Nghiên cứu quy trình công nghệ tổng hợp dược chất anastrozole từ 3 5 bis 2 cyano 2 methylethyl toluene quy mô 100g mẻ

TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Quy trình tổng hợp Anastrozole từ Ana-3 đã được nghiên cứu và cải tiến qua các patent đã công bố với tác nhân để sử dụng cho phản ứng brom hóa Ana-3 là N-brom

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM VIỆN HÀN LÂM KH VÀ CN VIỆT NAM

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN KHOA HỌC VẬT LIỆU ỨNG DỤNG

BÁO CÁO NGHIỆM THU

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ TỔNG HỢP DƯỢC CHẤT ANASTROZOLE TỪ 3,5-BIS(2-CYANO-2- METHYLETHYL)TOLUENE QUY MÔ 100G/MẺ

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: GS.TS NGUYỄN CỬU KHOA

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/ 2016

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ TỔNG HỢP DƯỢC CHẤT ANASTROZOLE TỪ 3,5-BIS(2-CYANO-2- METHYLETHYL)TOLUENE QUY MÔ 100G/MẺ

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/ 2016

TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Quy trình tổng hợp Anastrozole từ Ana-3 đã được nghiên cứu và cải tiến qua các patent đã công bố với tác nhân để sử dụng cho phản ứng brom hóa Ana-3 là N-bromsuccimide và benzoyl peroxide trong các dung môi CCl4, CH2Cl2, và CH3CN Sau

đó, Anastrozole được tổng hợp bằng cách phản ứng Ana-4 thô với 1,2,4-sodium triazole trong dung môi DMF Nhược điểm của quy trình này là việc sử dụng các dung môi Clo hóa độc hại và DMF Đồng thời, việc sử dụng tác nhân NBS trong dung môi acetonitril cho nhiều loại sản phẩm phụ hơn Do đó, gây khó khăn cho quá trình tách sắc ký cuối cùng vì Ana-4 được phản ứng trực tiếp với 1,2,4- sodium triazole mà không qua quá trình tinh chế nào khác

Do đó, để tối ưu quy trình tổng hợp Anastrozole từ Ana-3, các điều kiện khảo sát khác nhau cho 2 phản ứng tổng hợp Ana-4 từ Ana-3 và phản ứng tổng hợp Anastrozole

từ Ana-4 đã được thực hiện Cụ thể như sau:

a) Khảo sát phản ứng tổng hợp Ana-4 từ Ana-3 với các điều kiện khác nhau gồm: dung môi phản ứng, tỉ lệ tác chất, thời gian thực hiện, xúc tác và tác nhân brom hóa

b) Khảo sát phản ứng tổng hợp Anastrozole từ Ana-4 với các điều kiện khác nhau gồm: dung môi phản ứng, tỉ lệ tác chất sử dụng

c) Khảo sát hỗ trợ của vi sóng và siêu âm trong 2 phản ứng tổng hợp Ana-4 và Anastrozole

Đối với phản ứng tổng hợp Ana-4 từ Ana-3 bằng NBS, các kết quả khảo sát cho thấy acetonitril không phải là dung môi thay thế hữu hiệu cho các dung môi clo hóa với

độ chuyển hóa cũng như hiệu suất thấp Việc sử dụng xúc tác acid sulfuric, độ chuyển hóa Ana-3 được đẩy lên tối đa, tuy nhiên số loại sản phẩm phụ cũng tăng lên do sự chuyển hóa monoacid và diacid của gốc CN dưới sự tác động của acid

Bằng việc sử dụng hệ KBrO3/NaHSO3, tôi đã tìm được điều kiện thích hợp để tổng hợp Ana-4 từ Ana-3 với độ chuyển hóa cao (>90%) đồng thời phản ứng được tiến hành trong dung môi ethyl acetate và H2O, vì vậy tránh được việc sử dụng các dung môi độc hại Hơn nữa, kết quả HPLC cho thấy chỉ có udy nhất một loại sản phẩm phụ sinh ra, do

đó quá trình tách sắc kí cột cuối cùng để tinh chế Anastrozole sẽ thuận lới hơn

Đối với phản ứng tổng hợp Anastrozole từ Ana-4, kết quả khảo sát cho thấy aceton

là dung môi phù hợp để thay thế cho DMF với hiệu suất cao, độ chuyển hóa tối đa, tỉ lệ TMTADMBA thấp Đồng thời, do nhiệt độ sôi thấp, do đó dung môi có thể dễ dàng được loại bỏ khỏi phản ứng

Từ các kết quả trên, quy trình tổng hợp tối ưu Anastrozole từ Ana-3 đã được đề xuất với hiệu suất khoảng 70% Đồng thời quy trình đề xuất cũng đưa ra quy trình làm sạch anastrozole đảm bảo tiêu chuẩn USP36 về hàm lượng sản phẩm phụ Các thiết bị và thông số thiết bị cần dùng cho quy trình tổng hợp pilot 50g Anastrozole cũng đã được

SUMMARY OF RESEARCH CONTENT

The process for preparation of Anastrozole from 3,5-bis(2-cyanoprop-2-yl)Toluene (Ana-3) has been studied and published in recent patents which comprises: a) Bromination of Ana-3 in an organic solvent (CCl4, CH2Cl2, CH3CN) using N-bromosuccimide with a radical initiator (Benzoyl peroxide, AIBN); b) Reacting crude 3,5-bis(2-cyanoprop-2-yl)benzylbromide (Ana-4) with 1,2,4-sodium triazole in DMF The use of carcinogenic solvent like CCl4, DMF is disadvantageous with respect to industrial scale Beside, the use of NBS with acetonitrile as a alternate solvent gives more by-products Thus, the Ana-4 in the process is not isolated or further purified, but is directly converted to anstrozole in situ As the result, an impure final product is obtained

To optimize the process for preparation of Anastrozole from Ana-3, different reaction conditions for the preparation of Ana-4 from Ana-3 and the prepartion of Anastrozole from Ana-4 were carried out Included:

a) For the preparation of Ana-4 from Ana-3, 5 parameters were selected including: 1) selection of solvent, 2) selection of brominating agent, 3) presence of sulfuric acid, 4) reaction time and 5) molar ratio of NBS toward Ana-3

b) For the preparation of Anastrozole from Ana-4, 2 parameters were selected including: 1) selection of solvent, 2) molar ratio of 1,2,4-sodium triazole toward Ana-4

c) Preparion of Ana-4 with microwave and ultra sound assisted

Based on the results, it was concluded that acetonitrile is not a good alternate solvent for the preparation of Ana-4 with NBS while the conversion of Ana-3 is low By using a small amount of sulfuric acid, the reaction was pushed to completed with higher conversion of ana-3 and higher yield However, more impurities were detected One of those are monoacid and diacid of Ana-3/Ana-4 formed under acidic solution

A simple, regioselective, and economical method for preparation of cyanoprop-2-yl)benzylbromide from 3,5-bis(2-cyanoprop-2-yl)toluene is reported By using brominating agent potassium bromate/ sodium bisulfite in two-phase solvent water/ ethyl acetate, the bromination can be carried out under medium temperature of 50oC, giving the higher yield of product and lower the number of by-products All the reaction parameters are optimized The conversion of more than 80% is achieved

3,5-bis(2-For the preparation of Anastrozole form Ana-4, it was concluded that acetone is a good alternate solvent for the reaction The conversion is completely and the yield is comparable to those reactions carried out in DMF Beside, the by-product TMTADMBA formed is much lower compared to other solvents like 2-propanol Due to low boiling point, acetone is more easily to remove from reaction than DMF

An optimized process for preparation Anastrozole from Ana-3 is reported based on the optimized results above The overall yield is 70% Beside, a process for purify Anastrozole from isometric isomer is reported with the purified product of 99.9% All the equipments and their parameters for pilot-scale synthesis of 50g Anastrozole have been recommended

All the equipments and their parameters for pilot-scale synthesis of 100g Anastrozole have been recommended

The obtained results indicated that we had successfully synthesized all the intermediates and the final product with high yield and purity Presently, we are continuing to improve the synthetic methods

MỤC LỤC

Trang

I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.3 Các công trình nghiên cứu về quy trình tổng hợp Anastrozole từ Ana-3 10

2.2 Hoàn thiện quy trình tổng hợp Anastrozole từ 3,

Nội dung 2.2.1: Qui trình hoàn chỉnh, tinh chế và xác định thành phần cấu trúc

tiền chất

17

Nội dung 2.2.2: Qui trình tổng hợp, tinh chế sản phẩm Anastrozole trong phòng

thí nghiệm và phân tích thành phần, cấu trúc của sản phẩm thu được 20

Nội dung 2.3.1: Xây dựng quy trình tổng hợp tiền chất (Ana-4) và sản phẩm

Nội dung 2.3.2: Xây dựng qui trình làm sạch sản phẩm 28

Nội dung 2.3.3: Lắp ráp, xây dựng hệ thống sản xuất Anastrozole và tiến hành

Nội dung 2.3.5: Xác định hiệu suất, độ sạch và độ ổn định của sản phẩm 37

Nội dung 2.3.6: Đánh giá độ ổn định và thời gian bảo quản bằng phương pháp

3.2 Hoàn thiện quy trình tổng hợp Anastrozole từ 3,

Nội dung 3.2.1: Qui trình hoàn chỉnh, tinh chế và xác định thành phần cấu trúc

Nội dung 3.2.2: Qui trình tổng hợp, tinh chế sản phẩm Anastrozole trong phòng

thí nghiệm và phân tích thành phần, cấu trúc của sản phẩm thu được 53

Nội dung 3.3.1: Xây dựng quy trình tổng hợp tiền chất (Ana-4) và sản phẩm

Nội dung 3.3.3: Lắp ráp, xây dựng hệ thống sản xuất Anastrozole và tiến hành

Nội dung 3.3.4: Xác định thành phần cấu trúc sản phẩm 74

Nội dung 3.3.5: Xác định hiệu suất, độ sạch và độ ổn định của sản phẩm 79

Nội dung 3.3.6: Đánh giá độ ổn định và thời gian bảo quản bằng phương pháp

PHỤ LỤC 3 Các văn bản liên quan

Thuyết minh đề tài Hợp đồng khoán nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ Thẩm tra quyết toán năm 2014

Thẩm tra quyết toán năm 2015

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ana-3 3,5-bis(2-cyanoprop-2-yl)Toluene

HPLC High pressure liquid chromatography, sắc kí lỏng cao áp

MS Mass spectrometry, phổ khối lượng

NMR Nuclear magnetic resonance, phổ cộng hưởng từ hạt nhân

RRT Thời gian lưu

TBAB Tetrabutylammonium bromide

TLC Thin layer chromatography, sắc kí lớp mỏng

TMTAMBDA

α,α,α’,α’-tetramethyl-5-(4H-1,2,4-triazol-4-ylmethyl)-1,3-benzendiacetonitrile

Bảng 3 Hàm lượng tác chất và thời gian khảo sát phản ứng tổng hợp

Bảng 4 Kết quả khảo sát hiệu suất phản ứng thay đổi theo ảnh hưởng

Bảng 5 Phản ứng tổng hợp Ana-4 ở các tỉ lệ tác chất khác nhau 18

Bảng 6 Bố trí thí nghiệm toàn phần của phản ứng tổng hợp Ana-4 ở

các điều kiện nhiệt độ-thời gian khác nhau 19

Bảng 7 Bố trí thí nghiệm toàn phần của phản ứng tổng hợp

Anastrozole ở các điều kiện tì lệ tác chất-thời gian khác nhau 22

Bảng 8 Thành phần tỉ lệ các chất có trong sản phẩm Ana-4 sau phản

Bảng 9 Danh sách thiết bị sử dụng trong sản xuất Anastrozole quy

Bảng 10 Hiệu suất tái kết tinh sản phẩm anastrozole 34

Bảng 11 Kết quả phân tích hàm lượng kim loại nặng trong Ana-3 và

Bảng 17 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến

Bảng 18 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ mol NBS: Ana-3 đến

Bảng 19 Kết quả khảo sát hiệu suất tổng hợp Ana-4 bằng KBrO3 ở các

điều kiện dung môi, tỉ lệ tác chất khác nhau 45

Bảng 20 Kết quả phân tích 1H NMR và 13C NMR của Ana-4 tổng hợp

Bảng 26 Kết quả khảo sát phản ứng tổng hợp Anastrozole từ Ana-4

Bảng 27 Kết quả khảo sát phản ứng tổng hợp Anastrozole từ Ana-4

trong aceton với tỉ lệ mol 1,2,4-sodium triazole khác nhau 51

Bảng 28 Kết quả khảo sát hiệu suất phản ứng thay đổi theo ảnh hưởng

Bảng 29 So sánh kết quả dự đoán từ mô hình với hiệu suất thực tế thu

Bảng 30 So sánh kết quả dự đoán từ mô hình với hiệu suất thực tế thu

Bảng 31 Kết quả thực nghiệm phản ứng tổng hợp Anastrozole ở điều

Bảng 32 Thành phần tỉ lệ các chất có trong sản phẩm Ana-4 sau phản

Bảng 33 Hiệu suất tái kết tinh sản phẩm anastrozole 64 Bảng 34 Kết quả phân tích HPLC của sản phẩm 5 lần lập lại 64 Bảng 35 Kết quả phân tích phổ 1H & 13C NMR của Ana-4 71

Bảng 36 Thời gian lưu và phổ MS các sản phẩm phản ứng tổng hợp

Ana-4 với KBrO3/NaHSO3

71

Bảng 37 Thành phần tỉ lệ các chất có trong sản phẩm Ana-4 sau phản

Bảng 38 Kết quả phân tích phổ 1H & 13C NMR của Ana-4 76

Bảng 39 Thời gian lưu và phổ MS các sản phẩm phản ứng tổng hợp

Ana-4 với KBrO3/NaHSO3

77 Bảng 40 Hiệu suất tái kết tinh sản phẩm anastrozole 78 Bảng 41 Kết quả phân tích HPLC của sản phẩm 5 lần lập lại 79

Bảng 43 Kết quả phân tích hàm lượng nước Anastrozole 83 Bảng 44 Kết quả phân tích hàm lượng cắn sau nung 83 Bảng 45 Kết quả phân tích hàm lượng cắn sau nung 83 Bảng 46 Kết quả phân tích ẩm độ và kim loại nặng Anastrozole 84 Bảng 47 Phân tích tạp chất tương cận trong sản phẩm Anastrozole 84

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Công thức cấu tạo của Tamoxifen và Nolvadex 6 Hình 2 Công thức cấu tạo của một số các hoạt chất AI thông dụng 7

Hình 5 Sản phẩm phụ của nhóm thế Succimide với Ana-3 11

Hình 6 Hợp chất α ,α, α’,

α’-Tetramethyl-5-(4H-1,2,4-triazol-4-ylmethyl)-1,3-benzendiacetonitrile (TMTAMBDA) 12 Hình 7 Kết quả phân tích HPLC của mẫu chuẩn Ana-3 19

Hình 9 Hệ thống phản ứng Pilot và thiết bị cô quay 23 Hình 10 Phân tích thành phần sản phẩm bằng phương pháp HPLC 25

Hình 12 Kết quả phân tích HPLC của mẫu chuẩn Ana-3 41

Hình 14 Kết quả theo dõi TLC của phản ứng tống hợp Ana-4 bằng

NBS không có xúc tác acid (trái) và có xúc tác H2SO4 (phải) 43 Hình 15 Các sản phẩm phụ moniacid, diacid của Ana-3 và Ana-4 44

Hình 16 Kết quả theo dõi TLC của phản ứng tống hợp Ana-4 bằng

KBrO3

46

Hình 18 Quá trình phân mảnh của đồng phân TMTAMBDA 50 Hình 19 Biểu đồ thể hiện sự tương thích giữa mô hình và thực nghiệm 53 Hình 20 Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ điến hiệu suất phản ứng 53 Hình 21 Đồ thị ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất phản ứng 53 Hình 22 Vùng đáp ứng sự tương quan giữa nhiệt độ-thời gian đến hiệu

Hình 23 Bề mặt đáp ứng sự tương quan giữa nhiệt độ-thời gian đến

Hình 24 Sơ đồ quy trình thiết bị tổng hợp Ana-4 từ Ana-3 57 Hình 25 Biểu đồ thể hiện sự tương thích giữa mô hình và thực nghiệm 57 Hình 26 Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ điến hiệu suất phản ứng 58 Hình 27 Đồ thị ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất phản ứng 58

Hình 28 Vùng đáp ứng sự tương quan giữa nhiệt độ-thời gian đến hiệu

Hình 29 Bề mặt đáp ứng sự tương quan giữa nhiệt độ-thời gian đến

Hình 30 Phân tích thành phần sản phẩm bằng phương pháp HPLC 63

Hình 32 Sắc kí đồ HPLC của mẫu chuẩn anastrozole 65

Hình 42 Sơ đồ quy trình thiết bị tổng hợp Anastrozole từ Ana-4 69 Hình 43 Phân tích thành phần sản phẩm bằng phương pháp GC-MS 72 Hình 44 Phân tích MS của tạp chất trong sản phẩm 72 Hình 45 Phổ MS của sản phẩm phụ có thời gian lưu Ana-4 72 Hình 46 Sự phân mảnh của sản phẩm phụ thế vòng 25 73

Hình 47 Sự phân mảnh của Ana-4 73

Hình 49 Phân tích thành phần sản phẩm bằng phương pháp HPLC 75 Hình 50 Phân tích thành phần sản phẩm bằng phương pháp GC-MS 76 Hình 51 Phân tích MS của tạp chất trong sản phẩm 77 Hình 52 Phổ MS của sản phẩm phụ có thời gian lưu Ana-4 77 Hình 53 Sự phân mảnh của sản phẩm phụ thế vòng 25 78

DANH MỤC QUY TRÌNH

Quy trình 1 Tổng hợp Anastrozole từ

Quy trình 2 Tổng hợp Anastrozole từ 3,5-bis(bromo-methyl)Toluene 9 Quy trình 3 Tổng hợp anastrozole với tác nhân Hydrazine 9

Quy trình 5 Cơ chế phản ứng tổng hợp Ana-4 từ Ana-3 với NBS/BPO 11 Quy trình 6 Quy trình tổng hợp tối ưu Anastrozole từ Ana-3 52 Quy trình 7 Quy trình thực hiện tổng hợp Ana-4 từ Ana-3 56

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3 Quy trình làm sạch anastrozole độ tinh khiết 99.9% 26

Sơ đồ 4 Quy trình tinh chế anastrozole bằng phương pháp tái kết tinh

Sơ đồ 5 Quy trình tổng hợp và tinh chế anastrozole từ Ana-4 qui mô

Sơ đồ 6 Quy trình tổng hợp Anastrozole quy mô pilot 61

Sơ đồ 7 Quy trình làm sạch Anastrozole độ tinh khiết 99.9% 63

Sơ đồ 8 Quy trình tổng hợp và tinh chế anastrozole từ Ana-4 qui mô

BẢNG QUYẾT TOÁN KINH PHÍ NĂM 2014

Đề tài: Nghiên cứu quy trình công nghệ tổng hợp dược chất anastrozole từ 3,

5-bis(2-cyano-2-methylethyl)toluene quy mô pilot 100g/mẻ

Chủ nhiệm đề tài : GS.TS Nguyễn Cửu Khoa

Thời gian thực hiện : 12/2014 – 12/2016

Tổng kinh phí được duyệt : 1.430.000.000 đồng

Theo TB số: 297/TB-SKHCN ngày 19/12/2014 Số tiền: 715.000.000 đồng

Kinh phí được cấp trong năm: (theo TB)

Kinh phí quyết toán trong năm: (theo UNC)

Công chất xám

Công thuê khoán

Nguyên, nhiên, vật liệu, phụ tùng,

Thiết bị, sửa chữa

Xét duyệt, giám định, nghiệm thu

Hội nghị, hội thảo

Đánh máy tài liệu, VPP…

Thông tin liên lạc, công tác phí

Chi phí điều hành

Kinh phí nộp Ngân sách

Kinh phí cấp đợt sau

715.000.000 715.000.000

12.000.000 202.000.000 478.250.000

0 4.750.000

0 3.650.000

0 18.000.000

0

0

BẢNG QUYẾT TOÁN KINH PHÍ NĂM 2015

Đề tài: Nghiên cứu quy trình công nghệ tổng hợp dược chất anastrozole từ 3,

5-bis(2-cyano-2-methylethyl)toluene quy mô pilot 100g/mẻ

Chủ nhiệm đề tài : GS.TS Nguyễn Cửu Khoa

Thời gian thực hiện : 12/2014 – 12/2016

Tổng kinh phí được duyệt : 1.430.000.000 đồng

Theo TB số: 394/TB-SKHCN ngày 25/12/2015 Số tiền: 572.000.000 đồng

Kinh phí được cấp trong năm: (theo TB)

Kinh phí quyết toán trong năm: (theo UNC)

Công chất xám

Công thuê khoán

Nguyên, nhiên, vật liệu, phụ tùng,

Thiết bị, sửa chữa

Xét duyệt, giám định, nghiệm thu

Hội nghị, hội thảo

Đánh máy tài liệu, VPP…

Thông tin liên lạc, công tác phí

Chi phí điều hành

Kinh phí nộp Ngân sách

Kinh phí cấp đợt sau

572.000.000 574.200.000

12.000.000 320.000.000 218.400.000

0 5.800.000

0

0

0 18.000.000

0

0

PHẦN MỞ ĐẦU

Tên đề tài: Nghiên cứu quy trình công nghệ tổng hợp dược chất Anastrozole từ 3,

5-bis(2-cyano-2-methylethyl)toluene quy mô pilot 100g/mẻ

Chủ nhiệm đề tài: GS.TS Nguyễn Cửu Khoa

Cơ quan chủ trì: Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng

Thời gian thực hiện: 24 tháng

Kinh phí được duyệt: 1430 triệu

Kinh phí đã cấp giai đoạn 1: 715 triệu theo TB số: 297/TB-SKHCN ngày 19/12/2014

Kinh phí đã cấp giai đoạn 2: 572 triệu theo TB số: 394/TB-SKHCN ngày 25/12/2015

I Hoàn thiện quy trình tổng hợp Anastrozole từ methylethyl)toluene ở quy mô phòng thí nghiệm

3,5-bis(2-cyano-2-Nội dung I.1: Qui trình

- Báo cáo kết quả phân tích thành phần, cấu trúc bằng các phương pháp phân tích hiện đại

- Đã báo cáo qui trình tổng hợp và tinh chế tiền chất 3,5-bis(2-cyanoprop-2-

yl)benzylbromide ở qui mô phòng thí nghiệm (0,1g/mẻ)

- Đã khảo sát phản ứng khi thay đổi các tác nhân brom hóa

- Đã khảo sát phản ứng trong điều kiện siêu âm, microwave

- Đã khảo sát thay đổi tỷ lệ tác

Nội dung I.2: Qui trình

- Báo cáo kết quả phân tích thành phần, cấu trúc bằng các phương pháp phân tích hiện đại

- Đã khảo sát thay đổi tỷ lệ tác chất phản ứng

- Đã khảo sát thay đổi nhiệt độ phản ứng

- Đã khảo sát thay đổi dung môi phản ứng

-Đã tinh chế Anastrozole bằng HPLC

- Phân tích thành phần, cấu trúc của Anastrozole bằng các phương pháp phân tích hiện đại 1H-NMR, 13C-NMR

II Xây dựng hệ thống sản xuất pilot 100g/mẻ

Nội dung II.1: Xây

dựng quy trình tổng hợp

tiền chất (Ana-4) và sản

phẩm Anastrozole ở

quy mô sản xuất

Báo cáo xây dựng qui trình tổng hợp sản phẩm

Đã xây dựng hệ thống phản ứng tổng hợp tiền chất ở quy

mô sản xuất 100g/mẻ trên cơ

sở thử nghiệm ở qui mô 5g/mẻ -Thiết kế hệ thống khung đỡ, bơm chân không, bình phản ứng

- Thực hiện phản ứng tổng hợp tiền chất

- Lặp lại phản ứng ở điều kiện tối ưu

Nội dung II.2: Xây

dựng qui trình làm sạch

sản phẩm

Báo cáo xây dựng qui trình tinh chế sản phẩm (lặp lại 3 lần)

Đã xây dựng qui trình tinh chế tiền chất và sản phẩm Anastrozole ở quy mô sản xuất 100g/mẻ trên cơ sở thử nghiệm ở qui mô 5-10g/mẻ -Thiết kế hệ thống cột

- Thực hiện tinh chế tiền chất

và sản phẩm

- Xác định thành phần chất lượng sản phẩm bằng HPLC

- Đánh giá độ ổn định quy trình tổng hợp và tinh chế sản phẩm trung gian

+ Tính tổng lượng tạp chất trong nguyên liệu

+ Đo nhiệt độ nóng chảy + Xác định lượng kim loại nặng

+ Xác định cấu trúc và độ tinh khiết của nguyên liệu bằng phổ nghiệm IR, NMR, HPLC,

+ Thử độ hòa tan trong các dung môi cơ bản: methanol, ethanol, THF, acetonitril,

Nội dung II.3: Lắp ráp,

+ Hệ thống phản ứng 30 lít + Hệ thống cô quay 10 lít + Hệ thống cột

2 Tiến hành sản xuất

thử nghiệm pilot

Tiến hành sản xuất thử nghiệm tổng hợp Anastrozole ở qui mô pilot 100g/mẻ

Đã tiến hành sản xuất thử nghiệm tổng hợp Anastrozole

ở qui mô pilot 100g/mẻ (lặp lại 3 lần)

3 Tiến hành tinh chế

sản phẩm

Đã tiến hành tinh chế sản phẩm bằng cột và kết tinh lại

Nội dung II.4: Xác

định thành phần cấu

trúc sản phẩm

Báo cáo xác định thành phần cấu trúc sản phẩm

- Đánh giá độ ổn định của quy trình tổng hợp Anastrozole + Tính tổng lượng tạp chất trong sản phẩm

+ Đo nhiệt độ nóng chảy + Xác định lượng kim loại nặng

+ Xác định cấu trúc và độ tinh khiết của sản phẩm bằng phổ nghiệm IR, NMR, HPLC, + Thử độ hòa tan trong các dung môi cơ bản: methanol, ethanol, THF, acetonitril,

Nội dung II.5: Xác

- Đã thực hiện các tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu

Anastrozole theo USP 36

- Đã xác định hiệu suất phản ứng trong quá trình tổng hợp

và tinh chế sản phẩm

- Đã đánh giá độ sạch bằng HPLC

- Đã đánh giá độ ổn định của quy trình tinh chế anastrozole

Nội dung II.6: Đánh

giá độ ổn định và thời

gian bảo quản bằng

phương pháp lão hóa

cấp tốc

Báo cáo về độ ổn định của sản phẩm

Đang đánh giá độ ổn định và thời gian bảo quản bằng phương pháp lão hóa cấp tốc

III Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của sản phẩm anastrozole

Xây dựng tiêu chuẩn cơ

Báo cáo kết quả nghiên cứu

độ ổn định và thời gian bảo

quản của sản phẩm

Anastrozole

1 Dạng kết quả III Đã có

DANH MỤC SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

DẠNG KẾT QUẢ I, II

TT Tên sản phẩm Số lượng Chỉ tiêu kinh tế

1 Anastrozole 0.1 kg Tiêu chuẩn dược

điển USP Dạng kết quả I Đã có

I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về bệnh ung thư vú và Anastrozole

1.1.1 Ung thư vú và liệu pháp điều trị bằng Hoocmon

Ung thư vú là loại ung thư phổ biến và gây tử vong nhiều nhất cho phụ nữ Nguyên nhân gây ra bệnh ung thư vú khá đa dạng gồm những nguyên nhân do các yếu tố di truyền, bệnh lý hay môi trường Trong đó, nội tiết là yếu tố nguy cơ quan trọng của ung thư vú Thời gian tiếp xúc của estrogen và progesterone nội sinh càng lâu nguy cơ ung thư vú càng cao [1]

Estrogen được sản xuất chủ yếu từ buồng trứng cho đến trước khi mãn kinh Sau mãn kinh, estrogen được sinh ra từ các tuyến thượng thận và mô mỡ Khi estrogen vào tế bào

vú, nó gắn vào các thụ thể estrogen, làm mô vú bình thường tăng trưởng Ở một số trường hợp ung thư vú, estrogen gây nên sự tăng trưởng của các tế bào ung thư, do các tế bào này có chứa các thụ thể estrogen (ung thư có thụ thể dương tính-viết tắt là ER+) Ở một số các bệnh nhân khác, tế bào ung thư không có các thụ thể estrogen, nên không phụ thuộc vào lượng hoocmon Đó là các ung thư vú với ER-

Phương pháp điệu trị hoocmon có thể phân được thành 2 nhóm:

 Nhóm 1 bao gồm các chất kháng estrogen Các thuốc này không có tác dụng điều chỉnh nồng độ estrogen, chúng lại ngăn ngừa estrogen làm tăng trưởng tế bào ung thư bằng cách gắn dính vào các thụ thể estrogen và khóa các thụ thể này

 Nhóm 2 gồm các hoạt chất làm giảm sự sản xuất của estrogen, điển hình là các chất khóa men aromatase (aromatase inhibitors)

Tamoxifen (được lưu hành trên thị trường với tên thương mại Nolvadex) là chất kháng estrogen (thuộc nhóm 1) được dùng rộng rãi nhất từ trước tới nay để điều trị ung thư vú Tuy vậy, một số tác dụng phụ, đặc biệt là ung thư nội mạc tử cung và tắc mạch huyết khối là những nhược điểm của tamoxifen

Hình 1 Công thức cấu tạo của Tamoxifen và Nolvadex

1.1.2 Các chất ức chế Aromatase (Aromatase Inhibitor-AI)

Nhằm tăng độ an toàn cho bệnh nhân sử dụng thuốc, các nghiên cứu đối với thuốc kháng aromatase đã và đang thực hiện Aromatase là enzyme có nhiệm vụ chuyển đổi các androgen thành các estrogen, thuốc kháng aromatase tác động bằng cách ức chế hoạt động của enzyme này Hiện nay có 2 loại hoạt chất AI:

 Loại 1 (steroidal inactivators) là loại tương tự androgen steroid, có tác dụng vững chắc (không đảo ngược) lên men aromatase như Androstenedione, Formestane, Exemestane

 Loại 2 gồm loại triazol không steroid gây ra sự ức chế bằng cách gắn tạm vào enzyme aromatase như các thuốc anastrozle, letrozole và Aminoglutethimide

Hình 2 Công thức cấu tạo của một số các hoạt chất AI thông dụng

Hiện nay, trong điều trị ung thư vú, có ba phương thức sử dụng thuốc kháng aromatase: (1) Sử dụng ngay sau khi phẫu thuật

(2) Điều trị tiếp theo sau khi đã sử dụng tamoxifen 2-3 năm

(3) Điều trị mở rộng sau khi đã điều trị tamoxifen 5 năm

1.1.3 Anastrozole

Anastrozole, công thức hóa học 1,3-benzene-diacetonitrile, 5-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl) là thuốc ức chế men aromatase thuộc nhóm không steroid, có tính chọn lọc cao và tác dụng mạnh Anastrozole làm giảm nồng độ estrogen

α,α,α’,α’-tetramethyl-ở phụ nữ sau mãn kinh, làm chậm sự phát triển của một số loại ung thư vú cần estrogen

để phát triển trong cơ thể (hormone receptor positive tumors, ER+) Anastrozole được

lưu hành với tên thương mại ARIMIDEX® do công ty AstraZeneca sản xuất, hàm lượng 1mg mỗi viên uống [1]

Hình 3 Công thức cấu tạo của Anastrozole 1.2 Các quy trình tổng hợp Anastrozole đã được công bố

Quy trình tổng hợp Anastrozole đầu tiên được đề xuất bởi Edwards và cộng sự vào năm

1990 (U.S Pat Nos 4,935,437) [2] và được AstraZeneca đăng kí dưới mã RE 36617

Bằng sáng chế đã đưa ra 2 quy trình tổng hợp cho Anastrozole Quy trình đầu tiên được xuất phát từ methyl-3,5-dimethylbenzoate, qua 6 bước phản ứng Quy trình thứ hai đi từ 3,5-bis(bromo-methyl)toluene qua 3 bước phản ứng Đây là quy trình được quan tâm và nghiên cứu nhiều do quá trình tổng hợp ngắn và đơn giản Tuy nhiên, nhược điểm của cả

2 quy trình là sử dụng những tác chất, dung môi độc hại cho con người và môi trường như CCl4, benzoyl peroxide, DMF…

Quy trình 1 Tổng hợp Anastrozole từ 1,3-bis(bromomethyl)-5-methylbenzoate

Tác chất và điều kiện phản ứng.(i)NBS, BPO, CCl4; (ii)KCN, TBAB, H2O/ CH2Cl2; (iii) NaH, MeI, DMF; (iv) LiBH4, THF; (v) Pyr, CH2Cl2, SOCl2; (vi) 1,2,4-triazole, DMF

Quy trình 2 Tổng hợp Anastrozole từ 3,5-bis(bromo-methyl)toluene

Tác chất và điều kiện phản ứng (i) KCN, H2O/CH2Cl2; (ii) NaH, MeI, DMF; (iii) NBS, BPO, CCl4; (iv) sodium triazole, DMF

Ngoài ra, trong một bằng sáng chế khác, Gaitonde và các cộng sự đã đề xuất một quy trình tổng hợp Anastrozole khác bằng tác nhân hydrazine [2] Tuy nhiên, quy trình tổng hợp này đòi hỏi các tác chất không dụng và phương pháp thực hiện phức tạp qua nhiều bước trung gian

Quy trình 3 Tổng hợp Anastrozole với tác nhân hydrazine

Tác chất và điều kiện phản ứng.(i) MeI, NaH; (ii) CrO3, anhydride acetic, H2SO4; (iii)

H2N-NHBoc; (iv) HCO2NH4, Pd/C; (v) HCl;(vi) sodium triazole

1.3 Các công trình nghiên cứu về quy trình tổng hợp Anastrozole từ Ana-3

1.3.1 Tổng hợp cyanoprop-2-yl)Benzylbromide (Ana-4) từ cyanoprop-2-yl)toluene (Ana-3)

3,5-bis(2-Phản ứng tổng hợp Ana-4 từ Ana-3 diễn ra theo cơ chế gốc tự do Wohl-Ziegler Trong

đó, tác nhân Brom hóa bao gồm: NBS, HBr, Br2… Tác nhân xúc tiến gốc tự do bao gồm: benzoyl peroxide, AIBN, UV… Và dung môi bao gồm carbon tetrachloride, chloroform và dichloromethane Thông thường, NBS thường được sử dụng nhờ vào khả năng nhả phân tử Brom chậm, do đó khống chế được các sản phẩm phụ thế vòng Nhờ vào tính kém tan của NBS trong CCl4, dung môi này được xem là dung môi lý tưởng cho các phản ứng theo cơ chế này Sau khi NBS nhả Brom, các phân tử nhóm succimide không tan sẽ nổi lên bề mặt do đó giúp nhận biết được thời điểm phản ứng kết thúc cũng như dễ dàng loại bỏ ra khỏi hệ [4]

Quy trình 4 Phản ứng tổng hợp Ana-4 từ Ana-3

Theo Patent US ‘950, phản ứng tổng hợp Ana-4 từ Ana-3 được thực hiện với tác nhân NBS, benzoyl peroxide trong dung môi CCl4 diễn ra theo cơ chế Wohl-Ziegler được trình bày ở quy trình 4 [8] Do sản phẩm Ana-4 thô được sử dụng phản ứng trực tiếp với 1,2,4-triazole, hầu hết các quy trình tổng hợp Ana-4 đã đề xuất đều giới hạn thời gian thực hiện dưới 3 tiếng Nhờ vậy, lượng sản phẩm phụ thế 2 Brom sẽ ít đi, giúp quá trình tinh chế Anastrozole với sắc kí cột dễ dàng hơn Các nghiên cứu cho thấy, hàm lượng sản phẩm thế 2 Brom của Ana-3 (Hình 4) có thể đạt tới 20%, phụ thuộc vào dung môi

sử dụng và thời gian phản ứng Các dung môi khảo sát cho hiệu quả phản ứng cao gồm: CCl4, CH2Cl2 và CH3CN

Hình 4 Sản phẩm thế 2 Brom của Ana-3

Hiện nay, do tính nghiêm ngặt về việc sử dụng các loại dung môi độc, gây hại cho môi trường, CCl4 và các dung môi chlorine hóa khác đã bị nhiều quốc gia cấm/ hạn chế sử dụng Các công trình nghiên cho thấy acetonitrile là dung môi thay thế thích hợp, cho hiệu suất cao và hàm lượng sản phẩm phụ ít hơn so với CCl4 Tuy nhiên, kết quả khảo sát gần đây cho thấy trong Anastrozole thương mại, có tồn tại hợp chất thế của nhóm succimide và Ana-3, hình thành do khả năng hòa tan tốt của NBS trong acetonitrile [5,6]

Hình 5 Sản phẩm phụ của nhóm thế succimide với Ana-3

Quy trình 5 Cơ chế phản ứng tổng hợp Ana-4 từ Ana-3 với NBS/BPO

1.3.2 Tổng hợp Anastrozole từ 3,5-bis(2-cyanoprop-2-yl)Benzylbromide

Phản ứng tổng hợp Anastrozole từ Ana-4 diễn ra theo cơ chế SN2 Theo US’950, ngoài Anastrozole, phản ứng giữa Ana-4 với 1,2,4-triazole còn cho ra một đồng phân vị trí α,α,α’,α’-tetramethyl-5-(4H-1,2,4-triazol-4-ylmethyl)-1,3-benzendiacetonitrile

(TMTAMBDA) Do đó, để hạn chế sự xuất hiện của đồng phân này, muối sodium triazole được chuộng sử dụng hơn Hàm lượng của TMTAMBDA phụ thuộc vào dung môi và lượng sodium 1,2,4-triazole sử dụng Các dung môi thích hợp được đề xuất bao gồm: DMF, 2-propanol và acetone Tuy nhiên, các kết quả khảo sát cho thấy DMF cho hàm lượng TMTAMBDA thấp hơn so với các dung môi khác Ngoài ra, patent US0099887 cũng đề xuất quy trình tổng hợp Anastrozole sử dụng xúc tác chuyển pha trong dung môi toluene Tuy nhiên, hiệu suất thu hồi khá thấp (47%)

1,2,4-Hình 6 Hợp chất α ,α, α’,

α’-tetramethyl-5-(4H-1,2,4-triazol-4-ylmethyl)-1,3-benzendiacetonitrile (TMTAMBDA)

Anastrozole sau khi tổng hợp sẽ được tinh chế bằng sắc kí cột nhanh (Flash chromatography) với hệ giải ly ethyl acetate Đồng phân TMTAMBDA có thể dễ dàng loại bỏ khỏi sản phẩm bằng cách tái kết tinh trong hệ dung môi/ dung môi thích hợp như cyclohexane/ethyl acetate và 2-propanol Ngoài ra, patent US 0035950 cũng đề ra phương pháp làm sạch Anastrozole bằng cách acid hóa với HCl và kết tinh Anastrozole

ở dạng muối, sau đó kiềm hóa bằng Na2CO3 và thu hồi Anastrozole Mặc dù phương pháp này tránh được phương pháp sắc kí đắt tiền, tuy nhiên do quá trình làm sạch phức tạp và qua nhiều bước trung gian nên hiệu suất thu hồi bị hao hụt rất lớn, do đó không thích hợp với quy mô sản xuất công nghiệp

1.3.3 Phổ NMR của Anastrozole và IsoAnastrozole

Kết quả phổ NMR của Anastrozole và đồng phân được công bố bởi Hiriyana và Basavaiah (2008) [13] được trình bày ở bảng sau:

Phổ 1H & 13C NMR của Anastrozole và IsoAnastrozole

Từ các kết quả thu được, ta có thể thấy sự khác biệt giữa hai phổ 1HNMR của Anastrozole và IsoAnastrozole (CDCl3) ở số lượng mũi tín hiệu Phổ 1H NMR của

Anastrozole cho hai mũi tín hiệu phân biệt của proton vị trí 8,9 có độ dịch chuyển hóa học 7.95 và 8.13 ppm Ngược lại, đồng phân IsoAnastrozole chỉ cho một mũi tín hiệu duy nhất (δ =8.24) do 2 proton ở vị trí này tương đương nhau

II NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN

* Nguyên liệu và thiết bị khảo sát chung

Hóa chất và tác chất sử dụng:

Tác chất phản ứng và dung môi được mua từ các nguồn cung cấp uy tín có trên thị trường, và được sử dụng trực tiếp không qua bất kì quá trình tinh chế nào: dimethylformamide (Merck, 99.5 %); methanol (Xilong, 99 %); ethanol (Xilong, 99 %); dichloromethane (Xilong, 99.5 %); hexane (Xilong, 99.5 %); ethyl acetate (Xilong, 99.5

%); acetonitrile (Xilong, 99); acetone (Xilong, 99.5 %)

Sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên sản phẩm Merck Silica Gel 60 F254 và hiện màu bằng đèn UV bước sóng 254 nm và 365 nm Sắc kí cột được thực hiện với Himedia silica gel (230-400 mesh) Các dung môi sử dụng cho quá trình sắc kí được mua từ ChemSol

Các tác chất 3,5-bis(2-cyanoprop-2-yl)Toluene; yl)Benzylbromide và Anastrozole được mua từ TCR industries với độ tinh sạch >99% Sodium 1,2,4-Triazole (90%) và xúc tác TBAB (99%) được mua từ ACROS và được sử dụng trực tiếp mà không qua quá trình tinh chế nào

3,5-bis(2-cyanoprop-2-Sắc ký lỏng cao áp (HPLC):

Các kết quả HPLC trình bày được thực hiện bằng hệ thống sắc ký lỏng cao áp Agilent 1050 với đầu dò DAD và cột pha đảo Zobrax C-18 (150mm x 4.6 mm x 5.0 µm) Quá trình sắc kí được thực hiện ở 25oC, tốc độ dòng 1mL/phút với hệ dung môi nước và acetonitrile tỉ lệ 50:50 (v/v) Bước sóng đầu dò ở 270 nm Thể tích tiêm mẫu là 20µm

Phổ khối lượng (GC-MS):

Phổ GC-MS được đo trên thiết bị Aligent 6890N và đầu dò MS 5973 innert, quá trình tách được thực hiện bằng cột HP5-MS Nhiệt độ ban đầu được giữ ở 100oC trong 3 phút Sau đó gia tăng lên 300oC với tốc độ 30oC/phút và giữ trong 20 phút

Phổ NMR:

Phổ 1H và 13C NMR được đo trên thiết bị đo phổ Bruker ở 500 MHz với 1H NMR

và 125 MHz với 13C NMR Độ dịch chuyển hóa học (δ) được thể hiện ở đơn vị parts per

million (ppm) và hằng số ghép đôi (J) được thể hiện dưới đơn vị Hertz (Hz) Các tín hiệu mũi đa được kí hiệu dưới dạng s (singlet, mũi đơn), br (broad singlet, mũi dãn rộng), d (doublet, mũi đôi), t (triplet, mũi ba), q (quartet, mũi bốn, and m (multiplet, mũi đa)

* Thành lập đường chuẩn HPLC và định lượng Ana-3, Ana-4 và Anastrozole

Các mẫu chất chuẩn được pha với nồng độ tổng 20mg/mL và lần lượt được pha loãng thành các nồng độ khác nhau Thời gian lưu và diện tích mũi ứng với các nồng độ khác nhau được trình bày ở bảng sau:

Ana-3

(RRT=10.8 min)

Ana-4 (RRT=11.4 min)

Anastrozole (RRT=3.1 min)

mg/mL

(X)

Peak Area (Y)

mg/mL (X)

Peak Area (Y)

mg/mL (X)

Peak Area (Y)

Diện tích mũi các tác chất tại các nồng độ khác nhau

Phương trình tuyến tính của diện tích mũi theo nồng độ của các chất

Định lượng Ana-3, Ana-4 và Anastrozole

Hàm lượng Ana-4, Anastrozole và Ana-3 sau phản ứng được tính theo công thức:

(%) B 100

A

C

 

Với A: Hàm lượng của tác chất cần xét trong mẫu

B: Nồng độ của chất cần xét tính theo phương trình chuẩn (mg/mL)

C: Nồng độ mẫu (mg/mL)

2.1 Kiểm nghiệm tiêu chuẩn tiền chất theo USP 36

2.1.1 Nội dung kiểm tra

Để đảm bảo các tiêu chuẩn USP36 của Anastrozole sau quá trình tổng hợp Các tiền chất Ana-3 và Ana-4 được kiểm tra về các chỉ tiêu:

- Hảm lượng kim loại nặng

- Độ tinh khiết

- Hàm lượng tạp chất

2.1.2 Phương pháp thực hiện

a) Hàm lượng kim loại nặng: trong 2 mẫu tác chất được xác định bằng phương pháp phổ

hấp thu nguyên tử (AAS), bao gồm các tiêu chuẩn Pb, Hg, As, Co

b) Nhiệt độ nóng chảy: Để tiến hành đo, một lượng mẫu nhỏ vừa đủ của mỗi tác chất

3,5-bis(2-cyanoprop-2-yl)toluene và 3,5-bis(2-cyanoprop-2-yl)benzylbromide được cho vào vi ống nhỏ và được đặt vào thiết bị ELECTROTHERMAL Nhiệt độ của buồng đun nóng được cài đặt 90oC và tăng dần đến 135oC trong 20 phút Theo dõi quá trình biển đổi pha qua kính ngắm và ghi nhận kết quả, ta thu được:

c) Hàm lượng tạp chất trong mẫu: Hàm lượng tạp chất trong mẫu được xác định bằng

phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC) với cột C-18, dung môi pha động acetonitril:

H2O 50:50 v/v, tốc độ dòng 0.1mL/ phút Mẫu tiền chất Ana-3, Ana-4 được chuẩn bị bằng các hoàn tan 0.001g mẫu vào hệ dung môi acetonitril/ H2O : 70/30 v/v

2.1.3 Các tiêu chỉ cần đạt

Để sản phẩm Anastrozole đạt chuẩn USP 36, các tiền chất Ana-3 và Ana-4 phải đáp ưng những tiều chuẩn sau về độ tinh khiết và hàm lượng kim loại nặng (theo USP36):

Hàm lượng kim loại nặng ≤0,001%

Bảng 1 Chỉ tiêu USP 36 về độ tinh sạch và hàm lượng kim loại nặng của Anastrozole 2.2 Hoàn thiện quy trình tổng hợp anastrozole từ 3, 5-Bis(2-cyano-2- methylethyl)toluene ở quy mô phòng thí nghiệm

Nội dung 2.2.1: Qui trình hoàn chỉnh, tinh chế và xác định thành phần cấu trúc tiền chất 2.2.1.1 Hóa chất và thiết bị sử dụng

Tác chất phản ứng và dung môi được mua từ các nguồn cung cấp uy tín có trên thị trường, và được sử dụng trực tiếp không qua bất kì quá trình tinh chế nào: 3,5-bis(2-cyanoprop-2-yl) (); dimethylformamide (Merck, 99.5 %); methanol (Xilong, 99 %); ethanol (Xilong, 99 %); dichloromethane (Xilong, 99.5 %); hexane (Xilong, 99.5 %); ethyl acetate (Xilong, 99.5 %); acetonitrile (Xilong, 99); acetone (Xilong, 99.5 %)

Sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên sản phẩm Merck Silica Gel 60 F254 và hiện màu bằng đèn UV bước sóng 254 nm và 365 nm Sắc kí cột được thực hiện với Himedia silica gel (230-400 mesh) Các dung môi sử dụng cho quá trình sắc kí được mua từ ChemSol

Phổ 1H và 13C NMR được đo trên thiết bị đo phổ Bruker ở 500 MHz với 1H NMR

và 125 MHz với 13C NMR Độ dịch chuyển hóa học (δ) được thể hiện ở đơn vị parts per

million (ppm) và hằng số ghép đôi (J) được thể hiện dưới đơn vị Hertz (Hz) Các tín

hiệu mũi đa được kí hiệu dưới dạng s (singlet, mũi đơn), br (broad singlet, mũi dãn rộng), d (doublet, mũi đôi), t (triplet, mũi ba), q (quartet, mũi bốn, and m (multiplet, mũi

3,5-bis(2-cyanoprop-từ đến 75-80oC và duy trì trong vòng 1 giờ Phản ứng được theo dõi bằng sắc kí lớp mỏng (Hex : EtOAc = 9:1) với mẫu Ana-4 chuẩn được sử dụng để đối chiếu

Sau khi phản ứng kết thúc, dung môi được loại bỏ bằng cách hóa hơi dưới áp suất chân không Phần cắn còn lại được hòa tan vào hệ EtOAc/ H2O Hỗn hợp được khuấy trong khoảng 10 phút và thu hồi pha hữu cơ Sản phẩm thô Ana-4 thu được sau khi loại

bỏ dung môi bằng hệ thống cô quay chân không Sản phẩm sau cùng được phân lập và

đo phổ 1H NMR và 13C NMR để xác định cấu trúc hữu cơ

2.2.1.3 Khảo sát tổng hợp 3,5-bis(2-cyanoprop-2-yl)benzylbromide bằng NBS với các dung môi khác nhau

Dung môi hữu cơ (acetonitrile/ carbon tetrachloride/ dichloromethane 5 mL), bis(2-cyanoprop-2-yl)toluene (0.1 g, 0.44 mmol); benzoyl peroxide (0.0023 g, 0.09 mmol) và H2SO4 98% (0.001g) được cho vào bình cầu 150 mL và gia nhiệt đến 50oC Tiếp đó, N-bromosuccinimide (0.0865g, 0.484 mmol) được thêm vào bình cầu từ từ thành 6 lần trong 3 tiếng Sau khi toàn bộ lượng NBS được thêm vào, hệ phản ứng được gia nhiệt từ từ đến 75-80oC và duy trì trong vòng 1 giờ Phản ứng được theo dõi bằng sắc kí lớp mỏng (Hex : EtOAc = 9:1)

3,5-Sau khi phản ứng kết thúc, dung môi được loại bỏ bằng cách hóa hơi dưới áp suất chân không Phần cắn còn lại được hòa tan vào hệ EtOAc/ H2O Hỗn hợp được khuấy trong khoảng 10 phút và thu hồi pha hữu cơ Sản phẩm thô Ana-4 thu được sau khi loại

bỏ dung môi bằng hệ thống cô quay chân không

2.2.1.4 Khảo sát tổng hợp 3,5-bis(2-cyanoprop-2-yl)benzylbromide với các tác nhân Brom hóa khác nhau

Ethyl acetate (4 mL), H2O (6 mL), 3,5-bis(2-cyanoprop-2-yl)toluene (0.1 g, 0.44 mmol), KBrO3 (0.22 g, 1.3 mmol) được cho vào bình cầu 150 mL và thực hiện khuấy gia nhiệt, hoàn lưu ở 55oC Sau đó, NaHSO3 (0.14 g, 1.3 mmol) được thêm từ từ vào hệ trong 15 phút Phản ứng được duy trì ở điều kiện trên trong 150 phút

Sau khi phản ứng kết thúc, pha EtOAc được tách ra Pha nước được thực hiện trích ly với EtOAc (2 mL x 2) Pha tổng EtOAc được rửa lần lượt với Na2S2O3.5H2O (4 mL); nước cất (4 mL x 2) và được làm khan bằng MgSO4 Cuối cùng, ta thực hiện cô quay loại bỏ dung môi trong pha hữu cơ và thu được sản phẩm Ana-4 thô

2.2.1.5 Khảo sát tổng hợp 3,5-bis(2-cyanoprop-2-yl)benzylbromide với tỉ lệ tác chất NBS khác nhau

Acetonitril 5mL, 3,5-bis(2-cyanoprop-2-yl)Toluene (0.1 g, 0.44 mmol); benzoyl peroxide (0.0023 g, 0.09 mmol) và H2SO4 98% (0.001g) được cho vào bình cầu 150 mL

và gia nhiệt đến 50oC Tiếp đó, N-bromosuccinimide với tỉ lệ mol thay đối (1,1; 1,2; 1,4 meq) được thêm vào bình cầu từ từ thành 6 lần trong 2 tiếng Sau khi toàn bộ lượng NBS được thêm vào, hệ phản ứng được gia nhiệt từ từ đến 75-80oC và duy trì trong vòng 1 giờ Phản ứng được theo dõi bằng sắc kí lớp mỏng (Hex:EtOAc = 9:1)

2.2.1.6 Tổng hợp 3,5-bis(2-cyanoprop-2-yl)benzylbromide với sự hỗ trợ của vi sóng

và siêu âm

a/ Tổng hợp 3,5-bis(2-cyanoprop-2-yl)benzylbromide với sự hỗ trợ của vi sóng

Phản ứng tổng hợp 3,5-bis(2-cyanoprop-2-yl)benzylbromide được khảo sát với 2 tác nhân brom hóa khác nhau là NBS/BPO trong acetonitril và KBrO3/NaHSO3 trong EtOAc/ H2O Hàm lượng tác chất và dung môi sử dụng được thể hiện ở bảng 2 Các phản ứng được thực hiện trong thiết bị vi sóng công suất 1100W, với hệ thống sinh hàn được lắp vào thiết bị Phản ứng được hỗ trợ vi sóng trong 5 phút theo chu kì sau mỗi 5 phút khuấy Kết quả của phản ứng được theo dõi qua TLC (Hex:EtOAc = 9:1)

Dung môi (5ml) Ana-3 (g) NBS/KBrO3 (g) BPO/NaHSO3 (g) Thời gian

Bảng 2 Hàm lượng tác chất và thời gian khảo sát phản ứng tổng hợp Ana-4

với hỗ trợ vi sóng

b/ Tổng hợp 3,5-bis(2-cyanoprop-2-yl)benzylbromide với sự hỗ trợ của siêu âm

Phản ứng tổng hợp 3,5-bis(2-cyanoprop-2-yl)benzylbromide được khảo sát với 2 tác nhân Brom hóa khác nhau là NBS/BPO trong acetonitril và KBrO3/NaHSO3 trong EtOAc/ H2O Hàm lượng tác chất và dung môi sử dụng được thể hiện ở bảng 3 Các phản ứng được thực hiện với thiết bị siêu âm đồng hóa Hielscher UP200Ht (amplitube 70%, pulse 50%) Phản ứng được theo dõi qua TLC (Hex:EtOAc = 9:1)

Dung môi (5ml) Ana-3 (g) NBS/KBrO 3 (g) BPO/NaHSO 3 (g) Thời gian

Bảng 3 Hàm lượng tác chất và thời gian khảo sát phản ứng tổng hợp Ana-4

với hỗ trợ siêu âm

Nội dung 2.2.2: Qui trình tổng hợp, tinh chế sản phẩm Anastrozole trong phòng thí

nghiệm và phân tích thành phần, cấu trúc của sản phẩm thu được

2.2.2.1 Khảo sát tổng hợp Anastrozole theo Patent US /177081 A1

Cho 3,5-bis(2-cyanoprop-2-yl)benzylbromide (0.1 g, 3.3 mmol); 1,2,4-triazole sodium (0.033 g, 3.3 mmol) cùng 5 mL DMF được cho vào bình cầu 150 mL và thực hiện khuấy trong 4 tiếng Sau khi phản ứng kết thúc, EtOAc (20 mL) và H2O (20mL) được cho vào hỗn hợp, tiến hành khuấy trong 10 phút, lấy pha EtOAc Pha nước được trích ly với EtOAc (10 mL) Tổng pha hữu cơ được rửa với H2O (20 mL x 4) và làm khan bằng MgSO4 Cuối cùng, dung môi được loại bỏ dưới áp suất chân không và thu được Anastrozole thô Sản phẩm Anastrozole được phân lập và thực hiện đo phổ 1H NMR, 13C NMR để xác định cấu trúc

2.2.2.2 Khảo sát tổng hợp Anastrozole với các dung môi khác nhau

Cho 3,5-bis(2-cyanoprop-2-yl)benzylbromide (0.1 g, 3.3 mmol); 1,2,4-triazole sodium (0.066 g, 6.6 mmol) cùng 5 mL dung môi hữu cơ (aceton, DMF, 2-propanol) được cho vào bình cầu 150 mL và thực hiện khuấy, gia nhiệt hoàn lưu ở 75-80oC Sau khi phản ứng kết thúc, EtOAc (20 mL) và H2O (20mL) được cho vào hỗn hợp, tiến hành khuấy trong 10 phút, lấy pha EtOAc Pha nước được trích ly với EtOAc (10 mL) Tổng pha hữu cơ được rửa với H2O (20 mL x 4) và làm khan bằng MgSO4 Cuối cùng, dung môi được loại bỏ dưới áp suất chân không và thu được Anastrozole thô

2.2.2.3 Khảo sát tổng hợp Anastrozole với tỉ lệ 1,2,4-sodium triazole khác nhau

Cho 3,5-bis(2-cyanoprop-2-yl)benzylbromide (0.1 g, 3.3 mmol); 1,2,4-triazole sodium (0.066 g, 6.6 mmol), K2CO3 (0.11g, 0.8 mmol), TBAB (0.007 g, 0.02 mmol) cùng 5 mL aceton được cho vào bình cầu 150 mL và thực hiện khuấy, gia nhiệt hoàn lưu ở 75-80oC Sau khi phản ứng kết thúc, EtOAc (20 mL) và H2O (20mL) được cho vào hỗn hợp, tiến hành khuấy trong 10 phút, lấy pha EtOAc Pha nước được trích ly với EtOAc (10 mL) Tổng pha hữu cơ được rửa với H2O (20 mL x 4) và làm khan bằng MgSO4 Cuối cùng, dung môi được loại bỏ dưới áp suất chân không và thu được Anastrozole thô

2.2.2.4 Khảo sát hiệu suất phản ứng thay đổi xúc tác chuyển pha

Quy trình khảo sát được thực hiện như sau Cho hỗn hợp gồm Anas-4 (1,02 mmol); 1,2,4-triazole sodium (1.08 mmol), xúc tác chuyển pha (tỉ lệ và loại xúc tác chuyển pha cần khảo sát) vào bình cầu phản ứng có chứa acetone (20 ml) Tiến hành đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng Theo dõi phản ứng bằng sắc kí bản mỏng với hệ dung môi giải ly ethylacetate: hexane (1:9 v/v), kết thúc phản ứng sau 30 phút Hỗn hợp phản ứng được để nguội về nhiệt độ phòng, lọc bỏ rắn, rửa với acetone, làm khan bằng MgSO4

khan Phần dịch lọc được cô loại dung môi, thu được sản phẩm thô Nếu tái kết tinh thu được tinh thể rắn màu trắng

Bảng 4 Kết quả khảo sát hiệu suất phản ứng thay đổi theo ảnh hưởng của xúc tác

chuyển pha lên phản ứng

TT Xúc tác Hàm lượng sử dụng (%) Hiệu suất (%) Độ tinh khiết (%)

2.3 Xây dựng hệ thống sản xuất pilot 100g/mẻ

Nội dung 2.3.1: Xây dựng quy trình tổng hợp tiền chất (Ana-4) và sản phẩm

Anastrozole ở quy mô sản xuất

2.3.1.1 Tối ưu hóa qui trình tổng hợp tiền chất Ana-4 ở qui mô 10g/mẻ và đề xuất qui trình sản xuất Ana-4 ở qui mô 100g/mẻ

1/ Nguyên liệu và thiết bị khảo sát

Hóa chất

Dimethylformamide (Merck, 99.5 %); methanol (Xilong, 99 %); ethanol (Xilong,

99 %); dichloromethane (Xilong, 99.5 %); hexane (Xilong, 99.5 %); ethyl acetate (Xilong, 99.5 %); acetonitrile (Xilong, 99); acetone (Xilong, 99.5 %)

Sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên sản phẩm Merck Silica Gel 60 F254 và hiện màu bằng đèn UV bước sóng 254 nm và 365 nm Sắc kí cột được thực hiện với Himedia silica gel (230-400 mesh) Các dung môi sử dụng cho quá trình sắc kí được mua từ ChemSol

Các tác chất 3,5-bis(2-cyanoprop-2-yl)toluene; yl)benzylbromide và Anastrozole được mua từ TCR industries với độ tinh sạch >99% Sodium 1,2,4-triazole (90%) và xúc tác TBAB (99%) được mua từ ACROS và được sử dụng trực tiếp mà không qua quá trình tinh chế