Nghiên cứu khảo sát đột biến gen flt3 npm1 cebpa và kit trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi dna

Trong các đột biến gen thì đột biến cKIT làm cho bệnh nhân BN có t8;21 thuộc nhóm tiên lượng tốt trở thành nhóm tiên lượng trung bình, và các đột biến gen FLT3, NPM1 và CEBPA ảnh hưởng

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ Y TẾ

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC

BÁO CÁO NGHIỆM THU

KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN FLT3, NPM1, CEBPA VÀ cKIT

TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU CẤP DÒNG TỦY

BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA

CHỦ NHIỆM: TS.BS PHAN THỊ XINH ĐỒNG CHỦ NHIỆM: BS LÊ THANH CHANG

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 03/ 2016

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ Y TẾ

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC

HỌC

BÁO CÁO NGHIỆM THU

KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN FLT3, NPM1, CEBPA VÀ cKIT

TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU CẤP DÒNG TỦY

BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

TS.BS PHAN THỊ XINH BS LÊ THANH CHANG

CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ

(Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận)

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 03/ 2016

MỤC LỤC

Trang

TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU I SUMMARY OF RESEARCH CONTENT II DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT IV DANH MỤC CÁC BẢNG V DANH MỤC CÁC HÌNH VI BẢNG QUYẾT TOÁN KINH PHÍ VII PHẦN MỞ ĐẦU IX

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy 2

1.1.1 Định nghĩa 2

1.1.2 Phân loại 2

1.1.3 Các yếu tố nguy cơ gây bệnh BCCDT 4

1.1.4 Đặc điểm lâm sàng của BCCDT 5

1.1.5 Chẩn đoán BCCDT 6

1.1.6 Điều trị BCCDT không phải BCCDT-M3 6

1.1.6.1 Giai đoạn tấn công 7

1.1.6.2 Giai đoạn điều trị sau tấn công hay sau khi lui bệnh 7

1.2 Sinh bệnh học phân tử của bạch cầu cấp dòng tủy 8

CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2.1 Cỡ mẫu 20

2.2.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu: 20

2.2.3 Tiêu chuẩn loại trừ 21

2.3 Các phương pháp và kỹ thuật chính sau đây sẽ được sử dụng trong quá trình thực hiện đề tài 21

2.4 Tóm tắt sơ đồ các bước nghiên cứu 22

2.5 Phân tích số liệu 22 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 23 3.1 Nội dung 1: Thu thập bệnh phẩm là tủy xương của BN BCCDT mới được chẩn đoán 23 3.2 Nội dung 2: Nuôi cấy và thu hoạch tế bào tủy xương, phân tích NST đồ để chọn mẫu nghiên cứu phù hợp 23 3.3 Nội dung 3: Thực hiện tách chiết RNA từ tủy xương và tổng hợp cDNA 27 3.4 Nội dung 4: Thiết kế các đoạn mồi (primer) phù hợp cho phản ứng PCR để

khuếch đại chuyên biệt các đoạn gen cần khảo sát và chuẩn hóa điều kiện PCR, đảm bảo khuếch đại chuyên biệt các vùng gen cần khảo sát, kiểm chứng kết quả PCR bằng điện di trên thạch 27 3.5 Nội dung 5: Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự DNA các sản phẩm PCR theo 2 chiều xuôi và ngược bằng máy ABI PRISM 3130 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) 36

3.6 Nội dung 6: Phân tích, đối chiếu kết quả giải trình tự chuỗi DNA bằng NCBI Blast server để chẩn đoán tình trạng đột biến và tổng hợp kết quả nghiên cứu 37 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

I

TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) là thể bệnh ác tính của tế bào gốc dòng tủy, đặc trưng bởi tăng sinh và tích tụ các tế bào non trong tủy xương gây suy giảm 3 dòng tế bào máu bình thường Bệnh sẽ diễn tiến đến tử vong với bệnh cảnh xuất huyết hoặc nhiễm trùng nếu không được điều trị Các nghiên cứu đa trung tâm trên thế giới đã chứng minh rằng các bất thường nhiễm sắc thể (NST) và gen có ảnh hưởng độc lập đến tiên lượng bệnh và chia BCCDT thành 3 nhóm tiên lượng tốt, trung bình và xấu Trong các đột biến

gen thì đột biến cKIT làm cho bệnh nhân (BN) có t(8;21) thuộc nhóm tiên lượng tốt trở thành nhóm tiên lượng trung bình, và các đột biến gen FLT3, NPM1 và CEBPA ảnh

hưởng đến tiên lượng của các BN có NST đồ bình thường Nghiên cứu này được tiến

hành để khảo sát các đột biến gen FLT3, NPM1, CEBPA trên BN BCCDT có NST đồ bình thường và đột biến cKIT trên BN BCCDT có t(8;21) tại Bệnh viện Truyền máu

Huyết học, giúp lựa chọn hướng điều trị phù hợp là hóa trị liệu đơn thuần hoặc kết hợp với ghép tủy nhằm tăng tỉ lệ lui bệnh và kéo dài thời gian sống cho BN

Trong thời gian từ tháng 07/2012 đến tháng 12/2015, quy trình giải trình tự chuỗi

DNA để chẩn đoán các đột biến FLT3, NPM1, CEBPA và cKIT đã được thiết lập Kết

quả khảo sát trên 102 BN BCCDT có NST đồ bình thường, gồm 52 bệnh nhân nam, đã

phát hiện 29 BN có đột biến của FLT3-ITD (28,4%), 5 BN có đột biến FLT3-TKD (4,9%); 31 BN có đột biến NPM1 (30,4%), trong đó 15 BN (14,7%) có kèm theo đột biến

FLT3 Trong 102 BN, có 52 BN không phát hiện đột biến FLT3 và/hoặc NPM1 được

khảo sát đột biến CEBPA cho thấy có 26 (25,5%) BN mang 1, 2, 3 kiểu đột biến lần lượt

là 9, 15, 2 BN Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khảo sát đột biến cKIT trên 46 BN

mang t(8;21), cho thấy có 11 BN (23,9%) phát hiện được đột biến trên exon 8, 9 và 17

BN BCCDT có NST đồ bình thường mang đột biến FLT3-ITD và BN BCCDT có t(8;21) mang đột biến cKIT sẽ có tiên lượng xấu cần điều trị phối hợp hóa trị liệu và ghép tủy

Việc khảo sát đột biến gen trong BCCDT giúp phân nhóm tiên lượng sâu hơn nhằm lựa chọn hướng điều trị phù hợp Kết quả của nghiên cứu này cho thấy cần áp dụng phác đồ hóa trị liệu mạnh phối hợp với ghép tủy trong khoảng 27% trường hợp có đột

biến FLT3-ITD (29 BN) và đột biến cKIT (11 BN) của 2 nhóm BN BCCDT có NST đồ

bình thường và có t(8;21)

II

SUMMARY OF RESEARCH CONTENT

Acute myeloid leukemia (AML) is a malignancy of myeloid stem cells, characterized by proliferation and accumulation of immature cells in the bone marrow and reduction of healthy white blood cells, red blood cells, and platelets If not treated, this disease can be fatal from hemorrhage or infection Multicenter studies in the world demonstrated that genetic and chromosomal abnormalities are independent prognostic factors, which can divide AML patients into three distinguished groups: better-prognosis group, intermediate-prognosis group, and worse-prognosis group Among genetic

alterations, cKIT mutations replace patients with a t(8;21) from better-prognosis group into intermediate-prognosis group; while mutations of FLT3, NPM1, and CEBPA have an

effect on prognosis of patients with a normal karyotype We conducted this study to

investigate the mutational status of FLT3, NPM1, and CEBPA from AML patients with a normal karyotype and cKIT mutational status from AML patients with a t(8;21) at the Blood Transfusion and Hematology Hospital in order to select a suitable therapeutic regimen between chemotherapy alone or chemotherapy in combination with bone marrow transplantation with the hope to increase the remission rate and prolong survival time

From July 2012 to December 2015, a DNA sequencing procedure for determination of mutational status of FLT3, NPM1, CEBPA, and cKIT was established

We investigated 102 AML patients with a normal karyotype, including 52 men, and

found that 29 patients were positive for FLT3-ITD mutations (28.4%), 5 patients were

positive for FLT3-TKD (4.9%), and 31 patients carried NMP1 mutations (30.4%), of which 15 patients ((14,7%) also had FLT3 mutations Among 102 patients, 52 without mutations of FLT3 or NPM1 were further investigated the CEBPA mutational status

CEBPA mutations were detected in 26 patients (25,5%), including 1, 2, and 3 types of

mutations in 9, 15, and 2 patients, respectively In this study, we also investigated cKIT

mutational status from 46 AML patients with a t(8;21) and found that 11 patients (23,9%)

had mutations in exons 8, 9, and 17 AML patients with a normal karyotype and ITD mutations as well as patients with a t(8;21) and cKIT mutations belong to the worse-

patients, including 29 patients with FLT3-ITD and a normal karyotype and 11 patients

with cKIT mutations and a t(8;21)

IV

KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AML1 Acute myeloid leukemia 1

ATRA All trans retinoic acid

BCCDT Bạch cầu cấp dòng tủy

CBFB Core binding factor beta

CD Cluster of differentiation

cDNA Complementary DNA

CEBPA CCAAT/enhancer-binding protein alpha

BV.TMHH Bệnh viện Truyền máu Huyết học

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

ETO Eight-Twenty-One

FISH Fluorescent in situ hybridization

FLT3 Fms-like tyrosine kinase 3

ITD Internal tandem duplication

MLL Mixed-lineage leukemia

NCCN National Comprehensive Cancer Network

NPM1 Nucleophosmin

NST Nhiễm sắc thể

PCR Polymerase chain reaction

PHA-LCM Phytohemagglutinin-lymphocyte-conditioned medium

PML Promyelocytic leukaemia

PTD Partial tandem duplication

RARA Retinoic acid receptor alpha

RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction

TAD Transactivating domain

TKD Tyrosine kinase domain

V

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Phân loại bạch cầu cấp dòng tủy theo FAB 2

Bảng 1.2: Phân loại BCCDT dựa vào dấu ấn miễn dịch 4

Bảng 1.3: Phân nhóm nguy cơ dựa vào những bất thường nhiễm sắc thể (NST) 9

Bảng 1.4: Phân nhóm nguy cơ dựa vào đột biến gen trong nhóm NST đồ bình thường

10

Bảng 1.5: Phân nhóm nguy cơ dựa vào bất thường NST và gen 18

Bảng 3.1: Các bất thường NST phân chia theo nhóm tiên lượng 24

Bảng 3.2: Trình tự các mồi sử dụng khảo sát gen FLT3, NPM1, CEBPA và cKIT 33

Bảng 3.3: Kết quả đột biến gen FLT3-ITD 37

Bảng 3.4: Kết quả đột biến gen FLT3-TKD 39

Bảng 3.5: Kết quả đột biến gen CEBPA 40

Bảng 3.6: Kết quả đột biến CEBPA sau tạo dòng trong T-vector 42

Bảng 3.6: Kết quả BN BCCDT được điều trị phác đồ A7D3 43

Bảng 3.6: Kết quả đột biến gen cKIT 44

VI

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1: Cấu trúc gen FLT3 11

Hình 1.2: Cấu trúc gen và các sản phẩm phiên mã của gen NPM1 13

Hình 1.3: Cấu trúc protein NPM1 14

Hình 1.4: Cấu trúc protein của CEBPA 15

Hình 1.5: Cấu trúc gen cKIT 17

Hình 3.1: Kết quả nhiễm sắc thể 1 25

Hình 3.2: Kết quả nhiễm sắc thể 2 26

Hình 3.3: Kết quả nhiễm sắc thể 3 26

Hình 3.4: Kết quả kiểm tra chất lượng cDNA sử dụng gen giữ nhà ABL 27

Hình 3.5: Kết quả alignment của 3 trình tự chuỗi từ exon 13 đến exon 22 của gen FLT3 28

Hình 3.6: Kết quả alignment của 3 trình tự chuỗi vị trí mồi FLT3-F 28

Hình 3.7: Kết quả alignment của 3 trình tự chuỗi vị trí mồi FLT3-R 29

Hình 3.8: Kết quả alignment của 3 trình tự chuỗi của gen NPM1 29

Hình 3.9: Kết quả alignment của 3 trình tự chuỗi vị trí mồi cNPM1-25F 30

Hình 3.10: Kết quả alignment của 3 trình tự chuỗi vị trí mồi cNPM1-771F 30

Hình 3.11: Kết quả alignment của 3 trình tự chuỗi vị trí mồi cNPM1-1112R 30

Hình 3.12: Kết quả alignment của 5 trình tự chuỗi của gen CEBPA 31

Hình 3.13: Kết quả alignment của 3 trình tự chuỗi vị trí mồi CEBPA-F1 31

Hình 3.14: Kết quả alignment của 3 trình tự chuỗi vị trí mồi CEBPA-R2 32

Hình 3.15: Kết quả alignment của 5 trình tự chuỗi của gen cKIT 32

Hình 3.16: Vị trí mồi và sản phẩm khuếch đại gen FLT3 34

Hình 3.17: Vị trí mồi và sản phẩm khuếch đại gen NPM1 34

Hình 3.18: Vị trí mồi và sản phẩm khuếch đại gen CEBPA 35

Hình 3.19: Vị trí mồi và sản phẩm khuếch đại gen CEBPA từ cặp mồi F2-R2 35

Hình 3.20: Vị trí mồi và sản phẩm khuếch đại gen cKIT 36

VII

BẢNG QUYẾT TOÁN KINH PHÍ ĐỢT 1

Đề tài: Khảo sát đột biến gen FLT3, NPM1, CEBPA và cKIT trên bệnh nhân bạch cầu

cấp dòng tủy bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA

Chủ nhiệm đề tài: TS BS Phan Thị Xinh và

BS Lê Thanh Chang

Cơ quan thực hiện: Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học

Thời gian đăng ký: 2013 – 2015

Tổng kinh phí được duyê ̣t: 870.000.000đ

Kinh phí cấp giai đoạn 1: 500.000.000đ theo thông báo số 62/TB-SKHCN ngày 07

II Kinh phí quyết toán trong năm 500.000 500.000

2 Công thuê khoán (dịch tài liệu) 179.000 179.000

3 Nguyên, nhiên vật liệu, dụng cụ, VPP 263.947 263.947

5 Xét duyệt, giám định, nghiệm thu 5.800 5.800

VIII

BẢNG QUYẾT TOÁN KINH PHÍ GIAI ĐOẠN 2

Kinh phí đã cấp đợt 2: 300 triệu đồng theo Thông báo số 09/TB-SKHCN ngày 02 tháng 04

II Kinh phí quyết toán trong năm 300.000 300.000

2 Công thuê khoán (dịch tài liệu) 52.677 52.677

3 Nguyên, nhiên vật liệu, dụng cụ, VPP 240.053 240.053

5 Xét duyệt, giám định, nghiệm thu 7.270 7.270

IX

PHẦN MỞ ĐẦU

1 Tên đề tài/dự án: Khảo sát đột biến gen FLT3, NPM1, CEBPA và cKIT trên bệnh nhân

bạch cầu cấp dòng tủy bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA

Chủ nhiệm đề tài/dự án: TS.BS Phan Thị Xinh và BS Lê Thanh Chang

Cơ quan chủ trì: Bệnh Viện Truyền Máu Huyết Học

Thời gian thực hiện: tháng 7/2013 – 7/2015

Kinh phí được duyệt: 870 triệu đồng

Kinh phí đã cấp đợt 1: 500 triệu đồng theo Thông báo số 62/TB-SKHCN ngày 07

tháng 06 năm 2013

Kinh phí đã cấp đợt 2: 300 triệu đồng theo Thông báo số 09/TB-SKHCN ngày 02

tháng 04 năm 2015

2 Mục tiêu: Xác định tỉ lệ và đặc điểm đột biến gen FLT3, NPM1, CEBPA và cKIT trên

bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy

3 Nội dung thực hiện và sản phẩm của đề tài:

1 Thu thập bệnh phẩm là tủy xương của BN BCCDT

mới được chẩn đoán (250 mẫu tủy xương)

318 mẫu tủy xương, cấy NST thành công là 299 mẫu

2 Nuôi cấy và thu hoạch tế bào tủy xương, phân tích

NST đồ để chọn mẫu nghiên cứu phù hợp [nhóm có

NST đồ bình thường (100 mẫu), và nhóm mang

t(8;21) (45 mẫu)]

Kết quả NST đồ để chọn ra nhóm có NST đồ bình thường (102 mẫu), và nhóm mang t(8;21) (46 mẫu)

3 Thực hiện tách chiết RNA từ tủy xương và tổng hợp

cDNA (145 mẫu cDNA)

148 mẫu cDNA

4 Thiết kế các đoạn mồi (primer) phù hợp cho phản

ứng PCR để khuếch đại chuyên biệt các đoạn gen

cần khảo sát và chuẩn hóa điều kiện PCR, đảm bảo

khuếch đại chuyên biệt các vùng gen cần khảo sát,

kiểm chứng kết quả PCR bằng điện di trên thạch

agarose (100 mẫu đối với FLT3, NPM1, CEBPA và

45 mẫu đối với cKIT)

Sản phẩm khuếch đại

-FLT3: exon 14 đến exon 20 -NPM1: exon 9 đến exon 12 -CEBPA: vùng mã hóa

protein

-cKIT: exon 8 đến exon 17 (102 mẫu đối với FLT3 và

X

NPM1, 52 mẫu đối với

CEBPA và 46 mẫu đối với cKIT)

5 Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự DNA các

sản phẩm PCR theo 2 chiều xuôi và ngược bằng

máy ABI PRISM 3130 (PE Applied Biosystems,

Foster City, CA) (145 mẫu)

Dữ liệu thô về trình tự chuỗi DNA của các gen của 148 mẫu

6 Phân tích, đối chiếu kết quả giải trình tự chuỗi DNA

bằng NCBI Blast server để chẩn đoán tình trạng đột

biến và tổng hợp kết quả nghiên cứu (145 mẫu)

Kết quả các kiểu đột biến

FLT3, NPM1, CEBPA và cKIT của 148 mẫu

7 Lưu đồ và quy trình xác định đột biến gen trong

BCCDT

Hoàn chỉnh từ khâu ly trích RNA, tổng hợp cDNA, PCR, giải trình tự DNA và phân tích đột biến

8 Đào tạo học viên cao học (01 học viên) 01 học viên đã tốt nghiệp

cao học chuyên ngành Huyết học

9 Viết bài báo khoa học 02 bài báo khoa học đăng

trong tạp chí Y học TP.HCM

10 Viết báo cáo chuyên đề 03 báo cáo chuyên đề

11 Viết báo cáo giám định và giám định đề tài Báo cáo được hội đồng giám

định thông qua

12 Nghiệm thu đề tài cấp cơ sở Báo cáo được Hội đồng

nghiệm thu cơ sở thông qua

13 Nghiệm thu đề tài cấp thành phố Báo cáo được Hội đồng

nghiệm thu cấp thành phố thông qua

[Type text]

- 1 -

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) là một bệnh lý ác tính về máu, đặc trưng bởi

sự tăng sinh quá mức tế bào và không biệt hóa làm tích tụ tế bào non trong máu và trong tủy xương Dựa vào các bất thường nhiễm sắc thể (NST) và gen, bệnh được chia thành 3 nhóm tiên lượng gồm tốt, trung bình và xấu, trong đó nhóm tiên lượng xấu chiếm khoảng 1/3 trường hợp Các bất thường NST và gen đã đã được nhiều nghiên cứu trên thế chứng minh là yếu tố tiên lượng độc lập, quyết định tình trạng đáp ứng với hóa trị liệu và vấn đề tái phát của bệnh nhân Các bệnh nhân (BN) có bất thường NST và gen thuộc nhóm tiên lượng xấu thì phải ghép tủy mới cải thiện được tiên lượng

Trong tháng 10/2012 bệnh viện Truyền máu Huyết học (BV.TMHH) thành phố Hồ Chí Minh đã tổ chức lễ kỷ niệm 10 thành lập ngân hàng tế bào gốc, đó là nơi cung cấp nguồn tế bào gốc phục vụ cho việc ghép tủy xương điều trị bệnh lý máu ác tính Phương pháp ghép tủy xương đã được áp dụng từ năm 1995 và đến nay đã phát triển mạnh tại BV.TMHH, nên việc chẩn đoán các đột biến gen sẽ giúp các bác sĩ lựa chọn ra nhóm BN thuộc nhóm tiên lượng xấu để tư vấn hướng ghép tủy, nhằm cải thiện tiên lượng của nhóm

BN này Chẩn đoán đột biến của các gen FLT3, NPM1, CEBPA và cKIT là một nhu cầu

hết sức cấp thiết, giúp phân nhóm tiên lượng chính xác để các bác sĩ lâm sàng huyết học lựa chọn phương pháp điều trị thích hợp nhằm làm tăng tỷ lệ lui bệnh, kéo dài thời gian sống toàn bộ và tiết kiệm chi phí điều trị Ngoài ra, việc thiếu những chẩn đoán phân tử trong bệnh BCCDT cũng đang hạn chế khả năng tham gia vào các chương trình thử nghiệm lâm sàng đa trung tâm toàn cầu, nhằm tìm ra phác đồ phối hợp thuốc điều trị hiệu

quả cho BN tại Việt Nam Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “khảo sát đột biến gen FLT3,

NPM1, CEBPA và KIT trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy bằng kỹ thuật giải trình tự

chuỗi DNA" với các mục tiêu sau:

(1) Khảo sát đột biến gen FLT3, NPM1, CEBPA trên nhóm BN có nhiễm sắc đồ bình

thường bằng giải trình tự DNA từ mẫu tủy xương

(2) Khảo sát đột biến gen cKIT trên nhóm BN có t(8;21) bằng giải trình tự DNA từ

mẫu tủy xương

(3) Xác định tỉ lệ và mô tả các kiểu đột biến FLT3, NPM1, CEBPA và cKIT trên BN

BCCDT

- 2 -

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy

1.1.1 Định nghĩa

BCCDT là bệnh lý ác tính đơn dòng của mô tạo máu được đặc trưng bởi sự tích tụ

tế bào non bất thường, chủ yếu trong tủy xương và sự giảm sản xuất của tế bào máu bình thường Do đó, sự thâm nhiễm của tế bào bạch cầu trong tủy xương hầu như luôn kèm theo thiếu máu và giảm tiểu cầu Số lượng bạch cầu hạt có thể thấp hay bình thường tùy vào số bạch cầu tổng

1.1.2 Phân loại

Phân loại BCCDT có thể dựa vào hình thái tế bào có nhuộm hóa tế bào hay phân

loại dựa vào dấu ấn miễn dịch

Phân loại theo hình thái tế bào: Vào những năm 1970, nhóm nghiên cứu hợp tác

Pháp - Mỹ - Anh (French - American - British: FAB) chia BCCDT ra nhiều nhóm dựa vào hướng biệt hóa và mức độ biệt hóa của tế bào Các chi tiết hình thái tế bào được tóm

bào đơn nhân)

Phân loại theo dấu ấn miễn dịch: Một số lớn kháng nguyên màng tế bào bạch cầu đã

được xác định bằng kháng thể đơn dòng và kỹ thuật miễn dịch dòng chảy tế bào Các kháng nguyên và kháng thể này được phân nhóm theo “nhóm biệt hóa” (CD - cluster of differentiation) kèm theo một con số thứ tự Một số kháng nguyên thường phát hiện trên một dòng nhất định và trên một giai đoạn biệt hóa nhất định, do đó có thể phân loại và đánh giá

M4 BCCDT hỗn hợp

(tế bào đơn nhân

và nguyên tủy bào)

20

Nhiều thể Auer, tế bào tủy hỗn hợp (≥ 20% tế bào non và tiền tủy bào) và ≥ 20% tế bào đơn nhân

Hiếm gặp Khó chẩn đoán hình thái, xơ tủy

- 4 -

mức độ biệt hóa của tế bào BCCDT phân loại theo miễn dịch tế bào có thể được phân chia dựa vào các CD theo Bảng 1.2

Bảng 1.2: Phân loại BCCDT dựa vào dấu ấn miễn dịch

Nguồn: Liesveld JL, Williams Hematology 2010 1.1.3 Các yếu tố nguy cơ gây bệnh BCCDT

Nguyên nhân gây bệnh BCCDT chưa được biết rõ và cơ chế sinh lý bệnh phức tạp Di truyền và những đột biến gây ra do môi trường như tia xạ, thuốc và những độc tố khác đóng vai trò quan trọng trong việc làm gia tăng BCCDT Các yếu tố nguy cơ được biết đến của BCCDT bao gồm:

Các yếu tố môi trường

 Benzen và các dẫn xuất của nó, ethylene oxit và thuốc diệt cỏ

 Bức xạ ion hóa

Các yếu tố rối loạn di truyền

 Hội chứng Down

 Hội chứng Bloom

Nguyên tủy bào CD11b, CD13, CD15, CD33, CD117, HLA-DR

Tế bào đơn

nhân CD11b, 11c, CD13, CD14, CD33, CD65, HLA-DR

Mẫu tiểu cầu CD34, CD41, CD42, CD61, anti-von Willebrand

factor Bạch cầu ưa

kiềm CD11b, CD13, CD33, CD123, CD203c

Tế bào mỡ CD13, CD33, CD117

- 5 -

 Thiếu máu Fanconi

 Hội chứng Kostmann

 Hội chứng Klinefelter

 Các rối loạn huyết học sẵn có

 Loạn sinh tủy

 Hội chứng tăng sinh tủy

 Tiểu huyết sắc tố kịch phát về đêm

 Đã được điều trị trước đó với: tác nhân alkyl hóa, ức chế topoisomerase II,

xạ trị đơn độc hay kèm theo hóa trị

1.1.4 Đặc điểm lâm sàng của BCCDT

Có nhiều triệu chứng và biến chứng đe dọa tính mạng BN ngay thời điểm chẩn đoán do suy giảm khả năng tạo máu bởi sự xâm lấn của các tế bào bạch cầu vào tủy xương cũng như rối loạn chức năng và suy giảm của các cơ quan do thâm nhiễm tế bào bạch cầu

Các triệu chứng gồm:

Suy tủy xương

 Thiếu máu: mệt, thở nhanh, hồi hộp, ngất

 Nhiễm trùng: thường gặp ở phổi, miệng, hậu môn, da Sốt, ớn lạnh, vã mồ hôi

 Xuất huyết: chấm xuất huyết, bầm da, chảy máu răng và đường tiêu hóa

Tổn thương xâm lấn mô

 Đau xương

 Lách to nhẹ

 Tăng sinh nướu

 Xâm lấn thần kinh trung ương và tổn thương dây thần kinh ngoại biên

 Thay đổi thị giác (do xuất huyết võng mạc, phù gai thị)

Tắc nghẽn vi mạch do tăng bạch cầu

 Tắc mạch não

 Tắc mạch phổi

 Tắc mạch dương vật

Tế bào non dòng tủy thường hiện diện ở máu ngoại vi và luôn hiện diện ở tủy của

BN BCCDT Để chẩn đoán BCCDT cần dựa vào:

Chẩn đoán lâm sàng: thăm khám BN, dựa vào các triệu chứng lâm sàng như hạch

to, gan, lách to ra… để xác định bệnh

Các xét nghiệm cận lâm sàng

- Huyết đồ:

 Thiếu máu, hồng cầu lưới giảm

 Giảm tiểu cầu gần như luôn xảy ra lúc chẩn đoán Hơn một nửa trường hợp

có số lượng tiểu cầu dưới 50 x 109/L lúc chẩn đoán

 Bạch cầu tổng dưới 5 x 109/L và neutrophil dưới 1 x 109/L trong một nửa trường hợp lúc chẩn đoán

 Tế bào non luôn hiện diện ở máu ngoại vi nhưng cũng có thể không thấy do bạch cầu thấp

- Tủy đồ - hình thái học: Tủy đồ luôn chứa các tế bào non, để chẩn đoán BCCDT

đòi hỏi phải có ít nhất 20% tế bào non

- Xét nghiệm dấu ấn miễn dịch: Khi kết quả tủy đồ - hình thái học không thể xác định rõ ràng tế bào thuộc dòng tủy hay dòng lympho thì việc chẩn đoán xác định bệnh được khẳng định bằng những dấu ấn bề mặt chuyên biệt của tế bào dòng tủy

- Xét nghiệm di truyền tế bào - di truyền phân tử: Sử dụng các kỹ thuật như NST

đồ, FISH để phát hiện các bất thường NST trong BCCDT giúp phân nhóm tiên lượng trong điều trị bệnh RT-PCR với độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn giúp phát hiện sự thay

đổi cấu trúc của các gen liên quan như PML-RARA, CBFB-MYH11, AML1-ETO và

MLL-AF9

1.1.6 Điều trị BCCDT không phải BCCDT-M3

Điều trị BCCDT chia làm 2 giai đoạn: giai đoạn tấn công và giai đoạn điều trị sau lui bệnh

- 7 -

1.1.6.1 Giai đoạn tấn công

Mục tiêu điều trị của giai đoạn này là đưa bệnh vào lui bệnh bằng cách tiêu diệt những tế bào bệnh bạch cầu ở trong máu và tủy xương Phác đồ chuẩn điều trị tấn công BCCDT hiện tại là phác đồ A7D3 với 7 ngày Cytarabin truyền tĩnh mạch liên tục (100 - 200 mg/m2/ngày) và 3 ngày Anthracyclin Tỷ lệ lui bệnh đạt được là 60 - 70% với phác đồ chuẩn này Những trường hợp không đạt lui bệnh sau một phác đồ A7D3 có thể điều trị tiếp với một đợt A7D3 lần 2 hay với phác đồ A7D3E5 (bổ sung thêm 5 ngày Etoposide) Trong một thử nghiệm ngẫu nhiên được thực hiện bởi nhóm nghiên cứu về bạch cầu của Úc ALSG (Australian Leukemia Study Group), người ta nhận thấy bổ sung vào phác đồ A7D3 chuẩn với Etoposide liều 75 mg/m2/ngày (A7D3E5) không làm cải thiện tỷ lệ lui bệnh hoàn toàn và thời gian sống toàn bộ song lại ghi nhận có độc tính nhiều hơn Với 2 đợt điều trị tấn công bằng phác đồ tiêu chuẩn tỷ lệ lui bệnh hy vọng đạt được là 30% [6]

Cytarabin liều cao có hiệu quả chống tế bào ung thư tùy thuộc vào liều lượng và cách dùng Cytarabin có hiệu quả với cả liều chuẩn và liều cao Cytarabin liều cao (3 g/m2 mỗi 12 giờ với 4 đến 12 liều) thường kết hợp với anthracycline, mitoxantrone, hoặc etoposide sẽ đặc biệt hiệu quả như điều trị tăng cường hoặc như điều trị tái phát Cytarabin liều cao có thể qua hàng rào máu não và giúp phòng ngừa xâm lấn thần kinh trung ương, nhưng độc não có thể xảy ra đặc biệt trên BN từ 50 tuổi Tuy nhiên, một nghiên cứu ngẫu nhiên được thực hiện bởi nhóm nghiên cứu về bạch cầu của Úc ALSG (Australian Leukemia Study Group) cho thấy tỉ lệ lui bệnh ở BN BCCDT không khác nhau giữa nhóm dùng liều chuẩn và nhóm dùng liều cao cytarabin

1.1.6.2 Giai đoạn điều trị sau tấn công hay sau khi lui bệnh

Sau giai đoạn điều trị tấn công, khi BN đã vào lui bệnh hoàn toàn song thật ra vẫn còn mang tế bào ác tính Vì vậy cần phải điều trị nhằm mục đích tiêu diệt bớt khối tế bào ác tính còn lại sau giai đoạn điều trị tấn công để kéo dài thời gian lui bệnh và phòng ngừa tái phát Một đặc điểm của BCCDT là tỷ lệ tái phát cao và có khoảng 40% những BN đạt lui bệnh hoàn toàn sẽ tái phát trong vòng 2 năm Đối với những BN tái phát, một số nghiên cứu cho thấy những BN có thời gian lui bệnh ban đầu hơn 18 tháng hay từ 6 - 18 tháng có thời gian sống toàn bộ dài hơn so với nhóm có thời gian lui bệnh < 6 tháng [38]

Phác đồ điều trị sau lui bệnh 3 giai đoạn tăng cường với các tiêu chuẩn sau:

Tiêu chuẩn

- 8 -

- Đạt lui bệnh hoàn toàn sau điều trị tấn công

- ANC > 1,5 x 109/L; số lượng tiểu cầu > 100 x 109/L

- Siêu âm tim EF > 50%; ECG không có rối loạn dẫn truyền

Điều trị tăng cường 1:

- Cytarabine 1500 mg/m2/12 giờ pha trong dd G5% hoặc NaCl 0.9% TTM 2 giờ x 4 ngày liên tiếp N1-N4

- Daunorubicine 45 mg/m2/ngày (hoặc Mitoxantrone 12 mg/m2/ngày) pha 50ml dd G5% hoặc NaCl 0.9% TTM 30 phút x 3 ngày liên tiếp N1-N3

Điều trị tăng cường 2:

- Bắt đầu sau giai đoạn phục hồi suy tủy

- ANC > 1,5 x 109/L; số lượng tiểu cầu > 100 x 109/L

- Đánh giá lại tủy đồ nếu vẫn còn giai đoạn CR

- Cytarabine 2000 mg/m2/12 giờ pha trong dd G5% hoặc NaCl 0.9% TTM 2 giờ x 4 ngày liên tiếp N1-N4

- Etoposide 100/m2/ngày pha 200 ml dd G5% hoặc NaCl 0.9% TTM 2 giờ x 4 ngày liên tiếp N1-N4

Điều trị tăng cường 3:

- Bắt đầu sau giai đoạn phục hồi suy tủy

- ANC > 1,5 x 109/L; số lượng tiểu cầu > 100 x 109/L

- Đánh giá lại tủy đồ nếu vẫn còn giai đoạn CR

- Lặp lại tăng cường 1 hoặc

- Cytarabine 3000 mg/m2/12 giờ pha trong dd G5% hoặc NaCl 0.9% TTM 3 giờ x 3 ngày liên tiếp N1, N3, N5

1.2 Sinh bệnh học phân tử của bạch cầu cấp dòng tủy

Bệnh BCCDT là bệnh gặp ở mọi lứa tuổi nhưng thường gặp nhất ở người lớn BCCDT chiếm 35% trong tất cả các dạng bệnh ung thư máu và là thể bệnh không đồng nhất như theo phân loại của FAB thì có đến 8 thể bệnh BCCDT khác nhau được xếp từ M0 đến M7 theo hình thái học Tiên lượng của các thể bệnh BCCDT rất khác nhau, đòi hỏi các phương pháp điều trị phải dựa theo tuổi, phân loại hình thái học và bất thường về di truyền tế bào

- 9 -

Trong khoảng 10 năm trở lại đây, bất thường về di truyền tế bào phát hiện lúc chẩn đoán đã được coi là yếu tố tiên lượng độc lập trong phân nhóm tiên lượng BCCDT, giúp lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp Dựa vào những bất thường di truyền tế bào, BCCDT được chia thành 3 nhóm gồm tiên lượng tốt, tiên lượng trung bình và tiên lượng xấu (Bảng 1.3)

Bảng 1.3: Phân nhóm nguy cơ dựa vào những bất thường nhiễm sắc thể (NST)

Tiên

lượng

xấu

inv(3)(q21q26)/t(3;3)(q21;q26), -5, -7, del(5q) t(6;9)(p23;q34), t(6;11)(q27;q23), t(11;19)(q23;p13.1) Bất thường NST phức tạp (≥3)

(Nguồn: American Society of Hematology 2006)

Những bất thường NST của 3 nhóm tiên lượng trên gặp trong khoảng 55% BCCDT mới chẩn đoán, trong đó có khoảng 10% - 20% BN có bất thường NST phức tạp Cả 2 nghiên cứu của United Kingdom Medical Research Council (MRC) [21] và Cancer and Leukemia Group B (CALGB) [7] đều kết luận rằng nếu cùng điều trị theo phác đồ chuẩn thì tỷ lệ lui bệnh, tỷ lệ tái phát và thời gian sống toàn bộ của 3 nhóm trên là hoàn toàn khác nhau Theo đó, nhóm có tiên lượng xấu phải được điều trị với phác đồ hóa trị liệu mạnh và ghép tủy sau khi đạt lui bệnh hoàn toàn Còn

- 10 -

khoảng 45% BN BCCDT không phát hiện bất thường NST hay NST đồ bình thường được xếp vào nhóm tiên lượng trung bình Tuy nhiên, nhóm BN này cũng không đồng nhất nên trong những năm gần đây nhiều nghiên cứu đã tập trung khảo sát các bất thường di truyền phân tử như đột biến gen hoặc rối loạn biểu hiện gen nhằm phân

nhóm tiên lượng sâu hơn Từ năm 2007, các đột biến gen như FLT3 (Fms-like tyrosine kinase 3), NPM1 (nucleophosmin 1), CEBPA (CCAAT enhancer-binding protein-α), và MLL (mixed-lineage leukemia)… được xem như những yếu tố quan

trọng phân nhóm tiên lượng của BN BCCDT có NST đồ bình thường (Bảng 1.4)

Bảng 1.4: phân nhóm nguy cơ dựa vào đột biến gen trong nhóm NST đồ bình thường

(Schlenk RF,N Engl J Med 2008;358)

Gen FLT3 gồm 24 exon định vị trên NST 13q12, mã hóa cho một thụ thể gắn trên

màng có hoạt tính tyrosine kinase (RTK: receptor tyrosine kinase), thuộc họ RTK nhóm III được đặc trưng bởi 5 vùng ở phần ngoại bào có cấu trúc giống Imunoglobulin, một vùng xuyên màng, một vùng cận màng (JMD) và một vùng nội

Vùng xuyên màng (transmembrane domain) Vùng cận màng (juxtamembrane domain)

Hình 1.1: Cấu trúc gen FLT3

FLT3 đóng vai trò quan trọng trong sự tăng sinh, biệt hóa và tồn tại (survival) của

các tế bào gốc đa năng và trong BCCDT nó được biểu hiện vượt mức trong các tế

bào blast Đột biến FLT3 là một trong những đột biến thường gặp trong BCCDT [35], có 2 nhóm chính là FLT3-ITD (internal tandem duplication) ở JMD (thuộc exon

14 và 15) chiếm khoảng 30% và đột biến điểm ở vùng có hoạt tính tyrosine kinase

(FLT3-TKD, thuộc exon 20) chiếm 12% [20] Đột biến FLT3-ITD thì bảo tồn khung

dịch mã, có sự đa dạng về kích thước đoạn lặp lại và vị trí lặp lại [1] Trong một

nghiên cứu trên 241 BN BCCDT có tổng cộng 282 kiểu đột biến FLT3-ITD, trong đó

có một số BN có hơn 1 kiểu đột biến và chiều dài trung bình của ITD là 48 bp (từ

15-180 bp) FLT3-ITD chủ yếu xảy ra ở JMD, tuy nhiên cũng có một số trường hợp xảy

ra ở vùng tyrosine kinase thứ nhất (TKD1) [25] Hầu hết đột biến điểm FLT3-TKD là

thay thế aspartate tại vị trí 835 thành tyrosine (D835Y, là kiểu đột biến thường gặp nhất), histidine, valine hoặc glutamate Ngoài ra, còn có kiểu đột biến khác là mất hoặc thêm codon 835, 836 Trên exon 20 còn có thêm những đột biến điểm khác tại codon 839, 841 và 842 cũng như thêm 2 amino acid giữa condon 840 và 841 Theo

- 12 -

nghiên cứu của Schittenhelm và cộng sự thì còn có thêm một kiểu đột biến điểm nữa trong vùng tyrosine kinase thứ nhất là K663Q [1]

Đột biến FLT3-ITD được chứng minh là yếu tố tiên lượng xấu, có ảnh hưởng độc

lập và BN chỉ có thể lui bệnh tốt nếu được dị ghép tủy Phác đồ hóa trị liệu mạnh với anthracycline đôi khi cũng không đưa BN vào lui bệnh hoặc lui bệnh được nhưng tỉ

lệ tái phát rất cao [16] Trong một nghiên cứu trên 523 BN, trong đó 224 BN có NST

đồ bình thường cho thấy 32% có FLT3-ITD và 14% có FLT3 Asp835 [18] Nhóm

BN mang đột biến FLT3 có số lượng bạch cầu, tỉ lệ tế bào blast trong máu, trong tủy

xương, và mức LDH huyết thanh cao Ngoài ra, nhóm nghiên cứu phân tích tỉ lệ đáp ứng, thời gian lui bệnh và thời gian sống toàn bộ với điều trị theo phác đồ 2 đợt tấn công 7-3 và củng cố bằng liều cao cytarabine cho thấy tỉ lệ đáp ứng không khác biệt

giữa nhóm có và không có đột biến FLT3, tuy nhiên thời gian lui bệnh và thời gian sống toàn bộ ngắn hơn rõ rệt ở nhóm mang đột biến FLT3 [18] Gale RE và cộng sự nghiên cứu trên 1425 trường hợp cho thấy 26% BN có FLT3-ITD với kích thước đoạn lặp lại của FLT3 rất thay đổi từ 15 bp đến 231 bp, số đoạn lặp lại có thể là 1, 2,

3 hoặc 4 và mức độ biểu hiện của FLT3-ITD so với wild type FLT3 cũng thay đổi

tùy từng BN [19] Phân tích đa biến về ảnh hưởng của các yếu tố trên với tiên lượng của BN cho thấy kích thước đột biến và số lượng đột biến không ảnh hưởng đến tiên lượng, tuy nhiên mức độ biểu hiện của đột biến [mutant level: mức thấp (1-24%), trung bình (25-50%) và mức cao (> 50%)] là yếu tố tiên lượng quan trọng nhất ảnh hưởng đến thời gian sống toàn bộ và tỉ lệ tái phát Kết quả theo dõi 5 năm sau điều trị bằng phác đồ hóa trị liệu chuẩn cho thấy tỉ lệ tái phát của BN có mức biểu hiện cao

của FLT3-ITD là 82% so với 64% ở nhóm BN biểu hiện trung bình và 49% ở nhóm không mang đột biến FLT3-ITD [19] Nếu điều trị hóa trị liệu đơn thuần thì sau 5 năm tỉ lệ sống còn chỉ là 15% ở nhóm có mức biểu hiện cao của FLT3-ITD so với 42% ở nhóm không mang đột biến FLT3, nên việc xem xét chỉ định ghép tủy trên những BN có FLT3-ITD là rất cần thiết [19] Một vài nghiên cứu chứng minh rằng ghép tế bào gốc tủy xương cải thiện được tiên lượng của BN có FLT3-ITD [5,29]

Bornhäuser M và cộng sự thực hiện tự ghép và dị ghép tế bào gốc tủy xương trên 141

và 103 trường hợp tương ứng gồm những BN có và không có FLT3-ITD, kết quả

theo dõi sau 53 tháng cho thấy tỉ lệ sống toàn bộ không khác biệt ở nhóm có và

không rõ ràng [9,13,10] Tuy nhiên, các thuốc ức chế đặc hiệu hơn đối với FLT3 như

AC220 lại có đáp ứng tốt trong giai đoạn đầu của thử nghiệm lâm sàng và đang được nghiên cứu tiếp [11] Điều này cho thấy tầm quan trọng của ghép tủy xương trong

điều trị nhóm BN mang đột biến FLT3 trong giai đoạn hiện nay giúp cải thiện tiên

lượng bệnh

Gen NPM1 định vị trên NST 5q35 với chiều dài 25kb, gồm 12 exon Gen NPM1

có thể được phiên mã thành 3 dạng đồng phân khác nhau là NPM1, NPM1.2 và một dạng đồng phân thứ 3 chưa rõ chức năng Trong đó NPM1 là dạng phổ biến và dài nhất với 11 exon, thiếu exon 10, mã hóa cho protein có 294 aa NPM1.2 gồm 10

exon, thiếu exon 11 và 12, mã hóa cho protein có 259 aa Còn dạng đồng phân thứ 3 thì gồm 10 exon, thiếu exon 8 và 10, mã hóa cho protein có 265 aa (Hình 1.2) NPM1 được tìm thấy chủ yếu trong hạch nhân, còn NPM1.2 thì hiện diện với hàm lượng thấp trong tế bào, được xác định trong cả nhân và tế bào chất [27]

Hình 1.2: Cấu trúc gen và các sản phẩm phiên mã của gen NPM1

NPM1 là thành viên thuộc họ protein NPM, là một loại chaperone trong nhân NPM có nhiều chức năng khác nhau trong chu trình tế bào như tái cấu trúc NST, ổn định bộ gen, sao chép DNA, điều hòa phiên mã và sinh tổng hợp ribosome, NPM1

là một protein di chuyển giữa nhân và bào tương, định vị chủ yếu trong nhân tế bào,

- 14 -

có vai trò trong sinh tổng hợp ribosome, vận chuyển trong nhân, nhân đôi trung thể,

ổn định bộ gen, sao chép DNA, điều hòa phiên mã, tái cấu trúc những protein đã được biến tính, histone chaperon và kết hợp với DNA hay RNA Cấu trúc của NPM1

có đầu N kháng protease được cấu tạo gồm một vùng amino acid có tính acid (A1) chịu trách nhiệm cho hoạt tính oligomerization và chaperone, một vùng tín hiệu xuất khỏi nhân tế bào (nuclear export signal-NES) Đầu C của NPM1 cũng có thêm 2 vùng amino acid có tính acid (A2 và A3) Ngoài ra, ở đầu C còn có các vùng khác như vùng tín hiệu định vị nhân (nuclear localization signals-NLS), vùng tín hiệu định

vị hạch nhân (nucleolar localization signal-NoLS) và vùng gắn với nucleic acid (Hình 1.3) [17]

Hình 1.3: Cấu trúc protein NPM1

Khoảng 40 kiểu đột biến NPM1 đã được xác định, tất cả đều nằm trên exon 12,

làm thay đổi đầu C của NPM1, như đột biến W288del và W290del làm thay đổi vùng

C tạo ra motif NLS mới Gần đây, người ta còn phát hiện thêm đột biến chèn 8 bp tại

vị trí nucleotide 902 ở giữa exon 11 [2] và 2 trường hợp khác liên quan đến splicing

exon 9 và exon 11 Trong 40 đột biến NPM1 đã được xác định thì thường gặp nhất là

đột biến chèn thêm 4 bp “TCTG” tại vị trí nucleotide 956-959 (đột biến nhóm A) chiếm 75%-80%, đột biến nhóm B và D gặp trong 10% và 5% tương ứng, các đột

biến khác thì hiếm gặp hơn [15] Đột biến NPM1 được đánh giá có tiên lượng tốt là

sự nhân đôi 4 bp tại exon 12 dẫn tới sự thay thế 7 amino acid cuối bởi 11 amino acid

ở đầu C Sự thay đổi này làm biến đổi một hoặc hai Tryptophan còn lại ở đầu C tạo

ra một vùng NES mới dẫn tới giảm sự định vị nhân của NPM1 [33]

Đột biến NPM1 thì phụ thuộc vào độ tuổi, tỷ lệ đột biến NPM1 trong BCCDT trẻ

em thường thấp hơn, khoảng 8% và không tìm thấy ở BN BCCDT dưới 3 tuổi Đột

biến NPM1, xảy ra tại exon 12, gặp trong 50 - 60% BCCDT có NST đồ bình thường

và có thể đi kèm hoặc không với FLT3-ITD [14] BN BCCDT chỉ có đột biến NPM1 thì có tiên lượng tốt, nhưng nếu có cả 2 loại đột biến NPM1 và FLT3-ITD thì sẽ có tiên lượng xấu hơn Gale RE và cộng sự đã khảo sát đột biến FLT3-ITD và NPM1

trên 1217 BN BCCDT cho thấy có 47% BN không mang cả 2 loại đột biến, 11% chỉ

- 15 -

có FLT3-ITD, 24% chỉ có đột biến NPM1 và 17% mang cả 2 loại đột biến Theo dõi

5 năm với điều trị bằng phác đồ hóa trị liệu chuẩn cho thấy tỉ lệ tái phát ở nhóm chỉ

có đột biến FLT3-ITD là 79% so với 34% ở nhóm chỉ có đột biến NPM1, và 63%,

57% ở nhóm dương tính hoặc âm tính với cả 2 kiểu đột biến [19] Kết quả của

nghiên cứu trên cho thấy sự hiện diện của FLT3-ITD làm tiên lượng của nhóm BN

có mang đột biến NPM1 xấu hơn và tỉ lệ tái phát cao hơn

CEBPA nằm trên NST 19q13.1, là gen chỉ có một exon, không có intron CEBPA

mã hóa cho một yếu tố phiên mã (transcription factor) là CCAAT/enhancer binding protein-α, là yếu tố biệt hóa dòng hạt quan trọng trong điều hòa tế bào đầu dòng hạt Protein CEBPA gồm có 2 vùng, thứ nhất là vùng bZIP, là vùng trung gian cho sự gắn với DNA, có thể gắn kiểu homodimerization hay heterodimerization Vùng này cũng liên quan tới trung gian tương tác protein-protein với những yếu tố phiên mã khác liên quan tới việc xác định dòng hay sự tăng sinh tế bào Vùng thứ 2 ở đầu N, là vùng truyền hoạt tính (TAD - transactivating domain) qua tương tác trung gian với các yếu

tố phiên mã hay những protein quan trọng trong chu trình tế bào (Hình 1.4) CEBPA mRNA có thể được dịch mã thành 2 kiểu protein do sự khác nhau về vị trí của mã khởi đầu trên cùng một khung dịch mã để tạo ra protein có chiều dài 42 kDa hoặc protein có chiều dài 30 kDa (bị mất phần TAD1 ở đầu N) [22]

Hình 1.4: Cấu trúc protein của CEBPA

Leroy H và cộng sự tổng kết các nghiên cứu đã báo cáo về đột biến CEBPA trong

3 năm gồm 1175 BN trong đó có 962 BCCDT, 156 loạn sinh tủy, 23 bạch cầu cấp dòng lympho và 34 non-Hodgkin lymphoma, kết quả cho thấy 96 BN có đột biến

CEBPA gồm 9 đột biến im lặng và 87 đột biến không im lặng (nonsilent mutation),

và đột biến này chỉ gặp trong các bệnh lý ác tính dòng tủy Đột biến CEBPA gặp

trong khoảng 8-19% BCCDT có NST đồ bình thường, xảy ra trên toàn bộ vùng mã hóa của gen nhưng tập trung ở 2 đầu 5‟ và 3‟ [26] Đột biến vùng 5‟ là đột biến vô

- 16 -

nghĩa (nonsense mutation) tạo ra protein cắt cụt (truncated protein), ngược lại đột biến vùng 3‟ xảy ra ở bZIP domain thường là đột biến bảo tồn khung đọc (in-frame mutation) tạo ra protein thiếu vùng gắn DNA và/hoặc hoạt tính homodimerization, và các đột biến này rất đa dạng gồm đột biến điểm, thêm đoạn hoặc mất đoạn [26] Marcucci G và cộng sự khảo sát trên 175 BN BCCDT phát hiện 18% BN có đột biến

CEBPA Kết quả theo dõi 4,5 năm cho thấy thời gian sống toàn bộ là 58% ở nhóm có

đột biến so với 28% ở nhóm không có đột biến CEBPA Đồng thời khi phân tích đa biến, nhóm nghiên cứu kết luận rằng đột biến CEBPA là đột biến có tiên lượng tốt,

có ảnh hưởng độc lập dù có sự hiện diện hay không của FLT3-ITD [28] BN BCCDT mang đột biến CEBPA thường có 2 đột biến là đột biến đầu C và đầu N xảy ra đồng

thời và có thể trên cùng một alen hoặc trên 2 alen khác nhau [37] Một nghiên cứu khác khảo sát trên 467 trường hợp BCCDT cho thấy 38 BN (8%) có đột biến CEBPA, trong đó 52,6% BN mang 2 kiểu đột biến, 47,4% chỉ mang 1 kiểu đột biến

Kết quả theo dõi trung bình 7 năm chứng minh rằng nhóm BN có đột biến CEBPA 2 alen không đi kèm đột biến NPM1 và hiếm khi có kèm FLT3-ITD và nhóm này có tiên lượng tốt, ngược lại nhóm có đột biến CEBPA 1 alen có đi kèm đột biến NPM1

và FLT3-ITD với tần suất và tiên lượng tương đương nhóm không mang đột biến

CEBPA [12]

Các đột biến MLL-PTD (Partial tandem duplication), RAS và WT1 cũng gặp trong

BCCDT có NST đồ bình thường Giá trị tiên lượng của các đột biến này chưa được khẳng định, mặc dù nghiên cứu gần đây cho thấy BN BCCDT với NST đồ bình

thường có đột biến RAS sẽ cho tỷ lệ lui bệnh cao và thời gian sống toàn bộ dài hơn

nếu điều trị củng cố với cytarabine liều cao [31] Ảnh hưởng của các kiểu đột biến

MLL-PTD, RAS và WT1 đối với tiên lượng bệnh vẫn còn đang được nghiên cứu và

chưa được Mạng Lưới Ung Thư Quốc Gia của Hoa Kỳ (National Comprehensive Cancer Network: NCCN) khuyến cáo khảo sát trong BCCDT mới chẩn đoán

Ngoài ra, BN BCCDT thuộc nhóm tiên lượng tốt theo Bảng 1 sẽ có 1 trong 3 chuyển vị NST t(8;21), t(15;17) và inv(16)/t(16;16), trong đó nhóm t(15;17) có bệnh cảnh lâm sàng đặc biệt là BCCDT thể M3 có tiên lượng rất tốt với điều trị phối hợp hóa trị liệu chuẩn và ATRA, còn nhóm t(8;21) và inv(16)/t(16;16) thì không đồng nhất Nghiên cứu của Cairoli và cộng sự năm 2006 cho thấy khoảng 46% BN với

- 17 -

t(8;21) và inv(16)/t(16;16) có thêm đột biến ở exon 8 và exon 17 của gen cKIT sẽ tái phát sớm sau lui bệnh hoàn toàn [8] cKIT định vị trên NST 4q12 trải dài 89 kb, gồm

có 21 exon, trong đó exon 9 có 2 dạng đồng phân khác nhau bởi 12 nucleotide tạo ra

2 loại protein khác nhau có 976 aa và 972 aa cKIT là một thụ thể tyrosin kinase nhóm III, trọng lượng phân tử 145 kDa, được cấu tạo gồm một vùng ngoại bào với 5 Ig-like loops, một vùng xuyên màng kị nước (23 aa), và một vùng nội bào gồm 2 vùng có hoạt tính tyrosine kinase bị tách bởi kinase insert (Hình 1.5)

Hình 1.5: Cấu trúc gen cKIT

Khi cKIT được gắn với ligand ở dạng dimer hóa sẽ tạo ra sự phosphoryl hóa các protein và hoạt hóa con đường truyền tín hiệu liên quan tới sự tăng sinh, biệt hóa, di trú (migration) và tồn tại của các tế bào gốc tạo máu Sự hoạt hóa không phụ thuộc ligand của cKIT gây ra bởi sự xuất hiện của một số kiểu đột biến đã được báo cáo trong BCCDT và một số bệnh lý ác tính khác như u mô đệm đường tiêu hóa (GIST), Kiểu đột biến thường gặp trong BCCDT là đột biến thêm hoặc mất đoạn tại exon 8

dẫn tới mất amino acid aspartic tại codon 419, đột biến cKIT-ITD tại exon 11, 12

hoặc đột biến điểm làm thay đổi cấu trúc trong vùng tyrosine kinase (exon 17) Trong đó, phổ biến nhất là kiểu đột biến D816V và ít phổ biến hơn là D816Y, D816H, D816F và D816I hoặc đột biến điểm tại một số codon khác như 821, 822 và

823 Phức hợp đột biến cKIT-ITD tại exon 11, 12 được xác định khoảng 7% trong

BCCDT trẻ em [36]

Nghiên cứu khảo sát trên 61 BN có inv(16) và 49 BN có t(8;21) cho thấy 29,5%

và 22% BN tương ứng biểu hiện đột biến cKIT Theo dõi 5 năm sau khi điều trị bằng phác đồ hóa trị liệu chuẩn cho thấy tỉ lệ tái phát cao ở nhóm BN mang đột biến cKIT

exon 17 so với nhóm không mang đột biến [80% so với 29% ở nhóm BN có inv(16), 70% so với 36% ở nhóm BN có t(8;21)] [8] Vì thế, hướng dẫn của Mạng Lưới Ung

Thư Quốc Gia của Hoa Kỳ năm 2010 đề nghị khảo sát đột biến cKIT thường quy

- 18 -

trong nhóm BN có chuyển vị NST t(8;21) và inv(16)/t(16;16) Một số nghiên cứu

khác đã khảo sát ảnh hưởng của các kiểu đột biến cKIT trên nhóm BN có inv(16) và t(8;21), và kết quả cho thấy đột biến cKIT exon 17 ảnh hưởng đến tiên lượng bệnh, làm tăng tỉ lệ tái phát [39,8] so với đột biến cKIT ở các vị trí khác Đột biến cKIT

trong BCCDT là đột biến tăng chức năng và bị ức chế bởi các thuốc ức chế tyrosine kinase, vì vậy các nghiên cứu gần đây đề nghị phối hợp hóa trị liệu với các thuốc ức

chế tyrosine kinase trong điều trị nhóm BN mang inv(16), t(8;21) có đột biến cKIT

nhằm cải thiện tiên lượng hoặc xem xét khả năng ghép tủy trên nhóm BN này [23,24]

Tổng hợp kết quả của các nghiên cứu trên, Mạng Lưới Ung Thư Quốc Gia của Hoa Kỳ năm 2010 đã đưa ra bảng phân nhóm tiên lượng của BCCDT dựa trên bất thường NST và gen được tóm tắt theo Bảng 1.5

Bảng 1.5: phân nhóm nguy cơ dựa vào bất thường NST và gen

NST đồ bình thường

có đột biến CEBPA hoặc đô ̣t biến NPM1

không kèm với

t(8;21), inv16, t(16;16) có kèm đột