Nghiên cứu quy trình tinh sạch exopolysaccharide từ môi trường nuôi cấy ophiocordyceps sinensis bổ sung dầu ô liu và khảo sát hoạt tính sinh học của chúng

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

Phương Pháp

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy lỏng tĩnh trong môi trường bổ sung dầu ô liu

Hoạt hóa giống là quá trình phục hồi hoạt tính của giống vi sinh vật sau khi lưu trữ Điều này được thực hiện bằng cách cấy chuyển từ ống giống sang môi trường PGA trước khi tiến hành nuôi trồng trên các môi trường khác nhau.

Chuẩn bị môi trường PGA: khoai tây (200 g/L), glucose (20 g/L), agar (15 g/L) pH 6-

- Đổ 10-15 mL môi trường PGA vào đĩa petri

- Dùng que cấy vòng lấy một miếng thạch nhỏ có giống từ ống giống gốc sang đĩa petri

Thao tác thực hiện trong tủ cấy vô trùng

Tơ nấm lan đều bề mặt thạch và không nhiễm vi sinh vật khác

Chuyển giống cấp 1 của nấm O sinensis từ môi trường thạch sang môi trường lỏng giàu dinh dưỡng là bước quan trọng để tăng cường số lượng hệ sợi nấm trước khi tiến hành cấy giống vào môi trường nuôi cấy.

Chuẩn bị môi trường lỏng PG: khoai tây (200 g/L), glucose (20 g/L) pH 6-7

- Cho 200 mL PG vào erlen 250 mL, hấp 20 phút tại 121 o C

- Cấy 2 khoanh giống cấp 1 vào erlen

Sợi nấm mọc đều và không nhiễm vi sinh vật khác

 Phương pháp nuôi cấy lỏng tĩnh trong môi trường bổ sung dầu ô liu

Nấm O sinensis cần nguồn carbon để tổng hợp cấu trúc tế bào, biến dưỡng và tạo năng lượng Khi phát triển trong môi trường lỏng tĩnh, sợi nấm này có khả năng tạo ra lượng sinh khối cao và thu được các hợp chất thứ cấp, bao gồm EPS, được tiết ra trong quá trình phát triển.

Chuẩn bị môi trường: khoai tây (200 g/l), saccharose (50 g/l), cao nấm men (4 g/l), peptone (6 g/l), KH2PO4 (0,5 g/l), K2HPO4 (0,5 g/l), CaCl2 (0,5 g/l), MgSO4 (0,2 g/l) pH 6-7 Pha hỗn hợp dầu ô liu và Tween 80: tỉ lệ 1 ml: 0,3 ml

- Cho dầu ô liu và Tween 80 vào erlen 250 ml, dùng máy khuấy từ khuấy đều hỗn hợp thành dung dịch đồng nhất

- Bổ sung lượng nước thích hợp

- Dùng máy khuấy từ khuấy đều

- Hấp khử trùng 15 phút tại 121 o C

Môi trường được chia vào nồi inox, hấp khử trùng 30 phút, 121 o C

- Để nguội qua đêm trong tủ cấy, bổ sung 1 bình giống cấp 2 và stock dầu

- Khuấy đều bằng máy khuấy từ trong 5 phút Sau đó đổ 200 ml môi trường ra hộp nhựa

- Nuôi ở nhiệt độ 20 - 25 o C, trong 40 ngày

- Dịch thu được hấp khử trùng để tiến hành thu nhận EPS

2.2.2 Tối ưu hoá môi trường nuôi cấy bổ sung dầu ô liu

2.2.2.1 Phương pháp sàng lọc yếu tố có ý nghĩa bằng Plackett – Burman

Thiết kế Plackett-Burman là phương pháp hiệu quả để sàng lọc các thông số chính trong quá trình tối ưu hóa với nhiều yếu tố Phương pháp này cho phép đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến sinh tổng hợp EPS, với mỗi yếu tố được kiểm tra ở hai mức độ: thấp (-1) và cao (+1).

Sàng lọc yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng đến tổng hợp được nghiên cứu ở 2 mức (-1 và +1) (Bảng 2.2)

Chuẩn bị môi trường theo các nghiệm thức Plackett – Burman với các yếu tố bao gồm khoai tây, saccharose, peptone, cao nấm men và KH2PO4.

K2HPO4, CaCl2, MgSO4, dầu ô liu được liệt kê trong bảng 1 Trong đó, X1, X2, X3, X4, X5,

X6, X7, X8, X9: các biến độc lập Tổng thành phần môi trường mỗi nghiệm thức là 2 L

Bảng 2.1 Các biến trong ma trận Plackett-Burman

Yếu tố Đơn vị Ký hiệu Mức

Chuẩn bị stock dầu ô liu – Tween 80 tương ứng từng nghiệm thức ở bảng 2

- Môi trường cho vào nồi inox, hấp 30 phút tại 121 o C

- Để nguội qua đêm trong tủ cấy, bổ sung 1 bình giống cấp 2 và stock dầu – Tween

- Khuấy đều bằng máy khuấy từ trong 5 phút Sau đó đổ 200 mL môi trường ra hộp nhựa

- Nuôi ở nhiệt độ 20 – 25 o C, theo dõi trong 40 ngày

- Sinh khối thu nhận bằng cách lọc qua ray, rửa qua nước cất 1 lần Sấy khô ở 60 o C

- Dịch thu được hấp khử trùng để tiến hành thu nhận EPS

- Hàm lượng sinh khối khô

- Chọn yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng đến tổng hợp EPS của nấm

Bảng 2.2 Ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman

Ghi chú: mức 0 là mức trung bình

2.2.2.2 Phương pháp tối ưu hóa bằng đáp ứng bề mặt Box – Behnken

Phương pháp đáp ứng bề mặt là một kỹ thuật mô hình thực nghiệm hiệu quả, giúp đánh giá mối quan hệ giữa các yếu tố thử nghiệm được kiểm soát.

Xác định giá trị tối ưu của ba yếu tố chính từ kết quả sàng lọc thu được và được nghiên cứu ở 3 mức (-1, 0 và +1) (Bảng 4)

Bảng 2.3 Nồng độ các yếu tố sử dụng trong Box-Behnken

Yếu tố Đơn vị Ký hiệu Mức

Chuẩn bị môi trường: theo các nghiệm thức được thiết kế theo Box – Behnken Mỗi nghiệm thức được chuẩn bị tổng thể tích là 2 L môi trường

Pha stock dầu ô liu – Tween 80 tương ứng như bảng 2.4

- Môi trường cho vào nồi inox, hấp 30 phút tại 121 o C

- Để nguội qua đêm trong tủ cấy, bổ sung 1 bình giống cấp 2 và stock dầu – Tween

- Khuấy đều bằng máy khuấy từ trong 5 phút Sau đó đổ 200 mL môi trường ra hộp nhựa

- Nuôi ở nhiệt độ 20 – 25 o C, theo dõi trong 40 ngày

- Sinh khối thu nhận bằng cách lọc qua ray, rửa qua nước cất 1 lần Sấy khô ở 60 o C

- Dịch thu được hấp khử trùng để tiến hành thu nhận EPS

- Hàm lượng sinh khối khô

- Công thức tính hàm lượng EPS

Trong đó, Y: Hàm lượng EPS

B0: hằng số, B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7, B8, B9: hệ số tuyến tính

Bảng 1.4 Thiết kế Box-Behnken

- Khảo sát tỷ lệ tủa với ethanol 95 0 : 1:3; 1;4 và 1:5

- Ly tâm 6000 vòng/phút trong 20 phút

Khảo sát tỷ lệ dung môi và dịch nuôi cấy: Hexan, diethyl eter và PE

2.2.3 Tách chiết exopolysaccharide từ dịch nuôi cấy Ophiocordyceps sinensis bổ sung dầu ô liu

Quy trình tách chiết exopolysaccharide (EPS) từ dịch nuôi cấy nấm Ophiocordyceps sinensis dựa trên phương pháp của Kim và Yun (2003); Sharma Sapan Kumar và cộng sự

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.2.3.1 Khảo sát dung môi hữu cơ loại dầu ra khỏi dịch bằng kĩ thuật chiết lỏng-lỏng

Dung môi không phân cực hiệu quả trong việc hòa tan các hợp chất không phân cực, trong khi dung môi phân cực trung bình có khả năng hòa tan các hợp chất có tính phân cực trung bình Đối với các hợp chất có tính phân cực mạnh, dung môi phân cực mạnh sẽ mang lại hiệu quả hòa tan tốt nhất.

- 3 loại dung môi được chọn để khảo sát là petroleum ether, hexan, dietyl ether

Thu dịch nổi Cô nước

- Dịch nuôi cấy được lọc với vải lọc, hấp khử trùng ở 121 o C trong vòng 15 phút

- Cô quay giảm thể tích còn 1/4 so với thể tích ban đầu

- Cho mẫu dịch đã cô quay vào 3 bình lóng

- Cho vào mỗi bình lóng tương ứng 3 dung môi petroleum ether, hexan, dietyl ether với tỷ lệ 1:1

- Lắc đều các bình lóng cho dịch mẫu và dung môi đồng nhất

- Để yên bình lóng, quan sát sự tách lớp

- Thu phần dịch phía dưới sau 40 phút Lặp lại quá trình 4 lần

- Xác định hàm lượng polysaccharide và lipid trước và sau khi loại dầu

- Xác định hoạt tính bắt gốc tự do ABTS + của mẫu EPS trước và sau khi loại dầu

Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm loại dầu

Tên dung môi PE Hexan Dietyl ether

Thể tích dung môi(ml) 100 100 100

Kết quả cần đạt được

Chọn được dung môi loại dầu hiệu quả dựa vào các tiêu chí sau:

- Hàm lượng polysaccharide có trong mẫu sau khi loại dầu

- Hàm lượng lipid có trong mẫu sau khi loại dầu

- Khả năng bắt gốc tự do của EPS thu được sau khi loại dầu

2.2.3.2 Khảo sát tỷ lệ tủa ethanol 96 0 để thu nhận exopolysaccharide

Độ hòa tan của polysaccharide trong dịch nuôi cấy phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó có hằng số điện môi của dung dịch Các phân tử dung môi có hằng số điện môi lớn như nước giúp ổn định tương tác với polysaccharide, từ đó tăng cường sự hòa tan Ngược lại, dung môi ethanol với hằng số điện môi nhỏ cản trở sự phân tán của polysaccharide, dẫn đến giảm độ hòa tan và gây kết tủa.

- Dịch nuôi cấy sau khi loại dầu được tủa với ethanol 96 0 theo các tỷ lệ 1:3; 1:4; 1:5

- Ly tâm 4000/ phút trong vòng 10 phút, bỏ dịch

- Thu tủa và rửa tủa 3-4 lần với ethanol 96 0

-Xác định hàm lượng polysaccharide và protein có trong từng lô thí nghiệm

Bảng 2.6 Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ tủa

Kết quả cần đạt được:

Xác định tỷ lệ tủa cho khối lượng tủa polysaccharide cao nhất

2.2.4 Quy trình tinh sạch EPS

 Loại protein bằng phương pháp sevag

Dung môi có hằng số điện môi thấp sẽ cản trở sự phân tán của protein trong môi trường, dẫn đến giảm độ hòa tan của protein và gây ra hiện tượng kết tủa.

Quy trình tách protein được thực hiện theo phương pháp của Huang và cộng sự (2010), với một số bước được điều chỉnh để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.

- Thuốc thử sevag (Chloroform :Buthanol) với 3 tỷ lệ khảo sát 3:1; 4:1 và 5:1

- Hòa tan EPS thô bằng nước, lắc mạnh với thuốc thử sevag

- Ly tâm 4000 vòng/ phút trong 10 phút

- Thu dịch EPS, bỏ lớp dung môi và tủa Lặp lại quá trình từ 3-5 lần đến khi không còn kết tủa

- Dịch EPS thu được sau loại đem sấy khô ở 60 0 C

- Xác định hàm lượng protein và polysaccharide trước và sau khi loại protein với sevag

- Xác định khả năng bắt gốc tự do ABTS + của mẫu EPS trước và sau khi loại protein

Kết quả cần đạt được: Xác định tỷ lệ Sevag loại được protein hiệu quả

 Sử dụng TCA để loại protein ra khỏi mẫu EPS

Các cation protein sẽ gắn với TCA để tạo nên dạng muối không tan kết tủa do pI của protein thấp hơn pI của TCA

Quy trình tách protein được thực hiện theo phương pháp của Huang và cộng sự (2010), với một số bước được điều chỉnh để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.

- Hòa tan EPS thô bằng nước, ủ với TCA 10%, 20%, 30%, 40% điều chỉnh hỗn hợp đến pH 3,0

- Giữ lạnh 4 0 C trong 24h, sau đó ly tâm 10.000/phút trong 10 phút

- Thu dịch, lặp lại quá trình từ 3 lần

- Xác định hàm lượng protein và polysaccharide trước và sau khi loại protein

- Xác định khả năng bắt gốc tự do ABTS + của mẫu EPS trước và sau khi loại protein

Kết quả cần đạt được: Xác định tỷ lệ TCA loại protein hiệu quả

 Sử dụng enzyme protease để loại protein ra khỏi mẫu EPS

Sử dụng enzyme endoprotease, đặc biệt là protease Alcalase, để cắt các liên kết peptide nội phân tử của protein thành các đoạn peptide nhỏ Alcalase có ba hoạt tính chính: peptidase, amidase và esterase, nhưng hoạt tính phân cắt của enzyme này phụ thuộc vào cơ chất mà nó tác động.

- Hòa tan mẫu EPS thô vào nước, trộn với enzyme Alcalase 10U, 20U, 30U, 40U, 50U theo tỷ lệ 3:1 v/v

- Xác định hàm lượng protein và polysaccharide trước và sau khi loại protein

- Xác định khả năng bắt gốc tự do ABTS + của mẫu EPS trước và sau khi loại protein

Kết quả cần đạt được: Xác định hoạt độ enzyme loại protein hiệu quả

2.2.4.2 Phương pháp phân tách các phân đoạn EPS từ dịch nuôi cấy O sinensis

Sắc ký lọc gel (Gel Permeation Chromatography - GPC) là kỹ thuật phân tách polymer dựa trên trọng lượng phân tử (TLPT) Các phân tử polymer được tách ra thành các phân đoạn khác nhau khi đi qua cột gel với kích thước lỗ xác định, từ TLPT lớn đến nhỏ Sau đó, phổ đồ được ghi nhận bởi đầu dò, và TLPT của mẫu phân tích được xác định thông qua thang chuẩn.

- Sử dụng cột sắc ký có hpcm, d=2,4cm, gel Sephadex- G100, dung dịch ly giải NaCl 0,2M

- Cân 6g gel pha trong 300ml nước nóng, trong 5h, để nguội, nhồi vào cột sắc ký

- Chuẩn bị 25ml mẫu nồng độ 10g/l, ly tâm 6000v/p, lấy dịch nạp vào cột sắc ký

- Thu từng ống 4ml với tốc độ dòng chảy 1,0 ml/phút

- Và tiến hành xác định hàm lượng protein và polysaccharide của từng ống  xác định phân đoạn

2.2.5 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của EPS bằng khả năng bắt gốc tự do ABTS + Nguyên tắc

Cation ABTS •+ (2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)) là một gốc tự do bền và chất phát quang màu xanh, có độ hấp thu đặc trưng ở 734 nm Khi cho chất kháng oxy hóa vào dung dịch ABTS •+, các chất này sẽ khử ion thành dạng không màu ABTS - R + Để xác định hoạt tính của chất kháng oxy hóa, độ giảm hấp thu ở 734 nm được đo và so sánh với chất kháng oxy hóa chuẩn là vitamin C Trong môi trường kali persulfate, gốc ABTS •+ có thể duy trì sự ổn định trong 2 ngày ở nhiệt độ phòng trong điều kiện tối.

Hình 2.3 Phản ứng bắt gốc tự do làm nhạt màu

Khảo sát khả năng bắt gốc tự do ABTS được thực hiện theo quy trình của Sudha năm

2011 với một số thay đổi phù hợp, gồm 3 giai đoạn cơ bản như sau [42]:

- Tạo gốc tự do ABTS ·+ : hòa dung dịch ABTS 7 mM với dung dịch K2S2O8 2.45 mM theo tỷ lệ thể tích 1:1, ủ trong tối 12 – 16 giờ ở nhiệt độ phòng

- Pha loãng dung dịch ABTS· + : pha loãng trong đệm PBS pH 7,4 cho đến khi dung dịch sau pha loãng (dung dịch A) có OD734 nm = 0,70 ± 0,02

Để tạo hỗn hợp phản ứng, cho 3000 µl dung dịch A vào 100 µl dung dịch mẫu cần phân tích Sau đó, ủ hỗn hợp trong tối 30 phút và đo OD tại 734 nm Mỗi nồng độ mẫu cần được lặp lại tối thiểu 2 lần để đảm bảo độ chính xác của kết quả.

Bảng 2.7 Bố trí thử nghiệm khả năng bắt gốc ABTS· + của mẫu khảo sát

VABTS + (ml) 3000 3000 3000 3000 3000 3000 3000 Ủ tối trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, đo OD 734nm

Khả năng bắt gốc tự do ABTS· + = x100%

Với Ablank: giá trị OD734 nm mẫu trắng (nước + dung dịch A)

Amẫu: giá trị OD734 nm mẫu phân tích (mẫu phân tích + dung dịch A)

2.2.6 Phương pháp xác định khả năng kháng phân bào

 Thử nghiệm độc tính SRB (Sulforhodamin B assay)

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Kết quả sàng lọc yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng sinh khối và EPS

Mô tả quá trình phát triển của nấm

Tại thời điểm nghiên cứu, chúng tôi đã theo dõi sự phát triển của từng lô thí nghiệm qua các giai đoạn khác nhau và đưa ra những nhận xét chung cũng như riêng cho từng lô.

Bằng phương pháp nuôi cấy lỏng tĩnh, các lô thí nghiệm bổ sung dinh dưỡng từ dịch chiết khoai tây, saccharose, peptone, cao nấm men, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2, MgSO4 và dầu ô liu với nồng độ khác nhau đã cho thấy sự phát triển của nấm với tốc độ khác nhau Sau một tuần, có thể đánh giá sơ bộ sự phát triển của nấm, và hầu hết các lô thí nghiệm đã đạt giai đoạn hình thành mảng sinh khối sau hai tuần.

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái sinh khối hệ sợi nấm O sinensis theo thiết kế Plackett –

Nghiệm thức Sinh khối Màu môi trường ĐC

Bề mặt phủ kín tơ trắng, tơi xốp, độ dày đồng đều và gợn sóng có mép cong

Bề mặt dưới của nấm sần sùi

1P Dày, mọc nhanh hơn đối chứng Màu đỏ

3P Dày, bề mặt bằng phẳng Màu đỏ

4P Sinh khối xốp, nhẹ Màu nâu

5P Dày, mép cong vào môi trường Màu nâu

6P Sinh khối mỏng, giòn Màu đỏ

12P Mọc yếu có tơ nấm phủ trắng đều Nâu nhạt

13P, 14P, 15P Mọc mạnh, tơ trắng mịn phủ kín bề mặt Màu đỏ

Mức độ ảnh hưởng đến hàm lượng sinh khối và EPS

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc 9 yếu tố quan trọng, bao gồm dịch chiết khoai tây, saccharose, peptone, cao nấm men, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2, MgSO4 và dầu ô liu, với hai mức thấp và cao theo ma trận Plackett – Burman Kết quả được xử lý bằng phần mềm Minitab cho thấy những yếu tố này có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình nghiên cứu.

17 (bảng 3.2) cho thấy, các yếu tố có giá trị ảnh hưởng dương và lớn gồm saccharose,

Nghiên cứu cho thấy rằng peptone, cao nấm men và dầu ô liu có ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng sinh khối với mức ý nghĩa α 0,05 (p < 0,05) Trong đó, dầu ô liu là yếu tố có tác động mạnh nhất với hệ số ảnh hưởng 7,302, tiếp theo là saccharose (6,599), peptone (5,969) và cao nấm men (3,988) Đặc biệt, yếu tố KH2PO4 có tác động nghịch chiều đến hàm lượng sinh khối với độ tin cậy p < 0,05.

Năm yếu tố chính ảnh hưởng tích cực đến hàm lượng EPS bao gồm dịch chiết khoai tây, saccharose, peptone, MgSO4 và dầu ô liu, với mức ý nghĩa α 0,05 (p < 0,05) Trong đó, dầu ô liu có tác động mạnh nhất đến hàm lượng EPS với hệ số ảnh hưởng là 1,466, tiếp theo là saccharose (1,296), dịch chiết khoai tây (1,151) và MgSO4.

Trong nghiên cứu, hàm lượng EPS được xác định với giá trị lần lượt là 0,899 và 0,811 cho peptone Yếu tố KH2PO4 và K2HPO4 không có ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng EPS với độ tin cậy p < 0,05 Sự chênh lệch giữa hàm lượng sinh khối khô và EPS giữa thực nghiệm và mô hình cũng không đáng kể (Bảng 3.3) Nghiên cứu của Cui và cộng sự (2010) đã chỉ ra rằng glucose và peptone ảnh hưởng đến hàm lượng tổng hợp EPS của C militaris Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy saccharose, peptone và dầu ô liu là những yếu tố có ảnh hưởng mạnh nhất đến hàm lượng EPS trong thiết kế thí nghiệm theo phương pháp đáp ứng bề mặt Box – Behnken.

Bảng 3.2 Các biến trong ma trận Plackett-Burman

Mức độ ảnh hưởng đến hàm lượng sinh khối

Mức độ ảnh hưởng đến hàm lượng EPS Thấp

Bảng 3.3 Ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman

Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy bằng đáp ứng bề mặt Box – Behnken

3.2.1 Mô tả quá trình phát triển của nấm

Bằng phương pháp nuôi cấy lỏng tĩnh, 15 nghiệm thức với các nồng độ khác nhau của dầu ô liu, saccharose và cao nấm men đã cho thấy sợi nấm phát triển, tuy nhiên tốc độ phát triển khác nhau Quan sát sợi nấm sau 5 – 7 ngày cho thấy sự khác biệt rõ rệt Kết quả thu được sau 40 ngày nuôi cấy đã được đánh giá sơ lược cho từng nghiệm thức (Bảng 3.4).

Bảng 3.4 Đặc điểm hình thái sinh khối hệ sợi nấm O sinensis theo thiết kế Box –

Nghiệm thức Sinh khối Màu môi trường ĐC

Bề mặt phủ kín tơ trắng, tơi xốp, độ dày đồng đều và gợn sóng có mép cong

Bề mặt dưới của nấm sần sùi

1 Dày, mọc mạnh Màu đỏ

3 Tương tự đối chứng Màu đỏ

4 Sinh khối có tơ trắng mịn, dày phủ kín bề mặt Màu đỏ

5 Mọc tương tự đối chứng, nhưng bề mặt bằng phẳng có tơ mịn Nâu nhạt

6 Dày, mạnh hơn đối chứng Màu đỏ

7 Tương tự nghiệm thức 1, lớp tơ dày mịn Màu đỏ

8 Mọc mạnh, bề mặt bằng phẳng Màu đỏ

9 Mạnh, lớp tơ xốp, mịn Màu đỏ

10 Tương tự nghiệm thức 8 Màu đỏ

11 Bề mặt bằng phẳng, tơ mịn Màu đỏ

12 Tương tự nghiệm thức 7 Màu đỏ

13,14,15 Mọc mạnh, tơ trắng mịn phủ kín bề mặt Màu đỏ

Nghiệm thức nuôi cấy lỏng tĩnh để thu nhận EPS được thực hiện dựa trên ba yếu tố ở ba mức, tạo thành 15 công thức với ba lần lặp lại cho các điểm trung tâm Kết quả thực nghiệm được trình bày trong Bảng 3.5, cho thấy sự tương đồng giữa kết quả thực nghiệm và mô hình dự đoán từ phần mềm Minitab 17, với không có sự chênh lệch đáng kể.

Bảng 3.5 Thiết kế Box - Behnken

Các biến Hàm lượng SK (g/L) Hàm lượng EPS (g/L)

Thực nghiệm Mô hình Thực nghiệm Mô hình

Kết quả phân tích ANOVA cho thấy mô hình có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 và hệ số hồi quy R² = 0,9788, chứng tỏ sự tương thích tốt với thực nghiệm Thêm vào đó, giá trị R² dự đoán là 0,6601 phù hợp với R² điều chỉnh là 0,9405.

Phương trình hồi quy nhận được như sau:

Để xác định mức độ tối ưu của từng biến trong hàm lượng EPS tối ưu, một đồ thị bề mặt ba chiều tương tác được xây dựng, trong đó trục Z đại diện cho hàm lượng EPS và hai biến độc lập được chọn, trong khi biến còn lại được duy trì ở mức tối ưu.

Bảng 3.6 Mối liên hệ giữa dầu ô liu – peptone đến hàm lượng EPS

Luật Biến độc lập Hàm lượng EPS

1 Nếu lượng dầu ô liu tăng từ 3,91 đến 7,25 % và lượng peptone tăng từ 4,60 đến 8,44 g/L Đạt giá trị lớn nhất

2 Nếu lượng dầu ô liu giảm từ 2,28 đến 2 % và lượng peptone giảm từ 2,27đến 2,00g/L Đạt giá trị nhỏ nhất

Bảng 3.7 Mối liên hệ giữa dầu ô liu – saccharose đến hàm lượng EPS

Luật Biến độc lập Hàm lượng EPS

1 Nếu lượng dầu ô liu tăng từ 4,87 đến 5,51 % và lượng saccharose tăng từ 47,45 đến 51,63 g/L Đạt giá trị lớn nhất

2 Nếu lượng dầu ô liu giảm từ 2,18 đến 2,01 % và lượng saccharose giảm từ 21,28 đến 20,56 g/L Đạt giá trị nhỏ nhất

Bảng 3.8 Mối liên hệ giữa peptone – saccharose đến hàm lượng EPS

Luật Biến độc lập Hàm lượng EPS

1 Nếu lượng peptone tăng từ 5,98 đến 7,70 g/L và lượng saccharose tăng từ 45,88 đến 55,19 g/L Đạt giá trị lớn nhất

Nếu lượng peptone giảm từ 3,00 đến 2,00 g/L hoặc từ 10,00 đến 8,78 g/L và lượng saccharose giảm 24,64 từ 20,76 đến g/L Đạt giá trị nhỏ nhất

Hình 3.1 Mặt đáp ứng hàm lượng EPS theo hai yếu tố

A Dầu ô liu (Y1) – Peptone (Y2) với saccharose ở nồng độ 40 g/L; B Dầu ô liu (Y1) – Saccharose (Y3) với peptone ở nồng độ 6 g/L; C Peptone (Y2) - Saccharose (Y3) với dầu ô liu ở nồng độ 5 v/v

Kết quả nghiên cứu cho thấy dầu ô liu, peptone và saccharose đều ảnh hưởng đến hàm lượng EPS của nấm O sinensis Cụ thể, khi tăng cường các thành phần này, hàm lượng EPS cũng tăng, đạt mức tối đa khi sử dụng 7,25% dầu ô liu, 8 g/L peptone và 55 g/L saccharose Do đó, để tăng hàm lượng EPS, cần tăng lượng dầu ô liu, peptone và saccharose.

Qua những nhận xét của từng nghiệm thức, dựa vào kết quả phân tích biểu đồ ba chiều, kết quả biện luận, chúng tôi có những nhận xét sau:

Tất cả các nghiệm thức với nồng độ dầu ô liu thấp đều cho hàm lượng EPS thấp (3,00 g/L) Đặc biệt, nghiệm thức với lượng peptone cao (10 g/L) đã ảnh hưởng đến hình thái nấm, cụ thể là bề mặt sinh khối.

Ba yếu tố dinh dưỡng có ảnh hưởng đáng kể đến sinh khối và hàm lượng EPS, cho thấy sự biến thiên đồng thời giữa hai giá trị này Việc bổ sung dầu ô liu vào môi trường không chỉ cung cấp nguồn carbon cho sự phát triển của nấm mà còn tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình này.

Việc thay đổi tính thấm của màng giúp cải thiện quá trình phát triển và tạo EPS, từ đó tạo điều kiện cho nấm dễ dàng sử dụng các thành phần dinh dưỡng.

Chúng tôi sử dụng phần mềm Minitab 17 để dự đoán các thông số tối ưu cho môi trường sản xuất EPS, với kết quả cho thấy môi trường lý tưởng bao gồm 5,27% dầu ô liu, 6,77 g/L peptone và 48,69 g/L saccharose Dự kiến, công thức này sẽ tạo ra lượng EPS trung bình 6,06 g/L và sinh khối khô trung bình 31,87 g/L Tuy nhiên, kết quả này chỉ là dự đoán lý thuyết và cần được xác nhận qua thực nghiệm.

3.2.3 Hàm lượng polysaccharide và protein của EPS

Mẫu EPS của 15 nghiệm thức sau khi thu nhận được định lượng polysaccharide và protein, kết quả được tổng hợp ở bảng 3.9

Hàm lượng polysaccharide và protein trong EPS từ 15 nghiệm thức có sự khác biệt đáng kể, với các nghiệm thức này đều cho kết quả cao hơn mẫu đối chứng.

Bảng 3.9 Hàm lượng polysaccharide và protein của EPS

Nghiệm thức 4 có hàm lượng polysaccharide cao nhất với 75,67% và lượng protein tương đối cao 5,78% Các nghiệm thức 3, 6, 7 và 13 cũng cho thấy hàm lượng polysaccharide vượt quá 50% Hàm lượng protein trong 15 nghiệm thức có sự biến động rõ rệt, với mẫu EPS nghiệm thức 7 ghi nhận mức thấp nhất là 0,82%, và dao động từ 1,00 đến 5,67%.

3.2.4 Hoạt tính bắt gốc tự do ABTS· +

Kết quả thu được từ 15 nghiệm thức theo thiết kế Box – Behnken cho thấy khả năng kháng oxy hóa và khả năng bắt gốc tự do ABTS• +, được trình bày chi tiết trong bảng 3.10 và hình 3.2.

Bảng 3.10 Phần trăm bắt gốc tự do của các mẫu EPS

Mẫu % bắt gốc tự do Mẫu % bắt gốc tự do Mẫu % bắt gốc tự do

NT4 50,11 ± 17,08 NT9 20,32 ± 13,73 NT14 83,40 ± 16,73 NT5 48,34 ±11,17 NT10 38,90 ± 18,14 NT15 83,36 ± 0,13

Theo bảng 3.10, trong 15 mẫu phân tích, chỉ có 3 mẫu (nghiệm thức 4, 7 và 13) đạt tỷ lệ phần trăm bắt gốc tự do ABTS· + > 50% ở nồng độ 4000 àg/mL Mẫu EPS nghiệm thức 5 có tỷ lệ bắt gốc tự do cao nhất, đạt 56%, tiếp theo là mẫu EPS nghiệm thức 4 với 53% và nghiệm thức 7 với 51%.

Hình 3.2 Giá trị IC50 của EPS thu từ thí nghiệm Box – Behnken

Hoạt tính EPS của mẫu nghiệm thức 7 và 13 cao hơn so với mẫu đối chứng với giá trị IC50 là 3067,48 àg/mL Mẫu nghiệm thức 4 có hoạt tính thấp nhất, thấp hơn cả mẫu đối chứng, nghiệm thức 7 và 13 Trong đó, nghiệm thức 13 đạt giá trị IC50 cao nhất là 2304,34 àg/mL, tiếp theo là nghiệm thức 7 với giá trị IC50 là 2949,88 àg/mL.

Môi trường tối ưu dự đoán nuôi cấy nấm O sinensis: dịch chiết khoai tây (200 g/L), saccharose (48,69 g/L), cao nấm men (4 g/L), peptone (6,77 g/L), dầu ô liu (5,27 %), KH2PO4

Tiến hành kiểm tra thực nghiệm, nuôi kiểm chứng trên môi trường tối ưu dự đoán, kết quả thu được thể hiện ở bảng:

Bảng 3.11 Kết quả kiểm tra thực nghiệm các thông số tối ưu Mẫu

Dữ liệu từ bảng cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa (p0,05) Ngược lại, khi sử dụng dung môi DE, hàm lượng polysaccharide giảm xuống còn 0,068 g/ml, giảm một nửa so với mức ban đầu.

Trong nghiên cứu về hàm lượng lipid trong mẫu sau khi loại dầu, dung môi DE cho thấy khả năng lôi kéo dầu ô liu ra khỏi dịch nấm nuôi cấy cao nhất, với hàm lượng lipid chỉ còn 30,09% Tiếp theo là dung môi PE, với lipid chiếm 41,75% trong mẫu Ngược lại, dung môi hexan có khả năng lôi kéo dầu thấp nhất, khiến hàm lượng lipid còn lại trong mẫu vẫn cao, đạt 48,59%.

Từ kết quả trên chúng ta có thể thấy khả năng loại dầu ô liu ra khỏi dịch nuôi cấy nấm

O sinensis của DE> PE> hexan Tuy nhiên lượng polysaccharide có trong mẫu lại ngược lại

Chúng tôi tiến hành thí nghiệm để kiểm tra hoạt tính kháng oxy hóa của các mẫu DE < PE = hexan, nhằm đánh giá ảnh hưởng của các dung môi và hàm lượng lipid trong mẫu đến hoạt tính này.

Tính kháng oxy hóa của EPS là một yếu tố quan trọng trong việc lựa chọn dung môi hữu cơ để loại bỏ dầu Việc đánh giá khả năng này giúp đảm bảo hiệu quả trong quá trình xử lý và ứng dụng của EPS.

3.3.3 Khả năng bắt gốc tự do ABTS+ của các mẫu loại dầu

Các mẫu sau khi được loại dầu được khảo sát khả năng bắt gốc tự do ABTS + Kết quả được thể hiện ở bảng 3.12

Bảng 3.12 Phần trăm bắt gốc tự do ABTS + của các mẫu loại dầu

Tên mẫu thí nghiệm % bắt gốc tự do Đối chứng không loại dầu 33,88

Qua bảng kết quả 3.12 ta thấy mẫu được loại dầu bằng dung môi PE và DE bắt được

Các mẫu dịch nuôi cấy nấm được loại bỏ dầu bằng dung môi cho thấy tỷ lệ bắt gốc tự do cao hơn so với mẫu không loại dầu Cụ thể, mẫu sử dụng dung môi PE có hàm lượng lipid là 41,75%, thấp hơn so với mẫu hexan với 48,59% Tuy nhiên, mẫu PE lại có tỷ lệ bắt gốc tự do đạt 58,69%, gần gấp đôi so với mẫu EPS được xử lý bằng dung môi hexan, chỉ đạt 37,98%.

Dung môi nào loại được lipid ra khỏi dịch mẫu càng lớn thì khả năng bắt gốc tự do của EPS thu được càng cao

Dung môi DE có khả năng loại bỏ dầu khỏi dịch mẫu hiệu quả nhất, nhưng việc này dẫn đến sự thất thoát lớn hàm lượng polysaccharide trong mẫu Kết quả là hoạt tính của mẫu chỉ đạt mức tương đương với mẫu được xử lý bằng dung môi PE.

Kết quả cho thấy khả năng lôi kéo dầu và hoạt tính của mẫu sau khi xử lý bằng dung môi PE và DE vượt trội hơn so với dung môi hexan Dung môi DE có khả năng lôi kéo dầu tốt nhất, nhưng lại gây mất một lượng lớn polysaccharide Hoạt tính của mẫu được xử lý bằng dung môi PE và DE gần như tương đương.

 Chọn dung môi PE là dung môi loại dầu hiệu quả để tiến hành làm các thí nghiệm tiếp theo.

Kết quả xác định tỷ lệ tủa thu nhận EPS

Tỷ lệ tủa thu nhận EPS giữa dịch nấm và ethanol 96 0 được chúng tôi khảo sát theo tỷ lệ: 1:3; 1:4 và 1:5 cho kết quả hàm lượng tủa EPS qua hình 3.6

Hình 3.6 Sự biến thiên khối lượng EPS theo từng tỷ lệ tủa khác nhau

Chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng polysaccharide và protein có trong mẫu EPS thô, kết quả được thể hiện trong bảng 3.13

Bảng 3.13 Hàm lượng polysaccharide và protein trong mẫu EPS thô

Tỷ lệ Hàm lượng polysaccharide (%) Hàm lượng protein (%)

Kết quả cho thấy tỷ lệ tủa 1:3 (v/v) dẫn đến hàm lượng EPS thấp nhất (0,0154g/ml), trong khi tỷ lệ 1:4 cho hàm lượng EPS cao nhất (0,0171 g/ml) Vì vậy, tỷ lệ tủa 1:4 được chọn cho quá trình tách chiết EPS từ dịch nuôi cấy nấm O sinensis Bảng 3.14 trình bày một số nghiên cứu về tỷ lệ tủa với ethanol để thu nhận EPS từ các loài nấm khác nhau.

Bảng 3.14 Các nghiên cứu thu nhận EPS bằng ethanol

Loài nấm Tỷ lệ tủa với ethanol 96 0 (v/v) Tác giả

Paecilom Paecilomyces 1:4 Xiao và cộng sự (2003)

C militaris và O sinensis 1:4 Kim và Yun (2005)

C takaomontana 1:4 Lee và cộng sự (2009)

Altermaria alternate 1:5 Nehad và cộng sự (2010)

Tỷ lệ tủa được chọn trong nghiên cứu này tương tự như trong các nghiên cứu của Xiao và cộng sự (2010) và Kim và Yun (2005) Sự khác biệt về tỷ lệ tủa để thu nhận EPS giữa các nghiên cứu có thể xuất phát từ các yếu tố như chủng giống, thành phần và điều kiện môi trường nuôi cấy khác nhau, dẫn đến EPS mà nấm tiết ra có đặc tính phân tử không giống nhau, do đó cần xác định tỷ lệ tủa phù hợp để thu nhận với hàm lượng cao.

Kết luận chung: chúng tôi sử dụng tỷ lệ tủa 1:4 (v/v) với ethanol 96 0 để thu nhận EPS từ dịch nuôi cấy nấm O sinensis bổ sung dầu ô liu.

Kết quả loại protein

Sau khi tủa EPS, chúng tôi đã loại bỏ protein bằng các phương pháp Sevag, TCA và enzyme protease (Alcalase) Để đánh giá hiệu quả của từng phương pháp, chúng tôi phân tích hàm lượng polysaccharide và protein còn lại trong mẫu, cùng với hoạt tính bắt gốc tự do của EPS sau khi loại bỏ protein.

3.5.1 Kết quả khảo sát nồng độ TCA dùng để loại bỏ protein

Hình 3.7 Kết quả nồng độ TCA thích hợp loại protein

Nghiên cứu cho thấy TCA ở các nồng độ 10, 20, 30, và 40% có khả năng loại bỏ protein trong mẫu EPS thô, làm giảm hàm lượng protein từ 3,57% xuống còn 1,11% Sau khi loại bỏ protein, hàm lượng polysaccharide trong mẫu có sự thay đổi so với mẫu đối chứng, tăng hoặc giảm tùy thuộc vào nồng độ TCA Đặc biệt, phương pháp sử dụng TCA 10% đã làm hàm lượng polysaccharide trong mẫu tăng lên 41,23%, trong khi mẫu ban đầu chỉ đạt 34,10%.

Tỷ lệ bắt gốc tự do của các mẫu sau khi loại protein bằng TCA chỉ đạt 35,42%, thấp hơn đáng kể so với mẫu đối chứng 55,62% TCA hoạt động bằng cách gắn với cation của protein, tạo thành phức hợp tủa và phá vỡ phức hợp PSP, đồng thời làm hỏng một phần cấu trúc chuỗi polysaccharide Hệ quả là hoạt tính sinh học của EPS bị mất, cho thấy rằng phương pháp này không hiệu quả trong việc loại protein do ảnh hưởng tiêu cực đến hoạt tính của EPS.

3.5.2 Kết quả loại protein bằng phương pháp Sevag

Hình 3.8 Kết quả loại protein bằng phương pháp Sevag theo các tỷ lệ khác nhau

Hàm lượng polysaccharide có trong mẫu khi loại protein bằng Sevag 3:1 (45,64 %) và Sevag 5:1 (49,39 %) đều nhỏ hơn khi loại protein bằng Sevag 4:1 (62,72 %)

Tất cả các mẫu thí nghiệm đều cho thấy hàm lượng protein giảm, chứng tỏ protein đã được loại bỏ So sánh với hàm lượng polysaccharide sau khi loại protein, ta nhận thấy rằng hàm lượng polysaccharide tăng lên khi hàm lượng protein giảm Cụ thể, mẫu được xử lý bằng phương pháp Sevag 4:1 có hàm lượng protein thấp nhất (1,65%) so với mẫu ban đầu (3,57%) Phương pháp Sevag 4:1 cho thấy hiệu quả cao nhất trong việc loại bỏ protein khỏi mẫu.

Sử dụng phương pháp loại protein bằng Sevag đều cho kết quả tỷ lệ bắt gốc ABTS +

3.5.3 Kết quả khảo sát nồng độ enzyme protease dùng để loại bỏ protein

Hình 3.9 Kết quả nồng độ enzyme thích hợp loại protein

Sử dụng enzyme protease như một tác nhân loại bỏ protein đã cho thấy hiệu quả rõ rệt, với hàm lượng protein giảm từ 3,57% xuống còn 1,57% khi enzyme được sử dụng ở hoạt độ 20 UI/ml Đồng thời, hàm lượng polysaccharide tăng lên 69,2%, gấp đôi so với mẫu đối chứng Các mẫu EPS sau khi loại protein bằng phương pháp enzyme cũng cho thấy khả năng bắt gốc tự do ABTS+ đạt trên 50%, với mức cao nhất là 68,98% ở hoạt độ enzyme 20 UI/ml.

Dựa trên tỷ lệ loại protein, hàm lượng polysaccharide và khả năng bắt gốc tự do ABTS+ của các mẫu EPS sau khi xử lý với enzyme protease có hoạt độ 10-50 UI/ml, chúng tôi đã xác định enzyme protease với hoạt độ 20 UI/ml là lựa chọn tối ưu để so sánh khả năng loại protein trong mẫu EPS thô cho các thử nghiệm.

Bảng 3.15 So sánh khả năng loại protein của TCA 10%, Sevag 4:1 và enzyme protease 20

Phương pháp loại protein trong mẫu

Kết quả loại protein từ EPS thô bằng ba phương pháp TCA, Sevage và Enzyme protease cho thấy phương pháp Enzyme là hiệu quả nhất, với tỷ lệ protein còn lại chỉ 1,57% và hàm lượng polysaccharide cao nhất đạt 69,2% (p < 0,05), đồng thời không ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của EPS, cụ thể là khả năng bắt gốc tự do ABTS+ (68,98%) cao hơn hai phương pháp còn lại Phương pháp TCA gây ảnh hưởng lớn đến chuỗi polysaccharide, dẫn đến thất thoát polysaccharide nhiều hơn và hoạt tính giảm so với đối chứng Mặc dù phương pháp Sevag cũng cho kết quả loại protein tương đối cao, phù hợp với nghiên cứu của Huang và cộng sự (2009) cho mannan oligosaccharide, nhưng vẫn chưa đạt được hiệu quả tối ưu như phương pháp enzyme Nghiên cứu của Zhu và cộng sự (2011) đã chỉ ra rằng sự kết hợp giữa phương pháp enzyme và Sevage là tối ưu nhất cho việc loại protein từ polysaccharide.

Để nâng cao hiệu quả trong nghiên cứu về Armillariella tabescens, cần khảo sát thêm phương pháp sử dụng enzyme kết hợp với Sevage cho các công trình nghiên cứu trong tương lai.

Chúng tôi đã thu nhận EPS thô từ dịch môi trường sau khi nuôi cấy nấm O sinensis, với sự bổ sung của dầu ô liu trong điều kiện tối ưu Tiếp theo, chúng tôi lựa chọn phương pháp enzyme để loại bỏ protein từ EPS thô và tiến hành các bước thí nghiệm tiếp theo.

Kiểm tra phức protein- polysaccharide (PSP)

3.6.1 Các phân đoạn của EPS thô

Sắc ký lọc gel Sephadex G-100 được sử dụng để tinh sạch EPS thô, cho kết quả thể hiện qua hai phân đoạn EPS I và II Giá trị OD490nm và OD280nm được sử dụng để đo độ hấp thu của polysaccharide và protein.

Hình 3.10 Tách phân đoạn EPS bằng sắc ký lọc gel Sephadex G-100

Sử dụng sắc ký lọc gel Sephadex G-100, hai phân đoạn EPS được thu nhận: EPS I (ống 25 đến 35) và EPS II (ống 55 đến 76), mỗi ống có thể tích 2 ml EPS I có lượng protein cao hơn polysaccharide, trong khi EPS II lại ngược lại, nhưng tổng hàm lượng protein và polysaccharide của EPS II lại cao hơn EPS I Cả hai phân đoạn đều cho thấy hàm lượng polysaccharide và protein có chung đỉnh tại các ống tương ứng Các nghiên cứu trước đó đã chỉ ra rằng phân đoạn EPS từ dịch nuôi cấy nấm có tiềm năng ứng dụng cao.

Cordyceps có thể chứa protein hoặc không Năm 2005, Kim và cs thực hiện tách phân đoạn

EPS từ C militaris NG1 được tách thành 5 phân đoạn bằng sắc ký lọc gel Sepharose CL-6B, trong khi EPS từ C sinensis chỉ cho ra 3 phân đoạn Sự khác biệt này có thể liên quan đến nguồn gốc chủng nấm, thành phần dinh dưỡng và điều kiện môi trường nuôi cấy, cũng như kỹ thuật và loại gel được sử dụng trong quá trình phân tách.

3.6.2 Các phân đoạn của EPS sau khi loại bỏ protein bằng enzyme protease 20 UI/ml

Sử dụng enzyme protease 20 UI/ml là tác nhân loại bỏ protein ra khỏi mẫu EPS thô,

56 tiến hành tách các phân đoạn EPS này bằng sắc ký lọc gel Sephadex G-100

Hình 3.11 Phân đoạn EPS sau khi loại bỏ protein bằng enzyme protease 20 UI/ml

Kết quả sắc ký cho thấy EPS có hai phân đoạn chính: EPS I (ống 25-31) và EPS II (ống 61-76) Đo protein cho thấy không có đỉnh hấp thu ở EPS I, trong khi một số ống ở EPS II (68-73) vẫn có đỉnh hấp thu protein nhưng ở mức rất thấp Đỉnh hấp thu polysaccharide cũng thấp hơn so với trước đó Đối với EPS II, polysaccharide và protein có chung đỉnh hấp thu, nhưng độ cao của đỉnh hấp thu protein thấp hơn nhiều so với trước khi sử dụng enzyme protease để loại bỏ protein Điều này chứng tỏ polysaccharide và protein kết hợp với nhau thành phức protein-polysaccharide, làm cho enzyme protease không thể thủy phân hết protein, dẫn đến việc còn lại một lượng rất nhỏ protein gắn với polysaccharide.

3.6.3 Hoạt tính bắt gốc tự do ABTS, hàm lượng polysaccharide và protein có trong các phân đoạn EPS I và II

Bảng 3.16 % bắt gốc tự do, hàm lượng polysaccharide và hàm lượng protein trong mẫu EPS và các phân đoạn EPS I, EPS II

Mẫu % bắt gốc tự do

Kết quả từ bảng 3.16 cho thấy, khi áp dụng phương pháp sắc ký lọc gel G-100 để gia tăng độ tinh sạch của mẫu EPS thô, hai phân đoạn thu được có hàm lượng polysaccharide tăng đáng kể, với EPS I đạt 82,33% (tăng 2,4 lần) và EPS II đạt 78,98% (tăng 2,3 lần) Đồng thời, lượng protein giảm mạnh khi sử dụng enzyme protease, từ 3,57% xuống còn 0,002% ở EPS I và 0,0067% ở EPS II Các phân đoạn này cũng thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa cao hơn so với mẫu EPS thô.

Kết quả xác định tỷ lệ monosaccharide trong các phân đoạn EPS

Sau khi sắc ký lọc gel được 2 phân đoạn, chúng tôi tiến hành xác định tỷ lệ các monosaccharide trong 2 phân đoạn EPS thu được

Bảng 3.17 Thành phần các tỷ lệ monosaccharide có trong các phân đoạn

Phân đoạn Thành phần monosaccharide theo tỷ lệ

EPS II Glucose : Fructose: Mannose = 2 : 1: 1

Kết quả phân tích cho thấy, cả hai phân đoạn đều chứa các thành phần monosaccharide bao gồm glucose, fructose và mannose Đặc biệt, trong EPS II, glucose chiếm tỷ lệ gấp đôi so với fructose và mannose.

Các nghiên cứu phân tích thành phần monosaccharide trong polysaccharide tách chiết từ

C sinensis, Wu và cộng sự (2006) cho kết quả có 4 loại đường là glucose, mannose, galactose, arabinose, nghiên cứu của Fan và cộng sự (2008) cho kết quả CPS 1 có 4 loại đường là glucose, mannose, galactose, arabinose, Wang và cộng sự (2015) phân tích được 2 loại đường là glucopyranose và pyrano – acid [43] Trong khi, kết quả phân tích thành phần monosaccharide của 2 phân đoạn EPS mà chúng tôi thu nhận được có 3 loại đường là glucose, fructose và mannose Cũng có thể còn một số loại đường khác mà bộ kit không phát hiê ̣n đươ ̣c ở nồng đô ̣ nhỏ hơn.