Nghiên cứu phát triển dạng bào chế cho thuốc điều trị vết thương mạn tính dựa trên protein pdgf bb tái tổ hợp

HCM TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Tên nhiệm vụ: NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂ

ỦY BAN NHÂN DÂN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Tên nhiệm vụ:

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN DẠNG BÀO CHẾ

CHO THUỐC ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG MẠN TÍNH DỰA TRÊN PROTEIN PDGF-BB TÁI TỔ HỢP

Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Chủ nhiệm nhiệm vụ: Nguyễn Trí Nhân

Tp Hồ Chí Minh, năm 2020

ỦY BAN NHÂN DÂN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Tên nhiệm vụ:

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN DẠNG BÀO CHẾ

CHO THUỐC ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG MẠN TÍNH DỰA TRÊN PROTEIN PDGF-BB TÁI TỔ HỢP

(Đã chỉnh sửa theo kết luận của Hội đồng nghiệm thu ngày 30/10/2020)

Chủ nhiệm nhiệm vụ

Nguyễn Trí Nhân

Cơ quan chủ trì nhiệm vụ

Tp Hồ Chí Minh, ngày 12 tháng 10 năm 2020

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN

I THÔNG TIN CHUNG

1 1 Tên nhiệm vụ:

Thuộc: Chương trình/lĩnh vực (tên chương trình/lĩnh vực): Lĩnh vực Y dược

2 Chủ nhiệm nhiệm vụ:

Họ và tên: Nguyễn Trí Nhân

Ngày, tháng, năm sinh: 29/8/1982 Nam/ Nữ: Nam

Học hàm, học vị: Tiến sỹ

Chức danh khoa học: Giảng viên Chức vụ: Trưởng khoa

Điện thoại: Tổ chức: 08-38355273 Nhà riêng: Mobile: 0913-119183 Fax: E-mail: ntrnhan@hcmus.edu.vn

Tên tổ chức đang công tác: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Địa chỉ tổ chức: 227 Nguyễn Văn Cừ, phường 4, quận 5, thành phố Hồ Chí Minh Địa chỉ nhà riêng: TWB-15-10A Chung cư Lê Thành, 198A Mã Lò, P Bình Trị

Địa chỉ: 227 Nguyễn Văn Cừ, phường 4, quận 5, thành phố Hồ Chí Minh

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: Trần Linh Thước

Số tài khoản: 3713.0.1056908.0000

Kho bạc: Nhà Nước, Quận 5, TP.HCM

Tên cơ quan chủ quản đề tài: Sở Khoa học – Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện nhiệm vụ:

- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 11/ năm 2017 đến tháng 4/ năm 2020

ii

- Thực tế thực hiện: từ tháng 12/ năm 2017 đến tháng 10/năm 2020

- Được gia hạn (nếu có):

Thời gian

(Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

Thời gian (Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

…

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:

Đối với đề tài:

Đơn vị tính: Triệu đồng

Số

TT các khoản chi Nội dung

Theo kế hoạch Thực tế đạt được

- Lý do thay đổi (nếu có):

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án:

(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xét duyệt, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện nếu có); văn bản của tổ chức chủ

trì nhiệm vụ (đơn, kiến nghị điều chỉnh nếu có)

Số

TT

Số, thời gian ban

hành văn bản Tên văn bản Ghi chú

1 1076/QĐ-SKHCN

ngày 09/11/2017

Quyết định về việc phê duyệt nhiệm vụ khoa học và công nghệ

4 Số 349/QĐ-SKHCN

ngày 20/4/2020

Quyết định về việc điều chỉnh quyết định số 1076/QĐ-SKHCN ngày 09 tháng 11 năm 2017 của Sở Khoa học và Công nghệ

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Xây dựng bộ tiêu chuẩn cơ sở và phương pháp kiểm nghiệm nguyên liệu

và chế phẩm gel rhPDGF-BB 0,01%

Bộ tiêu chuẩn cơ sở, trong đó đã thẩm định phương pháp đánh giá hoạt lực sinh học

Xây dựng công thức

và quy trình bào chế gel rhPGDF-BB 0,01%

Công thức và quy trình bào chế gel rhPDGF-BB 0,01% đạt tiêu chuẩn cơ sở

Báo cáo đánh giá chế phẩm trên mô hình động vật

Đã báo cáo chế phẩm không gây kích ứng

da và có hiệu quả làm lành vết thương trên

mô hình chuột đái tháo đường

5 Cá nhân tham gia thực hiện nhiệm vụ:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt

được

Ghi chú

*

Xây dựng thuyết minh

đề tài, báo cáo tổng kết Tham gia quản lý thực hiện tất cả các nội dung nghiên cứu

Thuyết minh đề tài Báo cáo tổng hợp kết quả

Góp ý báo cáo tổng kết Xây dựng tiêu chuẩn và phương pháp kiểm nghiệm nguyên liệu

Bộ tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu rhPDGF-BB dựa trên Dược điển Việt Nam V

và Dược điển Mỹ USP40

Xây dựng quy trình lên men thu nhận nguyên liệu thô đáp ứng quy

mô sản xuất 1000 tuýp gel

Quy trình lên men sản xuất được trung bình 9,77±1,63g rhPDGF-

Xây dựng quy trình lên men thu nhận nguyên liệu thô đáp ứng quy

mô sản xuất 1000 tuýp gel

Nghiên cứu điều kiện bảo quản protein rhPDGF-BB nguyên liệu

Quy trình lên men sản xuất được trung bình 9,77±1,63g rhPDGF-

BB Điều kiện bảo quản nguyên liệu thô rhPDGF-BB trong dịch lên men ở - 20oC trong

Xây dựng quy trình tinh chế thu nhận rhPDGF-BB có độ tinh sạch >= 95% đáp ứng quy mô sản xuất 1000 tuýp gel

Quy trình tinh chế sắc

ký trao đổi cation trên cột tự nhồi 400 ml thu được trung bình 3,08 ± 0,16g rhPDGF-BB có

Xây dựng tiêu chuẩn và phương pháp kiểm nghiệm nguyên liệu

Bộ tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu dựa trên Dược điển Việt Nam V và Dược điển Mỹ USP40 Thẩm định phương pháp đánh giá hoạt lực

7 CN Đoàn

Thúy Vân

CN Đoàn Thúy Vân

Nghiên cứu điều kiện bảo quản protein rhPDGF-BB nguyên liệu

Điều kiện bảo quản nguyên liệu rhPDGF-

BB tinh sạch: trữ trong đệm acetate 100 mM

pH 4,5, hoặc đệm citrate 1 mM pH 6,5, hoặc đệm phosphate 1

mM pH 4,5 ở 4oC trong

12 tuần

Xây dựng tiêu chuẩn cơ

sở và phương pháp kiểm nghiệm gel rhPDGF-BB 0,01%

Bộ tiêu chuẩn kiểm nghiệm chế phẩm gel rhPDGF-BB 0,01%

dựa trên Dược điển Việt Nam V và Dược điển Mỹ USP40 Thẩm định phương pháp đánh giá hoạt lực

Thiết lập quy trình tạo sản phẩm gel chứa 0,01% rhPDGF-BB quy mô 1000 tuýp

Công thức và quy trình bào chế gel rhPDGF-

BB 0,01% đạt tiêu chuẩn cơ sở và ổn định sau 2 tháng bảo quản

Đánh giá độ an toàn và hiệu quả của sản phẩm trên mô hình chuột

Báo cáo cho thấy gel rhPDGF-BB 0,01%

không gây kích ứng da

và có khả năng làm lành vết thương hiệu quả trên mô hình chuột đái tháo đường

Cố vấn khoa học Thiết lập quy trình tạo sản phẩm gel chứa 0,01% rhPDGF-BB quy mô 1000 tuýp

Công thức và quy trình bào chế gel rhPDGF-

BB 0,01% đạt tiêu chuẩn cơ sở

6 Tình hình hợp tác quốc tế: Không có

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Không có

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

Xây dựng quy trình lên

men thu nhận nguyên

liệu thô đáp ứng qui mô

sản xuất 1000 tuýp gel

Thu nhận 6-12g nguyên liệu rhPDGF-

Thu được trung bình 3,08 ± 0,16g sạch ≥95%

Đạt yêu cầu đặt ra

3

Nghiên cứu điều kiện

bảo quản protein

rhPDGF-BB nguyên

liệu

Nguyên liệu rhPDGF-BB ổn định tối thiểu 12 tháng

Nguyên liệu ổn định 12 tuần

Theo dõi thêm đến

12 tháng

Bộ tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam V và USP 40 Báo cáo thẩm định phương pháp đánh giá hoạt lực sinh học

Đạt yêu cầu đặt ra

và ổn định tối thiểu

12 tháng

1000 tuýp gel chứa 0,01%

rhPDGF-BB đạt tiêu chuẩn cơ sở

và ổn định sau 2 tháng bảo quản

Theo dõi thêm độ ổn định trong

Bộ tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam V và USP 40 Báo cáo thẩm định phương pháp đánh giá hoạt lực sinh học

Đạt yêu cầu đặt ra

7

Đánh giá độ an toàn và

hiệu quả của sản phẩm

trên mô hình chuột

Báo cáo về tính an toàn và tính kích ứng

da Báo cáo về hiệu quả trên mô hình động vật

Báo cáo tính kích ứng da trên thỏ Báo cáo hiệu quả trên mô hình chuột đái tháo đường

Đạt yêu cầu đặt ra

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA NHIỆM VỤ

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

hoạch

Thực tế đạt được

- Hoạt lực đặt ra ban đầu là ≥106 IU/mg, cao hơn cả hoạt lực của chất chuẩn rhPDGF-BB của WHO là 7,5x105 IU/mg Mẫu thực tế thu được có hoạt lực 2,04x105 IU/mg, mặc dù thấp hơn chất chuẩn nhưng cao hơn mẫu tương tự của Ấn Độ sản xuất gấp nhiều lần (mẫu rhPDGF-BB của Ấn Độ chỉ có hoạt tính tương đương 47% mẫu rhPDGF-BB do chúng tôi sản xuất)

b) Sản phẩm Dạng II:

Quy trình lên men thu

nhận nguyên liệu thô

rhPDGF-BB đáp ứng

qui mô sản xuất 1000

tuýp gel bôi

Thu nhận 6-12g nguyên liệu rhPDGF-

BB thô

Thu được 9,77 ± 1,63g nguyên liệu rhPDGF-

ứng qui mô sản xuất

1000 tuýp gel bôi

Thu nhận 3g

rhPDGF-BB có độ tinh sạch

≥95%

Thu được 3,08 ± 0,16g rhPDGF-

BB có độ tinh

sạch ≥95%

Đạt yêu cầu

3

Nghiên cứu điều kiện

bảo quản protein

và nguyên liệu

tinh sạch

Theo dõi thêm độ ổn định nguyên liệu tinh sạch

đến 12 tháng

4 Tiêu chuẩn cơ sở và phương pháp kiểm

nghiệm nguyên liệu

Bộ tiêu chuẩn và phương pháp kiểm nghiệm phù hợp với yêu cầu của USP 40 hoặc BP 2016 Báo cáo thẩm định

phương pháp

Bộ tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam V và USP 40

Báo cáo thẩm định phương pháp đánh giá hoạt lực sinh

đạt tiêu chuẩn cơ sở

và được kiểm nghiệm độc lập bởi Viện Kiểm nghiệm thuốc

TP.HCM Báo cáo và bộ dữ liệu theo dõi độ ổn định

của chế phẩm

Chế phẩm gel rhPDGF-BB 0,01% đạt tiêu chuẩn cơ sở và

ổn định sau 2

tháng bảo quản

Tiến hành thêm kiểm nghiệm độc lập và theo dõi độ ổn định của chế phẩm gel trong 12

Báo cáo thẩm định

phương pháp

Bộ tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam V và USP 40

Báo cáo thẩm định phương pháp đánh giá

Đạt yêu cầu

Báo cáo về tính kích ứng da

Báo cáo về hiệu quả

trên mô hình động vật

Báo cáo tính kích ứng da trên thỏ

Báo cáo hiệu quả trên mô hình chuột đái

1 Bài báo 03 bài báo trong nước

01 bài quốc tế, 02 bài báo đăng kỉ yếu

Theo kế hoạch Thực tế đạt

được

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp: Không có

e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế: Không có

2 Đánh giá về hiệu quả do nhiệm vụ mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

Làm chủ được công nghệ lên men và tinh sạch protein tái tổ hợp ở quy mô 25 L

Làm chủ được công nghệ bào chế gel rhPDGF-BB 0,01%

Làm chủ được các phương pháp kiểm nghiệm nguyên liệu protein tái tổ hợp và chế phẩm gel rhPDGF-BB 0,01%

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

Chế phẩm gel rhPDGF-BB 0,01% đã được công ty Pharmedic khảo sát sơ bộ về nhu cầu thị trường trước khi công ty đề xuất hợp tác với Trường ĐH Khoa học tự nhiên, ĐHQG-HCM Ngoài ra như trình bày trong phần mở đầu, hiện nay số lượng bệnh nhân mắc các vết thương mạn tính chiếm tỉ lệ khá lớn so với các vết thương thông thường (theo thống kê của Khoa Liền Vết Thương - Viện Bỏng Quốc Gia vào năm 2014 trên 430 bệnh nhân được theo dõi,

Ghi chú

(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…)

I Báo cáo tiến độ 22/5/2018 Đạt khoảng 60% nội dung công việc đề ra của kỳ 1

II Báo cáo giám

định

29/01/2019 Hội đồng thống nhất thông qua báo cáo giai đoạn

1 và đề nghị tiếp tục thực hiện giai đoạn 2 theo kế hoạch

Chủ trì: PGS.TS Nguyễn Thị Bay III Nghiệm thu cơ

sở 15/10/2020 Phần hoạt tính của rhPDGF-BB chưa đạt so với đăng ký, tuy vậy vẫn có thể đạt được ứng dụng

trong thực tế Cần tiếp tục theo dõi độ ổn định của sản phẩm đủ 12 thán Kính trình sở xem xét và chấp thuận cho báo cáo nghiệm thu cấp Sở

Chủ trì: PGS.TS Nguyễn Thị Bay

Chủ nhiệm đề tài

Nguyễn Trí Nhân

Thủ trưởng tổ chức chủ trì

x

MỤC LỤC

MỤC LỤC x

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT xiii

DANH SÁCH HÌNH xv

DANH SÁCH BẢNG xix

1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Hiện trạng và kết quả các công trình nghiên cứu liên quan đến đề tài 2 1.2 Lý do thực hiện đề tài 9

1.3 Cơ sở khoa học của đề tài 11

2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 33

2.1 Nội dung 1: Xây dựng quy trình lên men thu nhận nguyên liệu thô đáp ứng qui mô sản xuất 1000 tuýp gel 33

2.2 Nội dung 2: Xây dựng quy trình tinh chế thu nhận rhPDGF-BB có độ tinh sạch ≥ 95% đáp ứng qui mô sản xuất 1000 tuýp gel 60

2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu điều kiện bảo quản protein rhPDGF-BB nguyên liệu 82 2.4 Nội dung 4: Xây dựng tiêu chuẩn và phương pháp kiểm nghiệm nguyên liệu rhPDGF-BB 96

2.5 Nội dung 5: Thiết lập quy trình tạo sản phẩm gel chứa 0,01% rhPGDF-BB quy mô 1000 tuýp 115

2.6 Nội dung 6: Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và phương pháp kiểm nghiệm gel rhPDGF-BB 0,01% 130

2.7 Nội dung 7: Đánh giá độ an toàn và hiệu quả của sản phẩm trên mô hình chuột 146 3 CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 155

3.1 Các sản phẩm KH&CN chính của dự án 155

xi

3.2 Khả năng ứng dụng và phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu160

4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1614.1 Kết luận 1614.2 Đề nghị: 161TÀI LIỆU THAM KHẢO A

5 PHỤ LỤC M5.1 Phụ lục 1 Sinh khối tươi giữa 3 lần lên men ở 7,5 L và lên men ở 0,5

5.5 Phụ lục 5 Kết quả biểu hiện protein mục tiêu theo thời gian cảm ứng giữa các nghiệm thức phối trộn cơ chất cảm ứng trên thể tích nuôi cấy 7,5 L P

5.6 Phụ lục 6 Sinh khối tươi của chủng P pastoris khi thử nghiệm lên men

5.16 Phụ lục 16 Mức độ thay đổi hoạt tính của rhPDGF-BB tinh chế từ dịch sau lên men có phối trộn thêm chất bảo vệ Y

5.17 Phụ lục 17 Đáp ứng của tế bào NIH/3T3 với rhPDGF-BB chuẩn Z5.18 Phụ lục 18 Đáp ứng của tế bào NIH/3T3 với nguyên liệu rhPDGF-

xiii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

%B: Mẫu dung ly ở nồng độ B tương ứng

AOX: Alcohol Oxidase

APS : Ammonium Persulfate

B subtilis: Bacillus subtilis

BMGY : Buffered Medium Glycerol-Complex

BSM : Basal Salt Medium

CV: Column Volume

DO : Dissolved Oxygen (Lượng oxy hòa tan)

DoE: Design of Experiment

E coli: Escherichia coli

F: Flowthrough – Mẫu dịch qua cột

FDA: Food and Drug Administration

FPLC: Fast Protein Liquid Chromatography

GM: Glycerol – Methanol

hPDGF : human Platelet-derived Growth Factor

hPDGF – BB: nhân tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu người dạng BB HPLC: High–Performance Liquid Chromatography

IDF: International Diabetes Federation

kDa : KiloDalton

LMW: Low Molecular Weight

Mut+ : Methanol utilization plus

Muts: Methanol utilization slow

OD: Optical Density (Mật độ quang)

P pastoris: Pichia pastoris

xiv

PI: Isoelectric point (điểm đẳng điện)

RP- HPLC: Reverse – Phase High–Performance Liquid Chromatography

S cerevisiae: Saccharomyces cerevisiae

S: Samle – Mẫu nạp cột

SDS : Sodium Dodecyl Sulfate

SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis SM: Sorbitol – Methanol

W: Wash – Mẫu rửa

WCW: Wet Cell Weight

WHO: World Health Organization

YNB: Yeast Nitrogen Base

xv

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1.1 Sự khác biệt trong quá trình làm lành vết thương ở người bình thường

và người mắc bệnh đái tháo đường [30] 12

Hình 1.2 Cấu trúc chuỗi hPDGF-B (A) và dimer hPDGF-BB (B) [31] 13

Hình 1.3 Quy trình lên men mẻ bổ sung cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu [44] 15

Hình 1.4 Phương trình oxy hóa hoàn toàn methanol, sorbitol và glycerol 18

Hình 1.5 Phương án dung ly gradient tuyến tính với thể tích dung ly từ 10 – 20 CV 22

Hình 1.6 Phương án dung ly stepwise 23

Hình 1.7 Hai hướng tiếp cận cho phương pháp nhồi cột bằng tốc độ dòng [66] 24

Hình 1.8 Các bước của phương pháp nhồi cột bằng áp lực dòng 25

Hình 1.9 Sự sắp xếp các hạt và sự hiệu quả của cột 26

Hình 1.10 Phân tích peak đánh giá cột [67] 27

Hình 1.11 Sự tương quan giữa nồng độ và nhiệt độ đông của glycerol 30

Hình 2.1 Quy trình thử nghiệm lên men và đánh giá kết quả lên men mẻ bổ sung ở quy mô 7,5 L 34

Hình 2.2 Đường cong tăng trưởng của chủng P pastoris sau 3 lần lên men ở thể tích 7,5 L 41

Hình 2.3 Kết quả biểu hiện protein theo thời gian cảm ứng ở thể tích 7,5 L 41 Hình 2.4 Đường hồi quy hàm số mũ của sinh khối tươi (X = X0eµt) giữa các nghiệm thức phối trộn cơ chất cảm ứng trên thể tích nuôi cấy 7,5 L 45

Hình 2.5 Tốc độ tăng trưởng đặc trưng trong giai đoạn cảm ứng và năng suất biểu hiện protein mục tiêu giữa các nghiệm thức phối trộn cơ chất cảm ứng trên thể tích nuôi cấy 7,5 L L (số lần lặp lại n=1) 46

Hình 2.6 Quy trình lên men mẻ-bổ sung trên thể tích 25 L 49

Hình 2.10 Lượng sinh khối tươi (WCW) theo giờ của chủng P pastoris khi

cải thiện lên men ở thể tích 25 L 54

Hình 2.11 Chiến lược cảm ứng theo phương pháp xung methanol 56Hình 2.12 Quy trình cảm ứng protein theo phương pháp xung methanol 57Hình 2.13 Đường cong tăng trưởng của chủng khi lên men ở thể tích 25 L bằng phương pháp xung methanol 58

Hình 2.14 Kết quả điện di SDS-PAGE dịch protein theo thời gian cảm ứng khi lên men ở thể tích 25 L bằng phương pháp xung methanol (lần 1) 59

Hình 2.15 Kết quả biểu hiện protein theo thời gian cảm ứng khi lên men ở thể tích 25 L bằng phương pháp xung methanol 60

Hình 2.16 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá hiệu quả của lọc tiếp tuyến 62Hình 2.17 Kết quả điện di mẫu tinh chế không qua lọc tiếp tuyến (A) và có qua lọc tiếp tuyến (B) 64

Hình 2.18 Sơ đồ thử nghiệm quy trình tinh chế bằng phương pháp dung ly stepwise 66

Hình 2.19 Kết quả điện di mẫu tinh chế bằng quy trình dung ly stepwise 67Hình 2.20 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát sức chứa tối đa rhPDGF-BB của cột HiTrap SP FF 5 ml đối với mẫu dịch lên men chứa 200 mg rhPDGF-BB 69

Hình 2.21 Kết quả khảo sát sức chứa tối đa của cột HiTrap SP FF 5 ml 70Hình 2.22 Kết quả tinh chế rhPDGF-BB trên cột SP FF 20 ml 71Hình 2.23 Các bước cơ bản cho quy trình nhồi cột BPG thể tích 400 ml 72

xvii

Hình 2.24 Cột tự nhồi BPG 400 ml (Thể tích cột CV = π x 52 x 5 ~ 400 ml) 73

Hình 2.25 Phân tích peak đánh giá cột [67] 75Hình 2.26 Quy trình tinh chế rhPDGF-BB bằng sắc ký trao đổi cation dung ly gradient trên cột tinh chế tự nhồi chứa 400 mL hạt SP 78

Hình 2.27 Kết quả tinh chế dung ly gradient (A) và dung ly stepwise (B) trên cột tự nhồi BPG 400 mL 79

Hình 2.28 Sơ đồ bố trí thử nghiệm bảo quản protein rhPDGF-BB trong dịch sau lên men ở -20⁰C trong 3 tuần và không sử dụng các chất bảo quản 83

Hình 2.29 Mức độ bảo toàn hoạt tính của protein rhPDGF-BB trong dịch lên men sau 3 tuần bảo quản ở -20⁰C 86

Hình 2.30 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của hỗn hợp glycerol với EDTA và PMSF lên quá trình tinh chế và hoạt tính của rhPDGF-BB trong các dung dịch lên men khác nhau 87

Hình 2.31 Phân tích kết quả tinh chế protein rhPDGF-BB từ dịch sau lên men không bổ sung chất bảo quản (no additive) và có bổ sung 3 hỗn hợp chất bảo quản

GE, GP và GEP bằng điện di SDS-PAGE 15% kết hợp nhuộm bạc 88

Hình 2.32 Sơ đồ bố trí thí nghiệm bảo quản protein rhPDGF-BB trong dịch sau lên men ở -20⁰C trong 3 tuần với sự hiện diện của các hỗn hợp chất bảo quản khác nhau 89

Hình 2.33 Mức độ bảo toàn hàm lượng và cấu hình của rhPDGF-BB sau 3 tuần lưu trữ ở 37⁰C của các mẫu protein rhPDGF-BB tồn tại trong các dung dịch khác nhau 93

Hình 2.34 Đường hồi quy tuyến tính giữa log nồng độ rhPDGF-BB chuẩn và OD570 101

Hình 2.35 Đánh giá cảm quan dung dịch nguyên liệu rhPDGF-BB 111Hình 2.36 Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (A) và dung dịch thử (B) 111

Hình 2.41 Sắc ký đồ gel và placebo giữa tháng 0, tháng 1 và tháng 2 A, B: gel

và tháng 0, C, D: gel và placebo tháng 1, E, F: gel và placebo tháng 2 127

Hình 2.42 Đường hồi quy tuyến tính giữa log nồng độ rhPDGF-BB và OD570 135

Hình 2.43 Sắc ký đồ gel (A) và placebo (B) 143Hình 2.44 Kết quả điện di SDS-PAGE để định tính sự hiện diện của rhPDGF-

BB trong mẫu gel rhPDGF-BB 0,01% bào chế (PM300), mẫu gel rhPDGF-BB 0,01% của Ấn Độ (AD300), so sánh với mẫu placebo (Pla) và mẫu placebo có bổ sung thêm nguyên liệu rhPDGF-BB (NL300) 144

Hình 2.45 Sơ đồ đặt mẫu thử 147Hình 2.46 Kết quả thử khả năng kích ứng da của gel rhPDGF-BB 0,01% 149Hình 2.47 Chuột ở các lô thử nghiệm gây vết thương mất da ngày 0 đến ngày

10 152

Hình 2.48 Vi phẫu mô da chuột sau 11 ngày gây vết thương ở các lô thử nghiệm (độ phóng đại 100X) 153

hệ đệm khác nhau ở 40⁰C trong 1 tuần (kết quả khảo sát sau 4 tuần) 31

Bảng 2.1 So sánh tốc độ tăng trưởng đặc trưng của chủng trên cơ chất glycerol

và methanol khi nuôi cấy ở thể tích 7,5 L và 0,5 L [84] 41

Bảng 2.2 Kết quả biểu hiện protein rhPDGF-BB sau 72 giờ cảm ứng ở thể tích 7,5 L 42

Bảng 2.3 So sánh mức độ biểu hiện rhPDGF-BB sau 72 giờ nuôi cấy ở thể tích 7,5 L (số lần lặp lại n=3, sai số biểu diễn bằng SD) và 0,5 L [84] 42

Bảng 2.4 Tỷ lệ methanol và các đồng cơ chất 43Bảng 2.5 So sánh mức độ biểu hiện rhPDGF-BB của chủng trong quy trình cải thiện ở thể tích 25 L (n=2) với quy trình trước cải thiện và với thể tích 7,5 L và 0,5 L 54

Bảng 2.6 Đánh giá tốc độ tăng trưởng đặc trưng khi lên men ở thể tích 25 L bằng phương pháp xung methanol (n=2, sai số SD) 58

Bảng 2.7 Đánh giá mức độ biểu hiện rhPDGF-BB khi lên men ở thể tích 25 L bằng phương pháp xung methanol (n=2, sai số SD) 59

Bảng 2.8 So sánh hiệu quả của việc thu nhận mẫu bằng phương pháp lọc tiếp tuyến (lặp lại 3 lần, trình bày dạng mean ± SD) 64

Bảng 2.9 So sánh phương pháp dung ly gradient và dung ly stepwise (lặp lại 3 lần, trình bày dạng mean ± SD) 68

xx

Bảng 2.10 Thông số cho cột tự nhồi BPG ở thể tích 400 ml 73Bảng 2.11 Kết quả trung bình đánh giá cột với 3 lần lặp lại 77Bảng 2.12 Các phân đoạn dung ly gradient chứa protein mục tiêu 79Bảng 2.13 Hiệu quả tinh chế trên cột 400 ml sử dụng phương pháp dung ly stepwise 80

Bảng 2.14 Hiệu quả lọc tiếp tuyến 82Bảng 2.15 Mức độ bảo toàn về mặt hàm lượng và về mặt hoạt tính của protein rhPDGF-BB sau 3 tuần bảo quản ở -20⁰C trong các dịch sau lên men khác nhau: không chất bảo quản và chứa các hỗn hợp chất bảo quản GE, GP và GEP 90

Bảng 2.16 Mức độ bảo toàn hàm lượng sau mỗi 2 tuần lưu trữ ở 4⁰C trong suốt

12 tuần của các mẫu protein rhPDGF-BB tồn tại trong đệm A (đệm acetate 100 mM

pH 4,5) và đệm C (đệm citrate 1 mM pH 6,5) (n=3, sai số SD) 94

Bảng 2.17 Mức độ bảo toàn cấu hình sau mỗi 2 tuần lưu trữ ở 4⁰C trong suốt

12 tuần của các mẫu protein rhPDGF-BB tồn tại trong đệm A (đệm acetate 100 mM

pH 4,5) và đệm C (đệm citrate 1 mM pH 6,5) (n=3, sai số SD) 95

Bảng 2.24 Giá trị OD570 trung bình t của các mẫu thử nghiệm sau 40 giờ 100Bảng 2.25 Giá trị OD570 trung bình của các giếng thử nghiệm sau 4 lần thử 100

Bảng 2.26 Kết quả thực hiện độ lặp lại 102Bảng 2.27 Kết quả thực hiện độ chính xác trung gian 102Bảng 2.18 Bộ tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu rhPDGF-BB 103Bảng 2.19 Chương trình chạy HPLC kiểm tra nguyên liệu rhPDGF-BB 105Bảng 2.20 Kết quả kiểm tra mẫu nguyên liệu rhPDGF-BB 110Bảng 2.21 Kết quả sắc ký HPLC mẫu nguyên liệu rhPDGF-BB 112Bảng 2.22 Kết quả đáp ứng của tế bào NIH/3T3 với mẫu chuẩn 113Bảng 2.23 Kết quả đáp ứng của tế bào NIH/3T3 với mẫu nguyên liệu rhPDGF-

BB 114

Bảng 2.33 Đặc điểm hình thái học của P aeruginosa trên môi trường chọn lọc

141

Bảng 2.34 Đặc điểm hình thái học của S aureus trên môi trường chọn lọc141

Bảng 2.35 Bảng kết quả kiểm tra mẫu gel rhPDGF-BB 0,01% 142Bảng 2.38 Hoạt tính sinh học của gel rhPDGF-BB 144Bảng 2.43 Mức độ phản ứng trên da thỏ 147Bảng 2.44 Phân loại các phản ứng trên da thỏ 148Bảng 2.45 Mức độ phản ứng trên da thỏ của gel PDGF 0,01% ở các thời điểm thử nghiệm (n=3) 148

Bảng 2.46 Đường huyết chuột trong thử nghiệm đái tháo đường (mg/dl) 150Bảng 2.47 Trọng lượng chuột (g) trong thử nghiệm tạo vết thương mất da và bôi gel 151

Bảng 2.48 Khả năng lành vết thương ở các lô thử nghiệm với gel rhPDGF-BB 0,01% 152

Bảng 3.1 Bài báo quốc tế thuộc danh sách … (SCI/ ESCI/ SCI-E/ SSCI/ khác thuộc ISI/ Scopus/ Ngoài ISI nhưng có ISSN) 159

Bảng 3.2 Hội nghị trong nước 159

1

1 MỞ ĐẦU

Nhân tố tăng trưởng từ tiểu cầu người dạng BB tái tổ hợp (rhPDGF-BB), hay còn gọi là becaplermin, đã được nghiên cứu ứng dụng điều trị các vết thương mạn tính do nhiều nguyên nhân khác nhau ở người Trong đó, sản phẩm gel bôi chứa becaplermin (rhPDGF-BB) với nồng độ 100 μg/g (Regranex® Gel 0,01%) đã được FDA công nhận dùng trong điều trị vết thương mạn tính ở bệnh nhân đái tháo đường

Với hiện trạng nhu cầu điều trị các vết thương mạn tính nói chung và vết thương ở bệnh nhân đái tháo đường nói riêng tại Việt Nam, việc nghiên cứu sản xuất trong nước dạng bào chế cho thuốc điều trị dựa trên protein rhPDGF-BB là hết sức cần thiết Trong khuôn khổ của đề tài, dạng bào chế chúng tôi hướng tới chủ yếu là dạng gel sử dụng bằng cách bôi trực tiếp lên vết thương Trong pha một trước đây của đề tài cấp Sở Khoa học và Công nghệ TP.HCM “Nghiên cứu tạo yếu tố tăng trưởng tái

tổ hợp từ tiểu cầu (Platelet derived growth factor-PDGF) nhằm điều trị loét bàn chân đái tháo đường” (mã số 219/2013/HĐĐH- SKHCN), chúng tôi đã tạo được chủng

nấm men Pichia pastoris tái tổ hợp mang đa bản sao gen mã hóa cho protein

rhPDGF-BB và tối ưu điều kiện lên men - tinh chế protein ở quy mô phòng thí nghiệm Trong pha hai của đề tài này, chúng tôi đặt mục tiêu thử nghiệm sản xuất 1000 tuýp gel rhPDGF-BB 0,01% Mỗi tuýp gel rhPDGF-BB 0,01% có khối lượng 15 g sẽ chứa 1,5

mg protein rhPDGF-BB Do vậy, để sản xuất 1000 tuýp gel, chúng tôi cần thu được

ít nhất 1,5 g protein rhPDGF-BB có độ tinh sạch ≥ 95% Ước tính quá trình xử lý và trữ mẫu sau tinh chế có thể làm thất thoát tối đa là 50% mẫu, do vậy để có 1,5 g protein rhPDGF-BB làm nguyên liệu cho bào chế 1000 tuýp gel, chúng ta cần tinh chế được khoảng 3 g protein rhPDGF-BB có độ tinh sạch ≥ 95% Nếu hiệu suất quá trình tinh chế đạt 25 – 50%, chúng ta cần có từ 6 – 12g nguyên liệu rhPDGF-BB thô trong dịch sau lên men, để sau tinh chế chúng ta có được khoảng 3 g protein tinh sạch Như vậy, đề tài cần tìm ra điều kiện lên men tạo được khoảng 6 – 12 g protein rhPDGF-BB nguyên liệu thô thô (nội dung nghiên cứu 1) và điều kiện tinh chế để thu được khoảng 3 g protein có độ tinh sạch ≥ 95% (nội dung nghiên cứu 2) Song song

đó, các điều kiện bảo quản nguyên liệu thô và nguyên liệu tinh sạch cũng cần được

2

khảo sát (nội dung nghiên cứu 3) Đối với nguyên liệu thô trong dịch lên men có thể chỉ cần bảo quản trong 2-3 tuần, là thời gian trữ mẫu phù hợp trước khi chuyển sang giai đoạn tinh chế Đối với nguyên liệu tinh sạch có thể khảo sát bảo quản từ vài tháng đến 1 năm Song song đó, đề tài cần nghiên cứu công thức và quy trình bào chế gel rhPDGF-BB 0,01% (nội dung nghiên cứu 5) và thử nghiệm chế phẩm gel này trên

mô hình động vật để đánh giá về độ an toàn và hiệu quả điều trị vết thương của chế phấm (nội dung nghiên cứu 7) Cuối cùng, nguyên liệu và thành phẩm cần có bộ tiêu chuẩn cơ sở và các phương pháp kiểm nghiệm phù hợp để đánh giá chất lượng của sản phẩm (nội dung nghiên cứu 4 và 6)

Với các mục tiêu nêu trên, báo cáo nghiệm thu của đề tài sẽ trình bày các tổng quan tài liệu quan trọng là cơ sở khoa học cho mục tiêu, nội dung và phương pháp nghiên cứu của đề tài (phần 1 Mở đầu), 7 nội dung nghiên cứu chính của đề tài với vật liệu

- phương pháp và kết quả - biện luận được trình bày cho từng nội dung (phần 2 Nội dung nghiên cứu), tóm tắt các sản phẩm đã đăng ký của đề tài và mức độ đạt được (phần 3 Các kết quả đạt được); và cuối cùng là các kết luận và đề xuất những nội dung cần thực hiện sau khi đề tài nghiệm thu (phần 4 Kết luận và đề nghị)

Hiện trạng và kết quả các công trình nghiên cứu liên quan đến đề tài

Ngoài nước

Nhân tố tăng trưởng từ tiểu cầu (Platelet-derived growth factor – PDGF), một yếu

tố phân bào chủ yếu của nguyên bào sợi, tế bào cơ trơn và nhiều tế bào khác, được chứng minh có vai trò trong quá trình làm lành vết thương Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm đánh giá hiệu quả trị liệu của nhân tố tăng trưởng

từ tiểu cầu người dạng BB tái tổ hợp (rhPDGF-BB), hay còn gọi là becaplermin, như các nghiên cứu tiền lâm sàng trên mô hình động vật và nghiên cứu điều trị lâm sàng trên người

Khi xử lí rhPDGF-BB trên mô hình vết thương rạch da lưng chuột, với liều lượng

20 μg/vết rạch dài 1,5 cm, cho thấy tốc độ lành vết thương trong tuần đầu tiên tăng nhanh hơn 2 ngày và nhanh hơn 4 – 6 ngày trong 2 tuần tiếp theo so với nhóm đối chứng (chỉ có tá dược collagen) [1] Trong một nghiên cứu khác trên mô hình vết

3

thương loét da tai thỏ, PDGF-BB được sử dụng với liều lượng 5 μg/vết thương tròn đường kính 6 mm, cho thấy vết thương có sự tăng mô hạt gấp 2,29 lần (ở ngày 5) và gấp 2 lần (ở ngày 7), tốc độ lành vết thương trong tuần đầu tiên cũng tăng nhanh hơn

2 ngày so với nhóm đối chứng [2] Bên cạnh đó, trong các nghiên cứu về khảo sát liều lượng và ảnh hưởng của PDGF-BB trên mô hình vết thương cắt da ở chuột Guinea đều cho thấy PDGF-BB kích thích làm tăng mô hạt Cụ thể như, PDGF-BB với liều lượng 30 μg/vết thương vuông 30 x 10 mm, được sử dụng để trị liệu trong vòng 5 ngày và hiệu quả được đánh giá vào ngày thứ 7, Kết quả cho thấy, mô hạt ở nhóm được xử lí với PDGF-BB dày hơn gấp từ 2,4 đến 3,7 lần (với % CV = 16,5%)

so với nhóm đối chứng [3] Ngoài ra, nghiên cứu trên vết thương của chuột đái tháo đường cũng cho thấy trị liệu với PDGF-BB có khả năng giúp làm lành được vết thương [4]

Các pha thử nghiệm của sản phẩm gel bôi chứa rhPDGF-BB trong điều trị vết loét

ở bệnh nhân đái tháo đường

Từ các kết quả thành công trên động vật nói trên đã dẫn tới việc nghiên cứu sản phẩm gel bôi chứa becaplermin (rhPDGF-BB) với nồng độ 100 μg/g (Regranex® Gel 0,01%) Sản phẩm này trước khi được FDA công nhận đã trải qua các pha thử nghiệm như sau:

• Pha 1 - tiền lâm sàng: các nghiên cứu trên chuột và khỉ cho thấy hiệu quả làm lành vết thương của becaplermin trên các con vật bình thường rất khó quan sát được, ngoại trừ thấy được sự gia tăng của mô hạt Các dữ liệu về dược động học cũng còn khá hạn chế nhưng nhìn chung có thể được xem xét chấp nhận sử dụng trên người Các nghiên cứu về độc tính (tác động lên sinh sản, đột biến gen, ung thư, gây khó chịu cho da…) đều không kết luận vấn đề nào đáng lo ngại Mặc dù nghiên cứu trong thời gian ngắn (tối đa 13 tuần) và trên số lượng động vật thử nghiệm nhỏ, nhưng các kết quả này được chấp nhận là đủ đối với một sản phẩm gel bôi [5]

• Pha 2 - nghiên cứu lâm sàng của Steed, 1995: 118 bệnh nhân đái tháo đường mang vết loét trong ít nhất 8 tuần được trị liệu với rhPDGF-BB (2,2 µg/cm2 của diện

4

tích vết loét) hoặc giả dược cho đế khi vết loét lành hoàn toàn hoặc cho đến tối đa

20 tuần Kết quả cho thấy 29 trong số 61 bệnh nhân (48%) của nhóm trị liệu rhPDGF-BB lành vết loét hoàn toàn, so với 14 trong số 57 bệnh nhân (25%) bôi giả dược placebo (p = 0,01) Diện tích vết thương trung bình được chữa lành khi trị liệu bằng rhPDGF-BB là 98,8%, so với 82,1% của nhóm dùng giả dược (p = 0,09) Không có biến chứng hay hiện tượng nào về sự không an toàn được quan sát trong cả nhóm trị liệu rhPDGF-BB và giả dược Kết luận bôi rhPDGF-BB một lần mỗi ngày thì an toàn và có hiệu quả trong kích thích làm lành vết loét do đái tháo đường [6]

• Pha 3 – gồm 3 nghiên cứu của d’Hemecourt và cộng sự (1998), Wieman và cộng

sự (1998), và Smiell và cộng sự (1999)

o Nghiên cứu của d’Hemecourt và cộng sự (1998) đánh giá hiệu quả và độ an toàn của gel bôi sodium carboxymethylcellulose (NaCMC) chứa rhPDGF-BB trong trị liệu vết loét do đái tháo đường kết hợp các biện pháp chăm sóc vết thương hỗ trợ thêm 172 bệnh nhân đái tháo đường type 1 hoặc type 2 mang vết loét trong ít nhất 8 tuần được trị liệu ngẫu nhiên với các biện pháp chăm sóc vết thương, hoặc vừa chăm sóc vết thương vừa bôi gel chỉ chứa NaCMC, hoặc vừa chăm sóc vết thương vừa bôi gel chứa becaplermin (rhPDGF-BB) với nồng độ 100 μg/g (Regranex® Gel 0,01%) cho đến khi vết thương lành hoàn toàn hoặc trong tối đa 20 tuần Tỉ lệ bệnh nhân có vết loét lành hoàn toàn

là 22% (15/68) với bệnh nhân chỉ được chăm sóc vết thương tốt, 36% (25/70) với bệnh nhân bôi gel NaCMC và 44% (15/34) với bệnh nhân bôi gel chứa 100 μg/g becaplermin Thời gian cần thiết để vết loét lành hoàn toàn là ngắn nhất

ở nhóm bôi gel chứa 100 μg/g becaplermin (85 ngày), kế đến là nhóm bôi gel NaCMC (98 ngày), và lâu nhất là ở nhóm chỉ chăm sóc vết thương ( > 141 ngày) Kết quả cho thấy thuốc bôi dựa trên gel NaCMC không có tác động ức chế quá trình lành vết loét đái tháo đường Ngoài ra, các nhóm điều trị đều không có hiện tượng nào cho thấy sự không an toàn [7]

5

o Nghiên cứu của Wieman và cộng sự, 1998: 382 bệnh nhân đái tháo đường type

1 hoặc type 2 mang vết loét trong ít nhất 8 tuần được trị liệu ngẫu nhiên với các biện pháp chăm sóc vết thương kết hợp bôi gel chứa becaplermin với nồng

độ 30 μg/g, 100 μg/g hay giả dược cho đến khi vết thương lành hoàn toàn hoặc trong tối đa 20 tuần So với giả dược, gel chứa 100 μg/g becaplermin làm tăng

tỉ lệ lành vết loét hoàn toàn lên hơn 43% (50% so với 35%, p = 0,007), và làm giảm thời gian lành vết loét 32% (86 so với 127 ngày, p = 0,013) Các quan sát về tính an toàn của thuốc trong suốt thời gian điều trị và 3 tháng sau đó cũng đều ghi nhận không có sự khác biệt giữa tất cả các nhóm điều trị Kết luận gel bôi chứa 100 μg/g becaplermin khi kết hợp với các biện pháp chăm sóc vết thương tốt làm tăng tỉ lệ lành vết thương và rút ngắn thời gian điều trị một cách có ý nghĩa về mặt thống kê Độ an toàn của gel becaplermin tương

tự như của giả dược [8]

o Nghiên cứu của Smiell và cộng sự (1999): 250 bệnh nhân bôi becaplermin gel (100 μg/g) hoặc chỉ được chăm sóc vết thương Kết quả cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê về tỉ lệ lành vết loét hoàn toàn giữa 2 nhóm (36% so với 32%) [9]

• Pha 4 – sau khi sản phẩm đã được FDA công nhận và thương mại hóa, nghiên cứu của Robson và cộng sự, 2005: điểm khác biệt với các nghiên cứu trước là chỉ thực hiện bôi gel thuốc 1 lần trong ngày, thay vì 2 lần/ngày Kết quả không đảm bảo

về mặt thống kê, trong số 340 bệnh nhân, 42% lành hoàn toàn khi bôi gel becaplermin so với 35% chỉ chăm sóc vết thương (p = 0,316) Mặc dù kết quả của pha 4 này không có ý nghĩa về mặt thống kê, nhưng khi kết hợp với tất cả số liệu của các nghiên cứu trước đây trong một phân tích tổng thể, kết quả vẫn cho thấy điều trị với gel bôi becaplermin mang lại hiệu quả điều trị có ý nghĩa về mặt thống

kê [10]

Một nghiên cứu nhỏ hơn trên 12 bệnh nhân mang vết loét mạn tính do nhiều nguyên nhân khác nhau nhưng không phải do đái tháo đường (xơ cứng bì (scleroderma, n = 3), tím xanh viêm mạch (livedo vasculitis, n = 2), suy tĩnh mạch (venous insufficiency, n = 2), hội chứng Werner (rối loạn lão hóa sớm, n = 1), khó lành sau khi phẫu thuật (n = 3), xạ trị (n = 2) và chấn thương (trauma, n = 1)) cũng cho thấy hiệu quả điều trị của gel bôi chứa 0,01% rhPDGF-BB [11]

Một ca điều trị sử dụng rhPDGF-BB trên một bệnh nhân nam 47 tuổi người Việt Nam mang vết loét mạn tính phía bên trái cổ suốt 12 năm sau khi hóa trị và xạ trị ung thư vòm họng (T2N2bM0 nasopharyngeal carcinoma) cũng đã được công bố [12] Một ca khác trên bệnh nhân nữ 59 tuổi mắc u lympho tế bào T ở da thể MF (cutaneous T-cell lymphoma of the mycosis fungoides type) mang vết loét mạn tính ở phần thân dưới sau khi xạ trị toàn thân, cũng cho thấy sau 6 tuần điều trị với sản phẩm Regranex (gel bôi chứa 0,01% rhPDGF-BB), hiện tượng rỉ dịch giảm đáng kể và vết thương đã được bao phủ với lớp biểu bì mới hình thành [13]

Đối với bệnh nhân mang vết loét mạn tính do ứ máu tĩnh mạch (venous stasis), một báo cáo trên 17 ca điều trị bằng gel bôi 0,01% rhPDGF-BB cho thấy có 11 ca được chữa lành với thời gian trung bình 67,7 ngày [14]

Thêm một báo cáo khác trên các bệnh nhân mang vết loét do nhiều nguyên nhân khác nhau như loét tĩnh mạch, loét do xơ hóa mô mỡ dưới da (lipodermatosclerosis ulcer), loét do biến chứng thần kinh (cả do đái tháo đường và không do đái tháo đường), và loét do nhiều yếu tố kết hợp (loét tĩnh mạch lẫn động mạch) cho thấy 14 trong số 21 ca được chữa lành hoàn toàn bằng gel bôi Regranex sau khoảng thời gian trung bình 111,1 ngày [15]

7

Không chỉ có tác dụng trên vết thương mạn tính, rhPDGF-BB trong một thử nghiệm làm lành vết thương ở bụng sau phẫu thuật trên 21 phụ nữ sinh mổ lấy thai, cũng cho thấy kích thích đóng vết thương nhanh hơn (35 ± 15 ngày) so với giả dược SurgiLube (54 ± 26 ngày; p = 0,05) [16]

Một số công bố đáng chú ý khác cũng báo cáo hiệu quả của gel bôi chứa 0,01% rhPDGF-BB trong điều trị thành công vết loét ở trẻ em u máu (hemangiomas) [17, 18], loét hốc mắt mạn tính (chronic orbital ulcer) [19], loét da do xơ cứng bì (scleroderma skin ulcer) [20], vết loét do bệnh lichen phẳng (lichen planus) [21], hoại

tử da dạng mỡ đái tháo đường (necrobiosis lipoidicum diabeticorum) [22], vết thương

dò họng sau phẫu thuật cắt thanh quản toàn phần (pharyngocutaneous fistul following total laryngectomy) [23], và vết loét do cá đuối gai độc gây ra [24]

Trong nước

Hiện nay vẫn chưa có công bố nào về việc sản xuất và ứng dụng protein

rhPDGF-BB người tái tổ hợp (rhPDGF-rhPDGF-BB) trong điều trị các vết thương mạn tính ở Việt Nam, ngoài trừ các công bố từ nhóm nghiên cứu của chúng tôi, bao gồm công bố của tác giả Vương Cát Khánh và cộng sự đăng trong Tạp chí sinh học (2014) với đề tài

“Nghiên cứu cấu trúc và sàng lọc dòng nấm men Pichia pastoris tái tổ hợp đa bản

sao biểu hiện nhân tố tăng trưởng từ tiểu cầu BB (PDGF-BB) mức độ cao”, công bố của tác giả Dương Long Duy và cộng sự cũng đăng trong Tạp chí sinh học (2015) với

đề tài “Khảo sát điều kiện lên men sinh tổng hợp hPDGF-BB (human Platelet-Derived

Growth Factor BB) tái tổ hợp từ chủng Pichia pastoris”, công bố của Vũ Kha Thanh

Thanh và công sự trên Tạp chí Công nghệ sinh học (2015) với đề tài “Khảo sát quy trình tinh chế nhân tố tăng trưởng từ tiểu cầu người hPDGF-BB (human platelet - derived growth factor BB) tái tổ hợp”, và công bố của Nguyễn Phạm Phương Thanh

và cộng sự trong Tạp chí sinh học (2015) với đề tài “Khảo sát chọn lọc và tối ưu qui

trình thử nghiệm hoạt tính PDGF (platelet-derived growth factor) người tái tổ hợp in

vitro”

Theo kết quả từ các công bố trên, cũng như báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Sở Khoa học và Công nghệ TP.HCM “Nghiên cứu tạo yếu tố tăng trưởng tái tổ hợp từ tiểu cầu

8

(Platelet derived growth factor-PDGF) nhằm điều trị loét bàn chân đái tháo đường” (mã số 219/2013/HĐĐH- SKHCN), nhóm chúng tôi đã lựa chọn hệ thống nấm men

Pichia pastoris để sản xuất biểu hiện protein rhPDGF-BB do các ưu điểm về biến đổi

sau dịch mã, sinh khối lớn và tiết protein ra môi trường

Chủng P pastoris X33 tái tổ hợp mang đa bản sao gene pdgf-b được thu nhận và

tiến hành khảo sát cảm ứng biểu hiện theo quy trình đề nghị bởi nhà cung cấp Invitrogen, đồng thời khảo sát tối ưu nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy và nồng độ chất cảm ứng - methanol Kết quả khảo sát cho thấy, chủng nấm men tái tổ hợp biểu hiện nhiều rhPDGF-BB hơn ở 30⁰C, pH 4,0; trong thời gian nuôi cấy khoảng 72 giờ và nồng độ methanol 0,5%

Để tinh chế protein rhPDGF-BB, phương pháp sắc kí trao đổi cation cho độ tinh sạch cao đạt 99% và hiệu suất tinh chế khoảng 22%, với điều kiệu cân bằng cột tốt nhất là đệm acetate 20 mM pH 4 và điều kiện dung ly là dung dịch NaCl 1 M trong đệm Tris-HCl 20 mM pH 7,5

Để đánh giá hoạt tính sinh học của protein rhPDGF-BB tái tổ hợp, quy trình thử

hoạt tính rhPDGF-BB in vitro thông qua khả năng kích thích tăng sinh nguyên bào

sợi NIH 3T3 được khảo sát tối ưu Áp dụng quy trình tối ưu này để xây dựng đường cong đáp ứng cho rhPDGF-BB thương mại và rhPDGF-BB tái tổ hợp, kết quả cho thấy giá trị độ nghiêng và ED50 của đường cong đáp ứng của mẫu PDGF tinh chế không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê so với các giá trị tương ứng ở mẫu rhPDGF-

BB thương mại Đồng thời, việc ứng dụng protein rhPDGF-BB để chữa trị vết thương trên mô hình chuột đái tháo đường cũng được thử nghiệm bước đầu Các kết quả thí nghiệm sơ bộ cho thấy rhPDGF-BB có tác động tốt trong quá trình làm lành vết thương ở chuột đái tháo đường

Từ các kết quả thực nghiệm và tham khảo các bộ dược điển của Việt Nam và thế giới, bộ tiêu chuẩn cho protein rhPDGF-BB sau tinh chế được xây dựng bước đầu bao gồm các tiêu chí sau: giải trình tự amino acid đạt độ tương đồng 100% với PDGF người và trọng lượng phân tử khoảng 24,5 kDa; độ tinh sạch đánh giá bằng điện di SDS-PAGE kết hợp nhuộm bạc, phân tích hình ảnh bằng phần mềm Image J hoặc

9

Quanti One đạt ≥ 95%; độ vô khuẩn đánh giá bằng nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng FTM (Fluid thioglycollate medium) và SCM (Soya-bean casein digest medium) ở 37⁰C, 14 ngày đảm bảo không phát hiện khuẩn lạc nào; điện di trên gel polyacrylamide 12% không phát hiện DNA tế bào chủ; và định lượng hoạt tính sinh học trên dòng tế bào NIH-3T3 cho hoạt tính tương đương với PDGF thương mại (BioLegend) với ED50 = 3,2 – 4,9 ng/ml, hoạt tính riêng 3,110-2,023x105 units/mg Theo chúng tôi tìm hiểu, hiện nay việc ứng dụng rhPDGF-BB trong điều trị ở Việt Nam còn hạn chế có thể do giá thành của sản phẩm này khá đắt tiền, khoảng 1000 USD cho 1 tuýp thuốc Regranex 15 g (https://www.drugs.com/price-guide/regranex)

Ấn Độ gần đây cũng đã sản xuất được hoạt chất và bào chế thành biệt dược PLERMIN cung cấp ra thị trường với giá khoảng 30 USD/tuýp 15 g Với tiềm năng điều trị của PDGF-BB trên các vết thương mạn tính như đã nêu trên, việc nghiên cứu sản xuất protein này ở Việt Nam là hết sức cần thiết nhằm hạ chi phí điều trị mang lại nhiều lợi ích cho bệnh nhân

Lý do thực hiện đề tài

Vết thương cấp tính và mạn tính ảnh hưởng khá lớn đến sức khỏe, đời sống con người và kinh tế của quốc gia Theo thống kê tại Hoa Kỳ, vết thương mạn tính ảnh hưởng trên khoảng 6,5 triệu người và chi phí điều trị khoảng 25 tỉ USD hàng năm Tính đến trước năm 2010, chi phí cho các sản phẩm chăm sóc vết thương hàng năm tại đây lên đến 15,3 tỉ USD [25]

Tại Việt Nam, vết thương khó lành, vết thương mạn tính ngày càng phổ biến trong đời sống và tăng lên cùng với sự phát triển của kinh tế, xã hội và tuổi thọ của người dân Vết thương mạn tính bắt nguồn từ nhiều nguyên nhân khác nhau như vết loét do tĩnh mạch, loét do bệnh đái tháo đường, do tì đè, do xạ trị, v.v Nếu vết thương không được chăm sóc đầy đủ sẽ dẫn đến tình trạng khó liền, để lại nhiều di chứng, biến chứng nặng nề, và gây ra nhiều tốn kém trong chi phí điều trị Trong một nghiên cứu

về một số đặc điểm dịch tễ vết thương cấp và mạn tính tại Khoa Liền Vết Thương - Viện Bỏng Quốc Gia vào năm 2014 trên 430 bệnh nhân được theo dõi, số bệnh nhân mang vết thương mạn tính chiếm tỷ lệ cao hơn vết thương cấp tính (87,67% so với

10

12,33%) Trong đó, 100% bệnh nhân vết thương mạn tính có bệnh lý kết hợp Vết thương mạn tính gặp chủ yếu do tỳ đè (73%) và vết thương đái tháo đường (9%) Tuy chưa tìm thấy các công bố nghiên cứu ảnh hưởng kinh tế và con người trong việc điều trị vết thương lâu lành ở Việt Nam, nhưng các khảo sát sơ bộ của chúng tôi

từ các bác sĩ chuyên khoa và các bác sĩ điều trị bệnh nhân có vết thương lâu lành cho thấy nhu cầu chăm sóc và điều trị vết thương hiện nay tại Việt Nam là rất lớn Do đó, việc nghiên cứu điều trị vết thương hiện nay đang nhận được khá nhiều sự quan tâm

từ giới khoa học

Việc điều trị vết thương mạn tính không chỉ bao gồm các biện pháp chăm sóc vết thương cơ bản như kiểm soát vết thương, kiểm soát nhiễm trùng, kiểm soát áp lực, kiểm soát mạch máu, v.v, mà còn bao gồm các biện pháp chăm sóc chuyên sâu như

sử dụng yếu tố tăng trưởng, tế bào gốc, liệu pháp gen, v.v Trong đó, becaplermin hay protein rhPDGF-BB (yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu người dạng BB tái tổ hợp) là sản phẩm đầu tiên được tổ chức FDA, Mỹ cấp phép sử dụng trong điều trị loét chi ở bệnh nhân đái tháo đường Ngoài ra, becaplermin đã được thử nghiệm điều trị thành công các vết thương mạn tính khác như vết loét do tì đè, do xạ trị, do phẫu thuật, loét tĩnh mạch, loét động mạch, v.v Tuy nhiên, hiện nay giá thành của các sản phẩm chăm sóc chuyên sâu còn cao so với thu nhập trung bình của người dân

ở nước ta, do đó vẫn còn nhiều bệnh nhân phải chấp nhận sống chung với vết thương đến hết đời, hoặc thậm chí dẫn đến đoạn chi hay gây tử vong

Do vậy, việc nghiên cứu sản xuất nguyên liệu hPDGF-BB tái tổ hợp trong nước và nghiên cứu bào chế thuốc điều trị vết thương dựa trên nguyên liệu này nhằm tạo ra sản phẩm điều trị vết thương với giá thành hợp lý là cần thiết và có ý nghĩa kinh tế, con người và xã hội

Trong đề tài từ đặt hàng của Sở Khoa học Công nghệ (mã số 219/2013/HĐĐH- SKHCN), chúng tôi đã thu được một số kết quả khả quan như:

- Thành công trong việc tạo được dòng nấm men sản xuất hPDGF-BB tái tổ hợp hiệu năng cao

11

- Thành công trong việc xây dựng các thông số nền tảng ban đầu trong quy trình sản xuất hPDGF-BB tái tổ hợp ở quy mô phòng thí nghiệm

- Thành công trong việc xây dựng các qui trình kiểm tra chất lượng

hPDGF-BB nhằm chuẩn hoá việc kiểm soát chất lượng nguyên liệu trong quá trình sản xuất thuốc

- Các kết quả khoa học của đề tài nhận được sự quan tâm và phối hợp đầu tư của Công ty CP Dược phẩm Dược liệu Pharmedic để phát triển thành sản phẩm thương mại

Với các nền tảng khoa học và thực tiễn nêu trên, để mở rộng khả năng ứng dụng điều trị các vết thương mạn tính, đáp ứng như cầu xã hội, chúng tôi đề xuất đề

tài “NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN DẠNG BÀO CHẾ CHO THUỐC ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG MẠN TÍNH DỰA TRÊN PROTEIN PDGF-BB TÁI TỔ HỢP”

hướng đến qui mô sản xuất lớn hơn so với qui mô phòng thí nghiệm đã thực hiện trước đây Đề tài này sẽ thực hiện: (a) Xây dựng quy trình sản xuất nguyên liệu rhPDGF-BB cho 1000 tuýp gel (15 g/tuýp, 0,01% rhPDGF-BB); (b) Thiết lập quy trình tạo sản phẩm gel chứa 0,01% rhPGDF-BB quy mô 1000 tuýp; (c) Chứng minh được độ an toàn và hiệu quả của sản phẩm trên mô hình chuột

Cơ sở khoa học của đề tài

Cơ sở khoa học của việc sử dụng rhPDGF-BB trong sản phẩm gel làm lành vết thương ở da

Quá trình làm lành vết thương

Quá trình lành vết thương tự nhiên là một quá trình phức tạp bao gồm đông máu,

sự tổng hợp chất nền, tái tạo mạch máu, sự phát triển của nguyên bào sợi, hình thành biểu mô mới, tái tạo chức năng và tính toàn vẹn của mô Nó bao gồm 4 giai đoạn nhưng có sự chồng chéo lên nhau: đông máu, viêm, tăng sinh và tái tạo Trong suốt quá trình làm lành vết thương, các nhân tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu (PDGF) hoạt động như một trung gian điều hòa chuỗi phức tạp các sự kiện bao gồm các tương tác giữa tế bào với tế bào, giữa tế bào với chất nền và chúng đã được công nhận là đóng một vai trò quan trọng trong các giai đoạn khác nhau của quá trình làm

12

lành vết thương [26-29] Tuy nhiên ở các bệnh nhân mắc các vết thương mạn tính như bệnh nhân đái tháo đường, các nhân tố như PDFG và FGF bị suy giảm, làm quá trình viêm kéo dài và vết thương trở nên lâu lành (Hình 1.1) [30]

Hình 1.1 Sự khác biệt trong quá trình làm lành vết thương ở người bình thường và

người mắc bệnh đái tháo đường [30]

13

Nhân tố tăng trưởng từ tiểu cầu người – hPDGF

Hình 1.2 Cấu trúc chuỗi hPDGF-B (A) và dimer hPDGF-BB (B) [31]

Protein hPDGF là một nhân tố tăng trưởng trong họ bốn nhân tố tăng trưởng cystein [32], có vai trò trong sự tăng trưởng các tế bào có nguồn gốc từ trung mô Trong tự nhiên, hPDGF tồn tại ở dạng dimer, có thể là homodimer hoặc heterodimer Cấu trúc hPDGF trưởng thành bao gồm hai chuỗi polypeptide được liên kết với nhau bằng cầu nối disulfide (S-S) Có bốn loại chuỗi polypeptide: hPDGF-A, hPDGF-B, hPDGF-C

và hPDGF-D, tạo thành năm dạng isoform của hPDGF (hPDGF-AA, hPDGF-BB, hPDGF-AB, hPDGF-CC và hPDGF-DD) Tất cả các dạng hPDGF đều bảo tồn ở vùng domain gọi là “cysteine-knot growth factor domain”, trong đó bao gồm các phiến β đối song được liên kết với nhau bởi ít nhất ba cầu nối S-S, còn các vùng trình

tự khác ngoài vùng domain bảo tồn này đều khác nhau đáng kể giữa các dạng hPDGF khác nhau

Để thực hiện chức năng của mình, đầu tiên hPDGF tác động lên tế bào đích bằng cách tương tác với thụ thể của chúng được biểu hiện trên bề mặt các tế bào đó Hai loại thụ thể của hPDGF bao gồm hPDGFR-α và hPDGFR-β, chúng thuộc nhóm thụ thể tyrosine kinase lớp III [32] Khi hPDGF dimer tương tác với thụ thể sẽ làm dimer hóa thụ thể, tạo ra 3 loại thụ thể là hPDGFR-αα, hPDGFR-ββ và hPDGFR-αβ Mỗi loại hPDGF có ái lực gắn khác nhau với các thụ thể, ví dụ: hPDGF-AA chỉ tương tác chuyên biệt với hPDGFR-αα; trong khi đó, hPDGF-BB có ái lực cao với cả 3 loại thụ thể [33] Sự tác động của hPDGF lên tế bào đích gồm nhiều giai đoạn, bao gồm sự

Ngoài ra, hPDGF còn có vai trò trong quá trình phát triển phôi và hình thành mạch máu Protein hPDGF được chứng minh là có khả năng kích thích tái tạo, tạo máu và

hình thành mạch máu mới sẵn có (angiogenesis) trong in vitro và in vivo [36]

Với các chức năng sinh học nêu trên, cùng với khả năng tương tác với cả 3 dạng thụ thể, protein hPDGF-BB tái tổ hợp đã được FDA công nhận sử dụng trong sản phẩm gel bôi làm lành vết thương Regranex (cấp phép năm 1997 và hết bản quyền năm 2015) và sản phẩm kích thích làm lành vết thương và tái tạo xương (GEM 21S, 2005) Ngoài ra, Canada (2009), Úc và New Zealand (2011) còn cấp phép sử dụng rhPDGF-BB trong sản phẩm thuốc hỗ trợ làm lành vết thương sau phẫu thuật chỉnh hình

Cơ sở khoa học của việc nâng cao quy mô sản xuất nguyên liệu rhPDGF-BB thông qua việc nghiên cứu nâng quy mô lên men

Lên men mẻ bổ sung trong sản xuất protein tái tổ hợp ở P pastoris

Trong quá trình sản xuất protein tái tổ hợp ở P pastoris, tăng lượng sinh khối

P pastoris là việc đầu tiên cần nhắm đến để thu nhận lượng lớn protein mục tiêu từ

15

đó làm tăng sản lượng tiết protein Trong đó, phương pháp lên men mật độ cao đã

được sử dụng đối với chủng P pastoris do chủng có khả năng đạt mức mật độ sinh

khối tươi (WCW) từ 350 đến 400 g/L ở cuối giai đoạn nuôi cấy [43] Hiện nay trên thế giới, riêng đối với hệ thống biểu hiện này, phương pháp lên mẻ bổ sung là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất và được tối ưu nhiều nhất Theo Invitrogen [44], quy trình lên men mẻ bổ sung gồm các bước: hoạt hóa giống, giai đoạn mẻ glycerol, giai đoạn bổ sung glycerol và giai đoạn bổ sung methanol (Hình 1.3)

Hình 1.3 Quy trình lên men mẻ bổ sung cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu [44] Hoạt hóa giống: chủng chủ sẽ sẽ được hoạt hóa trên môi trường BMGY Mục

đích của quá trình này nhằm ổn định trạng thái sinh lý của chủng, chuẩn bị cho quá trình lên men

Giai đoạn mẻ glycerol: chủng chủ sinh trưởng trong môi trường lên men có

glycerol là nguồn carbon duy nhất Giai đoạn mẻ glycerol kết thúc khi lượng glycerol trong môi trường cạn kiệt – được chỉ thị bằng sự gia tăng đột ngột của giá trị oxy hòa tan (DO), khi đó giá trị mật độ sinh khối tươi có thể thu được ở mức 90 – 150 g/L,

Mục đích của giai đoạn này làlàm tăng lượng sinh khối tối đa và duy trì được tốc độ tăng trưởng đặc trưng tối đa đã được xác định của chủng ở khoảng

16

μ = 0,177 h-1, trong khi protein mục tiêu vẫn chưa được sản sinh do promoter pAOX1 vẫn đang bị ức chế bởi glycerol và không có sự hiện diện của chất cảm ứng là methanol [45] Lượng sinh khối cao trong giai đoạn mẻ glycerol sẽ giúp đạt được hiệu quả biểu hiện protein mục tiêu về sau ở mức cao nhất

Giai đoạn bổ sung glycerol: hệ thống lên men tiếp tục được bổ sung thêm

glycerol Mục đích của giai đoạn mẻ bổ sung glycerol là tiếp tục tăng lượng sinh khối trước khi cảm ứng Giai đoạn bổ sung glycerol kết thúc một khi lượng sinh khối đã đạt được mức mong muốn, sẵn sàng cho việc sản xuất protein tái tổ hợp Kết thúc giai đoạn này, giá trị mật độ sinh khối tươi đạt mức 180 – 220 g/Ltrong khi protein mục tiêu vẫn chưa được cảm ứng biểu hiện

Giai đoạn bổ sung methanol: gồm hai giai đoạn là giai đoạn thích nghi và giai

đoạn cảm ứng methanol

+ Giai đoạn thích nghi methanol: methanol được bổ sung với tốc độ ban đầu

thấp, và sau đó tăng dần Trong khoảng thời gian này, không có bất kỳ sự tiêu thụ methanol nào diễn ra cho đến khi các gen phiên mã cho những enzyme tham gia chuyển hóa methanol được kích hoạt và tế bào đã có được 1 lượng enzyme cần thiết cho việc sinh trưởng trên methanol Giai đoạn này diễn ra trong khoảng 2 – 4 giờ và được nhận biết thông qua sự giảm đột ngột giá trị DO

+ Giai đoạn cảm ứng methanol: sau khi tế bào P pastoris đã đáp ứng được với

sự có mặt của methanol và bắt đầu sử dụng methanol làm nguồn carbon để sinh trưởng, gen mã hóa cho protein mục tiêu vốn được thiết kế nằm ngay sau promoter pAOX1 cũng sẽ bắt đầu được cảm ứng biểu hiện bởi các phân tử methanol Tốc độ

bổ sung methanol lúc này cũng được tăng dần và cố định ở mức tương ứng với tốc

độ tăng trưởng tối đa của chủng trên methanol là khoảng

μ ≈ 0,071 h -1, trong khoảng 72 giờ

Dựa trên quy trình lên men mẻ bổ sung P pastoris cơ bản của Invitrogen,quy trình lên men sản xuất rhPDGF-BB bởi chủng P pastoris X33::pdgf-b đã được tác

giả Dương Long Duy và cộng sự (2015) khảo sát tối ưu về các điều kiện pH và nhiệt

độ với các thông số cụ thể được tổng hợp trong Bảng 1.1

17

Bảng 1.1 Các giai đoạn của quá trình lên men mẻ bổ sung sản xuất rhPGDF - BB

Giai đoạn Thời gian

(h)

Tốc độ

bổ sung

cơ chất (ml /L/h)

OD 600 /Sinh khối tươi WCW (g/L) dự kiến

Điều kiện nhiệt

của P pastoris khi tế bào chết, sự thiếu hụt cung cấp oxy, nhiệt độ hệ thống tăng do

quá trình biến dưỡng cơ chất thành protein, protein được sản xuất có thể hình thành chất ức chế sự tăng trưởng và biểu hiện của chủng Do đó, cần đảm bảo các điều kiện trên và đưa ra các chiến lược lên men phù hợp để tăng năng suất của quá trình lên men [46]

Một số chiến lược lên men tăng biểu hiện protein tái tổ hợp ở hệ thống P pastoris

Trong giai đoạn cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu bằng methanol, việc biến

dưỡng methanol của chủng P pastoris cần xảy ra trong điều kiện hiếu khí và tiêu thụ

một lượng lớn oxy, nếu lượng oxy cung cấp không đủ sẽ dẫn đến tích tụ methanol gây độc cho tế bào [47] Sự tích tụ methanol ở nồng độ 3,65 g/L bắt đầu có ảnh hưởng

đến sự phát triển ở P pastoris [48], dẫn đến một số chiến lược lên men được đề ra

nhằm hạn chế việc tích tụ methanol