Nghiên cứu phương pháp bảo quản và bổ sung dữ liệu bộ sưu tập giống nấm họ linh chi ganodermataceae

TÓM TẮT Nhiệm vụ nghiên cứu khoa học “ Nghiên cứu phương pháp bảo quản và bổ sung dữ liệu bộ sưu tập giống nấm họ linh chi Ganodermataceae“ được thực hiện nhằm đánh giá hiệu quả của các

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP HCM

TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO

BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC - CÔNG NGHỆ

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN VÀ

BỔ SUNG DỮ LIỆU BỘ SƯU TẬP GIỐNG NẤM

HỌ LINH CHI Ganodermataceae

CN Mai Thị Hạnh Phúc

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 12/2019

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP HCM

TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO

BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC - CÔNG NGHỆ

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN VÀ

BỔ SUNG DỮ LIỆU BỘ SƯU TẬP GIỐNG NẤM

HỌ LINH CHI Ganodermataceae

CHỦ NHIỆM NHIỆM VỤ

Mai Thị Hạnh Phúc

CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 12/2019

TÓM TẮT

Nhiệm vụ nghiên cứu khoa học “ Nghiên cứu phương pháp bảo quản và bổ sung

dữ liệu bộ sưu tập giống nấm họ linh chi Ganodermataceae“ được thực hiện nhằm đánh

giá hiệu quả của các phương pháp bảo quản đã thực hiện năm 2017, đồng thời thực hiện thêm một số phương pháp bảo quản mới và bổ sung cơ sở dữ liệu bộ sưu tập các chủng

nấm họ Ganodermataceae Sau quá trình thực hiện nghiên cứu, kết quả cho thấy phương

pháp bảo quản chủng trên giấy trữ trong glycerol 10% ở 4°C cho hiệu quả phục hồi tốt nhất Phần lớn các chủng trữ trên lúa trong glycerol 10% ở 4°C không còn khả năng phục hồi Tất cả các chủng trữ trên thạch trong nước cất ở 4°C và trữ với lúa gạo trong nước cất ở 4°C đều không còn khả năng phục hồi Bộ sưu tập gồm 32 chủng nấm họ

Ganodermataceae sau thời gian 2 năm lưu trữ chỉ còn 25 chủng có khả năng phục hồi

Các chủng sau khi được phục hồi được tiến hành đánh giá và ghi nhận khả năng phân giải cellulose, xylan, lignin Ba phương pháp bảo quản khác gồm phương pháp trữ glycerol 10% làm lạnh sâu (-80°C), phương pháp trữ bằng mùn cưa có glycerol 10% làm lạnh sâu (-80°C) và phương pháp trữ glycerol 10% làm lạnh sâu bằng nitơ lỏng (-196°C) được thực hiện với 25 chủng nấm Đã bổ sung thêm trình tự ADN vùng ITS, LSU rDNA D1D2 và hình bào tử vào cơ sở dữ liệu của 25 chủng nấm thuộc họ

Ganodermataceae vào bộ sưu tập với 9 tiêu chí đã được thực hiện gồm: (1): Tên khoa

học (chi; loài; dưới loài); (2): Tên; mã số tại các bộ sưu tập khác liên quan đến xuất xứ; (3) Nguồn phân lập; (4) Địa điểm phân lập; (5) Người phân lập; người định danh; (12) Điều kiện bảo quản; (13) Môi trường nuôi cấy (sinh trưởng)

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát về họ nấm Linh Chi

1.2 Lịch sử phân loại và hệ thống học họ nấm Linh Chi trên thế giới

1.2.1 Chi Ganoderma

1.2.1.1 Nguồn gốc, phân loại và sự phân bố Linh Chi

1.2.1.2 Đặc điểm hình thái và vị trí phân loại

1.2.1.3 Đặc tính dược lý của nấm Linh Chi

1.2.2 Chi Amauroderma

1.2.3 Chi Humphreya

1.2.4 Chi Haddowia

1.3 Phương pháp bảo quản chủng nấm

1.3.1 Phương pháp cấy chuyền

1.3.2 Phương pháp bảo quản dưới lớp dầu khoáng

1.3.3 Phương pháp làm mất nước trong môi trường bảo quản

1.3.4 Phương pháp bảo quản đông khô

1.3.5 Phương pháp bảo quản lạnh sâu

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Trang

i

ii iii

vi vii

Chương 2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Vật liệu

2.2.2 Hóa chất thí nghiệm

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Nội dung 1: Đánh giá hiệu quả các phương pháp bảo quản thực hiện

năm 2017

2.3.1.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá sức sống của các chủng nấm Linh Chi đã

được bảo quản từ năm 2017

2.3.1.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng phân giải cellulose của các chủng

nấm sau thời gian bảo quản từ năm 2017

2.3.1.3 Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng phân giải xylan của các chủng nấm

sau thời gian bảo quản từ năm 2017

2.3.1.4 Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng phân giải lignin của các chủng nấm

sau thời gian bảo quản từ năm 2017

2.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu phương pháp bảo quản chủng nấm

2.3.3 Nội dung 3: Bổ sung cơ sở dữ liệu bộ sưu tập chủng nấm họ Linh Chi

2.4 Phương pháp xử lý số liệu

Chương 3 KẾT QUẢ THẢO LUẬN

3.1 Nội dung 1: Đánh giá hiệu quả các phương pháp bảo quản thực hiện

năm 2017

3.1.1 Đánh giá sức sống của các chủng nấm Linh Chi đã được bảo quản từ

năm 2017

3.1.2 Đánh giá khả năng phân giải cellulose của các chủng nấm sau thời

gian bảo quản từ năm 2017

3.1.3 Đánh giá khả năng phân giải xylan của các chủng nấm sau thời gian

bảo quản từ năm 2017

3.1.4 Đánh giá khả năng phân giải lignin của các chủng nấm sau thời gian

3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu phương pháp bảo quản chủng nấm

3.3 Nội dung 3: Bổ sung cơ sở dữ liệu bộ sưu tập chủng nấm họ Linh Chi

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DMSO Dimethyl sulfoxide ADN Axit deoxyribonucleic ITS Internal transcribed spacer LSU Large Subunit

PDB Potato dextrose broth PDA Potato dextrose agar CMC carboxymethylcellulose PCR Polymerase chain reaction ctv Cộng tác viên

tt Tiếp theo

DANH SÁCH BẢNG

2.1 Các phương pháp bảo quản được thực hiện năm 2017 21 2.2 Chu trình hạ nhiệt -80°C 24 2.3 Chu trình hạ nhiệt -150°C 24 2.4 Trình tự mồi vùng ITS và vùng LSU-rDNA D1-D2 26 2.5 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự ITS và

3.3 Sự phân giải xylan của các chủng được bảo quản từ năm 2017

sau khi phục hồi

40

3.4 Sự phân giải lignin của các chủng được bảo quản từ năm 2017

sau khi phục hồi

44

3.5 Ba phương pháp bảo quản (a) chủng được trữ trong glycerol

10% ở -80°C, (b) ống được trữ trong mùn cưa và glycerol 10%

ở -80°C và (c) ống được trữ trong ni tơ lỏng ở -196°C

THÔNG TIN ĐỀ TÀI

1 Tên đề tài/dự án: Nghiên cứu phương pháp bảo quản và bổ sung dữ liệu bộ sưu tập

giống nấm họ Linh chi Ganodermataceae – giai đoạn 1

2 Chủ nhiệm đề tài/dự án: Mai Thị Hạnh Phúc

3 Cơ quan chủ trì: Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao

4 Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/2019 đến tháng 12/2019

5 Kinh phí được duyệt: 308.272.959 đồng

6 Mục tiêu: Đánh giá các phương pháp bảo quản chủng nấm đã thực hiện năm 2017,

khảo sát sự tương thích của một số phương pháp bảo quản mới đối với các chủng nấm của bộ sưu tập chủng nấm họ Linh Chi Đồng thời bổ sung thêm một vài cơ sở dữ liệu cho bộ sưu tập chủng nấm họ Linh Chi và tìm ra phương pháp bảo quản hiệu quả hơn cho các chủng nấm

7 Nội dung đề tài:

Nội dung 1: Đánh giá hiệu quả các phương pháp bảo quản thực hiện năm 2017 Nội dung 2: Nghiên cứu phương pháp bảo quản chủng nấm

Nội dung 3: Bổ sung cơ sở dữ liệu bộ sưu tập chủng nấm họ Linh Chi

MỞ ĐẦU

Bảo quản chủng là một trong những vấn đề quan trọng, làm nền tảng cho các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng liên quan đến các lĩnh vực trong đời sống như nông nghiệp, sinh học, y học và môi trường Mục đích của việc bảo quản không chỉ là duy trì khả năng sống của chủng, tránh tạp nhiễm mà còn đảm bảo tính ổn định di truyền, đảm bảo tính thuần và các đặc tính sinh học trong quá trình bảo quản Với mỗi chủng khác nhau, phương pháp bảo quản phù hợp được lựa chọn tùy vào mục đích sử dụng, giá thành và sự tiện lợi Bên cạnh đó, bộ sưu tập chủng nấm cung cấp các thông tin quan trọng liên quan đến nấm cho người sử dụng như môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, nhu cầu dinh dưỡng, tính an toàn sinh học, tên phân loại,…

Trong năm 2016, chúng tôi thực hiện giai đoạn 1 nhiệm vụ nghiên cứu “Tạo bộ sưu tập chủng nấm Linh Chi (họ Ganodermataceae)” để thu thập chủng nấm tự nhiên tiềm năng và các chủng nấm thương phẩm có trên thị trường Sau quá trình thực hiện,

đề tài đã thu thập, phân lập và trữ giống được 21 mẫu quả thể nấm nghi ngờ Linh Chi hoang dại từ Vườn quốc gia Bidoup Núi Bà , tỉnh Lâm Đồng; 9 mẫu từ vườn quốc gia

Lò Gò – Xa Mát, tỉnh Tây Ninh; 10 mẫu từ khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu – Phước Bửu, tỉnh Bà Rịa – Vũng tàu Kết quả định danh hình thái cho thấy có 8 mẫu không

thuộc họ Ganodermatacae; 6 mẫu thuộc chi Amauroderma trong đó 1 mẫu là Amauroderma amoiense, 1 mẫu là Amauroderma subresinosum, 4 mẫu là Amaurodermma rugosum; 2 mẫu thuộc chi Humphreya trong đó 1 mẫu là Humphreya coffeatum (Berk) Steyaert, 1 mẫu tạm xác định là Humphreya aff.lloydii do còn thiếu cơ

sở dữ liệu để xác định tên loài này và 24 mẫu thuộc chi Ganoderma trong đó 13 mẫu là Ganoderma australe, 1 mẫu là Ganoderma capense, 1 mẫu là Ganoderma philippii, 1 mẫu là Ganoderma cochlear, 1 mẫu là Ganoderma flexipes, 1 mẫu là Ganoderma fulvellum, 1 mẫu là Ganoderma resinaceum, 3 mẫu tạm xác định là Ganoderma aff.lobatum, Ganoderma aff.mastoporum và Ganoderma aff.gibbosum (Ness) Pat do

còn thiếu cơ sở dữ liệu để xác định tên các loài này và 2 mẫu chưa xác định được tên

loài là Ganoderma sp1, Ganoderma sp2 Dựa trên các dữ liệu thu thập được, cơ sở dữ

liệu của bộ sưu tập đã được xây dựng sơ bộ, tuy nhiên vẫn còn một vài hạn chế và chưa

Do đó, để đánh giá hiệu quả các phương pháp bảo quản chủng đã thực hiện năm 2017; khảo sát thêm một số phương pháp bảo quản mới và bổ sung thêm cơ sở dữ liệu cho bộ sưu tập chủng nấm, nhiệm vụ nghiên cứu “ Nghiên cứu phương pháp bảo quản

và bổ sung dữ liệu bộ sưu tập chủng nấm họ Linh Chi Ganodermataceae” được thực hiện

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát về họ nấm Linh Chi

Từ xưa đến nay khi nhắc đến nấm Linh Chi người ta thường nghĩ đến nấm

Ganoderma lucidum Tuy nhiên, Ganoderma lucidum chỉ là một loài trong một họ nấm

Linh Chi Ganodermataceae Họ nấm này đại diện cho một phức hợp nấm lớn và đa dạng Nhiều loài trong họ này là nấm gây mục gỗ, một số gây bệnh cho cây trồng và một số

có giá trị dược liệu Hơn nữa, sự phân loại của nó rất thú vị và thu hút nhiều nhà nấm học nghiên cứu họ nấm này Cùng với sự phát triển nhanh chóng trên toàn thế giới trong nghiên cứu về họ nấm này, sự phân loại họ nấm này đạt được tiến bộ lớn

Ganodermataceae gồm 81 loài thuộc 4 chi (Ganoderma, Amauroderma, Haddowia và Humphreya)

1.2 Lịch sử phân loại và hệ thống học họ nấm Linh Chi trên thế giới

Nghiên cứu hệ thống học đầu tiên về họ Ganodermataceae chủ yếu dựa trên các đặc tính hình thái học và theo phương pháp phân loại theo ngoại hình để phân loại: sinh vật được chia nhóm dựa trên cơ sở tương đồng về hình thái học trên giả định rằng nhóm tương tự về âm vị học cũng tương tự về mặt di truyền Những khái niệm này làm cho các nhà nghiên cứu đưa ra sự phân loại khác nhau về họ nấm Ganodermatceae (Steyaert,

1972; Furtado, 1981)

Ganoderma (Ganodermataceae Donk) được xác định bằng sự hiện diện của bào tử

đảm (basidiospore) vách kép bởi vì đặc điểm này là duy nhất trong số nấm nhiều lỗ (polypore) và hình thái bào tử đảm luôn được các nhà nấm học xem như là một yếu tố quan trọng nhất trong những đặc điểm phân loại Tương tự, việc phân chia họ Ganodermataceae thành những nhóm chính gần như chủ yếu dựa vào hình thái bào tử

Bào tử đảm “ganodermatoid” điển hình có đỉnh dày (Ganoderma Karst.) và khác với

bào tử đảm “amaurodermatoid” điển hình mà bào tử này có vách dày đều nhau

(Amauroderma Murr.) Những nghiên cứu bằng kính hiển vi quang học cho thấy bào tử đảm “ganodermatoid” hình mắt lưới (Humphreya Stey.) và bào tử đảm

“amaurodermatoid” gợn sóng theo chiều dọc (Haddowia Stey.)

Vỏ cứng mũ nấm (Pilear crust) cũng đa dạng trong họ nấm Ganodermataceae và

mỏng và sáng nhưng không bóng láng với sự hiện diện của pilocystidia như ở G colossum và Humphreya eminii; xỉn màu và không có pilocystidia như ở những loài thuộc nhóm G applanatum – G australe (Ganoderma subg elfvingia) Trong những

loài có bào tử đảm “amaurodermatoid”, phần lớn các taxon không có pilocystidia và mũ

nấm xỉn màu; tuy nhiên pilocystidiate được mô tả trong một vài loài bóng láng như A leptopus, A renidens, Ha aetii, Ha longipes

Chi Tomophagus được đề nghị bởi Murill (1905) để phù hợp hơn với G colossum

dựa trên đặc điểm macro của mô vì nó có thịt nấm mềm và to khác thường Tuy nhiên, đặc tính này không được xem là có hiệu quả quan trọng trong phân loại ở mức độ chủng

loài và trong hầu hết nghiên cứu phân loại họ Ganodermataceae Chi Tomophagus là một đồng nghĩa của Ganoderma Phân tích phát sinh loài (phylogenetic analysis) trên

dữ liệu phân tử chỉ ra rằng Ganoderma colossum là cơ sở đối với Ganoderma và Amauroderma và nó chứng minh thứ hạng chủng loài của Tomophagus (Moncalvo và

ctv, 1995) Corner (1983) đánh giá tầm quan trọng của cấu trúc sợi trong sự hiểu biết về

hệ thống học Ganodermataceae mặc dù hệ thống phân loại trên nền tảng đó chưa được đưa ra

Hệ sợi của Amauroderma thường được mô tả là trimitric (Ryvarden và Johansen,

1980) nhưng sợi liên kết (binding hyphae) và nhánh mỏng của sợi hình cây khá giòn

không chủng ở Ganoderma (Ryvarden và Johansen, 1982) Corner (1983) mô tả những

biến đổi trong cấu trúc sợi bên trong họ Ganodermataceae và nhấn mạnh sự khác nhau

giữ các loài Ganoderma điển hình, mà trong nó những tế bào khung xương hình cây (aboriform skeletal cells) thường ở tận cùng và những loài Amauroderma điển hình mà

trong nó những tế bao khung xương hình cây ở cả tận cùng lẫn xen giữa Tuy nhiên, cả Steyaert (1972) và Corner (1983) nhấn mạnh rằng trong Vỏ cứng mũ nấm (pilear crust) không có sự khác biệt rõ ràng giữa những sợi khác nhau trong mô thịt

Những đặc điểm hình thái khác được sử dụng cho hệ thống học họ Ganodermataceae (màu sắc, kích thước bào tử, hình dạng và kích thước lỗ, đặc điểm cuống) giúp ích không nhiều trong phân biệt những dòng tiến hóa chính

Những loài trong họ Ganodermataceae đều gây mục trắng nhưng đa dạng về sinh thái học Chúng sống trên cây sống hoặc chết, trên cây hai lá mầm (cây hạt kín cũng như cây hạt trần) hay cây một lá mầm Ký chủ đặc trưng ít được biết đến Tuy nhiên, những

loài Amauroderma thường được tìm thấy trên mặt đất, đính trên cây chết hoặc rễ hay

trên những rễ mọc lan của cây nhiệt đới hay gốc cây, trong khi hầu hết những loài

Ganoderma mọc ở thân cây hoặc cao hơn

Amauroderma và Ganoderma được phân biệt dựa trên cơ sở độ dày vách bào tử Trong Ganoderma, những loài bóng láng (subg Ganoderma) với những loài không bóng láng (subg Elfvingia) được phân biệt Juhlich (1981) tạo ra họ Haddowiaceae cho Haddowia và Humphreya với đặc điểm là các bào tử đảm gồ ghề Trong một hệ thống dựa vào Furtado, Haddowia được phân loại trong chi Amauroderma trong khi Humphreya và Tomophagus được xếp lồng trong chi Ganoderma Trong một hệ thống khác dựa vào Steyaert (1972), Ganoderma, Amauroderma, Tomophagus, Haddowia và Humphreya hiện diện 5 dòng khác nhau với những mối quan hệ cơ bản chưa được giải

quyết

1.2.1 Chi Ganoderma

Nấm Linh Chi có nhiều tên gọi khác nhau như bất lão thảo, vạn niên thảo, thần tiên thảo, chi linh, đoạn thảo, nấm lim Mỗi tên gọi của Linh Chi gắn liền với một giá trị dược liệu của nó Tên gọi Linh Chi bắt nguồn từ Trung Quốc – Lingzhi - hay theo tiếng Nhật gọi là Reishi hoặc Mannentake, Yeongji (Hàn Quốc) và Ling-Chih (Đài Loan)

Chi Ganoderma trên thế giới có hơn 80 loài, riêng ở Trung Quốc có 48 loài, Việt

Nam có khoảng 37 loài Linh Chi phân bố ở các rừng có nhiều loại gỗ cây lá rộng, nhất

là rừng gỗ Lim nên còn gọi là nấm Lim (Trịnh Tam Kiệt, 1981) Ở các nước Châu Á, đặc biệt Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan…, Linh Chi đang được công nghiệp hóa về nuôi trồng, chế biến và bào chế dược phẩm Đồng thời các hoạt chất có trong Linh Chi được nghiên cứu về tác dụng dược lý và điều trị lâm sàng Cho đến nay

trong số các loài Linh Chi được tìm thấy, Xích Chi (Ganoderma lucidum) được nghiên cứu chi tiết nhất Loài chuẩn Ganoderma lucidum có thành phần hoạt chất sinh học

phong phú và hàm lượng nhiều nhất (Ahmed và Lee, 2007)

1.2.1.1 Nguồn gốc, phân loại và sự phân bố Linh Chi

Nấm Linh Chi trong thiên nhiên là các loài nấm gỗ mọc hoang, có hàng trăm loài khác nhau, trong đó có nhóm lớn là Linh Chi và cổ Linh Chi Linh Chi thường mọc ở

Quốc cách đây khoảng 2000 năm và được đánh giá là có giá trị lớn về mặt y học cổ truyền và ngành trồng trọt của Trung Quốc (Zhu L Yang và ctv.) Từ xưa đến nay, Trung Quốc, Nhật Bản và một số nước châu Á khác đã sử dụng nấm Linh Chi như một loại thảo dược để giúp tăng cường sức khỏe và kéo dài tuổi thọ của con người Linh Chi được phân bố rộng rãi ở các nước Á Đông và thường mọc trên các thân cây khô hoặc đã chết

Theo bảng phân loại của Alexopoulus năm 1979, Lingzhi thuộc chủng nấm Linh

Chi và là thành viên của họ Myceteae, lớp Basidiomycetes, chi Aphyllophorales và

thuộc họ Polyporaceae Đầu năm 1881, Karsten, nhà thực vật học người Phần Lan, đã đưa ra đặc điểm phân loại của nấm Linh Chi dựa vào lớp biểu bì bên ngoài của nấm Kể

từ đó nấm Linh Chi đỏ đã trở thành một đại diện tiêu biểu cho chủng loại nấm này Về sau, đặc điểm phân loại của nấm Linh Chi đã được thay đổi bởi một số nhà khoa học khác như Donk, Murrill, Furtano và Steyaert, … sau khi họ đã tìm ra những đặc tính khác của nấm Linh Chi như các bào tử của nấm Linh Chi có hình quả trứng, lớp ngoài của thành tế bào tương đối mỏng và trong suốt, ngược lại lớp trong của thành tế bào lại dày, màu vàng nâu và có nhiều nốt nhỏ Cũng từ đó, nấm Linh Chi không còn được phân loại dựa vào màu sắc hay hình dạng bên ngoài nữa

Cách đây hơn 60 năm, Donk đã xác lập họ Linh Chi Ganodermataceae Donk trên

cở sở tính đặc thù của bào tử đảm – là yếu tố sinh sản hữu tính của nấm Đảm (Basidiomycetes) mà ngày nay hầu hết các nhà nấm học đều công nhận Tuy nhiên tình trạng phân loại - hệ thống học của họ Ganodermataceae Donk đang rơi vào những khó khăn và hỗn độn trong toàn bộ các loài nấm nhiều lỗ (Đa khổng khuẩn - Polyporoid) Trên thực tế việc định loại các loài Linh Chi rất dễ nhầm lẫn bởi những biến hóa đa dạng hình thái thể quả và cấu trúc hệ sợi (Lê Xuân Thám và ctv, 2012)

Vì sự quý hiếm và những lợi ích to lớn mà nấm Linh Chi đem đến cho sức khoẻ

mà ngày xưa nấm Linh Chi được xem như một sản phẩm rất quý và đắt tiền Mãi đến năm 1970, người ta mới bắt đầu trồng nấm Linh Chi và đến năm 1980 thì ngành trồng nấm Linh Chi đã phát triển rất nhanh chóng ở Trung Quốc Ở Việt Nam, có rất nhiều loại Linh Chi mọc hoang dại trong tự nhiên, phân bố ở các rừng có nhiều loại gỗ cây lá rộng Riêng ở tỉnh Thừa Thiên Huế đã có đến 39 loài thuộc 3 chi khác nhau:

Amauroderma, Ganoderma và Haddowia, trong đó có 5 loài được sử dụng làm dược

liệu là: G amboinense, G applanatum, G capense, G lucidum và G sinense (Ngô Anh

và ctv, 2008)

1.2.1.2 Đặc điểm hình thái và vị trí phân loại

Nấm Linh Chi có thể mọc thành cụm hoặc đơn lẻ Phần thịt của thể quả nấm có màu nâu, mềm xốp nhưng hóa gỗ theo thời gian Quả thể của nấm gồm có hai phần, mũ nấm và cuống nấm (phần phiến đối diện với cuống nấm) Trên mũ nấm có hai vách, bào

tử hình thành phía bên trong giữa hai vách Đây là đặc điểm giúp phân biệt nấm Linh Chi với các loài khác Nấm Linh Chi có chung một đặc điểm là quả thể nấm hóa gỗ, mũ xòe tròn, bầu dục hoặc hình thận, có cuống ngắn hoặc dài hay không cuống Cuống nấm thường hình trụ hoặc thanh mảnh (đường kính khoảng 0,3 – 0,8 cm) hoặc mập khỏe (đường kính 2 - 3,5cm), ít khi phân nhánh dài từ 2,7 – 22 cm, đôi khi có uốn khúc Lớp

vỏ cuống láng màu đỏ - nâu đỏ - nâu đen, không có lông, liền với bề mặt tán nấm Mũ non khi non có hình trứng, lớn dần có dạng thận gần tròn, đôi khi xòe hình quạt hoặc có dạng khác thường Mặt trên mũ có vân đồng tâm và được phủ bởi lớp sắc tố bóng láng như verni Kích thước tán biến động lớn từ 2 – 36 cm, dày 0,8 – 3,3 cm phần đính cuống

gồ lên hay lõm Mặt dưới phẳng, màu trắng hoặc vàng, có nhiều lỗ li ti, là nơi hình thành

và phóng thích bào tử nấm Phần thịt nấm màu vàng kem – nâu nhợt, phân chia theo kiểu lớp trên và lớp dưới Khi nấm đến tuổi trưởng thành thì bào tử có màu nâu sẫm được phát tán từ phiến nấm Bào tử nấm dạng trứng cụt với hai lớp vỏ, giữa hai lớp vỏ

có nhiều gai nhọn nối từ trong ra ngoài Bào tử nấm Linh Chi có kích thước trung bình 4,5 – 6,5 x 8,5 – 11,5µm (Lê Xuân Thám, 1996) Bào tử hình thuẫn, có gai lõm, một đầu tròn lớn, một đầu tròn nhỏ có lỗ là nơi khuẩn ty mọc ra khi bào tử nảy mầm Khuẩn ty của nấm Linh Chi là những sợi nấm trắng, có enzyme để phá vỡ các thành phần gỗ như lignin và cellulose Khi nuôi cấy tơ nấm lúc đầu có màu trắng, sau chuyển sang màu vàng, sợi nấm ngăn thành nhiều phần và hình thành các bào tử vô tính

Nấm Linh Chi có vị trí phân loại được thừa nhận rộng rãi hiện nay (Trịnh Tam Kiệt, 2012):

Giới Fungi Ngành: Basidiomycota

và chu trình lại tiếp tục (Lê Xuân Thám, 1996)

1.2.1.3 Đặc tính dược lý của nấm Linh Chi

Linh Chi được dùng như một thượng dược khoảng từ 4000 năm nay ở Trung Quốc

và người ta chưa thấy tác dụng xấu hay độc tính của Linh Chi Đa số các loài Linh Chi điều có vị đắng, tính bình, không độc, tăng trí nhớ, dưỡng tim, chữa trị tức ngực, bổ gan khí, an thần… (Lê Xuân Thám, 2005)

Theo cách diễn đạt truyền thống của người phương Đông, các tác dụng lớn của nấm Linh Chi như sau: (Lê Xuân Thám, 1996)

- Kiện não (làm sáng suốt, minh mẫn)

- Bảo can (bảo vệ gan)

- Cường tâm (thêm sức cho tim)

- Kiện vị (củng cố dạ dày và hệ tiêu hoá)

- Cường phế (thêm sức cho phổi, hệ hô hấp)

- Giải độc (giải tỏa trạng thái dị cảm)

- Trường sinh (tăng tuổi thọ)

Qua phân tích các hoạt chất về mặt dược lý và sử dụng nấm Linh Chi, người ta thấy Linh Chi có tác dụng với một số bệnh như:

+ Đối với các bệnh tim mạch: Hàng loạt các hoạt chất của Linh Chi được chứng tỏ

có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp cholesterol, kìm hãm quá trình kết tụ tiểu cầu Các nghiên cứu này được củng cố để có kết quả trị liệu cho các bệnh nhân cao huyết áp, nhiễm mỡ xơ mạch, bệnh mạch vành tim Hầu hết các bệnh nhân có chuyển biến tốt sau một vài tuần, huyết áp ổn định dần, không xảy ra các tác dụng phụ như các loại thuốc tân dược Nhiều nghiên cứu đã phát hiện ra vai trò của các nguyên tố khoáng hiếm Vanadium (V) có tác dụng chống tích đọng cholesterol trên thành mạch Germanium

giúp lưu thông khí huyết, tăng cường vận chuyển oxy vào mô Hiện nay, chỉ số Ge trong các dược phẩm Linh Chi được xem như là một chỉ tiêu quan trọng, có giá trị trong điều trị tim mạch và giảm đau trong trị liệu ung thư (Lê Xuân Thám, 2005; Đoàn Suy Nghĩ

và Nguyễn Thị Thu Thủy, 2009)

+ Hiệu quả chống ung thư: Bằng việc kết hợp các phương pháp xạ trị, hoá trị, giải phẫu với trị liệu nấm trên các bệnh nhân ung thư phổi, ung thư vú và ung thư dạ dày có thể kéo dài thời gian sống trên 5 năm cao hơn nhóm không dùng nấm Nhiều thông tin

ở Đài Loan cho biết nếu dùng nấm Linh Chi trồng trên gỗ long não điều trị cho các bệnh nhân ung thư cổ tử cung đạt kết quả tốt - khối u tiêu biến hoàn toàn (Lê Xuân Thám, 2005)

+ Khả năng kháng HIV: Để khảo sát khả năng kháng HIV của các hợp chất trong

nấm Ganoderma lucidum, người ta đã sử dụng dịch chiết từ quả thể trong thử nghiệm

kháng virus HIV – 1 trên các tế bào lympho T ở người Sự nhân lên của virus được xác định qua hoạt động phiên mã ngược trên bề mặt các tế bào lympho T đã được gây nhiễm HIV – 1 Kết quả cho thấy có sự ức chế mạnh mẽ hoạt động tăng sinh của loại virus này (Kim, 1996) Do đó, nhiều quốc gia đã đưa Linh Chi vào phác đồ điều trị tạm thời, nhằm tăng cường khả năng miễn dịch và cải thiện thể trạng cho các bệnh nhân trong khi AZT, DDI, DDC còn hiếm và rất đắt (Đoàn Suy Nghĩ, 2009) Các nghiên cứu tại Nhật Bản đã chứng minh các hoạt chất từ nấm Linh Chi có tác dụng như sau: (Masao Hattori, 2001) Ganoderiol F và ganodermanontirol có hoạt tính kháng HIV – 1, Ganoderderic acid B

và lucidumol B có tác động ức chế hữu hiệu protease HIV – 1, Ganodermanondiol và lucidumol A ức chế phát triển tế bào Meth – A (mouse sarcoma) và LLC (mouse lung carcinoma) Ngoài ra các ganoderma alcohol là lanostane triterpene với nhóm hydroxol (-OH) ở vị trí C25 có khả năng kháng HIV – 1, Meth – A và LLC ở chuột (Lê Duy Thắng, 2001; Lê Xuân Thám, 1996)

+ Khả năng antioxydant: Nhiều thực nghiệm chỉ ra khả năng antioxydant của các

saponine và triterpenoid, mà trong đó Ganoderic acid được coi là hiệu quả nhất Những nghiên cứu gần đây đang đẩy mạnh theo hướng làm giàu Selenium - một yếu tố khoáng

có hoạt tính antioxydant rất mạnh – vào nấm Linh Chi Chính vì vậy con người có thể

Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh Chi có khả năng khử một số gốc tự do sinh

ra trong quá trình lão hóa cơ thể hay sau khi bị nhiễm xạ Chúng làm phục hồi các cơ quan bị tổn thương và không gây hiệu ứng phụ nào cho cơ thể Ngoài ra nấm Linh Chi còn có tác dụng chữa trị chứng bí tiểu, bổ thận khí chữa trị đau nhức khớp xương, gân cốt, … (Đoàn Suy Nghĩ, 2009)

1.2.2 Chi Amauroderma

Chi Amauroderma hiện nay gồm nhiều loài nhiệt đới, có cuống hoặc không cuống

với bào tử đảm hình cầu hoặc gần hình cầu (Ryvarden, 2004) Sự kết hợp các đặc tính

này phân biệt Amauroderma với 4 chi khác, vì Ganoderma, Humphreya và Tomophagus

có bào tử cụt và bào tử Haddowia có mào (Ryvarden, 2004) Amauroderma được xem

như là ký sinh trên rễ cây sống (Ryvarden, 2004) và có 30 loài phân bố ở vùng nhiệt đới

Chi Amauroderma Murill: Quả thể thường niên, đơn độc, thường mọc trên mặt đất, một

vài loài mọc trên gỗ, và cuống đính giữa, dạng trơn láng hoặc thô ráp Mũ nấm hình tròn, thỉnh thoảng dạng lồi (convex) do sự hiện diện của một mấu lồi (umbo) ở mặt trên của mũ nấm và xỉn màu Lỗ bào tầng (hymenial pore) hình trụ nhưng có thể bị ép dẹp

Việc xác định các loài Amauroderma theo cách truyền thống dựa trên đặc điểm

hình thái macro và micro, chẳng hạn như: sự hiện diện / vắng mặt của các bề mặt bóng láng, kích thước của lỗ trên bề mặt quả thể, màu sắc của mũ, hiện diện / vắng mặt của các dải nhựa trong thịt nấm; kiểu gồ ghề, kích thước và hình dạng của bào tử đảm và

loại mép mũ (Ryvarden, 2004) Một số loài thuộc chi Amauroderma: Amauroderma amoiense, A africana, A andina, A auriscalpium, A austrosinense, A bataanense, A boleticeum, A brasiliense, A buloloi, A calcigenum, A coltricioides, A congregatum,A conicum, A conjunctum, A dayaoshanense, A deviatum, A ealaense,

A elegantissimum, A exile, A fujianense, A fuscoporia, A guangxiense, A infundibuliforme, A insulare, A jiangxiense, A kwiluense, A leptopus, A leucosporum,

A longgangense, A macrosporum, A malesianum, A parasiticum, A perplexum, A praetervisum, A preussii, A pudens, A renidens, A rude, A rugosum, A salisburienseA Schomburgkii, A scopulosum, A secedens, A solomonense, A sprucei,

A subrugosum, A unilaterum, A wuzhishanense

Amauroderma rugosum là một loài nấm mọc hoang đã được người dân bản địa ở

Malaysia sử dụng làm vòng cổ để ngăn ngừa cơn đau và khóc không ngừng ở em bé

Umah và ctv (2013) đã thực hiện nghiên cứu các thành phần dinh dưỡng và tiềm năng

chống oxy hóa và chống viêm của chiết xuất từ A rugosum trên tế bào RAW264.7 có LPS kích thích Thành phần dinh dưỡng của sợi nấm A rugosum đông khô thu được từ

nuôi cấy ngập chìm chủ yếu gồm carbohydrate, protein, chất xơ, phospho, kali và natri Các chiết xuất thô ethanol, hexane, ethyl acetate, và các phần phân đoạn dịch nước của

sợi nấm A rugosum nuôi cấy ngập chìm đã được khảo sát EAF chứa tổng hàm lượng

phenolic cao nhất và các hoạt động chống oxy hóa mạnh nhất dựa trên thử nghiệm diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) và 2,2-azino-bis (3 ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) Chất chiết hexane cho thấy sự ức chế sản xuất nitric oxide phụ thuộc liều lượng trong các tế bào RAW264.7 LPS kích thích và hoạt động lọc triệt để nitric oxide Phân tích sắc ký khí HF cho thấy sự hiện diện của linoleate ethyl và ergosterol, đây là các hợp chất được biết đến có đặc tính chống viêm

2,2-Xie và ctv (2015) đã sàng lọc mười ba loài nấm cho tiềm năng ức chế sự phát triển

khối u và phát hiện ra rằng chiết xuất nước của Amauroderma rude có hoạt tính cao

nhất Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các polysaccharide trong dịch chiết nước

có hoạt tính chống ung thư Sử dụng chất chiết thô Amauroderma rude trong thí nghiệm

in vitro cho thấy hoạt động của các tế bào lympho lách, đại thực bào và các tế bào giết

tự nhiên đều tăng Thí nghiệm in vivo cho thấy chiết xuất làm tăng sự trao đổi chất của

đại thực bào, tăng sinh tế bào lympho và sản xuất kháng thể Ngoài ra, các sản phẩm

tinh khiết kích thích sự tiết cytokine in vitro và in vivo Nhìn chung, các chiết xuất giảm

tốc độ tăng trưởng khối u Cuối cùng, các hoạt chất đã được tinh sạch và xác định là polysaccharide F212

1.2.3 Chi Humphreya

Theo Trịnh Tam Kiệt (2012), ở Việt Nam có loài Humphreya coffeatum (Berk.)

Stey Đây là loài có quả thể một năm có cuống, chất lie Mũ gần như hình cầu đến giả bán cầu, kích thước 3-4 x 2-3,5 x 0,5-1 cm Mặt trên có màu nâu cánh gián đến màu nâu tím, bóng láng, có những gờ đồng tâm không có quy luật Mép hơi khum, phẳng xuống dưới Mô nấm có màu nâu, dài 1-4 mm Ống nấm màu nâu, dài 3-7mm, mặt ống có màu trắng, chuyển sang màu vàng nâu nhạt khi già hoặc khô, 3-4 ống trong 1 mm Cuống

xếp dạng bào tầng (Hymenioderm) Đảm bào tử có kích thước 11-13,5 x 7,5-9,5 µm, hình trái xoan cho đến hình oval rộng, đôi khi co dạng elip màu nâu, có trang trí màng ngoài dạng gờ nổi mạng lưới đặc trưng Mọc trên rễ cây nằm trong đất

1.2.4 Chi Haddowia

Theo Trịnh Tam Kiệt (2012), ở Việt Nam Haddowia có Haddowia longipes (lev.) Steyaert và Haddowia cucphuongnensis n sp H cucphuongnensis n sp có mũ nấm

không cuống, dạng móng – dạng đính phẳng, màu nâu, mép tù, màu trắng, kích thước 1

- 4 cm đường kính Ống nấm 5 – 17 mm chiều dài, màu nâu nhạt Mô nấm dày 5 mm, chết sợi Bào tử màu nâu hình oval, có gờ theo chiều thẳng đứng, kích thước 7,5 x 12

µm Mọc trên gốc cây sống và sau đó chết Phân bố: Cúc Phương, Ninh Bình Chín

lanostanoid được phân lập từ chất chiết ethyl acetate của quả thể nấm Haddowia longipes Các lanostanoid được xác định là 11-oxo-ganoderiol D, lanosta-8-en-7,11-

dioxo-3β-acetyloxy-24,25,26-trihydroxy,lanosta-8-en-7-oxo-3β-acetyloxy-11β,24,25,26 tetrahydroxy, lanosta-7,9(11)-dien-3β-acetyloxy-24, 25 ,26-trihydroxy, lanosta-7,9(11)-dien-3β-acetyloxy-24,26-dihydroxy-25-methoxy, 11-oxo-lucidadiol, 11β-hydroxy-lucidadiol, lucidone H và lanosta-7,9(11),24E-trien-3β-acetyloxy-26,27-dihydroxy bằng phổ 1D/2D NMR và MS

1.3 Phương pháp bào quản chủng nấm

Bảo quản chủng được phân thành hai nhóm chính gồm bảo quản ngắn hạn và bảo quản dài hạn Bảo quản ngắn hạn chỉ duy trì chủng được thời hạn là một năm, chủ yếu

là phương pháp cấy chuyền Bảo quản dài hạn có thể duy trì chủng trong thời gian hơn mười năm tùy thuộc vào từng phương pháp và từng chủng (Giani L và ctv, 2017)

1.3.1 Phương pháp cấy chuyền

Phương pháp cấy chuyền là phương pháp bảo quản đơn giản Chủng được cấy trên môi trường thích hợp (dịch thể hay trên thạch) trong ống nghiệm hay bình tam giác và

để trong điều kiện thích hợp cho chủng phát triển, sau đó được bảo quản ở nơi có điều kiện thích hợp Quá trình này được lặp lại trong một thời hạn nhất định, đảm bảo chủng luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết Phương pháp này có thể bảo quản được vài năm nếu người thực hiện có tay nghề cao Đồng thời phương pháp này ít tốn kém, không yêu cầu thiết bị đặc biệt, và việc phục hồi thì dễ đàng Thời gian

để cấy chuyền tùy thuộc vào từng chủng nấm, có thể là 2-4 tuần, 2-4 tháng hoặc 1 năm

Bảo quản ở nhiệt độ thấp có thể làm chậm quá trình chuyển hóa nên khoảng cách thời gian cấy chuyền có thể kéo dài hơn Tuy nhiên, phương pháp này có những nhược điểm như dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến mất chủng chủng gốc, mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữa các chủng trong quá trình bảo quản, tốn nhiều công sức để cấy truyền và chủng gốc

có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy truyền không thích hợp (Homolka, 2001

và 2007; Kitamoto, 2002)

1.3.2 Phương pháp bảo quản dưới lớp dầu khoáng

Trữ chủng trong môi trường thạch nghiêng sau đó được phủ lên một lớp dầu khoáng khoảng 10mm để ngăn chặn sự thoát hơi nước và làm chậm hoạt động chuyển hóa và sự phát triển Nếu lớp dầu dày hơn 10mm, nấm có thể chết do không nhận đủ oxy, ngược lại nếu lớp dầu quá mỏng, phần tơ nấm và agar không được phủ làm cho môi trường thạch bị khô do quá trình bay hơi Phương pháp này chỉ thích hợp với một

số chủng, không cần đầu tư thiết bị máy móc Tuy nhiên phương pháp này dễ bị nhiễm

và quá trình phục hồi chậm (Homolka, 2007; Kitamoto, 2002; Voyron, 2009, Homolka, 2014)

1.3.3 Phương pháp làm mất nước trong môi trường bảo quản

Phương pháp này thường dùng cho các chủng nấm sợi và nấm men Theo phương pháp này các chủng vi sinh vật có thể được bảo quản với các chất mang phổ biến như sau: Trên đất, cát và silicagel Các nghiên cứu cho thấy là bào tử nấm có thể sống 4-5 năm khi bị làm khô trong đất mà không bị thay đổi các đặc tính sinh học Ngày nay silicagel là chất mang được dùng phổ biến và có hiệu quả đối với bảo quản nấm men, nấm sợi Bảo quản trên giấy: Các chủng nấm men và nấm sợi được làm khô trên giấy

và sau đó được bọc bằng giấy bạc và đựng trong hộp kín Ưu thế của phương pháp này

là bảo quản được lượng mẫu lớn Bảo quản trên gelatin: Để thực hiện phương pháp này, người ta tạo dịch huyền phù chủng vi sinh vật trong môi trường có gelatin Sau đó các giọt mẫu được làm khô trong đĩa petri Phương pháp này có thể bảo quản được vi khuẩn trong vài năm

1.3.4 Phương pháp bảo quản đông khô

Phương pháp đông khô sẽ giữ lại hình dạng, cấu trúc và hoạt động của các chủng được bảo quản Phương pháp này nếu được thực hiện chính xác sẽ ngăn chặn sự co lại

chủng được bảo quản Thiết bị sử dụng cho quá trình đông khô không quá phức tạp Bảo quản bằng phương pháp đông khô đảm bảo được sự lây nhiễm, khả năng sống cao, duy trì được tốc độ phát triển, dễ dàng vận chuyển bằng được bưu điện Tuy nhiên nhiều chủng không có khả năng sống nếu bảo quản theo phương pháp này và sự biến đổi về mặt di truyền có thể xảy ra

1.3.5 Phương pháp bảo quản lạnh sâu

Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu, chủng được bảo quản trong môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của chủng bị bất hoạt ở nhiệt độ tế bào có thể

bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào

là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide) Phương pháp này được bảo quản ở các thang nhiệt độ khác nhau như -20°C, -30°C, -40°C, -70°C, -140°C và -196°C Tuy nhiên bảo quản ở nhiệt độ cao hơn -30°C cho hiệu quả thấp do tế bào chịu ảnh hưởng của nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải Trong

đó phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phương pháp vạn năng hơn cả nhưng tốn nhiều chi phí đầu tư cho thiết bị, điện và nitơ lỏng, đặc biệt không thích hợp cho các chủng thường xuyên dung đến

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trịnh Tam Kiệt, Lê Xuân Thám nghiên cứu đề tài “Những nghiên cứu về họ nấm Linh Chi Ganodermataceae Donk ở Việt Nam” đã cho biết năm 1994 ở Việt Nam họ Ganodermataceae gồm 43 loài, và ghi nhận mới 10 loài cho nấm lớn Việt Nam Hai tác giả này tiếp tục nghiên cứu trong “Chuyên san nấm Linh Chi Ganodermataceae” và cho biết các loài trong họ Ganodermataceae là một nguồn dược liệu quý

Ngô Anh và ctv (2008) đã thu thập được 13 họ nấm dược liệu ở Thừa Thiên Huế, trong đó Linh Chi chiếm ưu thế với 36 loài Có nhiều loài nấm dược liệu chiếm ưu thế

như Cổ Linh Chi (Ganoderma applanatum), Hoàng Chi (Ganoderma colossum), Tử Chi (Ganoderma fulvellum), Thanh Chi (Ganoderma philippii), Xích Chi (Ganoderma ramosissimum), Linh Chi nhiệt đới (Ganoderma tropicum) và Hắc Chi (Ganoderma subresinosum)

Lê Đình Hoài Vũ và Trần Đăng Hòa (2008) đã khảo sát khả năng sinh trưởng và

phát triển của các chủng chủng Ganoderma lucidum có nguồn gốc khác nhau trong điều kiện tự nhiên ở Thừa Thiên Huế Kết quả cho thấy Ganoderma lucidum cho năng suất

cao, thích nghi với điều kiện sinh thái ở Thừa Thiên Huế Tác giả cũng cho biết cần mở rộng mô hình phát triển chủng nấm này trên cơ chất nền (96,5% mùn cưa cao su + 2% bột ngô + 1,5% cám gạo)

Năm 2009, Lê Xuân Thám và ctv đã nghiên cứu hình thái nấm, phân hóa cấu trúc

DNA và thành phần hoạt chất loài Amauroderma subresinosum khẳng định Amauroderma subresinosum là một taxon trung gian, họ còn phát hiện ra 5 axit béo:

Pentadecanoic (C15H30O2) 4%, Methyl pentadecanoic (C16H32O2) 24%, axit 9,12 Octadecadienoic (C18H32O2) 19%, axit 9 Octadecenoic (C18H34O2) 42%, axit Octadecenoic (C18H36O2) 10% Ngoài ra, họ còn phát hiện và đã mô tả, phân tích trình

tự DNA và công dụng của loài Humphreya endertii

Năm 2011, Lê Xuân Thám và ctv đã phát hiện nấm Linh Chi đỏ mới ở Việt Nam

trên một cây phi lao cổ bào ở Đà Lạt Loài Linh Chi này có tên khoa học là Gannoderma

cf pfeifferii Nhóm nghiên cứu đã tiến hành phân lập để lấy chủng thuần khiết bảo vệ

nguồn gen Năm 2012, dựa vào đặc điểm hình thái và ADN, Lê Xuân Thám và ctv đã

nghiên cứu phát hiện ra 1 loài mới Tomophagus cattienensis sp tại vườn quốc gia Cát

Tiên

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

❖ Nghiên cứu liên quan đến bảo quản

Mata và ctv (2005) đã đánh giá tỷ lệ sống của giống nấm Agaricus bisporus sau

một thời gian bảo quản trong nitơ lỏng có chứa hạt lúa mì mà không sử dụng chất bảo

vệ glycerol Kết quả cho thấy tơ nấm có thể tồn tại trong môi trường đông lạnh mà không

sử dụng chất bảo vệ do tơ nấm lan vào bên trong hạt lúa mì và được bảo vệ bởi hạt lúa

mì nên không có sự khác biệt giữa việc sử dụng chất bảo vệ và không sử dụng chất bảo

vệ

Mười hai phương pháp bảo quản được đánh giá cho việc lưu trữ chủng nấm mới

được phân lập, Schizophyllum commune Fr bởi Karaduman A và ctv (2011) Chủng

thạch agar chứa tơ nấm ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau như 4°C, 20°C và -20°C Các chủng nấm được kiểm tra theo định kỳ về khả năng sống và hoạt tính sinh học đến một năm Sau 12 tháng bảo quản, tỷ lệ sống, tốc độ làn tơ và khối lượng sinh khối của các chủng nấm được tương đương nhau đối với các phương pháp thực hiện Chủng được cấy trong thạch trữ trong nước cất khử trùng ở 4°C và trong 15% glycerol ở 20°C thích

hợp hơn cho việc bảo quản của chủng S commune

Mantovani và ctv (2012) đã chứng minh rằng bảo quản đông sâu ở -20°C hiệu quả

đối với lưu giữ P ostreatus đến 3 năm với khả năng phát triển tơ nấm 87% khi sử dụng

hạt lúa mì làm cơ chất và 10% sucrose hoặc 4% glucose được dùng như chất bảo bệ quản đông sâu Do đó, họ Basidiomycetes có thể được bảo quản ở -20°C nếu các điều kiện bảo quản hạn chế được các tổn thương gây ra do bảo quản đông sâu

Mantovani và ctv (2012) đã nghiên cứu bảo quản đông sâu L edodes ở -70°C trong

thời gian là một, hai và ba năm và khi đánh giá ở thời gian bảo quản 1 đến 2 năm thì tơ nấm mất khả năng phát triển ở tất cả các nghiệm thức, tuy nhiên sau thời gian bảo quản

từ 2 đến 3 năm khả năng phát triển của tơ nấm được giữ nguyên

Colauto và ctv (2012) đã xác nhận rằng chủng A subrufescens phản ứng khác nhau

khi được bảo quản đông sâu ở -196°C, thể hiện ở khả năng phục hồi sự phát triển tơ nấm

với hai trong năm chủng tơ nấm không phát triển Làm lạnh nhanh tơ nấm A subrufescens trong ni tơ lỏng không phải phương pháp thích hợp nhất để bảo quản A subrufescens

Năm 2014, Rajesh và ctv đã phân lập được 2 loài nấm Linh Chi DKR1 và DKR2

từ 2 loài gỗ lâu năm Casurinaequiestifolia và Morinda tinctoria tại Ấn Độ Qua nghiên

cứu đặc điểm hình thái đại thể, vi thể, khuẩn lạc, hệ sợi và hình dạng bào tử đã kết luận chúng thuộc họ Basidiomycetes Linh Chi DKR1 có thể là nấm dược liệu hữu ích với

vai trò kháng khuẩn, ngăn chặn hoạt động của Staphylococcus aureusvà Micrococcus

sp (Rajesh và ctv, 2014)

Eichlerova và ctv (2015) đã xác nhận không mất đáng kể hoạt tính laccase trong

mẫu Trametes versicolor sau thời gian bảo quản ngắn (24h) ở -80°C nhưng khi lưu giữ

trong ni tơ lỏng lại gây giảm 10,6-21,7% hoạt tính laccase Việc kiểm soát làm lạnh trong ni tơ lỏng với tỉ lệ làm lạnh 1 hoặc 3°C /phút, thì hoạt tính laccase giảm từ 1,47%

đến 18,42% sau thời gian bảo quản ngắn phụ thuộc vào loại chất và nồng độ chất bảo quản đông sâu

Theo nghiên cứu của Giani và ctv (2017), bảo quản đông sâu -200C đã làm giảm khả năng phục hồi của họ Basidiomycetes Trong 2 năm bảo quản đông sâu ở -20°C, tất

cả có 134 nghiệm thức được sử dụng và khả năng phục hồi sự phát triển của các nghiệm thức đó chỉ là 7,5% Với bảo quản đông sâu lâu hơn 2 năm ở -20°C, chỉ có 132 nghiệm thức với khả năng phục hồi là 1,5%

❖ Nghiên cứu liên quan đến giải trình tự

Nghiên cứu của Lee và ctv (2006) về phát triển phương pháp định danh sinh học phân tử cho nấm dược liệu dựa trên trình tự các nucleotide của LSU (rDNA) Ba loại nấm dược liệu đại diện được sử dụng là: Ganoderma lucidum, Coriolus versicolor, Fomes fomentarius Nấm được sử dụng trong thí nghiệm này bao gồm cả quả thể thu thập từ tự nhiên và quả thể thu hái từ nuôi trồng ADN bộ gen của nấm được thu nhận

và 3 đoạn LSU (rDNA) được khuếch đại Trình tự thu nhận được cho thấy các trình tự gen của cùng một loài nấm có sự tương đồng hơn 99,48% và của 3 loài nấm dược liệu khác nhau là hơn 97,80% Kết quả phân tích cho thấy không có vị trí hữu ích đối với các enzyme giới hạn 6bp để phân biệt 3 trình tự với nhau nhưng một số mẫu đặc biệt đã được công nhận bởi các enzyme giới hạn 4 bp AccII và HhaI

Trong nghiên cứu của Nelson và ctv (2014), 14 mẫu Ganoderma và 2 mẫu Tomophagus được thu thập tại Brazil để thu nhận DNA, khuếch đại và giải trình tự các

vùng ITS và LSU (rDNA) Qua đó ghi nhận được 6 loài là G chalceum, G multiplicatum, G orbiforme, G parvulum, G aff oerstedtii and Tomophagus colossus

Từ đó cho thấy các kết quả giải trình tự gen của vùng ITS và LSU (rDNA) góp phần hỗ trợ phân loại chi

Nghiên cứu của Rasime Demirel (2016) được thực hiện nhằm mục đích so sánh tính ứng dụng, khả năng định danh loài, xây dựng cây phát sinh loài của các locus ITS,

LSU, SSU dựa trên 43 chủng nấm thuộc ba chi Aspergillus, Penicillium và Talaromyces

spp Kết quả chỉ ra rằng các locus ITS và LSU cho hiệu quả cao nhất, thể hiện sự phân biệt cấu trúc và phân loại chủng hệt nhau, trong khi locus SSU là kém hiệu quả nhất, thể

SSU dài và có chất lượng thu được trong nghiên cứu hiện tại thuộc về ba chi nấm nói trên đã được gửi vào cơ sở dữ liệu NCBI

Chương 2: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu:

Thời gian: năm 2019

Địa điểm: Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Vật liệu

Bộ sưu tập chủng nấm họ Linh chi Ganodermataceae – Trung tâm Nghiên cứu

và Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao

2.2.2 Hóa chất thí nghiệm

Môi trường trữ chủng và nhân chủng thạch đĩa: môi trường PDB (Himedia), môi trường PDA (Himedia), C4H12N2O6 (Sigma-Aldrich), KH2PO4 (Himedia), MgSO4.7H2O (Himedia) , yeast extract (Himedia), CaCL2.2H2O (Himedia), CMC (Sigma-Aldrich), xylan (Sigma-Aldrich), Azure B (Sigma-Aldrich), CuSO4.5H2O (Himedia), Fe2(SO4)3 (Himedia), glycerol (Himedia), mùn cưa, cám gạo, kit PCR Thermo Scientific™ Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu

- Bình thủy tính nắp vặn 500ml, 1000 ml

- Cốc thủy tinh 100 ml, 500 ml, 1000ml

- Ống đong 50 ml, 100ml, 1000ml, ống nghiệm, ống trữ mẫu cryotube

- Khay nhựa, rổ nhựa, khay inox, bộ dao kéo, bộ cấy nấm

- Cân phân tích độ chính xác 10-4mg - Sartorius - Đức

- Cân kỹ thuật chính xác 10-2mg - Sartorius - Đức

- Tủ âm -80°C, máy hạ nhiệt IceCube 11xs, bình trữ nitơ lỏng MVE Tec 3000, tủ cấy vi sinh Esco

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Nội dung 1: Đánh giá hiệu quả các phương pháp bảo quản thực hiện năm

2017

2.3.1.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá sức sống của các chủng nấm Linh Chi đã được bảo quản từ năm 2017

b Bố trí thí nghiệm: Bảy phương pháp bảo quản đã được thực hiện từ năm 2017

được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1: Các phương pháp bảo quản được thực hiện năm 2017

STT Phương pháp bảo quản Thời gian Số lượng

ống/chủng

1 Thạch trong nước cất, 40C 4/2017 5

2 Thạch trong glycerol 10%, 40C 4/2017 5

3 Đĩa giấy trong nước cất, 40C 4/2017 5

4 Đĩa giấy trong glycerol 10%, 40C 4/2017 5

5 Lúa gạo trong nước cất, 40C 4/2017 5

6 Lúa gạo trong glycerol 10%, 40C 4/2017 5

7 Lúa gạo trong glycerol 10%, -200C 4/2017 5

Thí nghiệm được thực hiện trên 32 chủng với bảy phương pháp bảo quản đã được lưu trữ từ năm 2017 Mỗi phương pháp bảo quản được phục hồi trên 20 đĩa môi trường

c Phương pháp thực hiện

Các ống trữ nấm được chuyển ra nhiệt độ phòng, sau đó cấy chủng từ các ống trữ của bảy phương pháp bảo quản khác nhau ra môi trường PDA Các đĩa sau khi được cấy phục hồi được ủ ở 25°C, trong điều kiện tối Sau khi các chủng nấm lan tơ, tơ nấm được tiếp tục cấy chuyền để theo dõi tốc độ lan tơ

d Chỉ tiêu theo dõi

Tỷ lệ phục hồi của chủng:

Tỷ lệ phục hồi (%) = đĩa thạch cấy còn sống

tổng số đĩa cấy x 100Sức sống của chủng được đánh giá bằng tốc độ lan tơ trên thạch (mm/ngày): Tốc độ lan tơ = (D2−D1)

(d2−d1) trong đó: D: đường kính khuẩn lạc (mm) d: ngày đo (ngày)

2.3.1.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng phân giải cellulose của các chủng nấm sau thời gian bảo quản từ năm 2017

a Mục đích: Xác định chủng nấm sau khi phục hồi có khả năng phân giải cellulose

b Bố trí thí nghiệm: Các chủng nấm có khả năng phục hồi được đánh giá khả năng

phân giải cellulose Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp thử hoạt tính phân giải cellulose bằng cách nhuộm màu trên môi trường agar chứa cơ chất

carboxymethylcellulose (CMC) (Pointing, S.P., 1999) Mỗi chủng nấm được thực hiện trên 3 đĩa môi trường cơ chất CMC, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần

c Phương pháp thực hiện: Môi trường cellulolysis basal medium (CBM) bổ sung

CMC gồm các thành phần 5g/L C4H12N2O6; 0,1g/L Yeast Extract; 1g/L KH2PO4; 0,001g/L CaCl2 2H2O; 0,5g/L MgSO4 7H2O; 2% w/v CMC độ nhớt thấp; 1,6% w/v agar được chuẩn bị, và hấp khử trùng ở 121°C, 15 phút Tơ nấm đã được phát triển trên môi trường PDA được cấy trên môi trường CMC, ủ ở 25°C trong tối Khi tơ nấm chạy được 2/3 đĩa tiến hành nhỏ 2% w/v thuốc thử Congo Red lên bề mặt nuôi cấy sao cho thuốc thử dàn đều khắp bề mặt đĩa thạch, để yên trong 15’ ở nhiệt độ phòng Sau đó, đĩa được rửa sạch thuốc thử bằng nước cất, nhỏ 1M NaCl lên bề mặt nuôi cấy sao cho thuốc thử dàn đều khắp bề mặt đĩa thạch, để yên trong 15’ và loại bỏ NaCl dư Quan sát sự đổi màu và đo đường kính vòng phân giải

d Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính vòng phân giải (mm)

2.3.1.3 Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng phân giải xylan của các chủng nấm sau thời gian bảo quản từ năm 2017

a Mục đích: Xác định chủng nấm sau khi phục hồi có khả năng phân giải xylan

b Bố trí thí nghiệm: Các chủng nấm có khả năng phục hồi được đánh giá khả năng

phân giải xylan Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp đánh giá enzyme hemicellulose (xylanase) bằng cách nhuộm màu trên môi trường cơ chất xylan (Pointing, S.P., 1999) Mỗi chủng nấm được thực hiện trên 3 đĩa môi trường cơ chất xylan, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần

c Phương pháp thực hiện: Môi trường xylanolysis basal medium (XBM) bổ sung

xylan gồm các thành phần 5g/L C4H12N2O6; 0,1g/L Yeast Extract; 1g/L KH2PO4; 0,001g/L CaCl2 2H2O; 0,5g/L MgSO4 7H2O; 4% w/v xylan; 1,6% w/v agar được chuẩn

bị, và hấp khử trùng ở 121°C, 15 phút Tơ nấm đã được phát triển trên môi trường PDA được cấy trên môi trường xylan, ủ ở 25°C trong tối Khi đường kính tơ nấm đạt khoảng 30mm, tiến hành nhỏ 0,25% w/v thuốc thử I2 và KI lên bề mặt nuôi cấy sao cho thuốc thử dàn đều khắp bề mặt, để yên trong vòng 5 phút Rửa sạch với nước cất Sau đó quan sát vòng phân giải xylan xung quanh khuẩn lạc nấm

2.3.1.4 Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng phân giải lignin của các chủng nấm sau thời gian bảo quản từ năm 2017

a Mục đích: Xác định chủng nấm sau khi phục hồi có khả năng phân giải lignin

b Bố trí thí nghiệm: Các chủng nấm có khả năng phục hồi được đánh giá khả năng

phân giải lignin Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp đánh giá enzyme phân giải lignin bằng cách làm mất màu môi trường chứa cơ chất Azure-B (Pointing, S.P., 1999) Mỗi chủng nấm được thực hiện trên 3 đĩa môi trường cơ chất aure-B, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần

c Phương pháp thực hiện: Môi trường LME basal medium (LBM) bổ sung

Azue-B gồm các thành phần 1g/L KH2PO4; 0,5 g/L C4H12N2O6; 0,5 g/L MgSO4.7H2O; 0,01 g/L CaCl2.2H2O; 0,01 g/L Yeast Extract; 0,001 g/L CuSO4.5H2O; 0,001 g/L Fe2(SO4)3; 0,001 g/L MnSO4.H2O; 0,01% w/v Azue-B; 1,6% w/v agar được chuẩn bị, và hấp khử trùng ở 121°C, 15 phút Sau đó bỏ thêm 1ml 20% w/v dung dịch glucose đã hấp khử trùng vào 100ml môi trường đã được chuẩn bị Tơ nấm đã được phát triển trên môi trường PDA được cấy trên môi trường Azure-B, ủ ở 25°C trong tối Sau đó quan sát sự thay đổi màu sắc của môi trường

d Chỉ tiêu theo dõi: Sự mất màu của môi trường sau khi nuôi cấy

2.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu phương pháp bảo quản chủng nấm

a Mục đích: Xác định phương pháp bảo quản thích hợp cho từng chủng nấm

b Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo 3 phương pháp bảo quản:

Phương pháp trữ glycerol 10% làm lạnh sâu (-80°C), phương pháp trữ bằng mùn cưa

có glycerol 10% làm lạnh sâu (-80°C) và phương pháp trữ glycerol 10% làm lạnh sâu bằng nitơ lỏng (-196°C) Mỗi chủng nấm được bảo quản trong 12 ống trữ đối với một phương pháp bảo quản

c Phương pháp thực hiện: Các chủng nấm còn sự sống của bộ sưu tập được nuôi

trên môi trường thạch đĩa phù hợp cho đến khi sợi nấm phát triển cực đại Đối với phương pháp trữ trong glycerol 10% ở -80°C, dùng ống đục thạch bỏ các mảnh sinh khối nấm vào các ống trữ, thêm vào glycerol 10% đã được hấp khử trùng cho ngập các mảng sinh khối nấm Ống sau cấy được hạ nhiệt bằng máy hạ nhiệt với chu trình hạ nhiệt theo bảng 2.2 và trữ vào tủ đông sâu -80°C

Đối với phương pháp trữ trong glycerol 10% ở -196°C, dùng ống đục thạch bỏ các mảnh sinh khối nấm vào các ống trữ, thêm vào glycerol 10% đã được hấp khử trùng cho ngập các mảng sinh khối nấm Ống sau cấy được hạ nhiệt bằng máy hạ nhiệt với chu trình hạ nhiệt theo bảng 2.3 và trữ vào bình trữ nitơ lỏng ở -196°C

(d2−d1) trong đó: D: đường kính khuẩn lạc (mm) d: ngày đo (ngày)

2.3.3 Nội dung 3: Bổ sung cơ sở dữ liệu bộ sưu tập chủng nấm họ Linh Chi

a Mục đích: Bổ sung thêm thông tin trình tự vùng ITS và LSU rDNA D1-D2

cho các chủng nấm

b Bố trí thí nghiệm: Các chủng nấm sau khi phục hồi được nuôi cấy để ly trích

DNA, thực hiện phản ứng PCR và giải trình tự các đoạn gen vùng ITS và LSU rDNA D1-D2

c Phương pháp thực hiện: Các chủng nấm sau khi phục hồi được nuôi cấy lỏng

trong môi trường PDB, sau khi nấm mọc trên bề mặt môi trường lỏng, tơ nấm được thu nhận để ly trích ADN

❖ Giải trình tự vùng ITS và LSU rDNA D1-D2 của các chủng nấm trong bộ

sưu tập

ADN được ly trích bằng phương pháp CTAB (ISO 21571:2005) như sau:

- Cân từ 200 mg đến 300 mg tơ nấm được lấy từ bề mặt môi trường và chuyển vào ống falcon 15ml

- Thêm 1,5 ml dung dịch đệm chiết CTAB đã được ủ trước ở (65°C) và phá mẫu và máy phá mẫu siêu âm Branson SLPe với cường độ và xung 60%

- Thêm 10μl dung dịch α- amylaza, 10μl dung dịch RNaza-A và trộn nhẹ nhàng

- Ủ 30 phút ở nhiệt độ 65°C, trong khi vẫn lắc trộn

- Thêm 10μl dung dịch proteinaza-K, lắc trộn nhẹ nhàng ống nghiệm và để 30 phút

ở 65°C, trong khi vẫn lắc trộn

- Ly tâm 10 phút ở khoảng 12.000 g Chuyển phần nổi phía trên sang một ống nghiệm mới, thêm 0,7 thể tích đến 1 thể tích chlorofom và trộn kỹ

- Ly tâm 15 phút ở khoảng 12.000 g Chuyển pha phía trên (pha lỏng) sang một ống nghiệm mới

- Cho thêm 2 thể tích dung dịch đệm kết tủa Để yên 60 phút ở nhiệt độ phòng

- Ly tâm 15 phút ở khoảng 12.000 g Gạn bỏ phần phía trên

- Hòa tan ADN kết tủa bằng cách thêm 350μl dung dịch NaCl

- Thêm 350μl dung dịch chlorofom và trộn kỹ Ly tâm 10 phút ở khoảng 12.000 g Chuyển pha lỏng sang một ống nghiệm mới

- Cho thêm 0,6 thể tích isopropanol, trộn kỹ bằng cách đảo chiều ống nghiệm và giữ trong 20 phút ở nhiệt độ phòng Ly tâm 15 phút ở 12.000 g

- Gạn bỏ phần nổi phía trên Cho thêm 500μl dung dịch ethanol vào ống nghiệm và đảo chiều ống nghiệm vài lần

- Ly tâm 10 phút ở khoảng 12.000 g Gạn bỏ phần nổi phía trên

- Làm khô các kết tủa ADN và hòa tan lại vào 100μl dung dịch đệm TE Đây là ADN gốc chính

Phản ứng PCR khuếch đại trình tự vùng ITS sử dụng cặp mồi ITS1F/ITS4B và vùng LSU-rDNA D1-D2 sử dụng cặp mồi LROR/LR6 Trình tự các cặp mồi được thể hiện qua bảng 2.1

Bảng 2.4: Trình tự mồi vùng ITS và vùng LSU-rDNA D1-D2

ITS1F 5′-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A-3′ Gardes và Bruns,

1993 ITS4B 5′-CAG GAG ACT TGT ACA CGG TCC AG-3′

LROR 5’ - ACC CGC TGA ACT TAA GC -3 Rehner và

Samuels, 1995

LR6 5’ - CGC CAG TTC TGC TTA CC -3

Sử dụng cặp mồi ITS1F/ITS4B và LROR/LR6 đã được chuẩn bị và sử dụng kit PCR Thermo Scientific™ Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase theo hướng dẫn nhà sản xuất Thành phần cho 1 phản ứng được thể hiện qua bảng 2.5

Bảng 2.5:Thành phần phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự ITS và vùng trình tự LSU-rDNA D1-D2

Bảng 2.6: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại trình tự ITS

Nhiệt độ (ºC) Thời gian Số chu kỳ

Bảng 2.7: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại trình tự LSU-rDNA

Nhiệt độ (ºC) Thời gian Số chu kỳ

Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% dung môi TBE 1X (pH 8,3) Sử dụng thang DNA 1kb để ước lượng kích thước sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR được gửi đi giải trình tự bằng dịch vụ giải trình tự thương mại được thực hiện bởi công ty First BASE Laboratories Sdn Bhd., Malaysia Mỗi đoạn gen được giải trình tự 2 chiều

Kết quả trình tự được hiệu chỉnh bằng phần mềm ATGC ver 8.0 (Genetyx, Nhật Bản) và tiến hành so sánh với các dữ liệu có trên NCBI sử dụng thuật toán Blast Ghi nhận các trình tự tương đồng có chỉ số Max score cao nhất

Phần mềm Mega 6 được sử dụng để xử lý các trình tự ITS, LSU: loại bỏ các trình

tự mồi 2 đầu, sắp gióng cột bằng Clustal X, hiệu chỉnh và dựng cây phát sinh loài Phần mềm Mega 5.0 được sử dụng để xây dựng cây phát sinh loài theo thuật toán

ML, mô hình Kimura 2 yếu tố, độ tin cậy của phép phân tích được đánh giá bởi chỉ số bootstrap với 1000 lần lặp lại

❖ Hình ảnh bào tử chụp bằng kính hiển vi của chủng nấm trong bộ sưu tập

Hình ảnh bào tử của các chủng nấm trong bộ sưu tập được ghi nhận và tổng hợp

2.4 Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu được nhập và xử lí bằng phần mềm Microsoft

Excel, được phân tích ANOVA và trắc nghiệm phân hạng LSD bằng phần mềm Minitab

17 ở mức ý nghĩa 95%

Chương 3 KẾT QUẢ THẢO LUẬN

3.1 Nội dung 1: Đánh giá hiệu quả các phương pháp bảo quản thực hiện năm 2017

3.1.1 Đánh giá sức sống của các chủng nấm Linh Chi đã được bảo quản từ năm

2017

Chủng nấm thu thập được vào năm 2016 được lưu trữ và bảo quản ở các điều kiện

khác nhau gồm bảo quản bằng thạch trong nước cất ở 4°C, thạch trong glycerol 10% ở

4°C, đĩa giấy trong nước cất ở 4°C, đĩa giấy trong glycerol 10% ở 4°C, lúa gạo trong

nước cất ở 4°C, lúa gạo trong glycerol 10% ở 4°C và lúa gạo trong glycerol 10% ở

- 20°C Sau thời gian 27 tháng bảo quản từ năm 2017, 32 chủng nấm không có khả năng

phục hồi trong các điều kiện bảo quản bằng thạch trong nước cất ở 4°C, lúa gạo trong

nước cất ở 4°C và lúa gạo trong glycerol 10% ở - 20°C Đối với điều kiện bảo quản bằng

giấy trong nước cất ở 4°C, chỉ có chủng T0317 có khả năng phục hồi với tỉ lệ thấp 5%

21 chủng nấm có khả năng phục hồi khi được trữ trên giấy trong glycerol 10% ở 4°C

với tỷ lệ phục hồi chỉ từ 5- 10% Ở điều kiện trữ trong lúa gạo trong glycerol 10% ở

4°C, 12 chủng nấm có khả năng phục hồi với tỷ lệ phục hồi là 5% (bảng 3.1) Như vậy,

25 chủng nấm có khả năng phục hồi cao hơn khi được trữ trong điều kiện giấy trong

glycerol 10% ở 4°C, lúa gạo trong glycerol 10% ở 4°C với tỷ lệ 5-10% Phương pháp

trữ trên giấy trong nước cất ở 4°C đã được thực hiện với chủng nấm Humphreya coffeata

(Berk.) Stey bởi Monserrat và ctv, phương pháp này có khả năng trữ đến 18 tháng mà

không làm thay đổi hình dạng tơ Bảy phương pháp được thực hiện được xếp vào phương

pháp bảo quản ngắn hạn, cần phải cấy chuyền liên tục trong vòng 3-5 tháng, do đó tỷ lệ

phục hồi của các chủng nấm từ các phương pháp bảo quản này không được cao sau thời

gian bảo quản hơn 2 năm

Bảng 3.1: Tỷ lệ phục hồi của các chủng được bảo quản từ năm 2017

STT Chủng Thạch,

nước cất, 4°C

Thạch, glycerol 10%, 4°C

Giấy, nước cất, 4°C

Giấy, glycerol 10%, 4°C

Lúa gạo, nước cất, 4°C

Lúa gạo, glycerol 10%, 4°C

Lúa gạo, glycerol 10%, -20°C