Nghiên cứu phát triển quy trình real time pcr phát hiện bệnh do vi bào tử trùng enterocytozoon hepatopenaei ehp gây ra trên tôm

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.. HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH REAL-TIM

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP HCM

TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO

BÁO CÁO NGHIỆM THU

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN BỆNH DO VI BÀO TỬ TRÙNG

Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) GÂY RA TRÊN TÔM

ThS Nguyễn Phạm Trúc Phương

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 01/2018

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP HCM

TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN BỆNH DO VI BÀO TỬ TRÙNG

Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) GÂY RA TRÊN TÔM

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 01/2018

CƠ QUAN CHỦ TRÌ

(Ký tên, đóng dấu xác nhận) CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký tên)

là 50 copies g bi n thiên n i ph n ng c a quy trình real-time PCR EHP

nh t là 0,582%, còn h s bi n thiên liên ph n ng cao nh t 1,427%

Enterocytozoon hepatopenaei, EHP, SWP, real-time PCR,

ABSTRACT

A TaqMan probe real-time PCR assay for rapid detection of Enterocytozoon

hepatopenaei is based on a gene encoding a spore wall protein (SWP) of EHP, which

has appeared on shrimp in recent years The optimum concentration of primers SWP2

-F, SWP2-R were 300nM, 200nM, respectively; and that of the TaqMan probe was 400

nM in the TaqMan-based EHP qPCR amplification mixture PCR amplification was performed for 2 min at 95°C, followed by 40 cycles for 5s at 95°C, 30s at 65°C The detection limit of the qPCR method was as low as 50 copies/ reaction and analytical specificity was 100% The intra-assay coefficient of variation were 0,612% to 1,202% The inter-assay coefficient of variation were 0,582% (minimum) and 1,427% (maximum)

Enterocytozoon hepatopenaei, EHP, SWP, real-time PCR,

t trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP)

25

25

2.3.3 N i dung 3: nh các thông s k thu t c a quy trình real-time

PCR phát hi n vi bào t trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) gây

2.3.4 N i dung 4: Th nghi m quy trình real-time PCR phát hi n m u

tôm nhi m vi bào t trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP)

36

v

37 3.1 Thi t k primer và probe c hi phát hi n vi bào

t trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP)

3.3 N nh các thông s k thu t c a quy trình real-time

PCR phát hi n vi bào t trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) gây

3.4 N i dung 4: Th nghi m quy trình real-time PCR phát hi n m u

tôm nhi m vi bào t trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP)

74

79

79

vi

79

80 xiv

vii

2.10 Thành ph n ph n ng real-time PCR t chu k nhi t 33 2.11 Chu trình nhi t cho real-time PCR t nhi t 34 3.1 K t qu ki c tính c a các c p m i và probe 38 3.2

61

62

3.14 K t qu chu k ng trong kh bi n thiên n i ph n

ng c a quy trình real-time PCR EHP trên DNA plasmid các

n khác nhau

71

3.15 K t qu chu k ng trong kh bi n thiên n i ph n

ng c a quy trình real-time PCR EHP c ly trích t

i EHP

72

3.16 K t qu chu k ng trong kh bi n thiên n i ph n

ng c a quy trình real-time PCR EHP trên DNA plasmid các

n khác nhau

73

3.17 K t qu chu k ng trong kh bi n thiên n i ph n

ng c a quy trình real-time PCR EHP c ly trích t

73

x

DANH SÁCH HÌNH

1.1 nh ch p hi n vi Enterocytozoon hepatopenaei ký sinh trên t bào

bi u mô gan t y c a Penaeus monodon

c hi u cho EHP trên DNA ly trích t i

b nh IHHNV, WSSV, AHPND, EHP

67

xii

2

gây ra

EHP (Enterocytozoon hepatopenaei)

nuôi tôm Vi bào

-Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) AccuPid EHP Detection Kit

4

1

1.1

(Lom và Dykovas, 2012; Stentiford và Bateman, 2007; Stentiford và cs, 2007)

Thelohania, Flabelliforma, Glugoides, Vavraia, Ordospora, Nadelspora và Enterospora (Landgdon, 1991; Larsson và cs, 1996; Larsson và cs, 1997; Larsson và cs, 1998; Lightner và cs, 1996, Canning và cs, 2002)

Agmasoma penaei Penaeus merguensis và Penaeus monodon (Flegel, 1994) Tuzetia Weidner ký sinh trên

Lightner, 1996)

(Anderson và cs, 1989; Hudson và cs, 2001; Walker

và Mohan, 2009; Stentiford và Bateman, 2007; Stentiford và cs, 2007)

5

H : Enterocytozoonidae (Cali and Owen, 1990)

Chi: Enterocytozoon (Desportes và cs., 1985)

6

Hình 1.1 nh ch p hi n vi Enterocytozoon hepatopenaei ký sinh trên t bào bi u mô

gan t y c a Penaeus monodon (Tourtip và cs, 2009)

(A) M u nhu m H&E c a mô gan t y cho th y có nhi u bào t EHP tên) (B) M u

c a bào t EHP (C và D) Ph n mô gan t y cho th y tính acid và các th vùi trong t bào

ch t c a t bào bi u mô ng n tên) (E) Bào t giai n s m (a) và giai n

ng thành (b) (Tourtip và cs, 2009)

7

và cs,

1

(Hình 1.2 D và E) (Tourtip và cs, 2009)

(Tourtip và cs, 2009)

8

Hình 1.2

(

13

i Enterocytozoon hepatopenaei

và cs, 1999)

14

15

, 2012; Tran Loc và cs., 2013; Flegel & Lo, 2014; Joshi và cs., 2014 và Nunan và cs., 2014)

pháp mô

gan và

hình elip hình kích 1,1 ± 0,2 0,6 0,7 ± 0,1 µm trong bào bào gan tôm, bào thành màu tím (Hình 1.6) bào do phóng các bào phân có nhìn trong gan Theo

in situ (ISH)

16

Hình 1.6 Bào EHP thành màu tím khi gram mô gan tôm sú

H&E (Bùi Quang và cs, 2011)

1.3.2

kích -2 m

khác nhau Và

cs

và cs, 2009)

LAMP-nanogold (Suebsing và cs

17

real-time tôm

ang có

5-Enterocytozoon

21

và cs

-PCR) Quy

-

- Luis và cs

-AHPND) và

5-

22

Paul và cs,

E hepatopenaei (EHP) khi

E hepatopenaei

P vannamei

23

2.1.

-2 ESCO,

24

2.3

2.3.1 Thi t k primer và probe c hi phát hi n vi bào t trùng

Enterocytozoon hepatopenaei (EHP)

2.3.1.1 M c tiêu

nh trình t m i và probe c hi u, thành ph n ph n ng real-time PCR và chu trình nhi t c a ph n ng real-time PCR

2.3.1.2 V t li u thí nghi m: m i xuôi, m c, qPCRBIO Probe Mix Lo-ROX,

b c d a trên gen spore wall protein (SWP) b

v nh y 104 c công b b i Pattana và cs, (2015) Pattana và cs,

t k m i d a vào chu i trình t SWP c a EHP trên genbank (KX258197)

và ph n m m Primer 3 Trình t probe SWP- c thi t k d a trên c p m n

Enterocytozoon hepatopenaei (EHP)

silicon

C p m i -actin (B ng 2.1) là c p m i nh n bi t gen ch ng n i c tham

kh o t nghiên c u c a Wenlin Wu và cs (2008) Trình t Probe -actin d n Beta-actin mRNA gene tôm trên Genbank (JN808449.1) và c p m i -actin và theo nguyên t c thi t k c p m i SWP-2

Tm ( C)

67,7

26

Probe -actin /5HEX/

AGTCACACCATCACCAGAGTCGC /3IABkFQ/

Beta-actin

mRNA gene

(JN808449.1)

ATGTGTGACGACGAAGTAGCCGCCCTGGTTGTAGACAATGGCTCCGGCATGTGCAAGGCCGGCTTCGCTGGTGACGATGCACCACGAGCTGTGTTCCCCTCCATCGTCGGCCGACCCCGTCATCAGGGTGTGATGGTCGGCATGGGCCAGAAGGACTCGTACGTGGGCGACGAGGCCCAGAGCAAGCGAGGTATCCTGACCCTGAAGTACCCCATCGAGCACGGCATCGTCACCAACTGGGACGACATGGAGAAGATCTGGCATCATACCTTCTACAACGAGCTCCGTGTGGCCCCCGAGGAGCACCCCGTCCTGCTGACCGAGGCTCCCCTCAACCCCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGACACAGATCATGTTCGAGACGTTCAACACCCCCGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCCGTGCTGTCCCTGTACGCCTCCGGCCGTACCACCGGCATCGTGCTGGACTCCGGCGACGGCGTGTCCCACACCGTGCCCATCTACGAGGGCTACGCCCTGCCCCACGCCATCCTGCGTCTGGACTTGGCCGGGCGCGACCTCACAGACTACCTGATGAAGATCCTGACCGAGCGTGGCTACACCTTCACGACCACCGCCGAGCGAGAAATCGTGCGCGACATCAAGGAGAAGCTGTGCTACGTGGCTCTGGACTTCGAGCAGGAGATGACCACCGCTGCTTCCTCCTCCTCGCTGGAGAAGTCCTACGAGCTCCCTGACGGCCAGGTGATCACCATCGGCAACGAGAGGTTCCGGTGCCCCGAGGCCCTGTTCCAGCCCTCATTCCTGGGCATGGAGTCGTGCGGCATCCACGAGACCACCTACAACTCCATCAT

27

Trình t m i và probe B ng 2 c ki m tra thông s v t lý, kh b t

c p, b t c p 2 m i b ng công c Oligo analyzer c a hãng IDT-M và ki c

hi u c a m i trên ngân hàng d li u GenBank b ng công c BLAST

2.3.1.4 Ch tiêu theo dõi

Tín hi u hu nh quang và chu k ng C(t)

2.3.2 N i dung 2: Xây d ng và t -time PCR phát hi n vi

bào t trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) gây ra trên tôm

2.3.2.1 M c tiêu

nh trình t m c hi u, thành ph n ph n ng real-time PCR và chu trình nhi t c a ph n ng real-time PCR

2.3.2.2 Mô t thí nghi m

S d ng plasmid ch n trình t KX258197.1 c a gen SWP c t ng h p b i

GAAGTGCGACGTGGACATCCGTAAGGACCTGTACGCCAACACCGTGCTGTCCGGAGGCACCACCATGTACCCTGGCATCGCCGACAGGATGCAGAAGGAGATCACTGCCCTCGCCCCCTCCACCATGAAGATCAAGATCATTGCCCCGCCCGAGCGCAAGTACTCCGTATGGATCGGCGGCTCCATCCTGGCCTCGCTCTCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCAGCAAGCAGGAGTACGACGAGTCTGGACCATCAATCGTTCACAGGAAGTGCTTCTAA

B9:

trong 1 phút ng DNA t ng s

v c Tr -70oC

b

nh nh t và tính hi u hu nh quang n t nh t cho m i trình t a các gen SWP và Beta-actin M i t l n c l p l i 3 l , nghi m th c

i ch ng không khu i (NAC) và nghi m th i ch ng âm (NTC) s d ng 500

trong b ng sau:

Khi ph n ng real-time PCR k nh giá tr CT n n

n i xuôi, m c t i thi c giá tr n nh t và giá tr CT nh ch t

Thí nghi m nh nh n probe t i thi u c a trình t gen SWP có

c giá tr CT nh nh t cho trình t hu nh quang

Khi ph n ng real-time PCR k t th c, d a vào k t qu CT c chon

n probe t i thi c giá tr n nh t và giá tr CT nh nh t

S d ng n m i, n probe và nhi b t c p t các thí nghi m

t chu k mà có th phát hi n n DNA th p Thí nghi m t

m c nhi b t m TN trên v i các m c chu k nhi t t 35, 40 chu k

2.3.3 N i dung 3: nh các thông s k thu t c a quy trình real-time PCR

phát hi n vi bào t trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) gây ra trên tôm

2.3.3.1 M c tiêu

nh thông s v c hi u k thu t nh y k thu t l p l i

2.3.3.2 Mô t thí nghi m

Eppendorf Biophotometer Plus c sóng h p th

c pha loãng thành 2x100, 2x101, 2x102, 2x103, 2x104, 2x105, 2x106 copy/mL (Hernandezc và cs, 2003) S nh b ng công th c (Arumuganathan và

cs, 1991):

S copy/mL = N plasmid/kh ng plasmid

Plasmid DNA t ng h p pha loãng các n 2x100, 2x101, 2x102, 2x103, 2x104, 2x105, 2x106 copy/mL s c dùng làm m u chu xây d ng chu n

ng T t c ph n ng real- c th c hi n v i m i n 3 ph n

ng, m i ph n ng 3 l n l p l i v i thành ph n ph n ng khu i và chu trình nhi t

c t n i dung 2

AHPND, WSSV, Infection Hypodermal and Haematopoietic

không T t c ph n ng real- c th c hi n v i m i tác nhân 3 ph n ng,

m i ph n ng 3 l n l p l i

c nh y k thu t

nh y k thu s LOD (limit of detection), là gi i h n

ng d ch m u phân tích ít nh t có trong ch t n cho k t qu

tính Pha loãng amplicon thành 6 m c n t 100 n 106 b n sao DNA EHP, ti n hành ph n ng real-time PCR v i thành ph n ph n ng và chu trình nhi

t xét nghi m khi s d l p l i c a ph n ng real-time

c th hi n qua h s bi n thiên liên ph n ng và bi n thiên n i ph n ng H

s bi n thiên càng th p thì tính l p l i càng cao Bi n thiên liên ph n bi n

35

thiên gi a các l n l p l i ph n ng các th m khác nhau Bi n thiên n i ph n ng

bi n thiên gi a các ph n c thi t l p vào cùng m t th m Chu k

ng là giá tr bi n thiên này

Ti n hành ph n ng real-time PCR v i thành ph n ph n ng và chu trình nhi

t n kh o sát h s bi n thiên liên ph n ng và bi n thiên n i ph n

ng trên m u chu n EHP v i các n t 102 n 106 b n sao/ph n ng, 3 m u b nh

th c t M i n ng 3 ph n ng Thí nghi c l p l i 8 l n

2.3.4 N i dung 4: Th nghi m quy trình real-time PCR phát hi n m u tôm nhi m

vi bào t trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP)

2.3.4.1 M c tiêu

u qu c a quy trình real-time PCR trên m u tôm nhi m vi bào t

trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) th c t

2.3.4.2 Mô t thí nghi m

Ti n hành ph n ng real-time PCR v i thành ph n ph n ng và chu trình nhi

trình real-time PCR phát hi n vi bào t trùng Enterocytozoon hepatopenaei gây ra trên

30 m u tôm th c t M i m u tôm th c hi n 3 ph n ng Thí nghi c l p l i 2 l n

, so sánh quy trình nghiên c u v i trên 20 m u tôm nhi m

vi bào t trùng EHP

36

3.1 Thi t k primer và probe c hi phát hi n vi bào t trùng

Enterocytozoon hepatopenaei (EHP)

phát hi n vi bào t

trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP)

Gen SWP (Enterocytozoon hepatopenaei spore wall protein- gen mã hóa protein

thành bào t c a EHP) c hi

tính gi ) khi phát hi n vi bào t trùng EHP (Tangprasittipap và cs l a

ph n m m Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0), Annhyb M i sau khi thu th p

ng hình thành các c u trúc b ng ph n m m tr c tuy n IDT

ng th c hi u

c a c p m c ki m tra b http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)

c tính c a c p m i c ki m tra b ng ph n m m Oligo Analyzer

ch ng minh các primer và probe ho ng t t trên lý thuy t K t qu

ki m tra c p m i c trình bày trong B ng 3.1

37

B ng 3.1 K t qu ki c tính c a các c p m i và probe

Primer Trình t nucleotide Chi u

dài (bp)

Tm (oC)

%GC (%)

Hairpin

G (kcal/mol)

Self-dimer G(kcal/mol)

Heterodimer

G (kcal/mole) SWP- 1F GCAGAGTGTTGTT

l c p m i kho ng 10oC và nhi y là c n thi t cho s g n

ra Ph a c p m i và probe n m trong kho ng cho phép t n 50%

u này cho phép các oligonucleotide g n hi u qu u trúc

38

ng t do ( G) l -9 kcal/mol V i giá tr ng t y, các c u trúc th c p không gây ng x n ho ng nhân b n trong ph n ng PCR

y trên lý thuy t, các m i c l a ch n trong nghiên c u này hoàn toàn

c hi u lý thuy t c a các c p m i c ki m tra b ng cách kh o sát kh t c p trên ngân hàng d li u b gen c a t t c các tác nhân gây b nh gây b nh tôm trên GenBank b ng ch (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi) K t qu Blast hình 3.1; hình 3.2; hình 3.3, hình 3.4, hình 3.5, hình 3.6 cho th y c p m i SWP1F/SWP1R và Taqman probe SWP1; c p

m i SWP2F/SWP2R, Taqman probe SWP2 ch b c hi u vào các trình t gen SWP

y, c p m i SWP1F/SWP1R và Taqman probe SW1; c p m i SWP2F/SWP2R

và probe SWP2 a ch c hi u cho gen SWP và thích h phát hi n EHP thông qua v t li u di truy n c a vi bào t trùng này

Hình 3.1 K t qu Blast trình t m i SWP1-F

39

Hình 3.3

40

42

4.946

gen mã hóa protein c a bào t EHP (KX258197.1

là gen mã hóa protein c a thành bào t EHP ( - 157 và

SWP2-F/SWP2-R

SWP2-F, SWP2-R, probe SWP2

148bp (Hình 3.8)

43

SWP2-Annhyb 4.946

44

phát hi n vi bào t

trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP)

45

real-time PCRSWPF/SWPR và Taqman probe SWP (SWP1F/SWP1R- probe SWP1;

49

phát hi n vi bào t trùng

Enterocytozoon hepatopenaei (EHP)

c hi u loài c a các c p m i thi t k c kh o sát qua ph n ng

real-time PCR trên các v t li u di truy n t nhi u tác nhân khác gây b nh tôm M t s tác

tín hi u hu nh quang ch ng n i

A

B

DNA ly IHHNV

53

tín hi u hu nh quang ch ng n i

ình 3.17)

real

SWP2F/SWP2R

EHP

59

N u t quan tr ng trong ph n ng real-time

c n có m t n ng probe nh s d ng v trong quá trình th c hi n ph n

ng h p thi u ho u n Taqman probe th p s không

không c n thi t và gây lãng phí N Taqman probe t n ng real-time

61

3.2.3 T lai c a m i và m u dò

Nhi lai là m t ch tiêu quan tr ng ng l n k t qu c a ph n ng real-time PCR Nhi lai quá cao ho c quá th u ng không t n k t

qu ph n ng real-time PCR N u nhi lai quá th p so v i nhi bi n tính c a

m i và probe s d ng thì d t o ra các s n ph m ký sinh không mong mu n N u nhi t lai quá cao s c n tr s b t c p c a m i và probe vào DNA b n m u thì hi u qu nhân b n s không cao

y nhi lai 65 C là nhi thích h p cho h primer và probe SWP2

g n vào trình t gen m c tiêu EHP

3.2.4 Kh o sát s chu k nhi t

real-time PCR S chu k nhi t t n ng real- c kh

n 45 v nh m tìm ra s chu k nhi t v i n DNA plasmid