Nghiên cứu quy trình điều chế cao chứa alcaloid và flavonoid có tác dụng sinh học chống oxy hóa kháng acetylcholinesterase in vitro chống suy giảm trí nhớ từ lá cây trinh nữ hoàng cung

- Chiết cao flavonoid toàn phần và cao alcaloid toàn phần từ lá TNHC từ cao toàn phần - Tách phân đoạn flavonoid và phân đoạn alcaloid từ cao flavonoid và cao alcaloid toàn phần - Phân l

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM (ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HCM)

BÁO CÁO NGHIỆM THU

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH ĐIỀU CHẾ CAO CHỨA ALCALOID

VÀ FLAVONOID CÓ TÁC DỤNG SINH HỌC

– CHỐNG OXY HÓA,

KHÁNG ACETYLCHOLINESTERASE (IN VITRO),

CHỐNG SUY GIẢM TRÍ NHỚ

TỪ LÁ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG

(CRINUM LATIFOLIUM L AMARYLLIDACEAE)

(PGS TS Võ thị Bạch Huệ và Th.S Nguyễn Hữu Lạc Thủy)

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 04/ 2015

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO NGHIỆM THU

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH ĐIỀU CHẾ CAO CHỨA ALCALOID VÀ

FLAVONOID CÓ TÁC DỤNG SINH HỌC

– CHỐNG OXY HÓA,

KHÁNG ACETYLCHOLINESTERASE (IN VITRO),

CHỐNG SUY GIẢM TRÍ NHỚ

TỪ LÁ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG

(CRINUM LATIFOLIUM L AMARYLLIDACEAE)

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

PGS TS Võ thị Bạch Huệ và Th.S Nguyễn Hữu Lạc Thủy

CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ

(Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận)

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 04/ 2015

TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện với các mục tiêu:

- Tiêu chuẩn hóa quy trình điều chế cao chứa alcaloid và flavonoid toàn phần (bằng phương pháp chiết siêu tới hạn và phương pháp ngấm kiệt)

-Tối ưu hóa các điều kiện áp suất, nhiệt độ và thời gian để chiết cao flavonoid và alcaloid từ lá Trinh nữ hoàng cung (TNHC) bằng phương pháp chiết siêu tới hạn và chiết ngấm kiệt

- Chiết cao flavonoid toàn phần và cao alcaloid toàn phần từ lá TNHC từ cao toàn phần

- Tách phân đoạn flavonoid và phân đoạn alcaloid từ cao flavonoid và cao alcaloid toàn phần

- Phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất tinh khiết flavonoid và alcaloid từ lá TNHC

- Thử nghiệm tác dụng sinh học

-Thử tác dụng chống oxy hóa in vitro của cao flavonoid và hợp chất flavonoid tinh khiết

- Thử tác dụng kháng AChE in vitro của cao alcaloid và hợp chất alcaloid tinh khiết

- Thử nghiệm tác dụng chống suy giảm trí nhớ của chuột từ các cao phân đoạn alcaloid

Đề tài đã đạt một số kết quả như sau:

1 Trong lĩnh vực chiết xuất : đã xây dựng hai quy trình chiết xuất cao alkaloid toàn phần hoặc

flavonoid toàn phần từ lá cây Crinum latifolium làm nguyên liệu cho sản xuất dược phẩm, thực

phẩm chức năng - 6 - hydroxycrinamidin , crinamidin , astragalin và isoquercitrin được phân lập

từ các cao alkaloid toàn phần

2 Trong lĩnh vực hóa học:

sắc ký cột chân không và sắc ký cột cổ điển với chất hấp phụ thích hợp đã được sử dụng Từ các

kỹ thuật này: - 16 hợp chất được phân lập từ lá cây TNHC , 1 alkaloid đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên - Thiết lập 4 chất đối chiếu : 2 alkaloids (crinamidin và 6 - hydroxycrinamidin ) và 2 flavonoid (astragalin và isoquercitrin) Lần đầu tiên, bốn chất tham khảo hóa học đã được thiết lập theo hướng dẫn của WHO về việc thành lập, phân phối và lưu giữ

3 Trong lĩnh vực sinh học

Cao toàn phần alkaloid đã được sử dung để thử nghiệm như chất ức chế AChE ở động vật TMT

đã được sử dụng như chất tham khảo và galanthamin là chứng dương đã được sử dụng Các phân đoạn alkaloid được chiết xuất từ lá cây TNHC cho thấy khả năng bảo vệ tế bào thần kinh , chống

suy giảm trí nhớ trong cơ thể trong điều kiện thí nghiệm in vivo

Summary

This subject was realized with the following objectives:

- Standardize the procedures for preparating the total alkaloids and flavonoids (by supercritical fluid extraction method and percolation method)

- Optimize the conditions of pressure, temperature and time for obtaining the flavonoid and

alkaloid extract from the leaves of Crinum latifolium using supercritical extraction methods and

extraction leach out

- Extract the total flavonoid and total alkaloid extract from Crinum latifolium leaves

- Separate the flavonoid and alkaloid fractions from total flavonoid and total alkaloid extracts

- Isolate and determine the chemical structures of flavonoid and alkaloid pure compounds which

were separated from Crinum latifolium leaves

- Study the biological effects

Study the (in vitro) antioxidant effects of flavonoid extract and pure flavonoid substances

- Study the (in vitro) acetylcholinesterase inhibitory activitiesof alkaloid extract and pure alkaloid substances

antibacterial effect of high alkaloids and alkaloid compounds purified

- Study the effects of dementia in mice from fractions of total alcaloid extract

This subject has some results as follows:

1 In the process of extraction: two total alkaloid or total flavonoids extraction processes from

Crinum latifolium leaveswere extracted determined as raw materials for production of

pharmaceuticals or functional foods 6 - hydroxycrinamidine, crinamidine, astragalin and isoquercitrin were isolated from these total extracts

2 In the field of chemistry:

Column chromatography vacuum and classical column chromatography with suitable adsorbent were used:

- 16 compounds were isolated from Crinum latifolium leaves, 1 alkaloid first was isolated from

nature

- Establish 4 Chemical Reference Substances: 2 alkaloids (crinamidin and 6 - hydroxycrinamidin) and two flavonoids (astragalin and isoquercitrin) For the first time, four chemical reference

substances have been established in accordance with the WHO guidelines on establishment, distribution and storage of chemical reference substances

3 In the field of biology

Total alkaloid extract was tested as AChE inhibition in animals TMT was used as Reference Substances and positive control galanthamin was used Alkaloid fractions were extracted from

Crinum latifolium leaves are shown the ability to protect nerve cells, against memory impairment

in vivo in experimental conditions

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 Tổng quan về thực vật học 1

1.2 Tổng quan về hóa học 3

1.3 Tổng quan tác dụng sinh học chi Crinum và TNHC 11

1.4 Chiết cao toàn phần từ dược liệu bằng phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn (SFE) 17

1.5 Các phương pháp sắc ký đã được ứng dụng phân tích hóa học của cây TNHC 18

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20

2.1 Tên nội dung 1: Khảo sát các điều kiện để chiết cao toàn phần từ lá TNHC 20

2.2 Tên nội dung 2: Xây dựng quy trình chiết cao flavonoid và cao alcaloid từ lá TNHC 23

2.3 Tên nội dung 3: Tách phân đoạn flavonoid và phân đoạn alcaloid 25

2.4 Tên nội dung 4: Phân lập và xác định cấu trúc flavonoid và alcaloid 25

2.5 Tên nội dung 5: Thử tác dụng chống oxy hóa in vitro 28

2.6 Tên nội dung 6: Thử tác dụng kháng AChE in vitro 28

2.7 Tên nội dung 7: Thử nghiệm tác dụng chống suy giảm trí nhớ và chống thoái hóa tế bào thần kinh in vivo của các mẫu cao alcaloid 29

2.8 Tên nội dung 8: Xây dựng chất đối chiếu alcaloid và flavonoid từ cao chiết TNHC 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Nội dung 1: Tối ưu hóa các điều kiện để chiết cao toàn phần 35

3.2 Nội dung 2: Quy trình công nghệ chiết cao flavonoid và cao alcaloid từ lá TNHC 43

3.3 Nội dung 3: Tách phân đoạn flavonoid và phân đoạn alcaloid 47

3.4 Nội dung 4: Phân lập và xác định cấu trúc flavonoid và alcaloid 48

3.5 Nội dung 5: Kết quả thử tác dụng chống oxy hóa in vitro 60

3.6 Nội dung 6: Kết quả thử nghiệm khả năng kháng AChE in vitro 61

3.7 Nội dung 7: Thử nghiệm tác dụng chống suy giảm trí nhớ và chống thoái hóa tế bào thần kinh in vivo của các mẫu cao alcaloid TNHC 63

3.8 Nội dung 8: Xây dựng chất đối chiếu alcaloid, flavonoid từ TNHC 73

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 93

CHƯƠNG 5 Tài liệu tham khảo i

CHƯƠNG 6 Phụ lục xii

FC Flash chromatography (Sắc ký cột nhanh)

NMR Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) PDA Photo Diode Array (Đầu dò dãy diod quang)

SF-CO2 Supercritical fluild carbon dioxide (CO2 lỏng siêu tới hạn) SFE Supercritical Fluid Extraction (Chiết lỏng siêu tới hạn)

UV-Vis Ultraviolet-Visible (Tử ngoại khả kiến)

VLC Vacuum Liquid Chromatography (Sắc ký cột chân không)

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1.1: Hình vẽ cây TNHC và các bộ phận: 1 Cây với thân hành và lá; 2 Cụm hoa; 3 Một

phần bao hoa và bộ nhị; 4 Bộ nhụy [6] 3

Hình 2.1 Màn hình khởi động JMP 22

Hình 2.2 Màn hình DOE với 3 biến số 22

Hình 2.3 Các thiết kế JMP 22

Hình 2.5 Nhập hàm lượng 6-hydroxycrinamidin, crinamidin và 6-hydroxybuphanidrin của các TN vào ma trận 23

Hình 2.6 Các bước xử lý của phần mềm JMP 23

Hình 3.1 Sắc ký đồ kiểm tra thành phần cao A-SFE từ dịch chiết SFE của lá TNHC 35

Hình 3.2 SKĐ CĐC 6-hydroxy crinamidin, crinamidin và 6-hydroxy buphanidrin 36

Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu thử A-SFE 36

Hình 3.4 Sắc ký đồ của mẫu thử A-SFE thêm chất đối chiếu 36

Hình 3.5: Mô hình thể hiện tính tương thích giữa các yếu tố khảo sát lên hàm lượng alcaloid 40

Hình 3.6 Bảng thể hiện tác động của các yếu tố đến hàm lượng 6-hydroxycrinamidin 40

Hình 3.7 Bảng thể hiện tác động của các yếu tố đến hàm lượng crinamidin 40

Hình 3.8 Bảng thể hiện tác động của các yếu tố đến hàm lượng 6-hydroxybuphanidrin 41

Hình 3.9 Mô hình bề mặt đáp ứng hàm lượng 6-hydroxycrinamidin (T, áp suất và thời gian) 41

Hình 3.10 Mô hình bề mặt đáp ứng hàm lượng crinamidin (nhiệt độ, áp suất và thời gian) 41

Hình 3.11 Mô hình bề mặt đáp ứng 6-hydroxybuphanidrin (nhiệt độ, áp suất và thời gian) 41

Hình 3.12 Sự tương tác giữa các yếu tố đến hàm lượng 6-hydroxycrinamidin 42

Hình 3.13 Sự tương tác giữa các yếu tố đến hàm lượng crinamidin 42

Hình 3.14 Sự tương tác giữa các yếu tố hàm lượng 6-hydroxybuphanidrin 42

Hình 3.15 Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng 6-hydroxycrinamidin 42

Hình 3.16 Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng crinamidin 42

Hình 3.17 Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng 6-hydroxybuphanidrin 42

Hình 3.18: Sự thay đổi thời gian tìm thấy bệ đỡ (giây) trong TN ẩn bệ đỡ giữa nhóm chứng và các nhóm TMT có điều trị dự phòng với Gal hoặc TNHC(1); (2).***p<0,001 so với nhóm Sal.; #p<0,05, ##p<0,01 và ###p<0,001 so với nhóm TMT; 64

$ p<0,05 so với TNHC (1) (87,5); %%p<0,01 so TNHC(2) 25 64

Hình 3.19: Sự thay đổi về số lần chuột bơi qua bệ đỡ trong thử nghiệm thăm dò các nhóm chứngvà nhóm TMT điều trị dự phòng với Gal hoặc cao TNHC(1), (2), 65

***p<0,001 so với nhóm Sal.; ##p <0,01 và ### p <0,001 so với nhóm TMT 65

Hình 3.20 Sự thay đổi về thời gian chuột tìm thấy bệ đỡ (giây) trong thử nghiệm trí nhớ hoạt động giữa nhóm chứng và nhóm TMT điều trị dự phòng với Gal hoặc cao TNHC(1), (2) 65

Hình 3.21 Sự thay đổi % tổ hợp giữa nhóm chứng và nhóm tiêm điều trị dự phòng với Gal,

TNHC(1)và TNHC (2) trong thử nghiệm mê cung chữ Y 66

Hình 3.22 Sự thay đổi % khám phá vật thể quen và vật thể lạ giữa các nhóm chứng 67

và các nhóm tiêm TMT có hoặc không có điều trị với Gal, TNHC(1), (2) 67

*** p<0,001 so với nhóm Sal; #p<0,05 và ##p<0,01;###p<0,001 so với nhóm TMT 67

Hình 3.23: Sự thay đổi về tiềm thời chuột tìm thấy ống nước (giây) (A) và số ô chuột di chuyển (B) giữa các nhóm chứng và các nhóm tiêm TMT có hoặc không có điều trị dự phòng với Gal, 68 Hình 3.24 Sự thay đổi hàm lượng ACh (nmol/mg protein) giữa nhóm chứng và nhóm tiêm TMT có hoặc không có điều trị với Gal, TNHC(1), TNHC(2) 69

Hình 3.25 Sự thay đổi hoạt tính AChE (mU/mg protein) giữa nhóm chứng và các nhóm tiêm TMT có hoặc không có điều trị với Gal, TNHC(1), TNHC (2) ***p<0,001 so với Sal 70

Hình 3.26: Sự thay đổi số lượng tế bào sống trong vùng hồi răng thuộc hải mã giữa nhóm chứng và các nhóm tiêm TMT có hoặc không có điều trị với Gal., TNHC(1), (2) 71

*** p<0,001 so với nhóm Sal; #p<0,05 và ###p<0,001 so với nhóm TMT 71

Hình 3.27 Sự thay đổi hình thái mô học quan sát bằng phương pháp nhuộm CV 72

Hình 3.28 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết alcaloid trên 3 hệ dung môi 73

Hình 3.29 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của astragalin (A) và isoquercitrin (B) 74

Hình 3.30 Sắc ký đồ xác định độ tinh khiết của CĐC crinamidin bằng HPLC 76

Hình 3.31 Sắc ký đồ xác định độ tinh khiết CĐC 6-hydroxycrinamidin HPLC 76

Hình 3.32 Sắc ký đồ xác định độ tinh khiết của CĐC astragalin bằng HPLC 77

Hình 3.33 Sắc ký đồ xác định độ tinh khiết của CĐC isoquercitrin bằng HPLC 77

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1.1: Alcaloid của TNHC Crinum latifolium L 9

Bảng 2.1: Các điều kiện chiết xuất 21

Bảng 2.2 Hàm lượng 6-hydroxycrinamidin, crinamidin và 6-hydroxybuphanidrin 23

Bảng 3.1 Kết quả phân tích alcaloid trong cao A-SFE bằng phương pháp HPLC 37

Bảng 3.2 Điều kiện SFE tối ưu 42

Bảng 3.3 Hiệu suất chiết bằng phương pháp NK: 43

Bảng 3.4 Hiệu suất chiết bằng phương pháp NK 44

Bảng 3.5 Kết quả tách phân đoạn alcaloid A-SFE và flavonoid FS-NK bằng VLC 47

Bảng 3.6 Kết quả phân lập alcaloid từ phân đoạn AS1 48

Bảng 3.7 Kết quả triển khai sắc ký cột phân lập hợp chất (2) và (3) 48

Bảng 3.8 Kết quả phân lập (2) và (3) từ cao n–hexan 48

Bảng 3.9 Kết quả phân lập các hợp chất (8), (9), (10) từ alcaloid AS-NK 50

Bảng 3.10 Dữ liệu phổ NMR (Máy 500 MHz, CDCl3) của (2) so sánh với 6α-hydroxyundulatin Bảng 3.11 Kết quả khả năng chống oxi hóa các mẫu cao flavonoid và chất tinh khiết TNHC 60

Bảng 3.12 Thành phần một mẫu thử nghiệm khả năng kháng AChE 61

Bảng 3.13 Liều LD50 trong thử nghiệm khả năng kháng AChE in vivo 63

Bảng 3.14 Phân lô chuột thử nghiệm: 63

Bảng 3.15 Kết quả thử nghiệm thời gian chuột tìm thấy bệ đỡ 64

Bảng 3.16 Kết quả TN thăm dò và trí nhớ hoạt động 65

Bảng 3.17 Kết quả thử nghiệm mô hình mê cung chữ Y 66

Bảng 3.18 Kết quả thử nghiệm mô hình khám phá vật thể lạ 67

Bảng 3.19 Kết quả thử nghiệm mô hình tìm nước 68

Bảng 3.20 Kết quả khảo sát hàm lượng ACh và hoạt tính AChE 70

Bảng 3.21 Số lượng tế bào sống ở vùng hồi răng thuộc hồi hải mã (Test CV) 71

Bảng 3.22 Kết quả khảo sát độ tinh khiết; hàm ẩm bằng nhiệt trọng lượng 74

Bảng 3.23 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống 75

Bảng 3.24 Kết quả xác định độ tinh khiết sắc ký (%) các CĐC (HPLC) 78

Bảng 3.25 Dữ liệu phổ UV-Vis, MS và điểm chảy của các CĐC 78

Bảng 3.26 Dữ liệu phổ IR của các CĐC 79

Bảng 3.27 Kết quả đánh giá đồng nhất lô của các CĐC sau khi đóng gói 80

Bảng 3.28 Kết quả phân tích robust A của CĐC crinamidin 81

Bảng 3.29 Kết quả phân tích robust A của CĐC 6-hydroxycrinamidin 82

Bảng 3.30 Kết quả phân tích robust A của CĐC astragalin 82

Bảng 3.31 Kết quả phân tích robust A của CĐC isoquercitrin 83

Bảng 3.32 Kết quả xác định giá trị ấn định và giá trị công bố các CĐC 83

DANH SÁCH SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1 Chiết cao alcaloid và flavonoid từ lá TNHC bằng phương pháp ngấm kiệt 45

Sơ đồ 3.2 Chiết cao alcaloid và flavonoid từ bột lá TNHC kết hợp hai phương pháp chiết 46

Sơ đồ 3.3 Phân lập hợp chất (2) và (3) 49

BÁO CÁO NGHIỆM THU

TỪ LÁ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG

(CRINUM LATIFOLIUM L., AMARYLLIDACEAE)”

Thuộc chương trình: VLM (136-15-ds 2011)

Cơ quan chủ trì: TT KHCN DƯỢC SÀI GÒN (SAPHARCEN)

Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Võ thị Bạch Huệ và Th.S Nguyễn Hữu Lạc Thủy

Kinh phí được duyệt: 676.000 ngàn đồng, trong đó: từ Ngân sách sự nghiệp khoa học thành phố

là 676.000 ngàn đồng và 88.000 ngàn đồng do công ty Domesco tài trợ

Thời gian thực hiện đề tài: 04/2012 – 04/2014

Kinh phí đã cấp:

Kinh phí đợt 1: 400.000.000 đ

(Hợp đồng số 126/2012/HĐ – SKHCN;

Theo TB cấp kinh phí nghiên cứu KH&CN số: 20/TB-SKHCN ngày 13/04/2012)

Mục tiêu: (Theo đề cương đã duyệt)

Nội dung: (Theo đề cương đã duyệt)

Những nội dung đã thực hiện ở giai đoạn 1 và giai đoạn 2 (đối chiếu với hợp đồng đã ký):

1

Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện SFE

(áp suất, nhiệt độ, thời gian) và phương

pháp ngấm kiệt để chiết cao toàn phần

chứa flavonoid và alcaloid từ lá TNHC

Xác định được các điều kiện tối ưu để chiết các hợp chất alcaloid, flavonoid toàn phần

từ lá cây Trinh nữ hoàng cung

2 Khảo sát phương pháp chiết cao

flavonoid và alcaloid từ lá TNHC

Xây dựng quy trình chi tiết chiết cao flavonoid và cao alcaloid từ lá TNHC

3

Khảo sát các phương pháp tách phân

đoạn flavonoid, alcaloid từ cao

Trinh nữ hoàng cung để làm chất thử

nghiệm sinh học và làm chất đối chiếu

trong việc xây dựng tiêu chuẩn để kiểm

nghiệm dược phẩm từ TNHC

Tách được ít nhất 2 alcaloid và 2 flavonoid (độ tinh khiết khoảng trên 95%) với khối lượng khoảng 100mg/ chất

Xác định cấu trúc Sử dụng các này làm chất thử nghiệm sinh học và làm chất đối chiếu trong việc xây dựng tiêu chuẩn

5

Thử tác dụng chống oxy hóa in vitro

của các mẫu cao flavonoid toàn phần,

cao phân đoạn flavonoid và một số hợp

chất flavonoid chiết được từ lá TNHC

Xác định được cao flavonoid có tác dụng chống oxy hóa tốt so với các chất đối chiếu quy định như acid gallic (hoặc Pyrogallol, hay Vitamin E….)

6

Thử tác dụng kháng AChE in vitro từ

các mẫu cao alcaloid toàn phần, cao

phân đoạn alcaloid và một số hợp chất

alcaloid chiết được từ lá TNHC

Xác định khả năng kháng AChE in vitro từ

50 mẫu cao chiết từ TNHC so với Galanthamin (chất đối chiếu có tác dụng kháng Alzheimer)

7

Thử nghiệm tác dụng chống suy giảm

trí nhớ và chống thoái hóa tế bào thần

kinh in vivo của chuột từ cao TP và cao

phân đoạn alcaloid chiết từ lá TNHC

Xác định khả năng chống suy giảm trí nhớ

và chống thoái hóa tế bào thần kinh chuột

(thử nghiệm kháng AChE in vivo)

8

Xây dựng CĐC alcaloid, flavonoid

chiết từ TNHC và một số chỉ tiêu cao

flavonoid và alcaloid TP để tiến tới sản

xuất cao có chất lượng ổn định theo yêu

cầu của các công ty Dược ở Việt nam

nhằm khai thác, bảo tồn hợp lý

Đề nghị các mức chỉ tiêu để kiểm nghiệm cao chiết toàn phần nhóm flavonoid và nhóm alcaloid từ lá Trinh nữ hoàng cung

Các sản phẩm của đề tài (đối chiếu với hợp đồng đã ký):

Dạng sản phẩm I và II Số lượng – Chỉ tiêu Kết quả

1 Cao alcaloid TP từ lá TNHC 0,5 đến 1,0 kg ĐẠT (0,5 kg)

2 Cao alcaloid TP từ lá TNHC 0,5 đến 1,0 kg ĐẠT ( 1,0 kg)

3

Alcaloid và flavonoid tinh khiết

để thử nghiệm sinh học và thiết

lập chất đối chiếu

2 alcaloid; 2 flavonoid khối lượng: 100 mg tinh khiết > 90%

ĐẠT (vượt)

- 16 hợp chất tinh khiết (trong

đó có 1 hợp chất mới và 4 hợp chất tinh khiết > 95% với khối lượng mỗi chất > 500 mg

4 Quy trình chiết tối ưu alcaloid

TP và flavonoid TP từ lá TNHC

Quy trình (phương pháp, thời gian, dung môi chiết)

ĐẠT (Quy trình mô tả đầy đủ các bước tiến hành và các điều kiện thực hiện chiết xuất.)

5 Quy trình chiết cao toàn phần từ

lá cây Trinh nữ hoàng cung

Quy trình (phương pháp, thời gian, tỷ lệ dược liệu và dung môi)

ĐẠT (Quy trình mô tả đầy đủ các bước tiến hành và các điều kiện thực hiện chiết xuất.)

Dạng sản phẩm III và IV Số lượng – Chỉ tiêu Kết quả

1

Thử tác dụng chống oxy hóa in

vitro của các mẫu cao flavonoid

TP, phân đoạn flavonoid và một

vitro từ các mẫu cao alcaloid

toàn phần, cao phân đoạn

3 Tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao

ĐẠT (02: Tiêu chuẩn cơ sở cao

alcaloid và flavonoid TNHC đã được Viện kiểm nghiệm thuốc TpHCM thẩm định

PHẦN MỞ ĐẦU

Cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L – Amaryllidaceae) là dược liệu đang được sử dụng

phổ biến như một thực phẩm chức năng hoặc có mặt trong các dạng bào chế thuốc cổ truyền và thuốc hiện đại

Công dụng được quan tâm và đã thử nghiệm lâm sàng như điều trị u xơ tử cung, u phì đại lành tính tuyến tiền liệt được cho là tác dụng của thành phần alcaloid trong cây với các chế phẩm như Crila và Tadimax [13], [23]

Các công dụng kháng viêm, chống oxi hóa in vitro do nhóm flavonoid cũng đã được khảo sát [13], [82]

Tuy nhiên, tác dụng được các nhà khoa học kỳ vọng là kháng khối u của loài Crinum Đã có nhiều

công trình nghiên cứu về khả năng kháng ung thư từ cao toàn phần như: cao chiết ethanol và cao alcaloid làm chậm sự phát triển khối u gây ra bởi tế bào Sarcoma TG 180 [9]; cao methanol ức chế NF-κB được giả thuyết do các hợp chất không phải nhóm polyphenol [90]; cao chiết nước kích thích

sự sinh sản và hoạt hóa tế bào lympho T [122]; khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và

hồi phục chức năng miễn dịch (in vitro) của cao chiết nước là tác dụng đáng chú ý khi giải thích tính kháng ung thư của Crinum latifolium [27], [82], [122] Các hợp chất alcaloid tinh khiết được phân lập từ Trinh nữ hoàng cung như lycorin, pratorimin, undulatin, crinafolin và crinafolidin cũng được thử nghiệm là có khả năng ngăn chặn chọn lọc sự phát triển của các tế bào ung thư thực nghiệm

Từ thực tế sử dụng cây Trinh nữ hoàng cung và kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học, dược liệu này dần được nhìn nhận như một cây thuốc quí Hiện nay đang được phát triển về quy hoạch trồng trọt và sản xuất theo công nghệ hiện đại để nâng cao chất lượng của thuốc từ dược liệu Ngoài yêu cầu chung như thuốc sản xuất từ hóa dược, thuốc từ dược liệu còn phải kết hợp đánh giá được chất điểm chỉ cùng với việc xây dựng quy trình định tính và định lượng hoạt chất chính trong dược liệu và sản phẩm

Thành phần của thuốc từ dược liệu khá phức tạp và thường chưa được xác định rõ ràng nên việc kiểm soát chất lượng từ khâu nguyên liệu cho đến bán thành phẩm, thành phẩm cũng rất khó khăn

mà nguyên nhân chủ yếu là sự phức tạp của mẫu và sự thiếu hụt chất đối chiếu

Do vậy, với mong muốn góp phần vào việc sản xuất cao chứa hoạt chất alcaloid và flavonoid có các tác dụng sinh học khác ngoài tác dụng kháng khối u như tác dụng chống suy giảm trí nhớ và chống thoái hóa thần kinh nên chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu quy trình điều chế cao chứa alcaloid và flavonoid có tác dụng sinh học (chống

oxy hóa; kháng acetylcholinesterase (in vitro); chống suy giảm trí nhớ) từ lá cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L., Amaryllidaceae)”

với các mục tiêu cụ thể lần lượt như sau:

Mục tiêu:

- Nghiên cứu và tiêu chuẩn hóa quy trình điều chế cao chứa alcaloid và flavonoid toàn phần (bằng phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn hoặc phương pháp ngấm kiệt)

- Thử nghiệm tác dụng sinh học [chống oxy hóa; kháng Alzheimer (in vitro); chống suy giảm trí

nhớ;] của cao chiết alcaloid hoặc cao flavonoid toàn phần và một số hợp chất alcaloid và flavonoid

phân lập được từ lá cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium.L.)

Nội dung: nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện SFE (áp suất, nhiệt độ, thời gian) và phương pháp ngấm kiệt để chiết cao toàn phần chứa flavonoid và alcaloid từ lá Trinh nữ hoàng cung

- Chiết cao flavonoid toàn phần và cao alcaloid toàn phần từ lá Trinh nữ hoàng cung từ cao toàn phần chiết bằng phương pháp siêu tới hạn và phương pháp ngấm kiệt

- Tách phân đoạn flavonoid và phân đoạn alcaloid từ cao flavonoid toàn phần và cao alcaloid toàn phần của lá Trinh nữ hoàng cung

- Phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất tinh khiết flavonoid và alcaloid từ lá Trinh nữ hoàng cung để làm chất thử nghiệm sinh học và làm chất đối chiếu trong việc xây dựng tiêu chuẩn để kiểm nghiệm dược phẩm từ Trinh nữ hoàng cung

- Thử tác dụng chống oxy hóa in vitro của các mẫu cao flavonoid toàn phần, cao phân đoạn

flavonoid và một số hợp chất flavonoid tinh khiết chiết được từ lá Trinh nữ hoàng cung

- Thử tác dụng kháng AChE in vitro từ các mẫu cao alcaloid toàn phần, cao phân đoạn

alcaloid và một số hợp chất alcaloid tinh khiết chiết được từ lá Trinh nữ hoàng cung

- Thử nghiệm tác dụng chống suy giảm trí nhớ và tác dụng chống thoái hóa tế bào thần kinh của chuột từ các cao phân đoạn alcaloid chiết từ lá Trinh nữ hoàng cung

- Thiết lập chất đối chiếu alcaloid, flavonoid chiết từ lá TNHC và xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm cho cao chiết flavonoid và alcaloid toàn phần để tiến tới sản xuất cao có chất lượng ổn định theo yêu cầu của các công ty xí nghiệp Dược ở Việt nam nhằm có hướng khai thác và bảo tồn hợp lý

1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về thực vật học

1.1.1 Họ Amaryllidaceae và chi Crinum

Họ Amaryllidaceae có tên gọi theo đa số tài liệu của các nhà thực vật học Việt nam là họ Thủy tiên [2], [4], [18], Loa kèn đỏ [1],Náng [6] hay Lan Huệ [3] Vị trí của chi Crinum thuộc họ Thủy tiên

theo hệ thống phân loại ngành thực vật hạt kín của A L Takhtajan công bố năm 1987 và đã sửa đổi năm 2009 [2], [29] như sau:

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp Hành (Liliopsida)

Phân lớp Hành (Liliidae)

Liên bộ hành (Lilianae)

Bộ Thủy tiên (Amaryllidales)

Họ Thủy tiên (Amaryllidaceae)

Chi Crinum L

Đặc điểm hình thái của họ Thủy tiên:thân cỏ, sống nhiều năm nhờ hành hay thân rễ Lá mọc từ

gốc, mỏng hay mọng nước, gân lá song song Đối với chi Crinum, các bẹ lá hợp thành thân giả cao

10-15 cm Cụm hoa dạng chùm, tán, ít hay nhiều hoa và có một mo bao lại Trục cụm hoa dài mọc

từ mặt đất Hoa đều, lưỡng tính, 5 vòng, mẫu 3 Bao hoa: 6 phiến cùng màu dạng cánh hoa, dính thành ống dài, ít khi rời Vài loại có tràng phụ Bộ nhị: 6 nhị đính trên 2 vòng Chỉ nhị rời hay dính nhau Bao phấn thẳng hay lắc lư Bộ nhụy: 3 lá noãn tạo thành bầu dưới 3 ô, mỗi ô chứa nhiều noãn, đính noãn trung trụ; 1 vòi nhụy, đầu nhụy chia 3 thùy Quả: thông thường là nang nứt lưng Hạt có nội nhũ [4]

Chi Crinum có khoảng 130 loài ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và vùng nóng

Ở Việt Nam, chi Crinum có 6 loài được trồng làm cảnh và làm thuốc: Crinum amabile Donn.,

Crinum asiaticum L., Crinum defixum Ker Gawl., Crinum giganteum Andr., Crinum latifolium

L., Crinum moorei Hook F [2]

2

1.1.2 Cây Trinh nữ hoàng cung (TNHC)

Tên khoa học: Crinum latifolium L

Tên thông thường: Trinh nữ hoàng cung [9], Hoàng cung trinh nữ [14], Tỏi lơi lá rộng [1], [2], Náng

lá rộng [2], [6], [8]

Đặc điểm hình thái: được nhiều nhà thực vật học Việt nam mô tả rất chi tiết [1], [2], [4], [6], [9], [12], [14], [18]

Tài liệu [6] phù hợp với hầu hết các tài liệu khác: cỏ nhiều năm; thân hành, hình cầu, phía ngoài

có áo mỏng, phía trên có thân giả ngắn do các bẹ lá ôm sát nhau làm thành Phiến lá dạng bản, kích thước 60-90  7-10 cm, màu xanh nhạt, nạc, mặt trên hơi lõm xuống thành hình máng, mép lượn sóng, gân giữa lồi lên ở mặt dưới, gân bên song song, chóp nhọn, gốc dạng bẹ Cụmhoa tán,

có 10-20 hoa; cuống cụm dài 60-90 cm, chiều ngang 1,5-2,0 cm, màu xanh, gốc tím nhạt Lá bắc tổng bao 2, dạng mo, mỏng, kích thước 7,5-10,0  2,5-3,0 cm Hoa đều, lưỡng tính, màu tím hồng, đứng thẳng; cuống hoa ngắn Bao hoa dài 15-20 cm, 6 mảnh, dạng tràng, phần dưới dính nhau thành ống dài 9-10 cm, thẳng đứng hoặc cong lên, phần trên 6 thùy, hình mũi giáo, giữa lưng có 1 dải màu tím hồng, đậm hơn, nhạt dần ra phía mép, chóp nhọn ngắn, có mũi màu hồng Nhị 6, rời

nhau; chỉ nhị dài 6-7 cm, dạng sợi, màu trắng, thẳng đứng hoặc choãi ra, đính ở họng ống bao

hoa; bao phấn màu vàng, dài 1,2-1,8 cm, 2 ô, hình dải, đính lưng, hướng trong, mở bằng khe dọc Bầu hạ, hình thoi, 3 ô, mỗi ô 5-6 noãn; vòi nhụy dài 15-18 cm, dạng sợi, dài, mảnh, phía trên màu tím thẫm nhạt dần xuống phía dưới; đầu nhụy nhỏ, dạng cầu

Quả nang, hình cầu, đường kính 4-5 cm

Ngoại trừ tài liệu [14] mô tả nhị của TNHC có màu đỏ, các tài liệu [6], [9] mô tả nhị của TNHC có màu trắng Các tài liệu còn lại đều không đề cập đến màu sắc của bộ nhị

Phân bố-Sinh thái: cây TNHC được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Thái lan, Trung Quốc, Indonexia, Philippin, Campuchia, Lào Ở Việt Nam, cây được trồng chủ yếu ở các tỉnh từ Quảng Nam-Đà Nẵng trở vào Mùa hoa quả: tháng 8-9 Là loại cây ưa ẩm,sáng hoặc một phần bóng mát Sinh trưởng và phát triển ở khí hậu nóng và ẩm của vùng nhiệt đới.Mỗi năm cây cho 6-8 lá mới và đẻ thêm 3-5 hành con.Cây ra hoa hàng năm vào khoảng tháng 6-8 Bộ phận dùng chủ yếu là lá và thân hành [1]

Cây TNHC đã được nghiên cứu nhân giống bằng phương pháp cấy mô [17]

3

Hình 1.1: Hình vẽ cây TNHC và các bộ phận: 1 Cây với thân hành và lá;

2 Cụm hoa; 3 Một phần bao hoa và bộ nhị; 4 Bộ nhụy [6]

1.2 Tổng quan về hóa học

1.2.1 Thành phần hóa học của các loài trong chi Crinum

Thành phần hóa học của các loài trong chi Crinum được nghiên cứu từ năm 1950 Nhóm hợp chất

chính là alcaloid, kế đến là nhóm non-alcaloid, đặc biệt là các hợp chất phenolic [100]

Chi Crinum được xem là đại diện cho họ Amaryllidaceae do thành phần hóa học có hầu hết các

hợp chất của các chi khác trong họ Khoảng 180 alcaloid thuộc nhiều nhóm cấu trúc khác nhau được phân lập và định danh Phần lớn chúng thuộc các khung alcaloid Crinin (5,10 b-enthanophenanthridin), Lycorin (Benzopyrano-(3,4 g)-indol) và Tazettin (2-Benzopyrano-(3,4 c)-indol) Các nhóm còn lại ít thông dụng hơn, alcaloid khung Montanin hiện nay vẫn chưa tìm thấy

trong chi Crinum [100]

Khoảng 100 các hợp chất non-alcaloid được phân lập và định danh, chúng thuộc các nhóm flavonoid, chromon, coumarin, terpenoid, steroid, glycosid, ionon, alcohol, aldehyd, ceton, acid, ester và hydrocarbon mạch dài

Phenolic là nhóm chiếm ưu thế trong nhóm hợp chất non-alcaloid [91], [100]

Thân hành là bộ phận được nghiên cứu nhiều nhất, các hợp chất alcaloid và flavonoid được tìm thấy chủ yếu từ bộ phận này

4

Alcaloid của chi Crinum

Alcaloid khung Crinin:

Đây là nhóm đại diện cho alcaloid của chi Crinum do phần lớn các alcaloid đều thuộc khung này

với hơn 80 alcaloid đã được phân lập Cấu trúc các alcaloid khung này thay đổi theo 3 cấu trúc sau [91], [100]

:

Các cấu trúc alcaloid khung Crinin

Alcaloid khung Lycorin:

Lycorin là nhóm được xếp thứ hai sau nhóm Crinin về số lượng alcaloid có cấu trúc thuộc khung này với khoảng 40 alcaloid đã được phân lập Đại diện cho nhóm này là lycorin, được tìm thấy

trong 30 loài Crinum, kế đến là hippadin, pratorimin và pratorinin được tìm thấy trong 10 loài

Crinum [91], [100]

Alcaloid khung Tazettin:

Khoảng 13 alcaloid thuộc khung này, đại diện là tazttin và criwellin được tìm thấy trong 6-7 loài

Crinum.Cấu trúc các alcaloid khung Tazettin thay đổi ở các vị trí R1, R2, R3, R4, một số ít (3 alcaloid) có cấu trúc vòng methylendioxy mở và được thay bằng 2 nhóm CH3O- (ornamin-

C18H21NO3); 2 nhóm -OH (ornazidin-C16H20NO3); 1 nhóm -OH và 1 nhóm acetyl

(ornazamin-C18H22NO4)

Cấu trúc alcaloid khung Lycorin Cấu trúc khung Tazettin

N O

N O

R1

R3

R4

5

Alcaloid khung Belladin:

7 alcaloid đã được tìm thấy, đại diện là belladin [45], latisodin và latisolin [51] được phân lập từ C

asiaticum và C latifolium

Alcaloid khung Galanthamin:

Galanthamin là alcaloid đại diện cho khung này, được tìm thấy trong thân hành của 8 loài Crinum

Các alcaloid còn lại (khoảng 7 alcaloid) có cấu trúc thay đổi theo khung Galanthamin

Cấu trúc khung Belladin Cấu trúc khung Galanthamin

Alcaloid khung Lycorenin:

Các alcaloid có cấu trúc thay đổi ở các vị trí R1, R2, R3, R4.Riêng hippeastrin có cấu trúc vòng methylendioxy ở vị trí R1 và R2

Cấu trúc khung Lycorenin Cấu trúc khung Cheryllin

Các kiểu khung còn lại chứa ít số lượng alcaloid:

Alcaloidkhung Narciclasin: crinasiadin-C14H9NO3, crinasiatin-C22H17NO4 và

narcicrinin-C14H17NO5

Alcaloidkhung Cheryllin: cheryllin-C17H19NO3 và latifin-C17H19NO3

3-hydroxy-8,9-methylendioxyphenanthridin (R=OH)

Alcaloid khung Augustamin: augustamin-C17H19NO4.

Alcaloid khung Latindin: latindin-C41H31N3O10

6

Các nhóm hợp chất non-alcaloid trong chi Crinum: khoảng 100 hợp chất đã được định danh,

flavonoid là nhóm được công bố với số hợp chất được phân lập nhiều nhất [91], [100]

Nhóm flavonoid: 24 flavonoid đã được phân lập từ thân hành và hoa Hai flavonoid

3’4’-dihydroxyflavan và 7-hydroxy-8-methoxyflavanon được phân lập từ C latifolium, lần đầu tiên tìm

thấy trong họ Amaryllidaceae [89] Isoliquiritigenin (2’,4,4’-trihydroxychacon) từ C bulbispermum

là cấu trúc chalcon đầu tiên được tìm thấy trong chi Crinum [97]

Flavonoid trong chi Crinum có cấu trúc thuộc các nhóm sau:

Cấu trúc flavonoid nhóm flavan Cấu trúc flavonoid nhóm flavanon

Cấu trúc flavonoid nhóm flavon Cấu trúc flavonoid nhóm chalcon

Nhóm coumarin: chỉ mới được tìm thấy trong loàiC latifolium [89], 4-dimethoxycoumarin và 4-[(senecioyloxy)methyl]-6-7-dimethoxycoumarin

4-[(senecioyloxy)methyl]-3-Nhóm terpenoid và sterol: các steroid thực vật như stigmasterol, sitosterol, dihydrositosterol đã

được tìm thấy trong vài loài của chi Crinum

Nhóm acid béo: hơn 20 acid béo linoleic, palmitic, arachidic, myrictic, oleic, palmitic, stearic…

được định danh từ dịch chiết nước Bằng phương pháp sắc ký khí, các acid linolic, oleic và palmitic

được phát hiện trong cả lá và thân hành loài C bulbispermum Methyl linolenic, methyl palmitic, stearic được phân lập từ loài C augustum

Nhóm carbohydrat: gồm resin, pectin, hemicellulose, glucan và polysaccharid Thân hành C

amabile có đến 5,4% saccharid; 8,7% pectin và 8,2% hemicellulose Glucan A và B từ loài C latifolium, glucan A chứa 12 đơn vị glucose và 110 gốc của glucose

Glucose, arabinose, xylose, galacturonic, glucuronic được phân lập từ C bulbispermum

R3

O

R1

7

1.2.2 Thành phần hóa học của TNHC - Crinum latifolium L

Hai nhóm hợp chất alcaloid và flavonoid được nghiên cứu nhiều nhất

- Thành phần hóa học của loài C latifolium khảo sát từ năm 1982 do nhóm tác giả Ghosal S.[45],

[46], [47], [48], [49], [50], [51], [52], [53], Kobayashi S.[71], [72] thực hiện

- Những nghiên cứu ở Việt Nam về thành phần hóa học của loài này phải kể đến các công trình của các tác giả Phan Tống Sơn [8], Nguyễn Công Hào [7], [28], [88], Nguyễn Hải Nam [89], [90], Võ Thị Bạch Huệ [10], [9], [11], [12] Tác giả Nguyễn Thị Ngọc Trâm với chủ yếu là các công trình nghiên cứu

, lycorin-1-Oac [8], pratorinin [8] và khung Augustamin chỉ có 1 alcaloid là augustamin[8], [9]

- Tài liệu [9] công bố 4 alcaloid từ dịch chiết lá, trong đó 6-hydroxycrinamidin, là hợp chất alcaloid

tự nhiên lần đầu tiên được công bố (năm 1998)

Flavonoid của TNHC: so với nhóm alcaloid thì nhóm flavonoid có số lượng các hợp chất được

công bố ít hơn với 8 flavonoid như sau:

4’,7-dihydroxyflavan [89], [90] 3’4’-dihydroxyflavan [89], [90]

O

OH OH

O

OH OH

O

OH OH

OCH=CH2

O

OMe OMe

OH

O OH OH

O

OH OMe

1 11-O-acetyl ambellin[54] C20H23NO6 OMe H OMe OAc

3 Ambellin [8], [9], [45], [78], [86], [112] C18H21NO5 OMe H OMe OH

2 11-O-Acetyl-1,2-β-epoxy ambellin [54] C20H23NO6 OMe H OMe OAc

4 1,2-β-epoxy ambellin [45], [52] C18H21NO6 OMe H OMe OH

11 Undulatin [72], [78], [86], C18H21NO5 OMe H OMe H

12 6-hydroxyundulatin [8], [78] C18H21NO6 OMe OH OMe H

O

H OH

R2

N OCH3

O

OCH3OH

O

OH OH

O OH

O

O N

O OH

N

11

1.3 Tổng quan tác dụng sinh học chi Crinum và TNHC

- Tác dụng sinh học của các loài trong họ Amaryllidaceae được đề cập nhiều về khả năng kháng ung thư, tăng cường miễn dịch, kháng viêm, kháng virus, kháng khuẩn và kháng nấm

- Những năm gần đây, hoạt tính kháng AChE được khẳng định và đây là tác dụng sinh học mới của họ Amaryllidaceae [31], [32], [33], [42], [56], [63], [74], [85], [103], [115] Điều này bắt nguồn từ những nghiên cứu về tác dụng kháng AChE của galantamin – một alcaloid tự nhiên được phân lập từ loài

Galanthus woronowii [109]

- Một công trình nghiên cứu đã thực hiện trên 23 hợp chất tinh khiết được phân lập từ họ

Amaryllidaceae và 26 cao chiết từ các loài trong chi Narcissus về hoạt tính kháng AChE Kết quả

khẳng định 7 hợp chất tinh khiết có cấu trúc khung Galantamin, Lycorin và các cao chiết có thành phần là alcaloid có cấu trúc thuộc các khung này thể hiện hoạt tính kháng AChE

- Cao cồn chiết từ thân hành Ammocharis coranica thể hiện khả năng kháng AChE với IC50

=14,3 ± 0,50 μg/ml Lycorin được phân lập từ cao này với IC50 = 29,3 ± 3,15 μg/ml [42]

1.3.1 Tác dụng sinh học và công dụng của một số loài thuộc chi Crinum

Các loài trong chi Crinum được quan tâm do có nhiều tác dụng sinh học Nhóm được chú ý nhiều

nhất là nhóm alcaloid[44], [47], [91], [100], kế đến là flavonoid [27], [90]

- Trước đây, các loài này được sử dụng như thuốc cổ truyền:

Thân hành và lá tươi của các loài C amabile., C asiaticum, C defixum, C giganteum điềutrị các

chứng mụn nhọt, sưng lở, sưng do viêm [2], [18], [47]

Cao cồn và cao nước chiết từ thân hành của loài C zeylanicum được sử dụng như vị thuốc cổ

truyền trong điều trị các chứng viêm, vết thương mưng mủ, trị rắn cắn Dịch ép từ lá tươi dùng để trị chứng đau tai[91], [111]

- Các công trình khoa học cho thấy các loài trong chi Crinum thể hiện hoạt tính sinh học chung

của họ Amaryllidaceae [44], [91], [100] như sau:

Tác dụng kháng AChE:

- Thử nghiệm sàng lọc khả năng kháng AChE bằng phương pháp SKLM với chất đối chiếu

galantamin, thuốc thử DNTB/ATCI Mẫu thử là 15 cao methanol từ thân hành của 15 loài trong

12

họ Amaryllidaceae Cao chiết C powellii và Amaryllis belladonna ở nồng độ 10 mg/ml thể hiện

hoạt tính cao nhất [101]

- Cao thân hành của C bulbispermum kháng AChE với IC50 = 0,14 ± 0,039 µg/ml và C moorei

vớiIC50 = 21,5 ± 8,40 µg/ml Hoạt tính này được giải thích là do thành phần alcaloid [30], [43]

- Cao methanol từ thân hành của loài C jagus (% ức chế 45,1%), và C glaucum (40,8%)ở nồng

độ 100 µg/ml Tính kháng AChE liên quan đến sự hiện diện của nhóm hydroxy tự do trong cấu trúc phân tử alcaloid [58]

Tác dụng chống oxi hóa:

- Liều 200 mg/kg, cao ethanol của loài C asiaticum làm giảm lượng đường trong máu, giảm

cholesterol, triglycerid, LDL và tăng HDL được quan sát sau 15 ngày điều trị Đồng thời, các chỉ

số men gan đều giảm chứng tỏ cao chiết có thể bảo vệ tế bào gan theo cơ chế chống oxi hóa trên

mô gan của chuột bị tiểu đường [61]

- Một số cao chiết từ thân hành được thử hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp đánh bắt gốc

tự do với thuốc thử DPPH, kết quả như sau:

Cao methanol C moorei chống oxi hóa với EC50=5,06 ± 1,54 (µg/ml) tương đương với vitamin C

EC50 = 5,06 ± 0,2 (µg/ml) [43]

Cao ethanol C defixum có %AA 79,01% hoạt tính chống oxi hóa so với vitamin C là 82,71% và

quercetin 85,19% cùng liều thử nghiệm (25 µg/ml) [80]

Cao chiết từ C jagus (50 μg/ml) có % AA = 81,47± 0,3 trong khi Vitamin C 74,1 ± 0,1 Nồng độ

400 µg/ml có %AA = 84,43 ± 4,2, viatmin C 79,24 ± 1,6 [93]

Cao ethanol C ornatum có %AA = 58,24% Từ cao ethanol, các alcaloid haemanthamin, crinamin,

lycorin, hamayne được phân lập Các alcaloid này đều có %AA nhỏ hơn cao toàn phần liều 1mg/ml Tuy nhiên, khi kết hợp 3 alcaloid lycorin, haemanthamin và crinamin cùng nồng độ 1 mg/ml thì %AA = 59,85; hoặc nồng độ 1; 1 và 0,5 (mg/ml) có %AA = 55,3; hoặc 1; 0,5 và 0,5 (mg/ml) thì %AA = 50,1 Như vậy, dạng kết hợp có khả năng chống oxi hóa cao hơn [95]

- Cao nước C bulbispermum có chỉ số kháng oxi hóa là 42,08± 2,25; chất đối chứng dương

butylated hydroxy toluen là 77,22 ± 1,27 (0,1 mg/ml) [98]

Các tác giả đều cho rằng hoạt tính chống oxi hóa là do vai trò của nhóm flavonoid và tanin có trong cây

13

Tác dụng kháng viêm:

Các thử nghiệm đều thực hiện trên động vật là chuột, mẫu thử là cao chiết nước hoặc methanol từ thân hành

- Hoạt tính kháng viêm theo các cơ chế khác nhau: cao methanol C asiaticum kháng viêm theocơ

chế kháng histamin ở liều (50 mg/kg) thực nghiệm trên chuột [105] và cao methanol C moorei

kháng enzym COX-1 (IC50 = 99,2 ± 0,96) và COX-2 (IC50 = 75,5 ± 1,5) [43]

- Cao nước từ thân hành C giganteum (200 mg/kg) thể hiện hoạt tính kháng viêm tương đương

với diclofenac (5m/kg) [67]

- Cao chiết nước C glaucum liều 400 mg/kg ức chế 60,78% cơn dị ứng phế quản trên chuột thử

nghiệm, chất đối chứng natri cromoglycat là 70,41% (50 mg/kg) [94]

Tác dụng giảm đau:

Các thử nghiệm đều thực hiện trên cao nước chiết từ thân hành trên động vật thử nghiệm là chuột:

C bulbispermum thể hiện khả năng giảm đau theo cơ chế giảm đau opioid [98], C giganteum liều

uống 200 mg/kg ức chế cơn đau khi so sánh với aspirin [67]

Phân đoạn alcaloid chiết từ cao toàn phần của C augustum ở liều 400 mg/kg thể hiện hoạt tính

kháng viêm và giảm đau [99]

1.3.2 Tác dụng sinh học và công dụng của TNHC (Crinum latifolium L.)

Dân gian sử dụng TNHC như thuốc cổ truyền: thân hành hoặc lá TNHC được xào nóng hoặc giã đắp bên ngoài trong điều trị đau khớp, mụn nhọt, áp xe mưng mủ [1]

Dịch ép từ lá trị đau tai [44] Dịch chiết nước được sử dụng để chữa ung thư vú, tử cung, tuyến tiền liệt và ung thư hầu họng, chữa bệnh đường tiêu hóa, viêm họng [1], [2]

Rất nhiều công trình khoa học công bố về hoạt tính sinh học của loài này trên cả in vitro lẫn in

vivo Các tác dụng được công bố là tính kháng khối u, kháng viêm, kháng oxi hóa

- Cao methanol chiết từ lá ức chế NF-κB, quá trình này liên quan đến tính kháng viêm và kháng ung thư [90]

- Cao methanol, cao nước chiết từ rễ, thân hành, lá và cao alcaloid ức chế sự phân bào trên mô

hình Allium Test, độc với tế bào trên Brine Shrimp Test Kết quả được so sánh với colchicin [9]

14

- Trên mô hình gây ung thư thực nghiệm trên chuột bằng cách cấy truyền tế bào ung thư sarcoma TG-180: cao cồn và cao alcaloid ngăn chặn hiệu quả giai đoạn sinh và phát triển của tế bào [9]

- Cao chiết bằng nước nóng có tác dụng kích thích sự sinh sản của tế bào lympho T trong thử

nghiệm invitro trên bạch cầu đơn nhân to ngoại vi lấy từ máu ngoại vi người Trong thử nghiệm

in vivo, tác dụng cũng tương tự: kích thích sự sinh sản và hoạt hóa tế bào lympho T trong máu

ngoại vi chuột [122] Đồng thời cao chiết này cũng ức chế sự phát triển của tế bào sarcoma thực hiện trên chuột [91], hoạt tính kháng oxi hóa, kháng viêm in vitro [82]

- Ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và hồi phục chức năng miễn dịch in vitro là hai hiệu quả đáng chú ý khi giải thích tính kháng ung thư của cao chiết từ lá C latifolium [82]

- Sản phẩm Panacrin có thành phần TNHC và một số dược liệu khác được nghiên cứu lâm sàng

về tác dụng bổ dưỡng (tăng lực, tăng trọng, tăng tính vận động trên chuột suy dinh dưỡng); chế phẩm có độ an toàn cao [22] Sử dụng Panacrin trong hỗ trợ điều trị ung thư dạ dày sau phẫu thuật cho hiệu quả rõ rệt: các chỉ tiêu về trọng lượng cơ thể, huyết học có sự khác biệt có ý nghĩa giữa nhóm chứng và nhóm nghiên cứu, thuốc được dung nạp tốt [15]

- Viên nang TNHC tác dụng điều trị rối loạn tiểu tiện ở bệnh nhân phì đại lành tính tuyến tiền liệt, kết quả đạt trên 96% Thuốc không gây biến đổi chỉ số sinh lý, huyết học, hóa sinh, chức năng gan, thận, tuần hoàn, máu cũng như chưa gây tác dụng không mong muốn ở hệ tiêu hóa, thần kinh trung ương và thần kinh thực vật [16]

- Viên Tadimax có thành phần chính là cao chiết từ lá TNHC và một số dược liệu khác cải thiện rối loạn tiểu tiện của chứng phì đại lành tính tuyến tiền liệt Thử lâm sàng so sánh với Tadenan trên 157 bệnh nhân: đáp ứng tốt 42%, khá 48% Thuốc tác dụng phụ trên hệ tiêu hóa, mẫn ngứa, chóng mặt (10%) Các biến đổi về tim mạch, huyết học, sinh hóa sau 2 tháng điều trị đều trong giới hạn bình thường [23]

15

1.3.3 Tác dụng sinh học của một vài hợp chất được phân lập từ TNHC

Các hợp chất alcaloid:

Alcaloid kiểu khung Crinin trong họ Amaryllidaceae có hoạt tính trên thử nghiệm gây chết tế bào

theo chương trình một cách chọn lọc Các thử nghiệm sàng lọc sinh học chứng tỏ crinamin và haemanthamin có hiệu quả trong thử nghiệm gây chết tế bào ung thư theo chương trình ở nồng độ

µM Cầu nối α ở vị trí C-2 và nhóm –OH tự do ở C-11 là những vị trí đóng vai trò quan trọng trong tác dụng dược lý này [81]

Pratorimin và Undulatin: khánglại sự phát triển của các tế bào gây ung thư phổi trên chuột thực

nghiệm [47]

Crinafolin và Crinafolidin: hoạt tính kháng khối u, làm giảm sự tăng trưởng của tế bào u báng

S-180 trên thử nghiệm in vivo trên chuột [53]

Lycorin, crinamin và 6-hydroxycrinamin tách từ thân hành loài C delagoense chống lại tế bào

ung thư BL-6 trên chuột [87]

Crinin và 6-hydroxybuphanidrin kháng sự tăng sinh tế bào, hiệu quả trong việc chống lại sự tăng

sinh dòng tế bào ung thư người HL-60 và MDA-MB-23 [35]

Alcaloid kiểu khung Lycorin, đại diện là Lycorin – một alcaloid được tìm thấy trong rất nhiều loài

- Ức chế sinh tổng hợp protein và DNA trong tế bào chuột, kiềm hãm sự tăng trưởng in vivo của

khối u được cấy truyền, làm giảm khả năng sống của tế bào ung thư [47]

- Với các dòng tế bào ung thư như Hep-G2 (ung thư gan), FI (ung thư màng tử cung), RD (ung thư màng tim), lycorin đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào với IC50 là 0,15 µg/ml các nhóm hydroxy

ở vị trí C1 và C2 đóng vai trò quan trọng đối với hoạt tính này vì các hợp chất 1,2-di-O-acetyllycorin

và lycorin-1,2-di-O-β-D-glucosid không còn hoạt tính [8]

- Hoạt tính kháng AChE in vitro được xác định bằng phương pháp quang phổ với thuốc thử Ellman,

IC50 = 29,3 ± 3,15 (μg/ml), chất đối chứng là physostigmin IC = 1,51 μg/ml [42]

16

- Lycorin cũng can thiệp vào sự tổng hợp acid ascorbic ở chuột thử nghiệm, chuột bị xuất huyết dưới da khi tiêm lycorin liên tiếp trong 10 ngày với liều 10 µg/g Hiện tượng này mất đi nếu tiêm

bổ sung acid ascorbic [40]

- Hoạt tính kháng viêm, giảm đau, bảo vệ gan của lycorin được thử nghiệm trên chuột Kết quả khảo sát cho thấy % hoạt tính giảm đau ở nồng độ 1 mg/kg là 11,30 ± 2,61 (%), so với morphin

10 mg/kg là 51,91 ± 10,57 (%) Hoạt tính bảo vệ tế bào gan nồng độ 2 mg/kg với các thông số ALT và AST (U/l) lần lượt là 348,0 ± 204,4 và 390,0 ± 131,6; so sánh với tetraclorua carbon 0,8 mg/kg lần lượt là 959,4 ± 152,1 và 1931,9 ± 303,6 [39], [65]

- Kháng sự sinh tổng hợp tế bào eukaryotic [64], kháng ký sinh trùng sốt rét [69], kháng virus [44]

- Bảo vệ gan chống tác động gây oxi hóa bởi CCl4 (5 mg/kg) được thử nghiệm trên chuột, chất đối chứng là silymarin [59], [60]

Lycorin, homolycorin và haemanthamin kháng HIV với IC50 = 0,4 - 7,3 μg/ml [110]

1-O-acetyllycorin: hoạt tính gây độc tế bào IC50 = 4,5 µg/ml trên dòngHep-G2 [8]

Hippadin: giảm khả năng thụ thai trên chuột khi tác động ức chế thuận nghịch trên tế bào mầm

của chuột cống đực ở giai đoạn trước khi sinh tinh [46]

1,2-β-epoxy ambellin: liều 5 µg/ml chất này có tác dụng điều hòa lympho bào lá lách chuột Hỗn

hợp ambellin và 1,2-β-epoxyambellin chống phân bào, so sánh với chất đối chiếu concavalin [52]

Các hợp chất non-alcaloid:

Isoquercitrin chống oxi hóa được xác định bằng phương pháp đánh bắt gốc tự do với thuốc thử

DPPH, IC50 = 17,9 ± 1,7 (µM/l); kháng tyrosinase với % ức chế là 54,55 ở 1000 µM [121]

Astragalin kháng viêm gây ra bởi lipopolysaccharid (i.p 5-40 mg/kg) trên phổi chuột bị tổn

thương Sáu giờ sau khi tiêm lipopolysaccharid, nồng độ các cytokin như TNF-a, interleukin-1 (IL-1) và interleukin-6 (IL-6) từ trong dịch phổi tăng đột ngột Nhưng nếu chuột được điều trị dự phòng với astragalin (50 – 75 mg/kg) thì các cytokin này giảm tuyến tính theo liều sử dụng [108]

Kaempferol là hợp chất chống oxi hóa được tìm thấy trong hầu hết các loài thực vật, nhiều nghiên

cứu cho thấy kaempferol làm giảm nguy cơ các bệnh mãn tính đặc biệt là ung thư Kaempferol giúp cơ thể chống lại gốc tự do liên quan đến sự phát triển của bệnh ung thư và ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư [37]

17

1.4 Chiết cao toàn phần từ dược liệu bằng phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn (SFE)

- Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung môi để lấy chất tan ra khỏi mô thực vật Tùy mục đích

và điều kiện trang thiết bị mà lựa chọn kỹ thuật chiết thích hợp Nhưng phải đảm bảo yêu cầu chiết được tối đa hoạt chất và tối thiểu tạp chất Ngoài các kỹ thuật chiết ngấm kiệt hay ngâm, các kỹ thuật chiết siêu âm, vi sóng, chiết với dung môi lỏng siêu tới hạn, chiết áp suất cao đã được phát triển để nâng cao chất lượng và hiệu quả của sản phẩm [26]

- Thử nghiệm so sánh hiệu quả phương pháp chiết siêu âm, vi sóng, chiết lỏng siêu tới hạn và

ngấm kiệt được thực hiện trên mẫu thử là lá của loài Mitragyna speciosa, kết quả cho thấy chiết

vi sóng cho hàm lượng alcaloid toàn phần cao nhất [96]

- Đã có những thiết bị cho chiết xuất qui mô lớn hơn nhưng các kỹ thuật này còn hạn chế vì sản phẩm có nhiều tạp chất, chủ yếu chúng được sử dụng để chuẩn bị mẫu để phân tích bằng các phương pháp SKLM, HPLC [117], [118]

, CE [120], UPLC [114]

Chiết xuất bằng CO 2 siêu tới hạn: chiết SFE đã được ứng dụng thành công trong nhiều lĩnh vực

môi trường, dược phẩm, thực phẩm và hợp chất tự nhiên Hiện nay công nghệ này được sử dụng phổ biến trong việc chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học do có nhiều ưu điểm hơn so với các phương pháp truyền thống, sản phẩm chiết tinh khiết vì không chứa dung môi [34] Nguyên lý

cơ bản phương pháp chính là độ hòa tan của các chất cần chiết vào dung môi ở nhiệt độ và áp suất tại đó dung môi ở trạng thái siêu tới hạn [5]

Trong công nghệ SFE, dung môi được lựa chọn thông dụng nhất là CO2 [41] Đây là dung môi được FDA và EFSA chứng nhận về mức độ thân thiện với môi trường [57] Ở nhiệt độ và áp suất thông thường CO2 ở trạng thái khí Nhưng khi nhiệt độ trên 31,1 oC và áp suất trên 73,9 bar, CO2 rơi vào vùng trạng thái đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn, ở đây tỷ trọng của pha lỏng - khí bằng nhau, ranh giới phân biệt giữa 2 pha biến mất Lúc này CO2 mang đặc tính của chất lỏng và chất khí [77], [83], [84]

Trạng thái vật lý này được mô tả như một chất lỏng lưu động nên còn gọi là lưu chất [5]

- Ứng dụng của phương pháp chiết SFE sử dụng CO2 làm dung môi đã được thực hiện trên nhiều lĩnh vực như chiết xuất hợp chất tự nhiên: tinh dầu [36], lipid [104], phenolic [107], saponin [106], coumarin [102], flavonoid [76], thuốc cổ truyền [66], [116] Chiết SFE cũng được sử dụng như một phương pháp chiết hay làm sạch thuốc trừ sâu cho các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên bao gồm thuốc từ dược liệu [66], [73]

18

Ngoài trang thiết bị tốn kém và vận hành phức tạp, nhược điểm lớn nhất của phương pháp SFE là cần phải khảo sát nhiều nghiên cứu để tìm các thông số tối ưu trước khi áp dụng trên mẫu thử mới như điều kiện về áp suất, thời gian, nhiệt độ, khối lượng mẫu, dung môi hỗ trợ và tỷ lệ dung môi

- Để chiết alcaloid của loài Scopolia japonica cần phải có diethylamin mới cải thiện hiệu suất chiết

hyoscyamin và scopolamin trong rễ và các bộ phận trên mặt đất [38]

1.5 Các phương pháp sắc ký đã được ứng dụng trong phân tích thành phần hóa học của cây TNHC

Trước khi cây ra hoa: undulatin chiếm hàm lượng cao nhất (19%), đến crinamidin (14%)

Crinamidin, hydroxycrinamidin gia tăng hàm lượng hydroxycrinamidin và hydroxypowellin không xuất hiện trước khi cây ra hoa

6-Sau khi cây ra hoa: không xuất hiện buphanidrin và 6-hydroxybuphanidrin, đồng thời hàm lượng

undulatin, 6-hydroxyundulatin giảm đáng kể

1.5.2 Phương pháp HPLC:

Định lượng alcaloid: chất đối chiếu là crinamidin hoặc 6-hydroxycrinamidin

19

- Hàm lượng 6-hydroxycrinamidin được xác định với đầu dò PDA Mẫu thử là cao alcaloid chiết

từ lá TNHC được hòa tan HCl 0,1 N Pha động là dung dịch KH2PO4 0,01 M (pH 2,26)– methanol (95 : 5), phát hiện ở bước sóng 224 nm Hàm lượng 6-hydroxycrinamidin là 0,024 ± 0,002% tính trên dược liệu khô [10], [9]

- Hàm lượng crinamidin được xác định bằng HPLC với đầu dò UV-Vis Chương trình pha động

là hỗn hợp đệm phosphat 100 mM (pH 3) – acetonitril, phát hiện ở bước sóng 285 nm Hàm lượng crinamidin trong dược liệu, cốm bán thành phẩm và thành phẩm của viên Crila lần lượt là 989,1± 45,0; 146,0 ± 6,5; 74,7 ± 3,8 (µg/g) [21]

- Hàm lượng crinamidin được xác định bằng HPLC với đầu dò UV-Vis Mẫu thử là alcaloid chiết

từ hoa TNHC được hòa tan trong HCl 0,1 N và được xử lý qua SFE với dung môi rửa giải là đệm phosphat 100 mM (pH 3) – acetonitril (9: 1) Pha động cũng là hệ đệm này nhưng rửa giải theo chương trình pha động Phát hiện ở bước sóng 212 nm Hàm lượng crinamidin trong mẫu nụ hoa nhỏ, búp chưa nở và hoa đã nở lần lượt là 0,0262; 0,0263 và 0,0122 (%) [25]

- Ngoài ra, alcaloid toàn phần trong lá TNHC cũng được định lượng bằng phương pháp quang phổ với kỹ thuật tạo cặp acid màu[9], [19] Hàm lượng alcaloid toàn phần được qui về 6-hydroxycrinamidin là C (%) = 0,26 ± 0,02

Định lượng flavonoid: chất đối chiếu là kaempferol Mẫu thử là bột lá và hoa TNHC được chiết flavonoid aglycon bằng cách thủy phân dịch acid với HCl 10%

- Hàm lượng kaempferol được xác định bằng HPLC, đầu dò UV-Vis Mẫu thử là flavonoid aglycon chiết từ hoa TNHC Pha động là đệm phosphat 100 mM (pH 3) – acetonitril (gradient) Bước sóng phát hiện 320 nm Hàm lượng kaempferol trong mẫu nụ hoa nhỏ, búp chưa nở và hoa đã nở lần lượt 0,0; 0,0005 và 0,0132 (%) [25]

- Điều kiện sắc ký tương tự, mẫu thử là flavonoid aglycon chiết từ lá TNHC Hàm lượng kaempferol trong lá được xác định là 225,98 ± 11,34 µg/g [24]

20

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1 Tên nội dung 1: Khảo sát các điều kiện để chiết cao toàn phần từ lá TNHC

Sản phẩm cần đạt: xác định các điều kiện tối ưu để chiết các hợp chất alcaloid, flavonoid toàn

phần từ lá Trinh nữ hoàng cung bằng phương pháp SFE và xác định dung môi để chiết ngấm kiệt

2.1.1 Mô tả nội dung:

Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện SFE (áp suất, nhiệt độ, thời gian) để chiết cao toàn phần chứa flavonoid và alcaloid từ lá TNHC và khảo sát các dung môi chiết bằng phương pháp ngấm kiệt

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp SFE: thực hiện các thí nghiệm trên cùng khối lượng mẫu, khảo sát các yếu tố:

- Nhiệt độ 40; 50 và 60 oC

- Áp suất 100; 125 và 150 bar

- Thời gian chiết: 2; 4 và 6 giờ

Dịch chiết từ các thử nghiệm được xử lý để thu được cao alcaloid toàn phần (A-SFE) Khảo sát hàm lượng hoạt chất dựa vào hàm lượng của các alcaloid (đã có được từ các thí nghiệm nhỏ với

số lượng để kiểm tra sắc ký như 6-hydroxycrinamidin; crinamidin) để tối ưu hóa điều kiện SFE

- Đối với phương pháp chiết ngấm kiệt: khảo sát các dung môi chiết cồn 96; 70 và 50% ảnh hưởng lên quá trình chiết, hiệu suất và độ tinh khiết của các cao chiết chứa alcaloid và flavonoid

2.1.3 Tên các thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Phương pháp chiết siêu tới hạn (SFE)

Cân khoảng 7,5 g bột lá TNHC nạp vào hệ thống Điều chỉnh các điều kiện chiết theo bảng 2.1; tốc độ dòng CO2 khoảng 12 g/phút; tỷ lệ dung môi hỗ trợ 15% ethanol

Hàm lượng hoạt chất trong dịch chiết SFE được phân tích bằng sắc ký lớp mỏng và HPLC

Thí nghiệm 2: Phương pháp chiết ngấm kiệt (NK)

Cân 1 kg dược liệu, làm ẩm bằng dung môi chiết khoảng 12 giờ Cho dung môi ngập dược liệu khoảng 1– 2 cm, ngâm khoảng 24 giờ Gộp các dịch chiết và thu hồi cồn đến cao đặc

Chiết cao flavonoid: cân 100 g cao cồn, hòa tan với acid hydrocloric 1%, lọc lấy dịch Lắc với

ethyl acetat Gộp các dịch chiết ethyl acetat, thu hồi dung môi được cao flavonoid (F-NK)

Chiết cao alcaloid: lớp dịch acid được kiềm hóa bằng amoniac 25% đến pH 9 – 10 Lắc với

cloroform Gộp các dịch chiết cloroform, thu hồi dung môi đến cao đặc alcaloid (A-NK)

21

Bảng 2.1: Các điều kiện chiết xuất

Mẫu Nhiệt độ (C) Áp suất (bar) Thời gian (giờ)

22

Thí nghiệm 3: Tối ưu hóa qui trình chiết alcaloid bằng phần mềm JMP 4.0

Xác định các điều kiện chiết xuất tối ưu với sự hỗ trợ của phần mềm JMP 4.0

Bước 1: khởi động phần mềm JMP 4.0 (hình 2.1)

Bước 2: Chọn DOE/ Response Surface Design Xuất hiện hộp thoại DOE có sẵn 2 yếu tố X1 và

X2 Ta tiến hành khảo sát 3 yếu tố nên sẽ “Add” thêm 1 yếu tố X3

Hình 2.1 Màn hình khởi động JMP Hình 2.2 Màn hình DOE với 3 biến số

Tiến hành đặt tên X1: “Nhiệt độ”, X2: “Áp suất”, X3: “Thời gian” Đồng thời tiến hành nhập giá trị mức dưới và mức trên của các yếu tố tương ứng tại ô -1 và 1 Nhấn “Continue”

X1: Nhiệt độ (C) ………… -1 (40) ………… 1 (60)

X2: Áp suất (bar) ……… -1 (100) ………… 1 (150)

X3: Thời gian (giờ) ………… -1 (2) ………… 1 (6)

Bước 3: chọn mô hình Box-Behnken, nhấn “Continue” (hình 2.3)

Bước 4: chọn “Generate table” với Number of center points = 3 là số thí nghiệm ở tâm, Replicates

= 0 là số lần lặp lại thí nghiệm Ta sẽ được một ma trận gồm các thí nghiệm cần phải tiến hành với Pattern là mã thí nghiệm, Y là hàm lượng chất cần phân tích

Hình 2.3 Các thiết kế JMP Hình 2.4 Các thí nghiệm cần thực hiện

Bước 5: Nhập hàm lượng 6-hydroxycrinamidin, crinamidin và 6-hydroxybuphanidrin (bảng 2.2)