẩm mủ giả định chứa vi khuẩn Staphylococcus aureus

sau khi phân phối vào lọ ở quy mô pilot 133

Hình 4.34 Mật độ vi khuẩn Staphylococcus aureus trong mẫu mủ giả định

trong 15 ngày bảo quản ở quy mô pilot 135 Hình 4.35 Mẫu bệnh phẩm phân giả định chứa vi khuẩn Shigella sonnei sau

khi phân phối vào lọ ở quy mô pilot 136

Hình 4.36 Mật độ vi khuẩn Shigella sonnei trong mẫu phân giả định trong 15

ngày bảo quản ở quy mô pilot 138 Hình 4.37 Mẫu bệnh phẩm nước tiểu giả định chứa vi khuẩn Proteus vulgaris

sau khi phân phối vào lọ ở quy mô pilot 139

Hình 4.38 Mật độ vi khuẩn Proteus vulgaris trong mẫu nước tiểu giả định

trong 15 ngày bảo quản ở quy mô pilot 141

15

HƯƠN 1 Ở ĐẦU

1

Đề tài: Nghiên cứu sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định thường gặp phục vụ công tác

kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng

Chủ nhiệm đề tài: TS.DS.Trần Hữu Tâm

Cơ quan chủ trì: Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm Thành phố

Thời gian đăng ký trong hợp đồng: 10/2012 – 10/2014, được Sở Khoa học Công nghệ gia

hạn đến tháng 5/2015

Tổng kinh phí được duyệt: 545.000.000 đồng

Kinh phí cấp giai đoạn 1: 220.000.000 đồng (Theo thông báo số: 124/TB-SKHCN ngày

1.2 ục tiêu cụ thể

 Tạo ra quy trình công nghệ, được Bộ Y tế và Sở Y tế áp dụng để sản xuất mẫu dùng trong kiểm tra chất lượng Vi sinh lâm sàng nhằm nâng cao chất lượng và chuẩn hóa xét nghiệm Vi sinh tại các đơn vị y tế

 Tạo sản phẩm là mẫu bệnh phẩm giả định (sử dụng cho mục đích kiểm tra chất lượng)

có đặc tính tương đồng với mẫu bệnh phẩm thật ở một số tiêu chí có thể ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm (VD: màu s c, thể chất, loại vi khuẩn, nồng độ vi khuẩn,…)

1.3 Nội dung nghiên cứu

Đề tài được thực hiện với những nội dung sau:

1.4 Đối tƣợng đƣợc thực hiện

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là 05 dạng mẫu bệnh phẩm giả định chứa vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn thường trú (tạp nhiễm): mẫu Đàm, mẫu Máu, mẫu Mủ, mẫu Phân, mẫu Nước tiểu

Chủng vi khuẩn bổ sung vào các mẫu bệnh phẩm được xác định dựa trên kết quả khảo sát từ các phòng xét nghiệm

1.5 ảng quyết toán kinh phí

STT

Nội dung

Đơn vị tính

Khối lƣợng Đơn giá Thành tiền

1.1 Xây dựng đề cương chi tiết đề cương 1 2.000 2.000

Phân, Máu, Mủ, Nước tiểu giả

định ở quy mô phòng thí nghiệm

chuyên

17

STT

Nội dung

Đơn vị tính

Khối lƣợng Đơn giá Thành tiền

1.4

Tối ưu hóa điều kiện sản xuất :

sản xuất mẫu Đàm, Phân, Máu,

Mủ, Nước tiểu giả định ở qui mô

Phân, Máu, Mủ, Nước tiểu giả

định ở qui mô pilot, đánh giá độ

Đánh giá tác động môi trường

thực tế đối với mẫu bệnh phẩm

Đàm, Phân, Máu, Mủ, Nước tiểu

giả định khi tiến hành gửi mẫu

đến PXN tham gia ngoại kiểm

18

STT

Nội dung

Đơn vị tính

Khối lƣợng Đơn giá Thành tiền

2 Chi phí đánh giá, kiểm tra nội

bộ, nghiệm thu các cấp

2.2 Chi nghiệm thu trung gian

2.4 Chi phí nghiệm thu ở cấp quản

19

HƯƠN 2 TỔN QU N

2

2.1 ét nghiệm Vi sinh lâm sàng

Xét nghiệm Vi sinh lâm sàng là một trong các lĩnh vực xét nghiệm cơ bản và trọng yếu trong các xét nghiệm cận lâm sàng, là căn cứ trong việc đưa ra quyết định về phương hướng điều trị lâm sàng, chỉ định kháng sinh, phát hiện và kiểm soát dịch bệnh trong cộng đồng, vì vậy đòi hỏi xét nghiệm Vi sinh tại các bệnh viện, phòng xét nghiệm phải tin cậy, chính xác Những yếu tố tác động quyết định kết quả xét nghiệm bao gồm nhân

sự, điều kiện môi trường làm việc, kỹ thuật xét nghiệm, phương pháp xét nghiệm, trang thiết bị, do đó, cần phải thực hiện kiểm soát, kiểm tra chất lượng xét nghiệm nhằm đảm bảo được sự tin cậy của các kết quả, từ đó giúp cho công tác điều trị, dự phòng, được tốt, góp phần chăm sóc và bảo vệ sức khỏe người bệnh [7]

Các dạng bệnh phẩm thường gặp trong xét nghiệm Vi sinh lâm sàng mà các phòng xét nghiệm thường tiếp nhận bao gồm [4],[12],[18],[30],[34],[35]:

 Bệnh phẩm đàm

Xét nghiệm đàm rất quan trọng để chẩn đoán các bệnh đường hô hấp, thông dụng nhất là dùng để kiểm tra trực khuẩn Koch, xác định bệnh lao phổi, trong trường hợp này xét nghiệm đàm trở thành một yếu tố quyết định có giá trị hơn cả lâm sàng và X-quang Đối với các bệnh của bộ phận lân cận như gan, tim, áp xe gan có lỗ rò sang phổi, viêm màng phổi,… xét nghiệm đàm cũng cho thêm các yếu tố chẩn đoán bệnh chính xác hơn

Bệnh phẩm đàm thường có màu tr ng, vàng, hoặc hơi xanh, không có mùi hay có mùi đặc trưng, chứa các vi khuẩn thường gặp như:

Heamophilus influenzae;

Streptococcus pneumoniae;

Moraxella catarrhalis;

Staphylococcus aureus;

21

Bình thường, phân hơi mềm và có dạng như hình ống, có màu tuỳ thuộc bệnh và vi khuẩn gây bệnh, một số vi khuẩn của bệnh phẩm phân:

Salmonella sp., Shigella sp.;

Các Escherichia coli gây bệnh;

Staphylococcus aureus (có enterotoxin);

Vibrio cholerae và các Vibrio khác;

Campylobacter jejuni và các Campylobacter sp khác;

Yersinia enterocolitica và các Yersinia khác;

Clostridium difficile (có toxin);

Các vi khuẩn difficile trong phân Plesiomonas sp., Aeromonas sp

 Bệnh phẩm mủ

Mủ là chất ngoại tiết được tống ra trên hay trong mô trong một quá trình bệnh lý Bệnh phẩm mủ thường có màu tr ng đục ngả xanh hay vàng đỏ tuỳ thuộc bệnh lý và thường có khác vi khuẩn như:

Enterobacteriaceae Pseudomonas Streptococci (các loài khác) Clostridium perfringens Bacteroides

Staphylococci coagulase (-)

 Bệnh phẩm nước tiểu

Xét nghiệm nước tiểu giúp cho chẩn đoán một cách tương đối chính xác các bệnh

về gan, thận, tuyến nội tiết, chuyển hóa các chất trong cơ thể, thai nghén, sự bài tiết các chất thuốc đưa vào cơ thể, nhiễm khuẩn và ký sinh trùng

Nội kiểm tra chất lượng (IQC) do phòng xét nghiệm tự làm thường quy theo một quy trình khoa học xác định, mang tính chủ quan nhằm mục đích [5]:

 Phát hiện sai số, xác định loại sai số và tính sai số toàn bộ;

24

 Tìm nguyên nhân gây ra sai số và đề xuất biện pháp kh c phục;

 Đánh giá độ tin cậy của kết quả xét nghiệm, từ đó quyết định trả kết quả xét nghiệm hay làm lại xét nghiệm đó;

 Đánh giá thiết bị, phương pháp, hóa chất xét nghiệm;

 Đánh giá tay nghề của nhân sự thực hiện xét nghiệm

Ngoại kiểm tra chất lượng (EQA) mang tính khách quan, là công cụ kiểm tra chất lượng song song với nội kiểm tra Chương trình ngoại kiểm tra do một đơn vị bên ngoài

tổ chức để các phòng xét nghiệm đăng ký tham gia thực hiện, nhằm mục đích [6], [35]:

 So sánh chất lượng xét nghiệm của các phòng xét nghiệm khác nhau của một thành phố, một khu vực, một nước (quốc gia), nhiều nước (quốc tế);

 Tìm nguyên nhân gây sai số và đề xuất biện pháp kh c phục;

 Làm cơ sở khoa học cho việc công nhận đạt chất lượng quy định và chuẩn hóa các phòng xét nghiệm

2.3 Tình hình triển khai ngoại kiểm tra xét nghiệm (EQ s) vi sinh lâm sàng

2.3.1 Trên thế giới

Chương trình ngoại kiểm tra vi sinh lâm sàng được thực hiện tại hầu hết các nước trên thế giới với nhiều mức độ khác nhau từ sơ bộ cho đến rất chuyên biệt Tại châu Phi, các bệnh truyền nhiễm tạo thành một vấn đề y tế công cộng rất quan trọng và sự bùng phát đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe [36] Các bệnh này ảnh hưởng rất lớn đến nền kinh tế và xã hội và cần được nh m mục tiêu thông qua kiểm soát dịch bệnh tích cực, phòng ngừa và các hoạt động giám sát [20]

Do đó vào năm 2002, 36 phòng xét nghiệm thuộc 29 quốc gia châu Phi tham gia vào chương trình ngoại kiểm vi sinh do WHO triển khai nhằm đánh giá khả năng chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh có nguy cơ tiềm ẩn trong các bệnh viêm não, tiêu chảy và dịch bệnh Ngoài ra, 43 quốc gia và Tiểu vương quốc thuộc khu vực Trung Đông cũng thực hiện ngoại kiểm tra vi sinh với mức độ phức tạp bằng cách thêm vào đánh giá chẩn đoán bệnh sốt rét và lao Tháng 10 năm 2007, hội thảo tại Manila (do WHO chủ trì), gồm 17

25

nước khu vực châu Á về Đảm bảo chất lượng xét nghiệm y khoa kết luận cần phải mở

rộng EQAs Vi sinh lâm sàng Thái Lan là quốc gia trong khu vực lân cận Việt Nam, có triển khai ngoại kiểm tra tương đối đầy đủ các lĩnh vực xét nghiệm, riêng lĩnh vực Vi

sinh chỉ ở mức phết nhuộm lame xác định vi khuẩn Gram (+/-) và AFB

Tại Vương quốc Anh, chương trình ngoại kiểm tra vi sinh lâm sàng chủ yếu xác định vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy, phân lập và định danh vi sinh vật trong mẫu bệnh phẩm giả định (đàm, phân, dịch họng và vết thương), xác định độ nhạy kháng sinh, huyết thanh học và xác định nồng độ kháng thể trong huyết thanh [32]

2.3.2 Tại Việt Nam

Chương trình ngoại kiểm tra là một công cụ rất hữu ích trong so sánh liên phòng xét nghiệm, cũng như nâng cao chất lượng xét nghiệm Đối với lĩnh vực ngoại kiểm tra xét nghiệm vi sinh lâm sàng, phòng xét nghiệm thực hiện ngoại kiểm tra do Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm TP.HCM triển khai năm 2007 chiếm tỷ lệ 2,5 % và năm 2009 là 8,61

%, tỷ lệ này còn khá thấp so với số lượng các cơ sở có xét nghiệm vi sinh [10] Đến năm

2011, số lượng phòng xét nghiệm tham gia ngoại kiểm vi sinh lâm sàng với Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm Tp.HCM tăng lên là 46 PXN và năm 2013 là 49 PXN, năm 2014

là 62 đơn vị, 2015 là 70 đơn vị [11]

Điều này cho thấy, ý nghĩa của chương trình ngoại kiểm tra vi sinh lâm sàng đã tác động tốt đến PXN Tuy nhiên, trong quá trình triển khai chương trình, còn tồn tại một số vấn đề như sự ổn định và đồng nhất về mẫu, tác động của môi trường trong quá trình vận chuyển mẫu đến phòng xét nghiệm cần phải được nghiên cứu thêm nữa Chương trình ngoại kiểm vi sinh của Vương quốc Anh (NEQAS) cũng gặp phải vấn đề tương tự [30]

Do đó, cần có những nghiên cứu về mẫu bệnh phẩm giả định phục vụ cho chương trình ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh để góp phần nâng cao kỹ thuật cũng như khả năng chẩn đoán của phòng xét nghiệm

2.4 ẫu ngoại kiểm Vi sinh

Mẫu ngoại kiểm vi sinh là các loại mẫu sử dụng trong các chương trình ngoại kiểm (EQAs) Vi sinh lâm sàng mà phòng xét nghiệm nhận được khi tham gia, có thể là mẫu

26

bệnh phẩm lâm sàng thật, các chủng vi sinh vật dưới dạng đông khô hoặc là các bệnh phẩm giả định đã được chuẩn bị đặc biệt mô phỏng bệnh phẩm lâm sàng Tùy đặc điểm dịch tễ của từng quốc gia mà việc chuẩn bị mẫu ngoại kiểm vi sinh bằng phương pháp đông khô hoặc mẫu bệnh phẩm giả định hướng đến kiểm tra và đánh giá khả năng của phòng xét nghiệm ở điều kiện địa phương [35]

Mẫu bệnh phẩm thật

Ưu điểm :

 Giống hoàn toàn mẫu phòng xét nghiệm nhận và thao tác hàng ngày

 Sát với thực tế xét nghiệm, bệnh cảnh lâm sàng

 Không đa dạng được các bệnh cảnh hoặc không thể thiết kế theo mục tiêu

để phòng xét nghiệm diễn tập, chuẩn bị

 Chất lượng mẫu không kiểm soát được

Chính vì nhược điểm trên, các nước không sử dụng mẫu bệnh phẩm thật cho ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm Vi sinh lâm sàng

Mẫu đông khô

Ưu điểm :

 Thời gian bảo quản lâu

 Thuận tiện trong vận chuyển xa, dài ngày

 Kiểm soát được số lượng và chủng loại vi khuẩn trong mẫu

 Có đặc tính tương tự mẫu thật nên có thể thay thế mẫu thật trong ngoại kiểm vi sinh, ưu điểm nổi bật: tương tự mẫu phòng xét nghiệm nhận hàng ngày, bảo quản lâu hơn mẫu thật, chất lượng mẫu được kiểm soát,…

 Cung cấp được số lượng lớn cho ngoại kiểm vi sinh, chất lượng ổn định

 Được thiết kế chuyên biệt tùy thuộc: mục tiêu đánh giá - kiểm tra, nhu cầu diễn tập, các tình huống bệnh cảnh thực tế

Nhược điểm:

 Mẫu chứa vi khuẩn sống, khả năng chết cao trong quá trình vận chuyển

 Thời gian bảo quản mẫu ng n ngày so với mẫu đông khô

 Không có công ty thương mại cung cấp

Mẫu bệnh phẩm đàm giả định đã từng được nghiên cứu và triển khai trong việc kiểm tra đánh giá phòng xét nghiệm vi khuẩn lao tại Nam Phi năm 2002, từ đó mẫu bệnh phẩm giả định được lựa chọn để nghiên cứu sản xuất và triển khai cho các chương trình kiểm tra chất lượng vi sinh lâm sàng, do các ưu điểm như: kiểm soát được số lượng và chủng loại vi khuẩn trong mẫu, có thể thay thế mẫu thật với những ưu điểm như: thời gian bảo quản lâu hơn mẫu thật, chất lượng mẫu có thể kiểm soát được, có thể chủ động

về nguồn mẫu cho chương trình ngoại kiểm vi sinh, hướng đến đánh giá từng mục tiêu theo khuyến cáo của các chuyên gia trong ngành và yêu cầu xã hội đề ra Tuy nhiên, cho

dù là dạng mẫu nào được dùng để sử dụng trong chương trình ngoại kiểm tra đánh giá chất lượng xét nghiệm phải đạt được điều kiện tiên quyết là giống nhau (đồng nhất) và ổn định [35]

Thí nghiệm Plackett-Burman là một phương pháp thực hiện hiệu quả, cho phép nghiên cứu sự tương tác và đồng thời tiên đoán được giá trị tối ưu của các yếu tố theo Plackett-Burman, xác định được các biến cần kiểm soát nhất, duy trì sự lặp lại của thí nghiệm, giới hạn số lượng thí nghiệm Ngoài ra nó còn cho kết quả đáng tin cậy, tiết kiệm chi phí và thời gian [28]

ảng 2.1 Thiết kế ma trận Plackett- urman 11 yếu tố

(-) mã hóa mức dưới của biến

(+) mã hóa mức trên của biến

R1 thí nghiệm 1

X1 biến 1

29

Dòng đầu tiên và cột đầu tiên được cho bởi Plackett RL, Burman JP Các dòng tiếp theo thành lập bằng cách lấy dòng trước liền kề từ vị trí 1 đến vị trí thứ n-1 để thành lập

vị trí thứ 2 đến n của dòng tiếp theo

Công thức tính hệ số ảnh hưởng của yếu tố thứ i:

∑

xcp: là giá trị trung bình của khoảng biến đổi và là khoảng thay đổi

nh hưởng của các nhân tố tới các hàm mục tiêu được mô tả theo mô hình bậc 2 với phương trình như sau:

j i ij n

i i ii n

i i

b b

Y

2

1 1

0

Trong đó:

Y: giá trị chỉ tiêu theo dõi

bo: hệ số hồi quy bậc 0

xi: yếu tố được mã hóa ảnh hưởng đến Y

bi: hệ số hồi quy bậc 1 mô tả ảnh hưởng của nhân tố xi với Y

bij: hệ số hồi quy tương tác mô tả ảnh hưởng đồng thời xi và xj với Y

bii: hệ số hồi quy bậc 2 mô tả ảnh hưởng của nhân tố xi với Y

30

Phương án cấu trúc có tâm CCD: là một trường hợp đặc biệt trong nhóm các mô hình quy hoạch thực nghiệm, được cấu thành từ 3 thành phần [24]:

- Nhân: là một phương án tuyến tính với 2k đỉnh của một khối hình đều trong không

gian k chiều Nếu k> 5, có thể giảm bớt số thí nghiệm bằng cách sử dụng phương

án yếu tố từng phần 2 k-1

- 2k điểm sao (*) nằm trên các trục tọa độ của không gian yếu tố Các tọa độ của các điểm sao là (±α, 0, 0,…, 0), (0, ±α, 0,…, 0),…, (0, 0,…, 0, ±α) α là khoảng cách

từ tâm phương án đến điểm sao gọi là cánh tay đòn Các điểm sao là cần thiết để

mở rộng không gian nghiên cứu khảo sát tác động của một yếu tố đơn để có thể tìm được các ước lượng của hệ số bii trong phương trình hồi quy bậc 2

- n0 thí nghiệm ở tâm phương án để tìm phương sai tái hiện

Cánh tay đòn α và số thí nghiệm n0 ở tâm được chọn phụ thuộc vào tiêu chuẩn tối

ưu, thường là phương án trực giao hay phương án quay

2.6 Tính cấp thiết của đề tài

Tại thông báo số 99/TB-VPCP của Văn phòng Chính phủ ngày 26/3/2015, Thủ tướng kết luận một trong những nhiệm vụ trọng tâm s p tới của ngành y tế là nâng cao chất lượng xét nghiệm, tiến đến liên thông kết quả Muốn đạt được điều này, cần phải thực hiện các biện pháp đảm bảo chất lượng xét nghiệm [13] Vấn đề đảm bảo và kiểm tra chất lượng xét nghiệm y khoa là một trong những vấn đề cần phải thực hiện, được Bộ

Y tế, Sở Y tế quy định thành những yêu cầu b t buộc đối với các phòng xét nghiệm, trong những vấn đề về đảm bảo chất lượng xét nghiệm thì ngoại kiểm tra chất lượng là công cụ đánh giá quan trọng bên cạnh nội kiểm tra và đã được quy định, hướng dẫn chi tiết trong thông tư 01/2013/TT-BYT do Bộ Y tế ban hành [2]

Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm TP.HCM là cơ quan được giao chức năng thực hiện triển khai ngoại kiểm tra chất lượng để giúp các phòng xét nghiệm y khoa nâng cao chất lượng và tiến đến đạt các tiêu chuẩn quốc gia và quốc tế Trung tâm lần đầu tiên đã triển khai chương trình ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh cho các phòng xét nghiệm y khoa từ năm 2008 – 2009, qua ghi nhận đã có những tác động tích cực đến kết quả xét nghiệm vi sinh thực hiện trên bệnh nhân [8] Tuy nhiên, trong quá trình chuẩn bị

31

mẫu còn một số vấn đề chưa giải quyết được như: sự đồng nhất của mẫu, thời gian bảo quản, điều kiện bảo quản và thay thế các yếu tố môi trường bằng nguồn nguyên liệu giá

rẻ, vì vậy cần tiến hành nghiên cứu sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định để làm rõ các luận

cứ khoa học trước khi sản xuất hàng loạt và áp dụng trong đánh giá chất lượng xét nghiệm vi sinh tại các phòng xét nghiệm theo thường quy hoặc kiểm tra đột xuất

Xét nghiệm vi sinh lâm sàng là một trong các lĩnh vực xét nghiệm quan trọng trong xét nghiệm y khoa, kết quả xét nghiệm vi sinh là căn cứ để đưa ra các quyết định về phương hướng điều trị, chỉ định kháng sinh, phát hiện và kiểm soát dịch bệnh trong cộng đồng, vì vậy đòi hỏi kết quả xét nghiệm vi sinh tại các bệnh viện, phòng xét nghiệm phải tin cậy Một trong những công cụ để đánh giá độ tin cậy của xét nghiệm là ngoại kiểm tra chất lượng, cần phải có các mẫu kiểm chuẩn [9]

Do đó, việc nghiên cứu sản xuất các mẫu bệnh phẩm giả định thường gặp phục vụ cho công tác kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng là vô cùng cấp thiết, cụ thể chế tạo mẫu bệnh phẩm giả định dùng trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng nhằm:

 Kiểm tra năng lực và giúp nâng cao chất lượng, khả năng xét nghiệm của phòng xét nghiệm

 Nâng cao chất lượng phòng xét nghiệm, giúp kết quả xét nghiệm vi sinh lâm sàng tin cậy

 Tin tưởng và thừa nhận kết quả lẫn nhau giữa các phòng xét nghiệm, giúp tiết kiệm chi phí và thời gian cho người bệnh

 Giúp phòng xét nghiệm có cơ hội tiếp cận, diễn tập với nhiều tình huống, nhiều chủng loại vi khuẩn có nguy cơ tiềm ẩn các dịch bệnh, luôn trong tình trạng sẵn sàng ứng phó với các dịch bệnh nguy hiểm cho cộng đồng

 Cung cấp dữ liệu tham mưu cho cơ quan quản lý trong việc xây dựng các tiêu chuẩn, quy chuẩn chất lượng xét nghiệm

32

2.7 Ý nghĩa và tính mới về khoa học và thực tiễn

Quy trình và công nghệ sản xuất mẫu ngoại kiểm được các công ty cung cấp mẫu ngoại kiểm trên thế giới bảo mật rất chặt chẽ vì đây là vấn đề thương mại của các công

ty, tại Việt Nam chưa có bất kỳ hướng dẫn hoặc quy trình nào về sản xuất và tiêu chuẩn mẫu ngoại kiểm sử dụng trong đánh giá độ thành thạo của phòng xét nghiệm Do đó việc nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất mẫu ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng có tính mới và ý nghĩa về khoa học và thực tiễn như sau:

 Tạo ra quy trình kỹ thuật chế tạo mẫu bệnh phẩm giả định phục vụ công tác kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng, cùng với tiêu chuẩn kiểm nghiệm, giám sát toàn bộ các công đoạn của việc chế tạo mẫu, đảm bảo độ đồng nhất và độ

ổn định của mẫu

 Mẫu bệnh phẩm giả định lần đầu tiên có quy mô nghiên cứu sản xuất có hệ thống

ở Việt Nam, giúp chủ động các mục tiêu và kế hoạch triển khai kiểm tra chất lượng xét nghiệm Vi sinh lâm sàng

 Thông qua công tác kiểm tra chất lượng, kết quả xét nghiệm vi sinh ngày càng tin cậy, nâng cao chất lượng, tạo sự thống nhất trong xét nghiệm, hướng đến sự tin tưởng và thừa nhận kết quả lẫn nhau giữa các bệnh viện, phòng xét nghiệm ở Việt Nam nói chung, trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh nói riêng

 Bên cạnh việc phục vụ công tác đánh giá - kiểm tra, mẫu bệnh phẩm giả định còn giúp các phòng xét nghiệm có thể diễn tập, chuẩn bị đối phó với các tình huống dịch bệnh có thể xảy ra

Chủng vi khuẩn Streptococcus mitis được chọn để nghiên cứu trong phạm vi của đề tài đại diện cho Viridans streptococci

Hoá chất và môi trường nuôi cấy

Môi trường Blood Agar (BA), Brain Heart Infusion (BHI), Mac Conkey Agar (MC), Tryptic Soy Agar (TSA), Hektoen Enteric Agar (HE), Muller Hinton Agar (MHA), Urea Agar, Manitol Salt Agar (MSA), Cetrimide Agar, Uriselect 4 Agar, Tryptic Soy Broth (TSB), dung dịch McFarland chuẩn, dung dịch NaCl 0,85%

2 Brain Heart Infusion

(BHI)

34

4 Tryptic Soy Agar (TSA) Tây Ban Nha –

11 Kit định danh API Strep BioMerieux - Pháp ISO 13485:2003

12 Kit định danh API 20E BioMerieux - Pháp ISO 13485:2003

13 Kit định danh API Staph BioMerieux - Pháp ISO 13485:2003

3.2 Trang thiết bị và cơ sở vật chất

2 Tủ an toàn sinh học cấp II SC2 – 4A1 Esco – Singapore

4 Máy phân phối mẫu tự động Dose It P910 Integra – Thụy Sĩ

35

Hình 3.1 Trang thiết bị thực hiện nghiên cứu đề tài tại Trung tâm iểm chuẩn ét

nghiệm TP.HCM 3.3 Nội dung 1: hảo sát và lựa chọn các dạng mẫu bệnh phẩm vi sinh thường gặp

Khảo sát các phòng xét nghiệm Vi sinh lâm sàng trên địa bàn TP.HCM và các tỉnh lân cận, các phòng xét nghiệm này thuộc bệnh viện công lập, bệnh viện ngoài công lập hoặc phòng xét nghiệm tư nhân, có thực hiện định danh vi khuẩn, kháng sinh đồ, phết nhuộm Gram và AFB

36

Thiết kế mẫu phiếu khảo sát (Hình 3.2) và gửi đến phòng xét nghiệm Trong đó, đối với chủng vi khuẩn thường gặp [30], phòng xét nghiệm sẽ liệt kê chủng vi khuẩn hiện

diện trong loại bệnh phẩm với các chủng sau: Staphylococcus spp., Enterococcus spp.,

Streptococcus spp., Vibrio spp., Campylobacter spp., Neisseria spp., Pseudomonas spp., Burkholderia spp., Stenotrophomonas spp., Acinetobacter spp., Haemophilus spp và

nhóm vi khuẩn khác Riêng họ Enterobacteriaceae, nhóm nghiên cứu phân loại để khảo sát gồm các chủng Escherichia spp., Salmonella spp., Shigella spp., Enterobacter spp.,

Edwardsiella spp., Klebsiella spp., Proteus spp., Providencia spp., Citrobacter spp., Serratia spp và các chủng còn lại

Phòng xét nghiệm sẽ điền thông tin vào mẫu phiếu khảo sát và gửi lại cho nhóm nghiên cứu

37

PHIẾU KHẢO SÁT MẪU BỆNH PHẨM VI SINH Tên đơn vị :

Bảng 1 Phân loại bệnh phẩm STT Loại Bệnh phẩm Tần suất thực hiện XN

39

3.4 Nội dung 2: Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định

ở quy mô phòng thí nghiệm

3.4.1 Xây dựng sơ đồ tổng quát quá trình sản xuất và các bước thực hiện

Căn cứ theo các hướng dẫn của ISO Guide 34:2000 về yêu cầu cần thiết của nhà sản xuất mẫu chuẩn

3.4.2 Xây dựng nội dung kiểm tra và tiêu chí kiểm tra ở các công đoạn

Kiểm tra nguyên vật liệu đầu vào: kiểm tra theo tiêu chuẩn chất lượng của nhà sản xuất

Kiểm tra đặc tính vi khuẩn: kiểm tra tính chất của vi khuẩn theo qui định

Kiểm tra môi trường nuôi cấy: xây dựng tiêu chí kiểm tra phù hợp với từng loại môi trường

Kiểm tra quy trình sản xuất: xác định công đoạn và nội dung kiểm tra

Kiểm tra thành phẩm: xây dựng tiêu chuẩn cơ sở bao gồm các tiêu chí chất lượng và phương pháp thử theo hướng dẫn của Dược điển Việt Nam III, WHO và Bergey's Manual

of Systematic Bacteriology [1],[16],[35]

3.4.3 Lấy mẫu ngẫu nhiên để kiểm tra trong lô sản xuất

Áp dụng công thức lấy mẫu n = 0,4√ (tối thiểu số lượng mẫu cần lấy là n ≥ 10) để xác định số lượng mẫu cần lấy [1] Phương pháp lấy ngẫu nhiên được thực hiện bằng cách đánh số thứ tự các lọ trong lô từ nhỏ đến lớn (theo hàng dọc hoặc hàng ngang), sử dụng phần mềm Microsoft excel để lấy mẫu ngẫu nhiên

3.4.4 Kiểm tra độ đồng nhất

Kiểm tra độ đồng nhất được thực hiện ở giai đoạn sau khi phân phối vào lọ

Chỉ tiêu kiểm tra: mật độ vi sinh vật gây bệnh

Sử dụng phép so sánh hai phương sai để đánh giá độ đồng nhất của 2 lô mẫu: chuẩn

F – F-test Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel

Giả thiết thống kê:

Tính thống kê tthực nghiệm:

̅ ̅̅̅

√Với:

√( ) ( )

( ) ( )

̅ : nồng độ trung bình của mẫu sau thời gian lưu trữ (lô 1)

̅̅̅: nồng độ trung bình của mẫu sau thời gian lưu trữ (lô 2)

n1: cỡ mẫu của lô 1

n2: cỡ mẫu của lô 2

phương sai của lô 1

phương sai của lô 2

tlý thuyết: tra bảng phân phối t được giá trị có (n1+n2-2) bậc tự do, mức ý nghĩa α=0,05