Nghiên cứu làm giàu dha docosahexaenoic acid trong dầu mỡ cá ba sa pangasius bocourti thô bằng phương pháp enzym và chưng cất phân đoạn

chương trình vườn ươm sáng tạo khoa học kỹ thuật trẻĐề tài: NGHIÊN CỨU LÀM GIÀU DHA DOCOSAHEXAENOIC ACID TRONG DẦU MỠ CÁ BASA PANGASIUS BOCOURTI THÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYME VÀ CHƯNG CẤ

chương trình vườn ươm sáng tạo khoa học kỹ thuật trẻ

Đề tài:

NGHIÊN CỨU LÀM GIÀU DHA (DOCOSAHEXAENOIC ACID) TRONG DẦU MỠ CÁ BASA (PANGASIUS BOCOURTI) THÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYME VÀ CHƯNG CẤT PHÂN ĐOẠN

(Đã được chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng Khoa học ngày 13/02/07)

chương trình vườn ươm sáng tạo khoa học kỹ thuật trẻ

Đề tài:

NGHIÊN CỨU LÀM GIÀU DHA (DOCOSAHEXAENOIC ACID) TRONG DẦU MỠ CÁ BASA (PANGASIUS BOCOURTI) THÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYME VÀ CHƯNG CẤT PHÂN ĐOẠN

(Đã được chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng Khoa học ngày 13/02/07)

CƠ QUAN CHỦ TRÌ : TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KH & CN TRẺ TP HCM CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI : ThS NGUYỄN DIÊN SANH

CỐ VẤN KHOA HỌC : PGS TS NGUYỄN TIẾN THẮNG

CỐ VẤN KỸ THUẬT : PGS TS HOÀNG ĐỨC NHƯ

ĐỒNG CHỦ NHIỆM : NCS VŨ ĐĂNG KHÁNH

CỘNG TÁC VIÊN : NCS ĐẶNG CHÍ HIỀN

CN ĐỖ THỊ TUYẾN ThS DIỆP QUỲNH NHƯ

CN LÊ THỊ KIM TRANG

Tp HCM, tháng 8 năm 2006

chương trình vườn ươm sáng tạo khoa học kỹ thuật trẻ

Đề tài:

NGHIÊN CỨU LÀM GIÀU DHA (DOCOSAHEXAENOIC ACID) TRONG DẦU MỠ CÁ BASA (PANGASIUS BOCOURTI) THÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYME VÀ CHƯNG CẤT PHÂN ĐOẠN

(Đã được chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng Khoa học ngày 13/02/07)

Đề tài này được hoàn thành với sự hướng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tận tình của Thầy TS Nguyễn Tiến Thắng Thay mặt nhóm nghiên cứu, tôi xin chân thành gửi đến Thầy lời cảm ơn sâu sắc

Xin chân thành cảm ơn Thầy PGS TS Hoàng Đức Như đã động viên, cố vấn khoa học kỹ thuật để chúng tôi có thể hoàn thành tốt đề tài này

Tôi xin ghi ơn anh NCS Vũ Đăng Khánh đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong việc chọn và tiến hành đề tài, cũng như giải quyết các vấn đề khó khăn trong quá trình thực hiện đề tài

Đại diện nhóm nghiên cứu, tôi xin chân thành cảm ơn Sở Khoa học- Công nghệ và Môi trường, Trung Tâm phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho hoạt động nghiên cứu khoa học, cũng như hỗ trợ kinh phí cho chúng tôi thực hiện đề tài này

Nhân đây, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy cô, anh chị và các bạn trong trong nhóm nghiên cứu đã tích cực tham gia thực hiện đề tài này

Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn Cô PGS TS Phạm Thị Ánh Hồng, Cô PGS TS Đồng Thị Thanh Thu, các Thầy Cô trong khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quí báu, dìu dắt tôi trong suốt quá trình theo học tại Trường

Tp Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006

Chủ nhiệm đề tài

Nguyễn Diên Sanh

Lời cảm ơn

Mục lục

Các kí hiệu, chữ viết tắt

Danh mục bảng

Danh mục hình

Phần 1: Đặt vấn đề 1

Phần 2: Tổng quan tài liệu 4

2.1 Hiện trạng và xu hướng phát triển nghề nuôi cá basa 4

2.2 Giới thiệu về cá basa 4

2.3 Mỡ cá basa 5

2.4 Giới thiệu về DHA và vai trò của DHA 6

2.4.1 Tình hình nghiên cứu về DHA trong nước và trên thế giới 6

2.4.2 DHA (Docosahexaenoic acid) 9

2.4.3 Vai trò của DHA 10

2.4.4 Nguồn nguyên liệu chứa DHA 13

2.5 Giới thiệu về enzyme lipase 13

2.5.1 Enzyme esterase và lipase 13

2.5.2 Enzyme lipase 14

2.6 Phương pháp làm giàu DHA và EPA 23

2.6.1 Làm giàu DHA và EPA bằng các phương pháp vật lý và hoá học truyền thống 23

2.6.2 Làm giàu DHA và EPA bằng các phương pháp enzyme 26

3.2 Phương pháp nghiên cứu 32

3.2.1 Thu nhận dầu mỡ thô từ mỡ lá cá basa bằng phương pháp gia nhiệt 32

3.1.2 Xác định độ ẩm và hàm lượng chất bay hơi của dầu mỡ cá basa 32

3.1.3 Xác định nước hoạt tính (water activity - aw) của dầu mỡ cá basa 32

3.1.4 Xác định tỷ trọng của dầu mỡ cá basa 33

3.1.5 Xác định độ nhớt của dầu cá basa 33

3.1.6 Xác định trọng lượng phân tử trung bình của glyceride trong dầu mỡ cá basa 33

3.1.7 Xác định chỉ số acid của dầu mỡ cá basa 33

3.1.8 Xác định chỉ số xà phòng hóa của dầu mỡ cá basa 33

3.1.9 Xác định chỉ số ester của dầu mỡ cá basa 33

3.1.10 Xác định chỉ số peroxit của dầu mỡ cá basa 33

3.1.11 Xác định chỉ số iodcủa dầu mỡ cá basa 33

3.1.12 Xác định thành phần và hàm luợng acid béo trong dầu mỡ cá basa 33

3.1.13 Xác định hoạt tính enzyme lipase 34

3.2.14 Làm giàu DHA trong dầu mỡ cá basa bằng phương pháp thuỷ phân dầu cá, với xúc tác enzyme lipase 36

3.2.15 Phương pháp làm giàu DHA trong dầu thô cá basa bằng enzyme lipase kết hợp với chưng cất phân đoạn 39

Phần 4: Kết quả – thảo luận 42

4.1 Thu nhận dầu mỡ thô từ mỡ lá cá basa bằng phương pháp gia nhiệt 42

4.2 Xác định trọng lượng phân tử trung bình và một số chỉ tiêu vật lý và hóa sinh của dầu mỡ cá basa 43

4.2.1 Xác định trọng lượng phân tử trung bình của triglyceride và acid béo 43

4.4 Xác định thành phần và hàm lượng acid béo trong dầu mỡ cá basa 47

4.5 Làm giàu DHA bằng phương pháp thuỷ phân chọn lọc dầu cá basa, xúc tác bởi enzym lipase 51

4.5.1 Thủy phân triglyceride dầu cá basa, xúc tác bởi enzyme lipase từ nấm Rhizopus oryzae (ROL) với các nồng độ khác nhau 52

4.5.2 Làm giàu DHA bằng sự thủy phân dầu cá dùng enzyme lipase từ nấm Rhizopus oryzae với nồng độ enzyme cố định, thời gian thay đổi 54

4.6 Làm giàu DHA bằng phương pháp ethanol giải chọn lọc dầu cá basa, xúc tác bởi enzym lipase kết hợp với chưng cất phân đoạn 57

4.6.1 Thực hiện phản ứng ethanol giải chọn lọc bởi enzyme lipase 59

4.6.2 Tách chiết các ethyl ester khỏi hỗn hợp acylglycerol bằng phương pháp chưng cất phân đoạn 61

4.7 Đánh giá và so sánh hiệu quả của các quy trình làm giàu 67

4.8 Hiệu quả kinh tế của các quy trình làm giàu DHA và EPA trong dầu mỡ cá basa 68

Phần 5: Kết luận – đề nghị 72

5.1. Kết luận 72

5.2 Đề nghị 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

AA: Arachidonic acid

ALA: Alpha-linolenic acid

aw: Activity water (nước hoạt tính)

DHA: Docosahexaenoic acid

EPA: Ecosapentaenoic acid

FFA: Fatty acid

GC: Gas Chromatography (sắc ký khí)

LA: Linoleic acid

LC PUFAs: Long chain polyunsaturated fatty acids (các acid béo không bão hoà nhiều nối đôi mạch dài)

O: Oleic acid

P: Palmitic acid

PFL: Lipase từ Pseudomonas fluorescens

ROL: Lipase từ Rhizopus oryzae

PUFAs: Polyunsaturated fatty acids (các acid béo không bão hoà nhiều nối đôi) S: Stearic acid

Bảng 2.1 Thành phần acid béo (%) có trong dầu mỡ cá basa thô và tinh luyện 7

Bảng 2.2 Ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính lipase 18

Bảng 2.3 Tính đặc hiệu cơ chất của lipase 19

Bảng 2.4 Các phương pháp làm giàu DHA và EPA trong dầu cá 24

Bảng 4.1 Hiệu suất thu nhận các sản phẩm dầu mỡ từ mỡ cá basa ban đầu 42

Bảng 4.2 Trọng lượng trung bình của triglyceride và acid béo trong dầu cá basa 44

Bảng 4.3 Các chỉ tiêu vật lý của dầu mỡ cá basa 45

Bảng 4.4 Các chỉ số hóa sinh của dầu mỡ cá basa 47

Bảng 4.5 Thành phần và hàm lượng các acid béo trong dầu mỡ cá basa 48

Bảng 4.6 So sánh hàm lượng EPA và DHA trong dầu cá basa và một số dầu cá đã được thương mại khác 50

Bảng 4.7 Hàm lượng EPA, DHA và tổng acid béo không no, đa nối đôi trong các phân đoạn dầu mỡ cá basa 51

Bảng 4.8 Mức độ thủy phân dầu cá ở các nồng độ enzyme theo thời gian phản ứng khác nhau 52

Bảng 8.9 Giá trị HC50 theo thời gian phản ứng 53

Bảng 4.10 Phần trăm acylglycerol không thủy phân theo những khoảng thời gian phản ứng khác nhau, với nồng độ lipase cố định là 900 UI/ 2 g 55

Bảng 4.11 Mức độ làm giàu EPA và DHA trong phân đoạn acylglycerol dầu cá basa theo theo thời gian 56

Bảng 4.13 Mức độ làm giàu DHA và EPA bằng phương pháp ethanol giải

chọn lọc kết hợp với chưng cất short-path theo thời gian phản ứng 62 Bảng 4 14 Hiệu suất thu hồi DHA và EPA trong sản phẩm sau khi qua

chưng cất của phân đoạn phản ứng ethanol giải chon lọc 20 giờ 65 Bảng 4.15 So sánh hiệu quả của các quy trình làm giàu DHA và EPA 67 Bảng 4.16 Ước tính chi phí sản xuất 1kg sản phẩm dầu cá giàu DHA và

EPA theo phương pháp thủy phân bằng enzyme 69 Bảng 4.17 Ước tính chi phí sản xuất 1kg sản phẩm dầu cá giàu DHA theo

phương pháp ethanol giải kết hợp với chưng cất phân đoạn 70

Hình 2.1 Cá basa (Pangasius bocourti) 4

Hình 2.2 Giả thuyết về sự tác động của tia UV lên sự tạo thành DHA trong hệ sinh thái biển thông qua chuỗi thực phẩm 9

Hình 2.3 Cách đánh số vị trí không gian trong phân tử glyceride 14

Hình 2.4 Cấu trúc thông thường của một lipase 15

Hình 2.5 Vùng tiếp xúc của dạng mở và đóng 15

Hình 2.6 Phản ứng tổng quát ở mặt tiếp xúc của lipase với cơ chất 15

Hình 2.7 Cơ chế phản ứng của lipase 17

Hình 2.8 Các bước thuỷ phân triglyceridexúc tác bởi lipase 20

Hình 2.9 Phương pháp xác định tính đặc hiệu vị trí cuả enzyme lipase 21

Hình 2 10 Sơ đồ tổng quát các phương pháp làm giàu DHA và EPA trong dầu cá 28

Hình 3.1 Mỡ lá cá basa 30

Hình 3.2 Mỡ cá basa thô 30

Hình 3.3 ROL 31

Hình 3.4 PFL 31

Hình 3.5 Hệ chưng cất phân đoạn 31

Hình 3.6 Máy cô quay chân không 31

Hình 3.7 Máy đo hoạt tính nước Aqualab series 3TE 31

Hình 4.1 So sanh chỉ tiêu hàm ẩm và nước hoạt tính của các phần dầu mỡ cá basa 45

Hình 4.2 Sắc ký đồ các acid béo trong dầu mỡ cá basa 49

thuỷ giải 24 giờ bằng enzyme ROL 57 Hình 4.5 Sơ đồ quy trình làm giàu DHA và EPA bằng phương pháp

thuỷ phân chọn lọc dầu cá basa, với xúc tác enzyme lipase 59 Hình 4.6 Hàm lượng acid béo được giải phóng do phản ứng phụ theo

thời gian 60 Hình 4.7 Đồ thị hàm lượng EPA và DHA trong sản phẩm sau các thời

điểm phản ứng ethanol giải khác nhau 63 Hình 4.8 Thành phần acid béo trong phân đoạn acylglycerol của phản ứng

ethanol giải chọn lọc 20 giờ sau khi qua chưng cất short-path 64 Hình 4.9 Quy trình làm giàu DHA và EPA bằng phương pháp ethanol giải

chọn lọc kết hợp với chưng cất short-path 66

Docosahexaenoic acid (DHA) đóng vai trò rất quan trọng cho sự phát triển não bộ và võng mạc của trẻ em nói chung và đặc biệt của thai nhi trong ba tháng cuối và trẻ sơ sinh Trong những năm đầu, não bộ phát triển rất nhanh Đến hai tuổi não trẻ đạt 80% và sáu tuổi đạt 100% Cấu trúc não chứa khoảng 60% chất béo, chủ yếu là các acid béo không no chuỗi dài, trong đó DHA chiếm 40% Như vậy, DHA chiếm khoảng 24% bộ não (Alexandre Lapillonne et al., 2000; Maria Makkrides, 2002; Maurice E Stansby, 1990; Robert Katz et al., 2003) [48], Cơ thể trẻ em không thể tự tổng hợp được DHA mà phải hấp thụ DHA từ sữa mẹ và thực phẩm Vì vậy, cần phải đáp ứng đầy đủ DHA cho người mẹ mang thai và trẻ nhỏ dưới sáu tuổi Có thể cung cấp lượng DHA nói trên bằng cách bổ sung DHA vào sữa hoặc thức ăn cho trẻ nhỏ (các loại bột trẻ em, bánh kẹo, nước giải khát, …) hoặc làm thực phẩm chức năng ở dạng viên nang

Hiện nay, hầu hết các loại sữa trên thị trường đều có bổ sung các acid béo nhiều nối đôi mạch dài (PUFAs), đặc biệt là DHA Tuy nhiên, tất cả DHA đều có nguồn gốc ngoại nhập và hiện chưa thấy sản phẩm nào có hàm lượng DHA lớn hơn 25% bán trên thị trường Việt Nam (Võ Tấn Hậu và ctv, 2004)

Ở Việt Nam, mỡ cá basa (Pangasius bocourti) là một nguyên liệu tương đối nhiều (vùng Đồng bằng sông Cửu Long), rẻ tiền và chứa DHA, có thể sử dụng làm nguồn cung cấp bổ sung acid béo không bão hòa sau khi được làm giàu (Hoàng Đức Như và ctv, 1999; Võ Tấn Hậu và ctv, 2004)

Tận dụng nguồn nguyên liệu mỡ cá basa dồi dào và rẻ tiền để tạo các chế phẩm giàu DHA là một trong những mục tiêu cần hướng tới Cho đến nay, ở Việt Nam mới chỉ có một vài công trình nghiên cứu tận dụng mỡ cá basa để chế biến

thành dầu ăn chất lượng cao hay chế phẩm giàu DHA của PGS TS Hoàng Đức Như, ThS Võ Tấn Hậu và TS Lại Mai Hương Các tác giả đã thu được nhiều kết quả rất đáng quan tâm Tuy nhiên, đa phần các nghiên cứu trên sử dụng phương pháp vật lý và hoá học và vẫn còn một số hạn chế, như: Chế biến ở điều kiện khắc nghiệt dễ làm hỏng cấu trúc đa nối đôi dạng cis của DHA, hoặc sử dụng dung môi hữu cơ có thể gây độc cho người chế biến và sử dụng

Gần đây, một số tác giả trên thế giới đã sử dụng lipase để làm giàu DHA trong dầu cá, thay thế cho các phương pháp hoá học truyền thống Enzyme lipase vừa có khả năng xúc tác phản ứng thuỷ phân vừa có khả năng xúc tác phản ứng ester hoá (hoặc trao đổi nhóm ester) của dầu cá tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường phản ứng, cho phép tăng hàm lượng DHA trong dầu cá [38]

Để thực hiện mục tiêu tìm giải pháp sử dụng lipase nhằm làm giàu hàm lượng acid béo không no chứa nhiều nối đối trong dầu cá basa, chúng tôi tiến hành đề tài: “Khảo sát làm giàu docosahexaenoic aicd (DHA) trong dầu cá basa (Pangasius bocourti) thô bằng phương pháp enzyme và chưng cất phân đoạn” Đề tài gồm những nội dung chính sau:

Thu nhận và xử lý mỡ cá basa thành dầu cá

Xác định một số chỉ tiêu vật lý - hóa sinh của dầu mỡ cá

Xác định thành phần và hàm lượng các acid béo trong dầu mỡ cá basa trên sắc ký khí (GC) và sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS)

Khảo sát khả năng làm giàu DHA bằng phương pháp thuỷ phân chọn lọc dầu cá bởi enzyme thương phẩm từ nấm Rhizopus oryzae

Khảo sát khả năng làm giàu DHA trong dầu cá basa bằng phương pháp ethanol giải chọn lọc dầu cá bởi enzyme từ vi khuẩn Pseudomonas fluorescens, kết hợp với phương pháp chưng cất

Cải tiến quy trình làm giàu DHA

Đề tài được thực hiện tại Phòng Các chất hoạt tính sinh học, Viện Sinh học nhiệt đới và Phân viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên

2.1 Hiện trạng và xu hướng phát triển nghề nuôi cá basa ở nước ta

Cá basa phân bố ở một số nước Đông Nam Á như Campuchia, Thái Lan, Indonesia và Việt Nam, là loài cá nuôi có giá trị kinh tế cao Đồng bằng Nam bộ của Việt Nam đã có truyền thống nuôi cá tra và cá basa Cá tra nuôi phổ biến trong cả ao và bè, cá basa chủ yếu nuôi trong bè Những năm gần đây, việc nuôi các loài cá này phát triển mạnh, phục vụ nhu cầu tiêu thụ nội địa và xuất khẩu Đặc biệt, từ khi chúng ta hoàn toàn chủ động về sản xuất cá giống nhân tạo thì nghề nuôi càng ổn định và phát triển vượt bậc Nuôi cá thương phẩm thâm canh cho năng suất rất cao Cá tra và basa nuôi trong bè có thể đạt tới 100 – 300 kg/m3 Trong năm 2002, chỉ tính riêng 2 tỉnh An Giang và Đồng tháp, sản lượng cá tra và cá basa nuôi đã đạt 180.000 tấn Cá tra và basa đã trở thành đối tượng xuất khẩu với nhiều mặt hàng chế biến đa dạng, phong phú và được xuất sang hàng chục nước và vùng lãnh thổ Cá tra hiện đang có sản lượng xuất khẩu nhiều nhất trong các loài cá nước ngọt Cá basa có nhiều đặc điểm giống với cá tra nhưng thịt và mỡ có màu trắng nên có giá trị thương phẩm và xuất khẩu cao hơn cá tra [66]

2.2 Giới thiệu về cá basa

Là cá da trơn, đầu dẹp bằng,

Hình 2.1 Cá basa (Pangasius bocourti)

(ảnh Phạm Văn Khánh)

trán rộng, răng nhỏ mịn, râu mép dài tới hoặc quá gốc vây ngực, mắt to, bụng to, lá mỡ rất lớn, phần sau thân dẹp bên lưng và đầu có màu xanh xám, bụng có màu trắng bạc (hình 2.1) [67]

2.2.3 Phân bố

Cá basa sống ở nuớc ngọt, phân bố ở Miến Điện, Thái Lan, Indonesia, Campuchia và Đồng bằng sông Cửu Long (Việt Nam) Cáù basa khác với cá tra ở chỗ không có cơ quan hô hấp phụ và ngưỡng oxi cao hơn nên chịu đựng kém ở môi trường nước tù bẩn và nơi có hàm luợng oxi hòa tan thấp [7]

2.3 Mỡ cá basa

Ở bụng cá có buồng mỡ chiếm 25% trọng lượng cơ thể cá Trong mỡ có khoảng 50 acid béo gần giống như ở dầu thực vật, 75% là acid béo không no, hàm lượng cholesterol là 85 mg%, thấp hơn mỡ lợn tiêu chuẩn (120 mg%) và một số loài cá biển (100 mg%) Ngoài ra trong mỡ cá còn có vitamin A Có thể dùng mỡ cá basa ăn thay dầu mỡ hàng ngày [26]

Thịt phi-lê cá basa bán sang châu Âu là chính, mỗi tháng Việt Nam xuất khoảng 2.000 tấn, giá 3 USD/kg Mỡ cá xuất sang Trung Quốc, Hồng Kông, Đài Loan, Campuchia, khoảng 500 tấn mỗi tháng, giá 6.500 đồng/kg (được dùng thay dầu cọ làm thức ăn chăn nuôi thơm hơn, ngon hơn) [71]

Gần đây, mỡ cá basa còn được chế biến thành dầu diesel (biodiesel) ở Đồng bằng sông Cửu Long, với giá thành chỉ 6.500 đồng/lít [25]

Như vậy, mỡ cá basa là nguồn phụ phế liệu rất dồi dào ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long Việc tận dụng nguồn nguyên liệu này để chế biến thành dầu mỡ cá chất lượng cao, biodiesel, hoặc tạo sản phẩm được làm giàu các acid béo không

no nhiều nối đôi có giá trị dinh dưỡng, trị bệnh và giá trị kinh tế cao hơn là vấn đề cần được quan tâm nghiên cứu ở nước ta

2.4 Giới thiệu về DHA

2.4.1 Tình hình nghiên cứu về DHA trong nước và trên thế giới

2.4.1.1 Tình hình nghiên cứu cứu về DHA trên thế giới

Trên thế giới, phần lớn các công trình nghiên cứu đều tập trung vào việc nghiên cứu hàm lượng DHA trong thực phẩm [32, 34, ]; về việc phát hiện DHA trong một số loài tảo và tạo sản phẩm giàu DHA từ tảo [52]; về các tính chất, vai trò và chức năng của DHA trong sự phát triển não bộ ở trẻ em và trong việc chuyển hóa cholesterol thành những dẫn xuất không gây tắc nghẽn mạch máu, làm giảm loạn nhịp tim, giảm nhồi máu cơ tim, giảm chứng đau bụng kinh ở một số phụ nữ, giảm chứng tiền sản giật [31, 53, 54] Bên cạnh đó là những nghiên cứu về khả năng bổ sung DHA vào một số sản phẩm thực phẩm dùng cho người [48, 63, 69]; biến đổi cấu trúc lipid có chứa DHA [35, 60] Những nghiên cứu về việc làm giàu hoặc tinh sạch DHA chủ yếu trên các đối tượng như: Cá bẹ ở Hà Lan [45]; dầu cá sardine ở Brazil [51], dầu cá ngừ của Úc [47, 59],

2.4.1.2 Tình hình nghiên cứu về DHA trong nước

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu về cá basa có những công trình như: “Nghiên cứu nhu cầu dinh dưỡng và chế biến thức ăn nuôi cá basa (Pangasius bocourti)” của nhóm tác giả Nguyễn Thanh Phương và cộng tác viên, 1999 [15]; “Species composition and distribution of Pangasiidae family in the Mekong River Delta, South Vietnam” của Nguyễn Văn Thưởng và cộng tác viên [23] Còn việc nghiên cứu về DHA nói riêng còn khá khiêm tốn, đáng chú ý có công trình nghiên cứu của

PGS.TS Hoàng Đức Như và cộng tác viên (1999) - “Nghiên cứu hoàn thiện thiết bị sản xuất thực nghiệm chế biến mỡ cá basa thành dầu mỡ thực phẩm quy mô 50kg/ngày để ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và thức ăn giàu dinh dưỡng cho trẻ em”, và công trình: “Nghiên cứu công nghệ thích hợp để sản xuất Margarin có thành phần mỡ cá basa chất lượng cao” Trong những nghiên cứu này, nhóm tác giả đã phát hiện có DHA trong mỡ cá basa và đã nghiên cứu tạo những sản phẩm hữu ích từ mỡ cá basa [14]

Bảng 2.1 Thành phần (%) acid béo có trong dầu mỡ cá basa thô và tinh luyện

Trong mỡ sau tinh luyện (%)

thô (%) Phần lỏng (%) Phần đặc (%)

“Nghiên cứu công nghệ tách các acid béo không no từ mỡ cá basa và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm” – Phân viện Công nghệ thực phẩm tại

Tp HCM, 2004) [4]; công trình “Xác định quy trình thích hợp tách acid béo không

no từ nội tạng cá” đang được nghiên cứu của TS Lại Mai Hương, Trường ĐH Bách

Khoa Tp.HCM [6] Hầu hết các tác giả đều sử dụng các phương pháp vật lý và hoá học truyền thống nên vẫn còn một số hạn chế do bản chất của các phương pháp đó

Chưa có công trình nào công bố nghiên cứu làm giàu DHA trong mỡ cá basa

ở Việt Nam bằng phương pháp enzyme và chưng cất phân đoạn Đây là phương pháp tiến tiến đang được nghiên cứu và sử dụng trên thế giới Phương pháp làm giàu DHA bằng enzyme có nhiều ưu điểm vượt trội so với phương pháp hoá học và vật lý Thứ nhất, lipase có khả năng xúc tác mạnh, do đó chỉ cần một dùng lượng nhỏ enzyme, đặc biệt nếu dùng enzyme cố định thì có thể sử dụng lại nhiều lần Thứ hai, lipase có tính xúc tác chọn cao đối với nhiều loại acid béo, nhất là DHA và EPA Khả năng xúc tác “mềm dẻo” của enzyme trong các điều kiện phản ứng như pH, nhiệt độ, áp suất ôn hoà là một đặc điểm rất quan trọng trong quá trình xử lý các acid béo không no nhiều nối đôi có tính nhạy cảm cao Cấu trúc all-cis n-3 của DHA rất dễ bị phá huỷ do sự oxi hoá, iso hoá cis-trans, do sự di chuyển nối đôi hay polimer hoá Tiết kiệm năng lượng cũng là một lợi thế quan trọng khi áp dụng

ở quy mô công nghiệp Cuối cùng, là sự ester hoá bằng lipase không dùng dung môi nên giảm được một lượng lớn các công đoạn xử lý phức tạp, độc hại và tốn kém [34]

Gần đây, vào đầu tháng 7 năm 2006, tại Hội nghị Khoa học và Công nghệ gắn với thực tiễn lần thứ 2 của các đơn vị thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam khu vực phía Bắc, nhóm tác giả Đặng Diễm Hồng và cộng tác viên, Viện Công nghệ sinh học đã báo cáo công trình “Labyrinthula – Vi tảo biển mới giàu acid béo không bão hoà DHA từ các vùng biển phía Bắc Việt Nam” Nhóm tác giả đã tuyển chọn được 3 chủng thuộc loài Labyrinthula có hàm lượng DHA cao, đã mở

ra một triển vọng mới về nguồn thu nhận DHA hàm lượng cao ở Việt Nam [5]

Hình 2.2 Giả thuyết về sự tác động của tia

UV lên sự tạo thành DHA trong hệ sinh thái biển thông qua chuỗi thực phẩm

2.4.2 DHA (docosahexaenoic acid)

2.4.2.1 Tên gọi của DHA

DHA: Docosahexaenoic Acid là acid béo thuộc nhóm omega–3 poliunsaturated fatty acid (ω-3, n-3 PUFA) [54]

2.4.2.2 Cấu tạo của DHA

DHA là một acid béo thuộc nhóm acid béo omega-3 (gồm có: DHA, EPA, ALA) Nhóm acid béo này có điểm chung là nối đôi đầu tiên nằm sau carbon thứ 3 (so với đầu gắn nhóm -CH3) DHA có 22 nguyên tử carbon và 6 nối đôi; EPA có 20 nguyên tử carbon và 5 nối đôi; ALA có 18 nguyên tử carbon và 3 nối đôi Mỗi acid béo này có chức năng sinh học nhất định [54]

Công thức cấu tạo của DHA:

2.4.2.3 Sự tạo thành DHA và các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp DHA ở vi tảo

Sự tạo thành DHA trong hệ

sinh thái biển chủ yếu tập trung trong

các loài phiêu sinh thực vật

(phytoplankton) và rất ít trong vi

khuẩn Sự tạo thành DHA trong phiêu

sinh thực vật bị ảnh hưởng bởi nhiệt

độ của nước và điều kiện ánh sáng,

đáng chú ý là tác động bất lợi của

khoảng bước sóng 280-320nm Wang

và Chai đã chứng minh sự tạo DHA và EPA trong tảo Isochrysis galbana và

Prorocentrum micans giảm đến 50% và 20% tương ứng sau 5-6 ngày chiếu tia UV trong điều kiện phòng thí nghiệm [52]

Động vật chân chèo (copepod) và các phiêu sinh động vật (zooplankton) đều phụ thuộc vào các phiêu sinh thực vật đối với nguồn cung cấp DHA Sự tăng chiếu xạ tia UV lên bề mặt đại dương có thể gây ảnh hưởng xấu đến hệ sinh thái biển thông qua chuỗi thực phẩm

Một số vi khuẩn ở biển tạo DHA và một vài acid béo khác sống cộng sinh trong ruột cá đại dương, nhờ đó giúp tạo đủ lượng DHA cần thiết cho vật chủ Do nhu cầu DHA là một yếu tố giới hạn đối với sự tăng trưởng và tồn tại của nhiều loài cá biển nên các vi khuẩn ký sinh trong ruột cá là rất có lợi Thậm chí, khi sự tạo DHA của tảo biển giảm do nhiều nguyên nhân, như thời gian chiếu xạ tia UV tăng chẳng hạn, thì các loài cá này vẫn có đủ lượng DHA dự trữ [52]

2.4.3 Vai trò của DHA

DHA là acid béo không no nhiều nối đôi mạch dài, thuộc nhóm PUFAs omega-3, do đó nó mang đầy đủ đặc điểm và chức năng sinh lý của nhóm PUFAs omega-3

Ngoài ra, DHA còn có một số vai trò đặc trưng khác Nó là thành phần quan trọng cấu thành màng phospholipid của tế bào người, đặc biệt ở não và võng mạc DHA cần thiết cho sự phát triển tối ưu của thần kinh và độ tinh nhanh của thị giác Trong sữa mẹ rất giàu DHA và omega-3 DHA tìm thấy trong tự nhiên ở dạng triacylglycerol (TAG) [32]

2.4.3.1 DHA là thực phẩm não (“brain food”)

Chất béo chiếm 60% bộ não và hệ thống dây thần kinh chạy khắp cơ thể Phần lớn vật chất của não là chất béo vì hoạt động của bộ não phụ thuộc nhiều vào chức năng của màng lipid So với các mô khác trong cơ thể thì não chứa hàm lượng DHA và acid arachidonic (ARA) cao hơn nhiều DHA tập trung đặc biệt ở màng có chức năng hoạt động, đó là màng synapse và màng thị giác Hình dạng và kích thước của nó giúp các neuron trao đổi các chất truyền tin Nếu não không có đủ DHA, thì nó sẽ dùng EPA để thay thế Tuy nhiên EPA không thích hợp bằng DHA, có thể làm quá trình truyền thông tin giữa các neuron tại các synapse bị sai lạc Sự tổng hợp DHA trong cơ thể giảm theo độ tuổi, lượng DHA trong màng tế bào não giảm ở người lớn tuổi [31]

Sự cung cấp DHA phụ thuộc rất nhiều vào khẩu phần ăn của người mẹ mang thai 3 tháng cuối và ở trẻ 3 tháng đầu sau khi sinh Vì trong giai đoạn này các synapse được tạo thành rất nhanh và nhu cầu của trẻ về DHA vượt quá khả năng tổng hợp DHA của cơ thể Do đó, nhu cầu DHA của cơ thể trẻ em hấp thu từ nhau thai của người mẹ là rất lớn

Sau khi sinh, trẻ được cung cấp DHA từ người mẹ Sự phát triển trí não của trẻ cần một lượng lớn acid béo omega-3 và omega-6 trong sữa mẹ Sữa mẹ chứa khoảng 12% linoleic acid; 0,5% alpha-linolenic acid; 0,6% acid arachidonic acid và 0,3% DHA Một nghiên cứu cho thấy trẻ em 8 tuổi được bú sữa mẹ khi còn nhỏ có chỉ số IQ là 8,3 cao hơn so với trẻ em không được bú sữa mẹ [32]

2.4.3.2 DHA với chức năng miễn dịch

Dầu cá đã được sử dụng để kháng viêm có hiệu quả trong bệnh viêm khớp Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng tác dụng kháng viêm của DHA (chứ không

phải EPA) có tác dụng ngăn ngừa bệnh tim mạch Một thí nghiệm trên những người tình nguyện cho thấy dầu cá cô đặc có tác dụng làm giảm ít nhất 1/3 lần lượng tế bào bạch cầu đơn nhân, sản sinh trong trong quá trình viêm

Sự kháng viêm có liên quan mật thiết với hệ thống miễn dịch nhờ tác động của dầu cá ức chế hệ thống miễn dịch trong suốt giai đoạn viêm sưng Các hợp chất peroxide của dầu cá ức chế sự tăng sinh tế bào lympho, nhưng khi bổ sung một lượng α-tocopherol (vitamine E) thích hợp vào dầu cá, thì sự tăng sinh tế bào lympho vẫn không giảm đi Kết quả này cho thấy vitamin E hiện diện trong dầu cá có thể dùng để ức chế miễn dịch có hiệu quả

Sự ức chế miễn dịch của dầu cá không phải lúc nào cũng có hiệu quả nhờ việc oxy hóa Tuy nhiên, các acid béo có trong màng tế bào luôn ảnh hưởng đến hệ thống truyền tin thứ hai (hệ tín hiệu phân tử bên trong tế bào) có thể dẫn đến thay đổi biểu hiện của gen Nghiên cứu tác dụng riêng của EPA và DHA cho thấy EPA có tác động khử hoạt tính tế bào giết tự nhiên và khử phản ứng miễn dịch tế bào trung gian, còn DHA không có khả năng này Điều này cho thấy khả năng ức chế miễn dịch của dầu cá có lẽ là do EPA, chứ không phải là DHA [31]

2.4.3.3 Vai trò của DHA đối với mắt

Võng mạc là phần nhạy cảm với ánh sáng của mắt Nó là một lớp gồm nhiều loại tế bào Giống như các neuron, các tế bào của lớp võng mạc được bảo vệ bởi lớp đôi lipid (chủ yếu là các phospholipid) Trong đó, các acid béo của phospholipid không no, mà điển hình là DHA Do vậy, việc nhận đủ lượng DHA trong suốt những năm đầu của cuộc sống – khi não bộ, mắt, và hệ thống thần kinh phát triển

mạnh – là điều hết sức quan trọng Thậm chí, ngay cả trong giai đoạn trưởng thành,

cơ thể cũng cần đủ lượng DHA để bảo vệ và thay thế các tế bào võng mạc [31] 2.4.4 Nguồn nguyên liệu chứa DHA

Nguồn nguyên liệu chứa DHA phong phú nhất là thực phẩm từ biển, bao gồm: tảo biển, cá biển và đặc biệt là dầu các loài cá ở vùng biển lạnh Nhìn chung, dầu cá biển chứa hàm lượng omega-3 cao Nguồn chứa DHA phổ biến là cá hồi, cá mòi, và cá ngừ Thịt và trứng cũng có một lượng nhỏ DHA, nhưng nguồn thực phẩm chứa DHA tốt cho sức khoẻ là thực phẩm từ biển Mỗi tuần cơ thể người trung bình có nhu cầu khoảng từ 56,70 – 113,40 g cá giàu acid béo omega-3, đặc biệt là DHA 2.5 Giới thiệu về enzyme lipase

Enzyme lipase có tầm quan trọng về mặt sinh lý học trong việc phân hủy và hình thành lipid ở sinh vật Lipase được tạo thành chủ yếu ở tuyến tụy, trong khi những esterase khác được tạo thành trong gan Các enzyme này được tìm thấy trong máu, mô cơ và sữa Lipase từ sữa đặc biệt quan trọng trong sự hình thành các chất thơm trong sản phẩm sữa và bơ Lipase hiện diện nhiều ở tế bào thực vật và hạt, như Rhicinus, ngũ cốc và đậu; chúng cũng được tạo bởi nấm mốc, nấm men, và vi khuẩn Vào những năm 1960 chế phẩm lipase dùng trong y học chỉ giới hạn ở việc làm các chất hỗ trợ tiêu hóa Ngày nay, với kỹ thuật mới, những ứng dụng này đã được mở rộng một cách đáng kể Sự phát triển các phương pháp mới sử dụng lipase đã thúc đẩy việc thu nhận và tinh sạch enzyme này Ngoài ra, lipase kiềm còn được dùng trong các chất tẩy rửa [29]

2.5.1 Enzyme esterase và lipase

Nhóm enzyme esterase bao gồm nhiều loại Các enzyme này được phân loại theo bản chất của phản ứng xúc tác và cơ chất Nhìn chung, esterase (EC 3.1.1.3) phân cắt các acid carboxylic từ các ester theo công thức:

R–CO–O–R1 RCOOH + R1–OH Đối với nhóm enzyme lớn này, thuật ngữ ali-esterase vẫn thường được dùng Các carboxylic ester đơn, đặc biệt là những ester của acid acetic, cũng được phân cắt bởi enzyme protease Các enzyme trypsin, chymotrypsin, và papain thể hiện hoạt tính esterase tương đối không đặc hiệu Enzyme pectinesterase cũng thuộc nhóm này Bên cạnh các esterase chung này, nhiều enzyme esterase có tính xúc tác đặc hiệu đã được sử dụng trong thương mại Ví dụ, phospholipase được dùng phân cắt đặc hiệu lecithin Lipase được mô tả là enzyme thủy phân các ester trong hệ không tan hay dị thể [44]

2.5.2 Enzyme lipase

2.5.2.1 Danh pháp

Các glyceride là triester của glycerol với 2 nhóm ester sơ cấp và 1 nhóm ester thứ cấp Hai nhóm ester sơ cấp có thể phân biệt theo vị trí các nguyên tử C trong không gian Các nguyên tử C của glycerol được đánh số 1, 2, 3 từ trên xuống [44]

2.5.2.2 Đặc điểm cấu tạo và cấu trúc không gian của enzyme lipase

Cấu trúc chung của lipase gồm một phiến β ở giữa với nhóm serine hoạt động nằm trong một vòng (loop) gọi là cùi chỏ xúc tác (catalytic elbow) Trên serine là một khe kỵ nước (hydrophobic cleft) được hình thành sau sự hoạt hoá enzyme Khe ưa nước là một túi được kéo dài

(elongated pocket) tuỳ theo cơ chất gắn khít vào

2.5.2.3 Cơ chế tác động của enzyme lipase

Hình 2.6 Phản ứng tổng quát ở mặt tiếp xúc của lipase với cơ chất

Hình 2.4 Cấu trúc thông thường của một

lipase Phiến β màu xanh, được bao quanh

bởi các xoắn α màu vàng, nhóm serine hoạt

động là các thanh màu đỏ và vùng nắp

xoắn (helica lid) của enzyme có màu đỏ

Hình 2.5 Vùng tiếp xúc của lipase dạng mở và đóng Nhóm kỵ nước màu trắng, nhóm ưa nước màu vàng, các nhóm mang điện tích dương màu xanh và các nhóm mang điện tích âm màu đỏ

Sự hoạt hoá enzyme lipase thường xảy ra ở mặt tiếp giữa enzyme và cơ chất

ở dạng hạt nhũ (miccelar substrates), do dịch chuyển một hoặc nhiều nắp (lid) của enzyme Sự tác động này tương đối khác nhau tuỳ loại cơ chất [29]

Hình 2.6 mô tả cơ chế tác động của lipase theo Jaeger et al (1999) [46] Trong đó, phản ứng 1 mô tả quá trình chuyển từ dạng enzyme hoà tan sang dạng enzyme hoạt hoá kết hợp cơ chất Quá trình này bao gồm các giai đoạn: (1) kết gắn, (2) định hướng, (3) hoạt hoá và cuối cùng (4) gắn cơ chất vào vị trí hoạt hoá Phần còn lại (phản ứng 2) là phản ứng xúc tác giữa enzyme và cơ chất phù hợp, tạo

ra dạng trung gian (Ea*S), Gồm hai bước:

Acyl hoá Ea*S Ea*Ac+P1 và đề acyl hoá Ea*Ac Ea*+P2

(Ea*: adsorbed and activated enzyme – enzyme hoạt hoá kết bám)

Cơ chế phân tử của phản ứng xúc tác bởi lipase được mô tả ở hình 2.7

Hình 2.7 Cơ chế phản ứng của lipase

1) Sự kết gắn lipid, hoạt hoá nhóm serine ưa nhân bởi histidine lân cận và O-Ser tấn công ưa nhân vào nguyên tố C-carbonyl của cơ chất

2) Dạng tetrahydral chuyển tiếp hình thành, với nguyên tử O được ổn định bởi hai nhóm NH-peptid Histidin phóng thích một proton đến phần alcohol của cơ chất 3) Dạng trung gian đồng trị (“acyl enzyme”) được hình thành, trong đó thành phần acid của cơ chất được ester hoá với serine của enzyme Phân tử nước thu vào được hoạt hóa nhờ histidine bên cạnh và ion hydroxyl tấn công ưa nhân nguyên tử

C của dạng đồng trị đó

4) Histidine giải phóng 1 proton đến nguyên tử O của gốc serine hoạt hoá, liên kết ester giữa serine và acyl bị bẻ gãy giải phóng gốc acyl

2.5.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme lipase

Sự thủy phân lipid tùy thuộc vào các yếu tố khác nhau như pH, nhiệt độ, hàm lượng nước, diện tích bề mặt tiếp xúc của enzyme với cơ chất Các lipase từ vi sinh vật hoạt động trong phạm vi từ pH 5,5-8,5 và lipase từ sữa là pH 4,1-6,5

Bảng 2.2 Ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính lipase

Ion kim loại Hoạt tính còn lại (%)

Colipase, một protein có trọng lượng phân tử 10 000 Daltons cần thiết cho sự phân hủy lipid trong đường ruột của động vật có xương sống Ngoài ra, lipase này còn có khả năng trung hòa sự ức chế của acid mật đối với sự phân cắt lipid Lipase tụy tạng có ái lực với mặt phân cách giữa nước – dầu và có tốc độ thủy phân cao Hoạt tính của lipase còn tùy thuộc rất nhiều vào bề mặt lớp nhũ tương dầu – nước [50]

2.5.2.5 Cơ chất của enzyme lipase

Dầu và mỡ động thực vật là những cơ chất thích hợp của enzyme lipase Tuy nhiên, đối với các loại cơ chất khác nhau, thì hoạt tính của enzyme cũng thể hiện không giống nhau [50]

Bảng 2.3 Tính đặc hiệu cơ chất của lipase

Cơ chất Hoạt tính tương đối (%)

2.5.2.6 Tính đặc hiệu của enzyme lipase

Lipase không cắt đặc hiệu

Lipase không đặc hiệu vị trí cắt các triglyceride thành các acid béo tự do và các dẫn xuất 1,2- hoặc 2,3-diglyceride Bước (1) xảy ra rất nhanh, trong khi đó bước thứ (2), phân hủy thành 2-monoglyceride và bước thứ (3), phân hủy thành glycerol và acid béo tự do, xảy ra chậm hơn

Các dẫn xuất 1,2- hoặc 2,3-diglyceride và 2-monoglyceride không ổn định về mặt hóa học, chúng chuyển thành 1,3-diglyceride hoặc 1-monoglyceride tương

ứng thông qua sự chuyển acyl nội phân tử Đại diện quan trọng nhất là lipase từ nấm Candida cylindracea và Humicola lanuginosa phân cắt được 95% dầu đậu nành và dầu olive ở các điều kiện công nghệ thích hợp [44]

Hình 2.8 Các bước thuỷ phân triglyceridexúc tác bởi lipase

Lipase thể hiện hoạt tính ở biên giới giữa hai pha: Cơ chất và sản phẩm của phản ứng xúc tác phân bố trong pha dung môi hữu cơ kỵ nước, còn enzyme lại ở trong pha nước Do vậy, bản thân phản ứng do lipase xúc tác có tính thuận nghịch

Hàm lượng nước trong hệ thống xúc tác quyết định hướng của phản ứng về phía thuỷ phân hay về phía chuyển nhóm ester Khi lipase xúc tác phản ứng chuyển nhóm ester thì tính đặc hiệu của enzyme đối với cơ chất đóng vai trò quyết định [25]

Lipase cắt đặc hiệu

Một số enzyme lipase không có tính đặc hiệu, còn lại đa số lipase có tính đặc hiệu: Đặc hiệu vị trí và đặc hiệu acid béo

Đặc hiệu vị trí hay đặc hiệu vùng (sn-1,3)

Tính đặc hiệu này có thể được xác định qua quá trình transester hóa triolein (OOO) với palmitic acid (P), xúc tác bởi enzyme lipase Sự tạo thành tripalmitin (PPP) cho thấy enzyme không có tính đặc hiệu vị trí và sự không tạo tripalmitin mà chỉ tạo 1,3-dipalmitin 2-olein chứng tỏ enzyme có tính đặc hiệu vị trí -1,3 [44]

Hình 2.9 Phương pháp xác định tính đặc hiệu vị trí cuả enzyme lipase

Enzyme lipase đặc hiệu vị trí 1,3

Lipase không đặc hiệu vị trí 1,3

Lipase đặc hiệu vị trí 1,3

Enzyme lipase từ tụy tạng thường thủy phân hoàn toàn một số triglyceride

Do vậy, có thể xem nó là lipase không đặc hiệu vị trí Tính đặc hiệu vị trí 1,3 xuất hiện khá phổ biến ở enzyme lipase vi sinh vật, như lipase từ nấm A niger, từ nấm

R delemar, từ nấm Mucor và vi khuẩn Pseudomonas sp khác Theo những khảo sát của Slotboom et al., 1970, các enzyme lipase từ vi sinh vật, đặc biệt từ nấm R arrhizus thể hiện tính đặc hiệu vị trí 1, 3 [44]

Enzyme đặc hiệu vị trí chỉ cắt các liên kết ester ở vị trí acylglycerol 1 và 3 Trong trường hợp này, triacylglycerol sau khi bị thuỷ giải bởi enzyme sẽ tạo ra 1,2- hoặc 2,3-diacylglycerol và 2-monoacylglycerrol Các sản phẩm này, đặc biệt là 2-monoacylglycerrol không bền, dễ dàng bị isomer hoá để tạo ra 1,3-diacylglycerol và 1(3)-monoacylglycerrol Nếu xử lý tiếp hỗn hợp trên bằng lipase có hoạt tính đặc hiệu vị trí 1,3 thì sẽ thuỷ giải hoàn toàn triglyceride tạo ra glycerine Tuy nhiên, enzyme lipase cắt đặc hiệu vị trí 1,3 chỉ xúc tác sự trao đổi các gốc acid béo

vị trí 1 và 3 trong phân tử triacylglycerol và như vậy, các sản phẩm nhận được sẽ khác với các sản phẩm cắt bằng hoá học Khả năng tạo hỗn hợp triacylglycerol mới

do tính đặc hiệu của enzyme lipase nói trên đã được ứng dụng trong thực tế Người

ta sử dụng lipase từ nấm Rh niveus để xúc tác quá trình đổi gốc các acid béo của dầu cọ Triglyceride dầu cọ chứa palmitic acid ở vị trí số 1 và 3, còn vị trí số 2 là oleic acid Sau khi thuỷ giải liên kết ester ở vị trí 1 và 3, vị trí palmitic acid trong triglyceride của dầu cọ được thay bằng stearic acid, tạo ra sản phẩm mới gần giống dầu cacao có giá trị kinh tế cao hơn [25]

Đặc hiệu acid béo

Thông thường để khảo sát tính đặc hiệu với acid béo người ta dùng các alkyl ester của acid béo làm cơ chất Tuy nhiên, tốc độ phản ứng rất chậm nếu dùng

triglyceride làm cơ chất, do một số triglyceride chứa các gốc acid béo chuỗi ngắn hoặc trung bình ở dạng lỏng, trong khi các triglyceride chứa các gốc acid béo chuỗi dài hơn lại ở dạng rắn Enzyme lipase từ Geotrichum candidum thể hiện tính đặc hiệu đối với các acid béo rất đáng lưu ý Enzyme này ưu tiên giải phóng các acid béo chuỗi dài với một liên kết đôi cis ở vị trí 9 Do đó, các methylester của oleic acid, linoleic acid và linolenic acid được thủy phân khá nhanh chóng Trong khi đó, ester của các acid béo bão hòa như palmitic acid, stearic acid,… bị thủy phân rất chậm Các triglyceride-triolein (cis-d9-18:1) trilinolin (cis-d9,12-18:2) và trilinolen (cis-d9,12,15-18:3) được phân cắt khá nhanh chóng Trong khi, tributyrin, trimyristin (14:0) và tristrearin (18:0) được thủy phân chậm hơn nhiều [44]

Ngoài tính đặc hiệu đối với độ dài chuỗi acid béo, một số lipase còn thể hiện tính đặc hiệu đối với vị trí nối đôi đầu tiên so vơi nhóm carboxyl trong chuỗi acid béo Ví dụ, lipase từ Candida cylindracea không thể hiện hoặc thể hiện hoạt tính rất kém đối với DHA (C22:6, ∆5), trong khi thể hiện hoạt tính rất cao đối với EPA (C20:5, ∆5) [51]

2.6 Phương pháp làm giàu DHA

2.6.1 Làm giàu DHA bằng các phương pháp vật lý và hoá học truyền thống

Do thành phần phức tạp của dầu cá nên việc thu được DHA có độ tinh sạch cao là rất khó Thông thường các kỹ thuật tinh sạch được dùng kết hợp, tuỳ thuộc vào thành phần acid béo của dầu cá ban đầu và độ tinh sạch cần thu được trong sản phẩm cuối

Nhiều phương pháp đã được sử dụng để làm giàu hoặc tách chiết DHA và EPA trong dầu cá (bảng 2.4) Các phương pháp này được tổng kết bởi Breivik và

cộng sự (1992, 1997) Sử dụng lipase để làm giàu DHA và EPA trong dầu cá là một hướng rất có triển vọng Các enzyme lipase có thể làm giàu DHA và EPA trong dầu cá tới lên 50-75% [34]

Đông lạnh (winterization) là một phương làm lạnh đơn giản, được sử dụng để tách phần lớn các triacylglycerol bão hoà ra khỏi phần dầu còn lại Phương pháp này có thể làm giàu PUFA lên 30% Phương pháp này chỉ thích hợp đối với dầu có hàm lượng các acid béo không bão hoà một nối đôi (20:1 và 22:1) ở mức trung bình (dầu gan cá tuyết) hoặc thấp (dầu cá cơm, cá sardine và cá pilchard) và không thích hợp đối với dầu cá hẹ (herring) và cá ốt vảy nhỏ (capelin) có hàm lượng acid béo không bão hoà một nối đôi rất cao [34]

Bảng 2.4 Các phương pháp làm giàu DHA và EPA trong dầu cá

Triacylglycerol

Acid béo tự do hay monoester

Kết tinh hay phân đoạn ngược dòng 50%

Tách DHA và EPA ở dạng acid béo tự do hay monoester

(*): Mức độ làm giàu trong bảng có tính tương đối, so với nguyên liệu ban đầu chứa khoảng 20-30% (EPA + DHA)

Phương pháp tinh thể hoá triacylglycerol trong dung môi hữu cơ như acetone với sự hỗ trợ của nước có tính phân cực cao ở nhiệt độ thấp để đóng băng triacylglycerol bão hoà và loại chúng ra khỏi dầu cá không có tính thực tiễn do sự phức tạp của các triacylglycerol dầu cá

Tính chất không bền của PUFA ester với nhiệt độ là một hạn chế của phương pháp chưng cất truyền thống Tuy nhiên, chưng cất phân đoạn có thể dễ dàng làm giàu đến 50% mà không phá huỷ đáng kể cấu trúc của các PUFA

Phương pháp chiết lưu bằng carbon dioxide siêu lỏng tới hạn (W Eisenbach, 1984) có thể được dùng để phân tách các acid béo n-3 Việc phân tách phụ thuộc chủ yếu vào kích thước phân tử của acid béo Do đó, cần có một bước làm giàu trước đó để thu được sản phẩm cuối có độ tinh sạch cao Sự chiết bằng dòng carbon siêu lỏng sau bước tạo phức của các ethyl ester dầu cá menhaden cho phép làm giàu DHA và EPA đến hơn 90%

Tạo phức với urea (D Swern, 1988) là một kỹ thuật rất hữu dụng cho phép làm giàu PUFA lên đến 70-80% với hiệu suất thu hồi cao Các tinh thể urea lục giác với nhiều hốc, bắt giữ những monoester hay các acid béo bão hoà và không bão hoà một nối đôi Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là sử dụng một lượng lớn dung môi, hoá chất và tạo ra nhiều sản phẩm trung gian Kỹ thuật này đã được đưa vào qui mô sản xuất kết hợp với phương pháp chưng cất phân đoạn Từ 30 tấn ethyl ester dầu cá (28% tổng EPA + DHA) được chưng cất phân tử qua hai bước để thu được 10 tấn sản phẩm chứa khoảng 50% EPA + DHA Kết tủa với 16 tấn urea để thu được 19 tấn phức hợp urea và 3.14 tấn sản phẩm làm giàu chứa 84% EPA + DHA Hiệu suất thu nhận sau chưng cất là 57% và sau tạo phức urea là 31% Sản phẩm này đã được thương mại hoá bởi hãng Pronova Biocare ở Norway và

được phân phối trên nhiều quốc gia như là một dược phẩm phòng ngừa các bệnh tim mạch [34]

Kỹ thuật sắc ký cuốn chiếu (moving-bed chromatography) gần đây đã trở thành công cụ hữu ích để tách chiết DHA và EPA Kỹ thuật này có hiệu suất cao và dùng ít dung môi hơn so với kỹ thuật HPLC thông thường Bằng cách sử dụng một gradient áp suất với dòng carbon siêu lỏng tới hạn làm chất rửa giải, cho phép đạt hiệu suất cao Corey đã phát triển một phương pháp dựa trên phản ứng iodolactonization để phân tách DHA và EPA khỏi dầu cá dựa trên đặc điểm liên kết đôi đầu tiên trong DHA (∆4) gần với nhóm carboxyl hơn trong EPA (∆5) (Corey, 1987) Tuy nhiên, giá thành sản phẩm thu được quá cao

Một cách thức khác có thể thu nhận dễ dàng DHA gần như tinh khiết là dựa vào một số chủng vi sinh vật có thể tạo triacylglycerol chứa rất ít hoặc chỉ một loại PUFA duy nhất Ví dụ, vi tảo Crypthecodenium cohnii, một loại trùng roi (dinoflagelatte) không có khả năng quang dưỡng, tổng hợp một lượng lớn dầu (đến 40%) chỉ chứa DHA như là PUFA duy nhất Loại dầu này đã được thương mại hoá như một dạng DHA bổ sung vào thực phẩm cho trẻ sơ sinh [34]

Trong số các phương pháp làm giàu DHA và EPA, phương pháp sử dụng lipase là rất có triển vọng

2.6.2 Làm giàu DHA và EPA bằng phương pháp enzyme

Bản chất của phương pháp làm giàu DHA và EPA trong dầu cá bằng lipase dựa trên đặc điểm chọn lọc acid béo và sự phân biệt của lipase đối với các PUFA n-3 có nối đôi gần nhóm carboxyl Về phương diện này, lipase có thể được chia làm

3 nhóm:

Nhóm 1: Không có hoạt tính hoặc thể hiện hoạt tính rất thấp đối với dầu cá,

Hai loại lipase từ Pseudomonas đã được thương mại có khả năng làm giàu DHA và EPA tới 50% với hiệu suất thu hồi cao (80-90%), chỉ sử dụng một lượng ethanol vừa đủ Một ưu điểm vượt trội của việc sử dụng lipase là giảm được đáng kể các công đoạn xử lý do không sử dụng dung môi hữu cơ trong phương pháp này, ethylester tạo ra được tách trực tiếp bằng kỹ thuật chưng cất phân đoạn, ra khỏi hỗn hợp DHA và EPA còn lại [38]

Geotrichum candidum lipase cũng được sử dụng để làm giàu đồng thời DHA và EPA trong dầu cá ngừ lên tới 50%, với hiệu suất thu hồi tương đương với sử dụng lipase từ Pseudomonas [57, 58]

Nhóm lipase thứ ba thể hiện khả năng phân biệt tốt giữa DHA và EPA, thiên về EPA gồm lipase từ Candida rugosa (trước đây có tên là Candida cylindracea), Rhizopus delema và lipase từ nấm mốc Rhizopus miehei [59] Sự thuỷ giải dầu cá ngừ sử dụng lipase từ Candida rugosa tạo ra hỗn hợp acylglycerol giàu DHA (đến

50%) Các acid béo tự do còn lại chứa đến 73% DHA với một hiệu suất thu hồi cao (84%) và không dùng dung môi Bước tinh sạch kế tiếp cũng là một phản ứng ester hoá thu được sản phẩm chứa 90% DHA, hiệu suất thu nhận là 71% so với tổng DHA ban đầu [40] Haraldsson và Kristinsson (1998) cũng thu được sản phẩm với mức làm giàu DHA tương tự từ dầu cá ngừ bằng phản ứng ester hoá với ethanol, không có mặt dung môi, sử dụng lipase Rhizopus miehei cố định [38]

Hình 2.10 Sơ đồ tổng quát các phương pháp làm giàu DHA và EPA trong dầu cá

Triacylglycerol dầu cá (20-30% EPA+DHA)

Ethyl ester hoặc acid béo (20-30% EPA+DHA)

Ethyl ester hoặc acid béo (50% EPA+DHA)

Ethyl ester hoặc acid béo (80-85% EPA+DHA)