Nghiên cứu hiệu quả điều trị bệnh xơ gan trên chuột của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ had msc được nuôi trong môi trường có huyết tương giàu tiểu cầu prp và yếu tố tăng trưởng tế bào gan hgf

Kết quả nghiên cứu này cho thấy việc cấy ghép tế bào gốc mỡ giúp hạn chế sự hoạt động của tế bào hình sao hoạt động, giảm các biểu hiện viêm gan, góp phần cải thiện chức năng và tái tạo

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ BỆNH XƠ GAN TRÊN CHUỘT

CỦA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÔ MỠ (hAD-MSC)

ĐƯỢC NUÔI TRONG MÔI TRƯỜNG CÓ HUYẾT TƯƠNG GIÀU TIỂU

CẦU (PRP) VÀ YẾU TỐ TĂNG TRƯỞNG TẾ BÀO GAN (HGF)

Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ

Chủ nhiệm nhiệm vụ: NGUYỄN HẢI NAM

Thành phố Hồ Chí Minh - 2018

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ BỆNH XƠ GAN TRÊN CHUỘT

CỦA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÔ MỠ (hAD-MSC) ĐƯỢC

NUÔI TRONG MÔI TRƯỜNG CÓ HUYẾT TƯƠNG GIÀU TIỂU CẦU

(PRP) VÀ YẾU TỐ TĂNG TRƯỞNG TẾ BÀO GAN (HGF)

(Đã chỉnh sửa theo kết luận của Hội đồng nghiệm thu ngày 20/01/2018 )

Chủ tịch Hội đồng nghiệm thu

(Ký và ghi rõ họ tên) Nguyễn Hải Nam

THÀNH ĐOÀN TP HỒ CHÍ MINH

TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

, ngày tháng năm 200

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN I THÔNG TIN CHUNG 1 Tên nhiệm vụ: Thuộc: Chương trình/lĩnh vực (tên chương trình/lĩnh vực): Vườn ươm Sáng tạo Khoa học và Công nghệ trẻ 2 Chủ nhiệm nhiệm vụ: Họ và tên: Nguyễn Hải Nam

Ngày, tháng, năm sinh: 17/6/1990 Nam/ Nữ: nam

Học hàm, học vị: Thạc sĩ

Chức danh khoa học: Chức vụ

Điện thoại: Tổ chức: Nhà riêng: Mobile: 01656151485

Fax: E-mail: nghnam@hcmus.edu.vn Tên tổ chức đang công tác: Viện Tế Bào Gốc, ĐH KHNT, ĐHQG TP.HCM Địa chỉ tổ chức: 227 Nguyễn Văn Cừ, P4, Q5, TP.HCM Địa chỉ nhà riêng:

3 Tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ Điện thoại: 8233363 – 8230780 – Fax: 8244 705

E-mail:

Website:

Địa chỉ: Số 1 Phạm Ngọc Thạch, P Bến Nghé, Q1, Tp Hồ Chí Minh

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: ĐOÀN KIM THÀNH

Số tài khoản: Số tài khoản: 3713.0.1083277

Kho bạc: Kho bạc Nhà nước Q.1 – Tp Hồ Chí Minh

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện nhiệm vụ:

- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 06 năm 2017đến tháng 12 năm2017

- Thực tế thực hiện: từ tháng 06 năm 2017 đến tháng 12 năm 2017

- Được gia hạn (nếu có):

Thời gian

(Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

Thời gian (Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

…

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:

Đối với đề tài:

Đơn vị tính: Triệu đồng

Số

TT

Nội dung các khoản chi

khác

ồn khác

Đơn vị tính: Triệu đồng

Số

TT

Nội dung các khoản chi

- Lý do thay đổi (nếu có):

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án:

(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xét duyệt, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện nếu có); văn bản của tổ chức chủ trì nhiệm vụ (đơn, kiến nghị điều chỉnh nếu có)

Số

TT

Số, thời gian ban

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

5 Cá nhân tham gia thực hiện nhiệm vụ:

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

nội dung

2 Trương Hải Nhung Trương Hải Nhung Cố vấn

- Lý do thay đổi (nếu có):

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

(Nội dung, thời gian, kinh

phí, địa điểm ) Ghi chú*

1

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

1 Nội dung 1: Tao ̣ mô hình chuột

xơ gan bằng CCl4 theo

30/06-30/09 Hoàn thành Nguyễn Hải

Nam Lê Văn

Chuột nhắt trắng đực (từ 7-8 tuần

tuổi) sẽ được gây

xơ gan bằng phương pháp uống

CCl4: Olive qua thưc ̣

quản trong 11 tuần Sau đó, chuôt ̣

mô hình bên ̣ h sẽ đươc ̣

thử nghiêm ̣ điều tri ̣bằng tế bào ở

nôi ̣ dung 1

2 Nội dung 2: Nuôi cấy tế bào gốc

trung mô từ mô mỡ

ngườ i (hADSC) trong các điều

kiên ̣ khác nhau, chuẩn bi ̣

tế bào cho cấy ghép

Tế bào hADSC sẽ được nuôi trong

môi trường chuẩn

thông thườ ng và trong điều kiên ̣

thay thế huyết thanh bào

thai bò bằng 10% huyết tương

giầu tiểu cầu (PRP) của

người và bổ sung yếu tố tăng

trưởng tế bào gan (HGF)

trong 7 ngày

30/07-30/09 Hoàn thành Nguyễn Hải

Nam Lê Văn Trình, Đỗ Quang Huy

3 Nội dung 3: Cấy ghép tế bào để

điều tri ̣bên ̣ h xơ gan trên

mô hình chuột So sánh hiêu ̣ quả

điều tri ̣bên ̣ h xơ gan của

các nhóm tế bào khác nhau: tế bào

nuôi trong điều kiên ̣

chuẩn, tế bào nuôi trong PRP, và

HGF

30/9-30/10 Hoàn thành Nguyễn Hải

Nam Lê Văn Trình, Đỗ Quang Huy

- Lý do thay đổi (nếu có):

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA NHIỆM VỤ

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

Thực tế đạt được

1

2

1 Cuốn báo cáo tổng kết Đầy đủ, rõ ràng Hoàn thành

- Lý do thay đổi (nếu có):

chấp nhận đăng

BMRAT

- Lý do thay đổi (nếu có):

d) Kết quả đào tạo:

Theo kế hoạch Thực tế đạt

được

- Lý do thay đổi (nếu có):

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp:

Số

TT

Tên sản phẩm đăng ký

(Thời gian kết thúc)

Theo

kế hoạch

Thực tế đạt được

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

Các kết quả của nghiên cứu đã cho thấy hiệu quả điều trị xơ gan trên mô hình chuột bằng liệu pháp tế bào gốc Việc ghép tế bào gốc đã giúp các con chuột mô hình xơ gan cải thiện về men gan, khối lượng, cấu trúc mô học và giảm biểu hiện các gen gây xơ hóa Kết quả của nghiên cứu

là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm ứng dụng liệu pháp ghép tế bào gốc để điều trị cơ gan trên người Khi được thử nghiệm đầy đủ các giai đoạn và thành công, liệu pháp ghép tế bào gốc để điều trị xơ gan có thể được chuyển giao đến các bệnh viện và cơ sở y tế

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

Việc điều trị xơ gan hiện nay đòi hỏi bệnh nhân phải chi trả các khoản chi phí rất lớn cho ghép gan, tiêu tốn nhiều thời gian của bệnh nhân và xã hội, nguồn gan hiến tặng khan hiếm Việc có thể nghiên cứu và ứng dụng liệu pháp điều trị xơ gan bằng tế bào gốc có thể giúp giảm được các chi phí và tăng cơ hội được điều trị bệnh cho bệnh nhân góp phần giảm các hao phí về vật chất

và sức khỏe cho bệnh nhân và xã hội

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của nhiệm vụ:

I Báo cáo tiến độ

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ vi

MỞ ĐẦU 1

TỔNG QUAN 4

1.1 Sơ lược về gan 4

1.1.1 Cấu trúc 4

1.1.2 Khả năng tái sinh của gan 7

1.2 Bệnh xơ gan 8

1.2.1 Định nghĩa 8

1.2.2 Dịch tễ học 8

1.2.3 Bệnh nguyên 9

1.2.5 Các hậu quả của bệnh xơ gan 12

1.2.6 Các liệu pháp điều trị xơ gan 12

1.3 Liệu pháp tế bào gốc trong điều trị xơ gan 13

Sử dụng tế bào gốc từ tuỷ xương 13

Sử dụng tế bào gốc từ mô mỡ 13

1.4 Tế bào gốc trung mô 15

1.4.1 Các đặc điểm của tế bào gốc trung mô 15

Khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau [62] 16

Khả năng ức chế miễn dịch, ngăn cản thải loại [3, 44] 17

1.4.2 ADSC- Tế bào gốc trung mô có nguồn gốc từ mô mỡ 18

1.5 HGF- Yếu tố tăng trưởng tế bào gan 19

1.6 PRP- Huyết tương giàu tiểu cầu 20

VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP 22

2.1 Vật liệu 22

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.1.2 Hoá chất 22

2.1.3 Dụng cụ-thiết bị 23

2.2 Phương pháp 25

2.2.1 Phương pháp tạo mô hình chuột xơ gan bằng CCl4 25

2.2.2 Phương pháp xét nghiệm sinh hóa 26

2.2.3 Phương pháp xác định số lượng bạch cầu tổng 27

2.2.4 Phương pháp tách RNA tổng số 28

2.2.5 Phương pháp định lượng RNA bằng Realtime-PCR 29

2.2.6 Phương pháp nhuô ̣m mô bằng Haematoxylin và Eosin 30

2.2.7 Phương pháp nhuộm mô bằng Sirius red 31

2.2.8 Phương pháp thu huyết tương giàu tiểu cầu (PRP – Platelet Rich Plasma)

từ máu cuống rốn 32

2.2.9 Phương pháp nuôi cấy hADSC 32

2.2.10 Phương pháp ghép tế bào vào tĩnh mạch đuôi chuột 34

2.2.11 Phương pháp xử lý thống kê 35

KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 36

3.1 Nội dung 1: Tạo mô hình chuột xơ gan bằng CCl 4 36

3.1.1 Sự thay đổi khối lượng 36

3.1.2 Hoạt độ men ALT 37

3.1.3 Kết quả đánh giá số lượng bạch cầu tổng 38

3.1.4 Biểu hiện gen ở mức phiên mã 38

3.1.5 Kết quả nhuộm H&E và Sirius red 39

3.2 Nội dung 2: Nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ mô mỡ người (hADSC) trong các điều kiên ̣ khác nhau 42

3.2.1 Kết quả giải đông tế bào hADSC 42

3.2.2 Hình dạng của tế bào được nuôi trong các môi trường khác nhau 43

3.2.3 Thời gian nhân đôi của tế bào được nuôi trong các môi trường khác nhau 44 3.3.1 Kết quả tại mốc 7 ngày sau khi ghép tế bào 46

Thảo luận 58

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62

4.1 Kết luận 62

4.2 Kiến nghị 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

PHỤ LỤC 72

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt

ADSC Adipose tissue-derived stem cells Tế bào gốc có nguồn gốc từ mô

mỡ ALT Alanine aminotransferase

AST Aspartate aminotransferase

BM-MSC Bone Marrow Mesenchymal Stem

CXCR4 C-X-C chemokine receptor type 4

ECM Extracellular matrix Chất nền ngoại bào

EMT Epithelial menchymal transition Chuyển dạng biểu mô -trung

mô

ES Embryonic stem cell Tế bào gốc mô phôi

FCM Flow cytometry Kỹ thuật phân tích tế bào theo

HGF Hepatocyte growth factor Yếu tố tăng trưởng tế bào gan

HLA Human leukocyte antigen Kháng nguyên bạch cầu ở

người HSC Hepatic stellate cells Tế bào hình sao

IDO Indoleamine 2,3-dioxygenase

mADSC Mouse adipose tissue-derived stem

cells

Tế bào gốc có nguồn gốc từ mô

mỡ chuột

MCP Monocyte chemoattractant protein Protein hóa hướng động của tế

bào đơn nhân MHC Major histocompatibility complex Phức hợp tương thích mô chính MMPs Matrix Metalloproteinase Enzyme tiêu hủy cấu trúc nền

mBM-MSC Mouse Bone Marrow Mesenchymal

PBS Phosphate-buffered saline Nước muối phosphate

PDGF Platelet-derived growth factor Yếu tố tăng trưởng có nguồn

gốc từ tiểu cầu

SDF-1 Stromal derived factor 1

SMA-α Alpha-Smooth Muscle Actin

SVF Stromal vascular fraction Phân đoạn mạch nền

TGF Transforming Growth Factor Yếu tố tăng trưởng chuyển dạng

TIMPs Tissue Inhibitor Metalloproteinase Enzyme ức chế quá trình tiêu

hủy cấu trúc nền TNF Tumor Necrosis factor Yếu tố hoại tử khối u

UCB Umbilical cord blood Máu cuống rốn

VEGF Vascular endothelial growth factor Yếu tố tăng trưởng nội

mô mạch máu WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3 1: So sánh khối lượng chuột giữa nhóm mô hình (CCl4) và nhóm đối chứng (Olive) tại thời điểm tuần 11 36 Bảng 3 2 Hoạt độ men ALT giữa nhóm mô hình (CCl4) và nhóm đối chứng (Olive)

tại thời điểm tuần thứ 11 37

Bảng 3 3: Số lượng bạch cầu tổng của nhóm mô hình (CCl4) và nhóm đối chứng (Olive) tại tuần thứ 11 38 Bảng 3 4: Mức độ biểu hiện các gen liên quan đến xơ hóa giữa nhóm mô hình (CCl4)

và nhóm đối chứng (Olive) 38 Bảng 3 5: Phần trăm dương tính với các marker bề mặt của tế bào gốc trung mô 42 Bảng 3 6: Thời gian nhân đôi của tế bào ở mỗi nghiệm thức 44 Bảng 3 7: Sự thay đổi khối lượng ở các nhóm chuột sau 7 ngày ghép tế bào 46 Bảng 3 8: Hoạt độ men ATL của các nhóm sau 7 ngày ghép 48 Bảng 3 9: Mức độ biểu hiện các gen xơ hóa ở các nhóm chuột sau 7 ngày ghép tế bào 49 Bảng 3 10: Sự thay đổi khối lượng ở các nhóm chuột sau 14 ngày ghép tế bào 52 Bảng 3 11: Hoạt độ men ATL của các nhóm sau 14 ngày ghép 52 Bảng 3 12: Mức độ biểu hiện các gen xơ hóa ở các nhóm chuột sau 14 ngày ghép tế bào 54

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1 1: Tiểu thùy gan – đơn vị cấu trúc, chức năng cơ bản của mô gan 5

Hình 1 2: Các con đường hình thành myofibroblast 11

Hình 1 3: Khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào của MSC 16

Hình 1 4: Khả năng điều biến miễn dịch của MSC 17

Hình 1 5 Cấu trúc của HGF (A) và Tương tác giữa HGF và thụ thể c-met (B) 19

Hình 3 1 Đồ thị quá trình thay đổi khối lượng chuột trong 11 tuần gây mô hình giữa nhóm mô hình (CCl4) và nhóm đối chứng (Olive) 36

Hình 3 2: Biểu đồ so sánh khối lượng chuột giữa nhóm mô hình (CCl4) và nhóm đối chứng (Olive) tại thời điểm tuần 11 37

Hình 3 3 Biểu đồ hoạt độ men ALT giữa nhóm mô hình (CCl4) và nhóm đối chứng (Olive) tại thời điểm tuần thứ 11 37

Hình 3 4: Biểu đồ so sánh số lượng bạch cầu tổng giữa nhóm mô hình (CCl4) và nhóm đối chứng (Olive) tại tuần thứ 11 38

Hình 3 5: Kết quả biểu hiện các gen liên quan đến xơ hóa giữa nhóm mô hình (CCl4) và nhóm đối chứng (Olive) 39

Hình 3 6: Kết quả nhuộm H&E mô gan chuột tại thời điểm 11 tuần 40

Hình 3 7: Tế bào hADSC bào bám trải lớp đơn trên bề mặt bình nuôi sau khi giải đông 24 giờ 42

Hình 3 8: kết quả phân tích các marker bề mặt của tế bào bằng phương pháp flow cytometry 43

Hình 3 9: Hình dạng tế bào sau 7 ngày được nuôi ở các điều kiện môi trường khác nhau 44

Hình 3 10: Biểu đồ thời gian nhân đôi của các nhóm tế bào được nuôi ở các điều kiện khác nhau sau 7 ngày 45

Hình 3 11: Biểu đồ so sánh phần trăm thay đổi khối lượng sau 7 ngày ghép giữa nhóm 46

Hình 3 12:số lượng bạch cầu tổng ở các nhóm sau 1 ngày ghép Student’s t-test (*: đạt ý nghĩa thống kê) 47 Hình 3 13: số lượng bạch cầu tổng của các nhóm sau 3 ngày và sau 7 ngày 47 Hình 3 14 hoạt độ ALT của các nhóm chuột sau 7 ngày ghép tế bào 48

Hình 3 15: Mức độ biểu hiện gen Pro-collagen sau 7 ngày ghép tế bào của các nhóm chuột 49

Hình 3 16: Mức độ biểu hiện gen alpha-SMA sau 7 ngày ghép tế bào của các nhóm chuột 50

Hình 3 17: Kết quả nhuộm H&E mô gan các nhóm chuột tại thời điểm 7 ngày sau khi ghép tế bào 51 Hình 3 18:Phần trăm thay đổi khối lượng sau 14 ngày ngày ở các nhóm chuột 52 Hình 3 19: Biểu đồ hoạt độ ALT sau 14 ngày ghép tế bào ngày của các nhóm chuột 53

Hình 3 20: Biểu đồ so sánh số lượng bạch cầu tổng sau 14 ngày ghép tế bào của các nhóm chuột 54

Hình 3 21: Biểu đồ mức độ biểu hiện gen Pro-collagen sau 14 ngày ghép tế bào ở các nhóm chuột 55

Hình 3 22: Biểu đồ mức độ biểu hiện gen alpha-SMA sau 14 ngày ghép tế bào ở các nhóm chuột 55 Hình 3 23: Kết quả nhuộm H&E mô gan các nhóm chuột tại thời điểm 7 ngày sau khi ghép tế bào 57

MỞ ĐẦU

Xơ gan là một căn bệnh thầm lặng và nguy hiểm, các triệu chứng của xơ gan thường không biểu hiện rõ ràng cho đến khi chức năng gan của người bệnh bị suy giảm nghiêm trọng Vì vậy, việc điều trị bệnh lúc này gặp rất khó khăn Vì gan vừa là nơi dự trữ vừa là nơi chuyển hóa nhiều chất quan trọng cho cơ thể nên bệnh xơ gan không chỉ ảnh hưởng đến hoạt động, chức năng của gan mà còn ảnh hưởng đến chức năng của các cơ quan khác

Theo thống kê của WHO, Việt Nam là nước có tỷ lệ nhiễm HBV, HCV cao [7], bên cạnh

đó Việt Nam là quốc gia có lượng tiêu thụ rượu bia cao và có xu hướng gia tăng trong thời gian tới [6] Các nhân tố trên là nguyên nhân chính dẫn đến xơ gan, ung thư gan Theo các nhà dịch tễ học tại Việt Nam, số ca mắc viêm gan do virus sẽ giảm do tác động của các chương trình tiêm chủng ngừa HBV đang được mở rộng ở Việt Nam hiện nay Tuy nhiên, những gánh nặng về y tế do các bệnh về gan gây ra sẽ tiếp tục gia tăng và kéo dài trong thời gian tới [9]

Việc điều trị xơ gan hiện nay đang gặp rất nhiều khó khăn, không có thuốc đặc trị cho loại bệnh này, liệu pháp duy nhất cứu sống các bệnh nhân xơ gan giai đoạn cuối hiện nay là ghép gan Tuy nhiên, liệu pháp này đòi hỏi nguồn mô hiến tặng dồi dào, chi phí chữa bệnh cao và gặp phải nguy cơ thải loại sau ghép [16, 17] Việc tìm ra một liệu pháp chữa trị xơ gan an toàn, hiệu quả và chi phí vừa phải là một yêu cầu cấp thiết hiện nay

Mô mỡ là nơi có nguồn tế bào gốc dồi dào [4], mặt khác việc thu nhận mô mỡ dễ dàng, ít ảnh hưởng đến sức khỏe người bệnh, thuận lợi cho liệu pháp ghép tế bào gốc tự thân Vì vậy liệu pháp sử dụng tế bào gốc trung mô có nguồn gốc từ mô mỡ để điều trị xơ gan hứa hẹn một liệu pháp đều trị xơ gan mới, ít rủi ro và chi phí phù hợp hơn Trên thế giới, các thí nghiệm về hướng nghiên cứu này đã được thực hiện trong những năm gần đây và cho kết quả khả quan Banas và cộng sự (2009) cấy ghép tế bào gốc trung mô có nguồn gốc từ mô mỡ qua tĩnh mạch đuôi vào chuột BALB/c nude bi ̣ xơ gan do cảm ứng CCl4 Kết quả đã cho thấy có sự biệt hóa các tế bào được ghép vào thành tế bào gan trưởng thành [2] Akihiro Seki và cộng sự (2013)

đã tiến hành thí nghiệm cấy ghép tế bào gốc mỡ vào chuột mô hình Kết quả nghiên cứu này cho thấy việc cấy ghép tế bào gốc mỡ giúp hạn chế sự hoạt động của tế bào hình sao hoạt động, giảm các biểu hiện viêm gan, góp phần cải thiện chức năng và tái tạo gan [11] Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu sử dụng liệu pháp tế bào gốc trong điều trị xơ gan vẫn là hướng mới, đang phát triển và đạt được một số kết quả trong những năm gần đây [10, 14]

Về tích cực, các nghiên cứu lâm sàn gần đây đã chứng minh , việc ấy ghép tế bào gốc không gây phản ứng phu ̣ và các biến chứng nguy, liệu pháp cấy ghép tế bào gốc giúp cải thiê ̣n chức năng gan và giảm tỉ lê ̣ tử vong ở bê ̣nh nhân được điều tri ̣ trong thời gian ngắn nên cấy ghép tế bào gốc có hiê ̣u quả điều tri ̣ bê ̣nh Tuy nhiên, viê ̣c nuôi cấy tế bào gốc trước khi cấy ghép cần sử du ̣ng FBS (huyết thanh bào thai bò), thành phần này có chứa protein ngoại lai có thể gây đáp ứng miễn di ̣ch nếu không được loa ̣i bỏ hết trước khi ghép tế bào gốc[13] đây cũng là nguồn tiềm ẩn nhiều nguy cơ gây nhiễm vi sinh vật, đặc biệt là virus hay prion.[1, 12] Chính vì vậy,

để giải quyết vấn đề trên, vào năm 2007, Asli Kocaoemer cùng cộng sự đã tiến hành thử nghiệm việc thay thế FBS bằng PRP ( huyết tương giàu tiểu cầu) có nguồn gốc từ người Để thực hiện nghiên cứu của mình, ông tiến hành thu mẫu tế bào gốc trung mô từ mô mỡ người hADSC từ

10 người cho, sau đó tiến hành nuôi hDASC này trong các môi trường khác nhau: một là môi trường nuôi có bổ sung 10% FBS và hai là môi trường nuôi có bổ sung 10% PRP Kết quả cho thấy rằng PRP hoàn toàn có thể thay thế cho FBS, ngoài ra PRP còn hỗ trợ tế bào hADSC tăng sinh mạnh hơn, duy trì sự biểu hiện các marker đặc trưng cho hADSC sau một thời gian dài nuôi cấy in vitro[5]

Các nghiên cứu trước đây cho thấy tế bào gốc có thể cải thiê ̣n mô ̣t số chỉ tiêu về chức năng gan tuy nhiên hiệu quả này không được duy trì theo thời gian Do đó, viê ̣c nghiên cứu cải tiến và kết hợp liê ̣u pháp tế bào gốc với các liê ̣u pháp khác nhằm tăng hiê ̣u quả và thời gian điều tri ̣

bê ̣nh xơ gan đang là hướng nghiên cứu được quan tâm Mô ̣t trong các liê ̣u pháp được sử du ̣ng kết hơ ̣p với tế bào gốc đó là sử du ̣ng các nhân tố tăng trưởng Nhân tố tăng trưởng là các protein có tác du ̣ng kích thích sự tăng sinh, biê ̣t hóa, sửa chữa tổn thương của tế bào nói chung và tế bào gốc nói riêng HGF (nhân tố tăng trưởng tế bào gan) là nhân tố tăng trưởng đang được sử

du ̣ng nhiều trong ứng du ̣ng điều tri ̣ bê ̣nh gan Tác du ̣ng của HGF là nhân tố kích thích tế bào gan tăng sinh và phân chia, làm trưởng thành tế bào tiền thân gan thành tế bào gan Nghiên cứu của Sabine Neuss và cộng sự (2007) cho thấy rằng MSC vừa có khả năng tiết HGF vừa biểu hiê ̣n thu ̣ thể của HGF là c-met ở mức mRNA và protein[8] Theo nghiên cứu của Forte và cô ̣ng sự (2006), khi ông tiến hành thử nghiê ̣m khả năng di cư của MSC ở mức in vitro khi được xử lý trong môi trường có bổ sung HGF, ông đưa ra kết luâ ̣n rằng HGF có khả năng kích thích sự

di cư của MSC đến vi ̣ trí tổn thương[3] Các công bố của Sabine Neuss (2004)[8] Sabrina Valente v(2015)[15] cũng cho thấy các kết quả tương tự

Từ các nhâ ̣n đi ̣nh trên, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu điều tri ̣ thực nghiê ̣m bê ̣nh xơ gan bằng tế bào gốc kết hợp với PRP và HGF trên mô hình chuô ̣t xơ gan Vì PRP và HGF là

hỗn hơ ̣p các yếu tố tăng trưởng và yếu tố kích thích phân chia tế bào nên chúng tôi kỳ vo ̣ng nó có thể hoa ̣t hóa tế bào gốc tăng sinh ma ̣nh, phân chia nhanh, tăng cường hiê ̣u quả và duy trì tác

du ̣ng điều tri ̣ trong thời gian dài hơn so với tế bào gốc đơn thuần

TỔNG QUAN

1.1 Sơ lược về gan

Gan là cơ quan lớn nhất bên trong cơ thể mỗi người, có khối lượng từ 1,2 kg đến 1,5 kg tùy thuộc vào giới tính và trọng lượng của cơ thể Dựa vào hình thái bên ngoài,

ta có thể chia gan thành bốn thùy lớn: thùy phải, thùy trái, thùy vuông và thùy đuôi [15]

1.1.1 Cấu trúc

Hệ thống mạch máu - ống mật

Gan được bao bởi lớp vỏ nang mỏng gọi là vỏ Glisson Lớp vỏ này được cấu thành bởi các sợi collagen hay các nguyên bào sợi nằm rải rác, các mạch máu nhỏ cũng như các mạch bạch huyết Điểm đặc biệt ở gan là gan nhận máu từ hai nguồn cung cấp máu, 70% máu gan nhận được từ ruột thông qua tĩnh mạch cửa, 30% còn lại là từ tim thông qua động mạch gan Máu đi ra khỏi gan thông qua tĩnh mạch trên gan Các sản phẩm được hấp thụ bởi hệ tiêu hóa được đưa đến gan để tiếp tục quá trình biến dưỡng, sau đó được mang trở lại máu để đến các cơ quan khác hoặc tiếp tục được dự trữ lại ở gan Ngoài ra, gan còn thu nhận những chất độc từ ruột hay từ hệ tuần hoàn, thông qua các quá trình oxy hóa khử để phân hủy các chất này, sau đó bài xuất vào túi mật Qua

đó, dịch mật mang các chất thải này đổ vào ruột để từ đó được thải ra ngoài Gan còn tham gia tổng hợp các đại phân tử quan trọng của cơ thể như protein, carbohydrate, lipid cũng như dự trữ glycogen [7, 11]

Tiểu thùy gan – đơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của gan

Ở gan, tiểu thùy gan vừa là đơn vị cấu trúc, đồng thời là đơn vị chức năng cơ bản cấu thành nên gan Ở đa số động vật có vú cũng như ở người, giữa các tiểu thùy gan không có sự tồn tại của lớp mô liên kết nên không có sự phân định rõ ràng giữa các tiểu thùy Biên giới tưởng tượng để phân biệt các tiểu thùy đó là tĩnh mạch trung tâm nằm

ở tâm của tiểu thùy gan và khoảng bốn đến năm bộ ba cửa được phân bố ở các góc của tiểu thùy gan Tiểu thùy gan cổ điển được Kiernan mô tả dựa vào thủy động học của dòng máu trong gan: máu đi vào khoảng cửa thông qua động mạch gan và tĩnh mạch cửa, sau đó đi qua mao mạch nan hoa vào đến trung tâm của tiểu thùy, máu đi ra khỏi tiểu thùy thông qua tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy Theo Kiernan, mỗi tiểu thùy được

xác định là một hình đa giác (5-6 cạnh) Mỗi góc của hình đa giác bao gồm một tĩnh mạch cửa, một động mạch gan và một ống dẫn mật Do đó, những tế bào nào nằm càng gần với những nhánh của tĩnh mạch cửa thì nhận máu trước, đồng thời hấp thu trước tiên những chất dinh dưỡng và O2 từ máu của tĩnh mạch cửa Dựa vào mức độ giảm dần của dinh dưỡng trong máu từ ngoài vào trung tâm tiểu thùy, ta xác định được mức độ hoạt động chuyển hóa của từng vùng của tiểu thùy [7]

Hình 1 1: Tiểu thùy gan – đơn vị cấu trúc, chức năng cơ bản của mô gan [7]

Các loại tế bào ở mô gan

Một mô gan bình thường có ít nhất 15 loại tế bào khác nhau Trong đó, tế bào nhu mô gan hay còn được gọi là hepatocyte, chiếm 80% tổng số lượng tế bào trong gan, 20% còn lại là các tế bào thuộc xoang gan (tế bào nội mô: 2.5%, tế bào Kuffer: 2%, tế bào hình sao: 1,4%….) [15]

Tế bào nhu mô gan

Là những tế bào có hình đa diện với thể tích của mỗi tế bào từ 5000-6000 µm3

Bề mặt của mỗi tế bào nhu mô gan tiếp xúc một phần với khoảng Disse, một phần với lòng vi quản mật và phần còn lại với các tế bào gan kề bên (khoảng 50%) Chính những

tế bào này góp phần hình thành nên các đĩa gan Tế bào nhu mô gan có nhân hình tròn, chiếm thể tích 5-10% Khoảng 25% tế bào có hai nhân, 15% tế bào có 4 nhân Ngoài

ra, tế bào này còn chứa nhiều mạng lưới nội chất trơn và nhám, thể Golgi, ti thể, peroxisome Tế bào nhu mô gan đảm nhận nhiều chức năng như: thu nhận, vận chuyển, tổng hợp, biến dưỡng và thoái dưỡng các đại phân tử (protein, lipid, carbohydrate), các hormone và các hợp chất thứ cấp [29]

Tế bào thuộc xoang gan

Tế bào nội mô: hình thành nên hàng rào của xoang gan Với các lỗ trên màng có đường kính khoảng 100nm, chúng cho phép các phân tử nhỏ đi qua Ngoài ra, các tế bào này còn chứa nhiều túi thực bào cho thấy khả năng thực bào cao Không những vậy, các tế bào nội mô còn thể hiện sự tương tác với các tế bào miễn dịch thông qua các thụ thể scavenger, thụ thể Fc IgG, hay phân tử CD4 [53]

Tế bào Kuffer: được đính vào hàng rào tế bào nội mô, nằm bên trong xoang gan, chứa nhiều lysosome (chiếm 1/4 toàn bộ lysosome của gan), với chức năng chính là thực bào các phân tử latex, albumin bị biến tính, cũng như vi khuẩn và các phức hợp miễn dịch

Các tế bào lympho: chiếm số lượng rất ít trong gan, bằng khoảng một phần mười

số lượng các tế bào Kuffer, với chức năng chính là kháng khối u và kháng vi rút Mô gan chứa nhiều loại tế bào lympho khác nhau, phần lớn trong số chúng là các tế bào lympho có kích thước lớn và có hạt gọi là tế bào pit Các tế bào này có khả năng tương tác với tế bào Kuffer và tế bào nội mô Để phân biệt các tế bào lympho cư ngụ tại mô gan với các tế bào lympho thuộc máu ngoại vi, ta có thể dựa vào hình dạng và khả năng gây độc của tế bào này

Tế bào hình sao HSC: còn được gọi là các tế bào nằm ngoài xoang gan hay tế bào Ito Đây là các tế bào thuộc họ các nguyên bào sợi cơ, không có màng cơ bản bao quanh, cư ngụ tại các khoảng Disse Ở mô gan bình thường, các tế bào hình sao đảm nhiệm chức năng chính là dự trữ chất béo cho cơ thể, phần lớn là vitamin A Tuy nhiên, khi mô gan chịu sự tác động của các tổn thương mạn tính, dưới sự kích hoạt chủ yếu của TGF-β, tế bào hình sao được hoạt hóa, chuyển biệt hóa thành nguyên bào sợi cơ Một khi HSC được hoạt hóa, chúng tiến hành di cư và tích tụ tại các vùng mô đang hồi phục, cũng như tăng cường tiết ECM để điều hòa lại sự thoái biến ECM do tổn thương gây ra Từ một HSC chưa được hoạt hóa biểu hiện các marker cho tế bào tạo mỡ như

PPARγ, SREBP-1c, leptin, sau khi được hoạt hóa, chúng chuyển biệt hóa thành tế bào nguyên bào sợi cơ và biểu hiện các marker của tế bào tạo cơ như α-SMA, c-myb, myocyte enhancer factor – 2 [47]

1.1.2 Khả năng tái sinh của gan

Khả năng tái sinh mạnh của gan cho phép gan phục hồi về cấu trúc cũng như về chức năng [38, 39] Khả năng này được thấy ở tất cả các động vật có xương sống, từ lớp cá cho đến người Một trong những nghiên cứu đầu tiên chứng minh khả năng tái sinh của gan được thực hiện bởi nhà khoa học Higgin vào năm 1931 Trong nghiên cứu này, Higgin đã thực hiện cắt bỏ 2/3 gan của động vật gặm nhấm (chuột rat và mice) bằng cách cắt bỏ 3/5 thùy gan mà không làm ảnh hưởng đến 2 thùy còn lại Sau 5 đến

7 ngày, ông tiến hành cân lại khối lượng của gan và nhận thấy rằng khối lượng gan đã trở lại như ban đầu, cho thấy rằng các tế bào gan đã tiến hành tăng sinh, hồi phục chức năng [25] Quá trình tái tạo mô gan bao gồm một chuỗi các hoạt động diễn ra liên tiếp

Ở giai đoạn đầu, khi mô gan bị tổn thương, với sự kích hoạt của hệ thống miễn dịch bẩm sinh của cơ thể, đồng thời với sự tương tác giữa các tế bào nhu mô gan còn lại với các tế bào không thuộc nhu mô gan, các tế bào nhu mô gan bắt đầu đi vào chu trình tế bào, chuẩn bị nhân đôi Khoảng 12 giờ sau thủ thuật cắt gan, các nhân tố phiên mã cần thiết cho sự nhân đôi DNA được hoạt hóa [17]

1.2 Bệnh xơ gan

1.2.1 Định nghĩa

Xơ hóa gan (liver fibrosis) được mô tả là sự hình thành các vách xơ trong mô gan Quá trình này bao gồm sự chết của các tế bào gan và sự thay thế các tế bào này bởi rất nhiều các mô sợi liên kết làm gan trở nên chắc hơn và bề mặt xuất hiện các nốt sần Xơ hóa gan là kết quả của việc tập trung quá mức của các thành phần của chất nền ngoại bào (bao gồm collagen, glycoprotein, proteoglycan) trong gan Xơ hóa gan có thể đảo ngược hay hồi phục, nhưng khi đã tiến triển thành xơ gan (cirrhosis) thì không thể hồi phục Xơ gan là giai đoạn cuối cùng và là kết quả tất yếu của tất cả các tổn thương gan mãn tính Xơ gan được phân thành 2 loại: xơ gan hòn lớn - macronodular (nốt 3 mm trở lên) và xơ gan hòn nhỏ - micronodular (nốt bé hơn 3 mm) [40] Sự tiến triển của tổn thương gan dẫn đến xơ gan có thể xảy ra trong vài tuần tới vài năm Hậu quả của xơ gan là sự suy giảm chức năng sinh học của gan, lâu ngày dẫn đến suy gan, ung thư gan

1.2.2 Dịch tễ học

Theo nghiên cứu dịch tễ học giai đoạn 1980-2010 ở 187 quốc gia của Lozano và cộng sự (2012) cho thấy, số ca tử vong ở bệnh nhân mắc xơ gan tăng từ 676.000 người (chiếm 1,54% tổng số người chết trong năm 1980), lên tới hơn 1 triệu người ( chiếm 2% tổng số người chết trong năm 2010) [37] Cũng trong nghiên cứu này, trong suốt 20 năm (1990-2010) xơ gan luôn là căn bệnh có nguy cơ gây tử vong cao (đứng thứ 12 trong số 25 nguyên nhân gây tử vong hàng đầu) Theo thống kê từ WHO (2015) có 20%-50% người mắc bệnh xơ gan là do lạm dụng thức uống có cồn, 20-30% người mắc HBV mạn tính có thể tiến triển thành xơ gan, tỷ lệ này ở người mắc HCV mạn tính là 15%-25% Hiện chưa có các thống kê chính thức về số lượng người mắc bệnh xơ gan

ở Việt Nam [22] Tuy nhiên, Việt Nam nằm trong vùng nguy cơ cao HBV, HCV (gần

10 triệu người có HBV, 1 triệu người có HCV trong cơ thể) và là quốc gia có lượng tiêu thụ thức uống có cồn lớn [36] Vì vậy với các nguy cơ nêu trên, các chuyên gia dịch tễ học dự đoán hiện tại và tương lai gần, tỷ lệ dân số mắc bệnh xơ gan ở Việt Nam vẫn còn tăng cao[22]

1.2.3 Bệnh nguyên

Xơ gan xuất phát từ nguyên nhân gan bị tổn thương liên tục và trải qua quá trình viêm gan kéo dài Tổn thương gan có thể được gây ra bởi các tác nhân bên ngoài như: viêm gan do viêm nhiễm (nhiễm virus viêm gan siêu vi A, B và C, do nhiễm ký sinh trùng, sán máng (schistosomia mansoni), sán lá nhỏ (clonorchis sinensis), nhiễm vi khuẩn đường ruột, vi khuẩn mang độc tố gây hại, trùng amip, nấm), tế bào gan bị tổn thương do tiếp xúc trong thời gian dài với các hóa chất độc hại từ môi trường, thực phẩm, nước uống, các loại thuốc, kháng sinh, hay việc lạm dụng các loại thức uống có cồn

Ngoài ra, gan còn có thể bị thương tổn bởi sự sai hỏng hệ thống miễn dịch như: các bệnh viêm gan tự miễn, xơ ống mật sơ cấp và thứ cấp, bệnh Graft-versus-host Một số bệnh do rối loạn chuyển hóa các chất như Wilson’s disease, béo phì hoặc tiểu đường gây chứng bệnh gan nhiễm mỡ, hội chứng thừa chất sắt (Haemochromatosis) cũng dẫn đến thương tổn ở gan Một số nguyên nhân do rối loạn cơ chế và cấu trúc gan như tắc nghẽn ống mật, rối loạn mạch máu cũng là nguyên nhân gây tổn thương cho gan Sau các tổn thương nêu trên, nếu gan không được bảo vệ, các nguyên nhân gây tổn thương gan không được loại bỏ, bệnh sẽ tiến triển thành viêm gan, xơ hóa gan và cuối cùng là xơ gan

1.2.4 Bệnh sinh [24, 25, 31, 38, 58]

Xơ hóa là sự thay thế hoặc bao bọc vùng tổn thương bằng các dãy collagen Khởi phát của quá trình xơ hóa gan là những đáp ứng nhằm chữa lành vết thương ở mô gan Đây là các đáp ứng thông thường mà kết quả là sự chữa lành vùng mô bị tổn thương Quá trình này chịu ảnh hưởng của các nhân tố tiền viêm, viêm, tế bào miễn dịch, tế bào hình sao, tế bào Kupffer Tuy nhiên, nếu các nguyên nhân gây tổn thương gan không được khắc phục, mô gan tiếp tục bị tổn thương, quá trình đáp ứng chữa lành vết thương

ở gan phải diễn ra liên tục và kéo dài, mô gan sẽ bắt đầu xuất hiện bệnh lý xơ hóa Dấu hiệu đầu tiên của xơ hóa gan là sự thay đổi về lượng và thành phần cấu trúc ECM (Extracellular matrix) Các thành phần trong ECM không còn cân bằng như ở gan bình thường và lượng ECM ở gan bị xơ hóa tăng cao hơn gấp nhiều lần Các dãy xơ hóa được hình thành (thành phần chủ yếu là collagen) Việc hình thành các dãy xơ hóa sẽ

tùy thuộc vào nguyên nhân gây tổn thương và vùng gan bị tổn thương Tiếp theo là sự thay đổi cấu trúc và hình dạng mô học của gan mà quan trọng nhất là sự biến dạng các mạch máu Sự thay đổi cấu trúc này có thể dẫn đến việc kém cung cấp dinh dưỡng cho

tế bào gan và gây ra tình trạng tổn thương mô gan kéo dài Khi các dãy xơ hóa này liên kết lại với nhau tạo xơ hóa bắc cầu (bridging fibrosis) gan xơ hóa sẽ tiến triển thành xơ gan

Ở gan tổn thương, hàng loạt các biến đổi xảy ra trong cấu trúc cũng như chức năng của mọi tế bào trong gan dưới sự điều khiển của những tín hiệu nội bào Trung tâm chính của quá trình xơ hóa gan là sự hình thành các nguyên bào sợi cơ (một dạng nguyên bào sợi hoạt hóa-myofibrolast) Chúng đóng vai trò quan trọng trong cơ chế làm lành các tổn thương, tạo ra các tổ chức xơ như tham gia tổng hợp collagen, tiết các MMPs, TIMPs… đồng thời, còn tham gia vào quá trình tái sinh và hình thành mạch

Ở gan bình thường, các tế bào gan tồn tại thành từng lớp đơn tế bào phân cách nhau bởi các xoang sinusoid chứa các tế bào như HSC (tế bào hình sao), Kupffer… HSC tồn tại ở dạng yên lặng, thực hiện chức năng dự trữ các giọt dầu chứa vitamin A, cân bằng

sự tổng hợp chất nền ngoại bào, tham gia vào sự phát triển của gan, điều hòa mạch và biến dưỡng thuốc cũng như các chất độc Khi gan bị tổn thương, các tế bào HSC giảm tích trữ vitamin A, mất đi dạng hình sao đặc trưng HSC tiếp xúc với các cytokine như PDGF, TGF-β1 tiết ra từ tế bào Kupffer hoạt hóa và các tế bào gan bị tổn thương, chuyển biệt hóa thành tế bào nguyên bào sợi cơ Tế bào này trực tiếp tham gia vào quá trình tiết collagen và sự giảm biểu hiện các enzyme giữ vai trò trong việc phân giải và thoái hóa ECM mà quan trọng nhất là MMP2, MMP3, MMP9 Ngoài ra chúng làm tăng cường phiên mã các yếu tố ức chế hoạt tính của MMPs như TIMP1-2, dẫn tới MMPs mất hoạt tính

Ngoài HSC, một số tế bào khác trong gan cũng có khả năng chuyển biệt hóa thành nguyên bào sợi cơ Tuy nhiên, các quá trình này diễn ra ở giai đoạn sau của sự xơ hóa,

và làm cho tình trạng xơ hóa gan trở nên nghiêm trọng hơn Ở gan bình thường, máu đem các chất dinh dưỡng vào các xoang sinusoid, máu tới tiếp xúc với các tế bào gan nhờ vào các lỗ thông nhau giữa các tế bào nội bì ngăn cách sinusoid và khoảng Disse Tuy nhiên, trong gan bị tổn thương, các lỗ thông này bị đóng lại, gây ảnh hưởng đến

quá trình biến dưỡng trong các tế bào gan Do đó, các tế bào gan dần chết theo chương trình hoặc bị hoại tử Đồng thời, quá trình tổng hợp collagen các loại I, III, IV, VI, các glycoprotein cũng như các proteoglycan, fibronectin, undulin, elastin, laminin, hyaluronan tăng đến 6 lần so với gan bình thường trong khoảng Disse Để hạn chế các tác động trên, một số tế bào trong gan trải qua quá trình EMT (Epithelial mesenchymal transition) EMT là quá trình cho phép tế bào biểu mô (phân cực và có các liên kết tế bào-tế bào, tế bào-chất nền ngoại bào tương tác thường xuyên với lớp màng đáy) chuyển đổi các đặc trưng sinh hóa để trở thành tế bào trung mô (có khả năng tăng sinh cao, khả năng xâm lấn, kháng apoptosis và đặc biệt là tăng sản xuất các thành phần chất nền ngoại bào)

Hình 1 2: Các con đường hình thành myofibroblast [23]

Hai nguồn tế bào chính cho quá trình này là tế bào gan (hepatocytes) và tế bào biểu

mô ống mật (cholangiocytes) Do sự thiếu oxi trong mô hoặc các cytokine tiết ra từ tế bào viêm như TGF-β, collagen type I, MMP-2, MCP-1, các marker đặc trưng của tế bào biểu mô (E-cadherin, cytokeratin…) giảm biểu hiện, đồng thời, tăng biểu hiện các marker tế bào trung mô (α-SMA, vimentin, fibronectin, FSP-1…) Dẫn đến việc các tế bào biểu mô bước vào quá trình EMT để chuyển biệt hóa thành các myofibroblast Các quá trình này giúp giảm lượng tế bào phải đi vào chương trình chết hoặc bị hoại tử do

thiếu chất dinh dưỡng nhưng đồng thời làm tăng số lượng nguồn cung cấp thành phần chất nền ngoại bào, làm trầm trọng thêm sự xơ hóa gan

1.2.5 Các hậu quả của bệnh xơ gan

Hậu quả chính của xơ gan là gây suy chức năng gan và tăng huyết áp tĩnh mạch cửa.[1, 34] Suy chức năng gan làm giảm khả năng tổng hợp protein huyết thanh; giảm tổng hợp chất chống đông máu gây bầm tím, chảy máu; giảm chức năng tiết mật, giảm chuyển hóa bilirubin gây vàng da; thay đổi chuyển hóa đạm gây giảm chức năng não, hay quên, mất tập trung, khó ngủ… do các chất đạm cần cho não như ammonia không được cung cấp đủ; giảm khả năng giải độc của gan, giảm khả năng chuyển hóa thuốc… Tăng huyết áp ở tĩnh mạch cửa gây ra các chứng bệnh cổ chướng, lách to, giãn mạch thực quản, tăng huyết áp phổi, gây xanh tím, khó thở … Ngoài ra còn gây giảm khả năng miễn dịch, tăng nguy cơ mắc bệnh do nhiễm trùng, tăng nguy cơ ung thư gan dẫn đến tử vong, dễ nghẽn tĩnh mạch gan, không cung cấp đủ máu cho thận gây suy thận

1.2.6 Các liệu pháp điều trị xơ gan

Hiện nay không có thuốc đặc trị cho bệnh xơ gan, việc điều trị xơ gan chủ yếu kết hợp biện pháp trị nguyên nhân và trị triệu chứng Vì vậy tùy vào mức độ của bệnh và nguyên nhân gây bệnh, bác sĩ điều trị sẽ đưa ra phác đồ điều trị phù hợp Xơ gan thường chỉ được phát hiện ở giai đoạn cuối, khi bệnh đã biểu hiện thành triệu chứng rõ rệt, nên bệnh nhân khó có thể được điều trị khỏi, việc điều trị chủ yếu là điều trị biến chứng của bệnh [34].Biện pháp đầu tiên và cần thiết nhất trong điều trị là loại bỏ các tác nhân gây ra bệnh như: ngừng sử dụng rượu đối với người bị xơ gan do rượu, ngừng tiếp xúc với các hóa chất độc hại đối với người bị xơ gan do nhiễm hóa chất, sử dụng thuốc ức chế và tiêu diệt virus như IFN và PEG-Interferon mục tiêu chính ngăn chặn sự sao chép

và xâm nhiễm sang tế bào gan mới đối với bệnh gan do virus Sau khi đã loại bỏ các tác nhân thì tiếp đó là quá trình điều trị các biến chứng Chứng cổ trướng và phù thủng thường đáp ứng tốt với khẩu phần ăn ít Natri Đối với tăng áp tĩnh mạch cửa, có thể sử dụng thuốc beta-blocker hoặc nitrat Bệnh não do gan được điều trị bằng cách rửa ruột với lactulose Khi gan đã suy giảm chức năng một cách trầm trọng, bệnh nhân có thể phải sử dụng biện pháp ghép gan từ các nguồn hiến tặng Đây là liệu pháp tốt nhất cho bệnh gan giai đoạn cuối Liệu pháp này làm tăng tỉ lệ sống sót của bệnh nhân sau 5 năm

lên 75% Tuy nhiên, vấn đề lớn nhất của liệu pháp ghép gan là nguồn gan hiến tặng rất

ít, nguy cơ thải loại mô do dị ghép, sự rủi ro trong lúc phẫu thuật, và chi phí điều trị cao.Vì vậy, các nhà khoa học, các bác sĩ luôn quan tâm đến việc tìm ra những liệu pháp thay thế khác nhằm điều trị xơ gan, trong đó liệu pháp tế bào gốc một liệu pháp đầy hứa hẹn

1.3 Liệu pháp tế bào gốc trong điều trị xơ gan

Sử dụng tế bào gốc từ tuỷ xương

Năm 2004, Isao Sakaida và cộng sự cấy ghép tế bào gốc tuỷ xưởng kết hợp với CCl4 vào chuột bị xơ hoá gan Kết quả cho thấy, chuột mô hình bệnh xơ gan giảm đáng kể

sự xơ hoá gan Anjos-Afonso và cộng sự (2004) dùng tế bào gốc tuỷ xương chuô ̣t cấy ghép qua tĩnh ma ̣ch đuôi cho thấy sự chuyển biê ̣t hoá thành tế bào giống tế bào gan trong chuô ̣t nhâ ̣n [6] Alison và cộng sự (2000), thử nghiê ̣m lâm sàng trên người, sử

du ̣ng nhiễm sắc thể giới tính để phân biê ̣t tế bào cấy ghép từ người nhâ ̣n có giới tính khác biê ̣t Korbling và cộng sự (2002), Theise và cộng sự (2000) chứng minh tế bào gốc từ tuỷ xương có thể hoà nhâ ̣p vào gan và chuyển biê ̣t hoá thành tế bào gan trưởng thành[32, 58] Nikeghbalian và cộng sự (2011) ghép tự thân tế bào đơn nhân và có CD133+ từ tủy xương vào các bệnh nhân xơ gan, kết quả cho thấy các phục hồi khả quan ở bệnh nhân xơ gan[46]

Sử dụng tế bào gốc từ mô mỡ

ADSC là các MSC đa tiềm năng nằm trong mô mỡ, có khả năng tự làm mới và biệt hóa thành nhiều dòng tế bào, trong đó có các tế bào gan [5] Theo Rehman và cộng sự (2004), các tế bào gốc trong cơ thể hoạt động như những tế bào cận tiết hoặc nội tiết, chúng tiết ra các tín hiệu sinh học như yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF), yếu tố tăng trưởng tế bào gan (HGF), yếu tố chuyển đổi tăng trưởng beta (TGF- β ) tác động đến các tế bào bên cạnh [48] Trong nghiên cứu của Katsuda và cộng sự (2014), ADSC được cấy ghép vào chuột giúp phục hồi mô gan tổn thương Nghiên cứu này cũng đã chứng minh hiệu quả phục hồi mô gan là do ADSC tiết các chất cận tiết và thực hiện các quá trình điều hòa những tế bào trong gan [27] Rony Avritscher và cộng sự (2013) tiến hành ghép ADSC có đánh dấu bằng GFP vào tĩnh mạch cửa gan lợn Kết quả ADSC -GFP đã nằm trong không gian tế bào nội mô, và một số đã nằm trong vùng

quanh tĩnh mạch cửa gan sau 1-2 giờ ghép tế bào [8] Sự tồn tại của ADSC mang gen đánh dấu huỳnh quang GFP chứng tỏ sự di cư và tập trung các tế bào tiềm năng vào vị trí mục tiêu thực hiện các chức năng sau đó Banas và cộng sự (2009) đã cấy ghép tế bào gốc từ mô mỡ thông qua tiêm tĩnh ma ̣ch đuôi chuột, kết quả cho thấy có sự biê ̣t hoá của tế bào ghép thành tế bào gan trưởng thành ở chuô ̣t BALB/c nude bi ̣ xơ gan do cảm ứng CCl4 Akihiro Seki và cộng sự (2013) đã tiến hành thí nghiệm cấy ghép tế bào gốc

mỡ vào chuột mô hình Kết quả cho thấy việc cấy ghép tế bào gốc mỡ giúp hạn chế sự hoạt động của tế bào hình sao hoạt động, giảm các biểu hiện viêm gan, góp phần cải thiện chức năng và tái tạo gan ADSC là nguồn MSC dồi dào, lượng tế bào gốc nhiều hơn khoảng 40 lần so với tủy xương [27, 28] ADSC dễ dàng thu nhận, ít xâm lấn sâu vào cơ thể Do vậy, ADSC là ứng cử viên mạnh mẽ cho y học tái tạo và những nghiên cứu về sự biệt hóa của chúng

Sử dụng tế bào gốc từ máu cuống rốn

Thí nghiệm cấy ghép 105 tế bào UC-MSC trên mô hình chuột xơ gan của Ishikawa

và cộng sự (2003) cho thấy các tế bào sau ghép di cư về gan và biệt hóa thành các tế bào giống tế bào gan một cách độc lập không qua dung hợp với các tế bào gan trưởng thành [26] Tsai và cộng sự (2009) tiến hành tiêm 5.105 tế bào vào thuỳ phải gan chuô ̣t

bi ̣ xơ, kết quả cho thấy có sự kiềm chế xơ gan, dù chúng không biê ̣t hoá thành tế bào gan trưởng thành Trong nghiên cứu này tác giả đã đề ra giả thuyết về việc các tế bào gốc không biê ̣t hoá có thể tiết ra các cytokine nhất đi ̣nh như human cutaneous T cell-attracting chemokine, leukemia inhibitory factor, và prolactin sẽ giúp duy trì chức năng gan và kích thích sự tái ta ̣o gan nô ̣i sinh[61] Abdel và cộng sự (2010) đã tiến hành ghép quần thể tế bào UCB-MSC dương tính với CD34 trên mô hình chuột Kết quả cho thấy sự cải thiện đáng kể chức năng gan các vùng xơ hóa ở gan chuột mô hình, cùng với sự biểu hiện MMP-2, Albumin của người trong mô gan chuột mô hình[2]

Sử dụng tế bào gốc phôi trong điều trị xơ gan

Forbes và cộng sự (2012) chỉ ra rằng tế bào gốc phôi có khả năng biê ̣t hoá thành tế bào giống tế bào gan [18] Teratani và công sự (2005) [57], Kumashiro và cộng sự (2005) [33]tiến hành cấy ghép tế bào gan thu từ tế bào gốc phôi vào lách hoă ̣c gan tổn

thương của chuô ̣t nhâ ̣n, tình tra ̣ng xơ gan được hạn chế, chức năng gan và khả năng sống được cải thiê ̣n

1.4 Tế bào gốc trung mô

1.4.1 Các đặc điểm của tế bào gốc trung mô

Tế bào gốc trung mô (MSC) được phát hiện ra vào năm 1966 bởi Alexander Friedenstein và các cộng sự MSC có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như tủy xương, mô mỡ, máu cuống rốn, dịch ối, nhau thai, tủy răng, dây chằng, màng hoạt dịch,

da và cơ xương Tế bào gốc trung mô có khả năng bám dính khi được nuôi cấy lớp đơn

in vitro, có khả năng tăng sinh cao mà vẫn giữ được trạng thái không biệt hóa Chúng

có khả năng biệt hóa thành các tế bào xương, sụn, mỡ, các tế bào thuộc gan và nhiều loại tế bào khác có nguồn gốc từ trung mô khi được nuôi cấy trong môi trường phù hợp Chúng có thể hình thành quần thể từ các tế bào đơn (single - cell populations) khi được

nuôi cấy in vitro với mật độ rất thấp 1-10 tế bào/cm2

Theo nhiều nghiên cứu, khả năng di cư tới vị trí tổn thương (homing), khả năng điều biến hệ thống miễn dịch cũng như khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác của MSC có thể bị phụ thuộc vào nguồn mô thu nhận MSC Các thành phần đặc biệt tồn tại trong vi môi trường nơi MSC tồn tại sẽ góp phần quyết định các khả năng và tiềm năng của MSC

Khả năng di cư đến vùng bị tổn thương (homing) của tế bào gốc trung mô

MSC biểu hiện những protein bề mặt góp phần hình thành khả năng di cư và homing tại vị trí mô, cơ quan tổn thương trong cơ thể Một trong những phân tử quan trọng đó

là CXCR4 và c-met CXCR4 (C-X-C chemokine receptor type 4) là nhân tố đóng vai trò trung tâm trong quá trình di cư và homing Đây là một thụ thể biểu hiện trên MSC Theo công trình của Yuan và cộng sự (2013), MSC tăng mức độ biểu hiện CXCR4 trong trường hợp gây tổn thương lên tế bào so với đối chứng Đồng thời, khi bị tổn thương, SDF-1 (stromal derived factor 1) cũng tăng cao trong môi trường nuôi Chính liên kết đặc hiệu giữa CXCR4 trên MSC và SDF-1 tại vị trí tổn thương đã dẫn dắt MSC

di cư theo hướng xác định Ngoài ra, một thụ thể khác là c-met cũng tham gia vào quá trình di cư, homing của tế bào gốc trung mô Trong trường hợp gan bị tổn thương, HGF

(hepatocyte growth factor) là một trong những nhân tố tăng trưởng được tăng cường tiết Chúng tham gia tăng cường tái tạo gan và tăng sinh tế bào gan Sự chênh lệch nồng

độ HGF này dẫn đến việc di cư MSC từ vị trí cấy ghép đến vùng mô gan tổn thương Bên cạnh đó, việc tăng cường tiết IL-8 trong trường hợp gan tổn thương, gây kích thích tăng sản xuất MMP9 Các enzyme phân giải chất nền này tăng tạo điều kiện MSCs phóng thích khỏi tủy xương, hỗ trợ cho quá trình di cư của tế bào gốc trung mô

Khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau [62]

Khả năng biệt hóa thành tế bào có nguồn gốc trung bì phôi như xương, mỡ và sụn được xem là một trong những tiêu chí quan trọng trong định danh tế bào gốc trung mô Ngoài ra, MSCs còn có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác thuộc cả nội bì

và ngoại bì phôi như tế bào gan, phổi, nguyên bào sợi, tế bào thần kinh, tế bào cơ, biểu

mô da và ruột Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện nhằm tìm ra điều kiện cần thiết cho khả năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô thành tế bào gan Đây là một tiền đề quan trọng cho việc cải thiện các phương pháp trong liệu pháp cấy ghép tế bào trong điều trị

xơ gan

Hình 1 3: Khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào của MSC [62]

Khả năng ức chế miễn dịch, ngăn cản thải loại [3, 44]

Tế bào gốc trung mô có tiềm năng điều hòa hệ thống miễn dịch thông qua một phản ứng quan trọng: ức chế sự tăng sinh tế bào T MSC biểu hiện rất thấp MHC-I và MHC-

II trên bề mặt, đồng thời, các phân tử đồng kích thích cũng giảm như CD80, CD86, CD40 Chính biểu hiện này làm giảm sự tiếp xúc của tế bào T lên MSC, ngăn cản các tín hiệu gây đáp ứng miễn dịch Ngoài ra, MSC còn có khả năng ức chế sự tăng sinh, hoạt động chức năng và gây độc của các tế bào T MSC có khả năng ức chế sự tiết TNF-

 của tế bào tua (dendritic cell) dẫn tới tế bào Th-1 giảm tiết IFN- (một thành phần tham gia phản ứng viêm) Trong khi đó, MSC kích thích tế bào tua tăng tiết IL-10 nhằm tăng sản xuất IL-4 từ tế bào Th-2 và tăng tỉ lệ biệt hóa tế bào T ngây thơ thành tế bào T điều hòa Vai trò của IL-10 đóng góp rất lớn trong khả năng điều hòa miễn dịch của MSC Chúng tham gia vào việc giảm biểu hiện MHC-II, giảm sự trưởng thành của tế bào tua, giảm các yếu tố gây viêm như IL-1, IL-6, TNF- IL-1 và TNF- còn là hai nhân tố kích thích sự tăng sinh của tế bào nội bì và nguyên bào sợi, hỗ trợ thêm cho quá trình hình thành mạch máu, thu hút các tế bào miễn dịch đến làm lành tổn thương bằng

cơ chế tạo sẹo Khả năng ức chế hoạt động của hai phân tử này giúp MSC ngăn cản một phần quá trình viêm và tạo xơ

Hình 1 4: Khả năng điều biến miễn dịch của MSC [3]

Mặt khác, với khả năng tiết các phân tử như prostaglandin E2 (PGE2), indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) và HLA-G5 hòa tan (soluble HLA-G5), MSC ức chế sự tăng sinh và gây độc của tế bào diệt tự nhiên dạng nghỉ (resting natural killer cells) và kích thích tế bào diệt tự nhiên dạng hoạt hóa giảm tiết IFN-

1.4.2 ADSC- Tế bào gốc trung mô có nguồn gốc từ mô mỡ

ADSC là tế bào gốc trung mô thu từ mô mỡ Do đó, ADSC mang đầy đủ các đặc điểm của một tế bào gốc trung mô, bao gồm khả năng biệt hóa thành tế bào gan [66] Ngoài ra, ADSC có rất nhiều ưu điểm: số lượng dồi dào, dễ dàng thu nhận bằng các phương pháp ít xâm lấn, có khả năng tăng sinh in vitro mạnh [66] Hơn thế nữa, khi tiến hành phân lập ADSC thì đạt được tỉ lệ là 100% [28]

Nhiều nghiên cứu đã ứng dụng ADSC trong điều trị các bệnh về gan, từ in vitro đến

in vivo Vào năm 2005, tác giả Seo vào cộng sự đã tiến hành nuôi cảm ứng biệt hóa ADSC thành tế bào giống tế bào gan trong môi trường có bổ sung các nhân tố HGF và OSM (oncostatin) [54] Những nghiên cứu sau đó đã bổ sung thêm nhiều nhân tố khác như DEX (dexamethasone), Insulin-transferrin-sodium selenite (ITS), bone morphogenetic protein 2 (BMP2) Đến năm 2014, tác giả Li và cộng sự đã thành công trong biệt hóa tế bào gốc ADSC thành tế bào gan với đầy đủ các kiểu hình chức năng [35] Theo công bố này, tác giả Li và cộng sự đã tạo ra một vi môi trường in vitro tương

tự như môi trường trong quá trình phát triển của gan ở giai đoạn sớm

Trong nghiên cứu của tác giả Banas và cộng sự vào năm 2009 [10], tác giả đã tiến hành cảm ứng biệt hóa tế bào gốc ADSC thành tế bào giống tế bào gan và cấy ghép vào

mô hình chuột bị tổn thương gan cấp tính Theo công bố này, sau 24 giờ cấy ghép, tác giả ghi nhận được có 10% tế bào cấy ghép di cư tới gan, hoạt độ men về mức bình thường, và tỉ lệ các tế bào apoptosis có xu hướng giảm Vào năm 2013, trên mô hình tổn thương gan cấp tính, tác giả Koellensperger và cộng sự đã chứng minh được rằng

tế bào gốc ADSC giúp cải thiện chức năng gan thông qua sự cải thiện về các chỉ số albumin, glutamic oxaloacetic transaminase, lactate dehydrogenase [31] Ngoài ra, theo công bố của tác giả Harn HJ và cộng sự vào năm 2012, tế bào ADSC giúp phục hồi chức năng gan cũng như cải thiện độ viêm, xơ trên mô hình chuột bị tổn thương gan mạn tính [24] ADSC có khả năng ngăn chặn sự xơ hóa gan thông qua điều hòa sự tổng

hợp cũng như phân giải collagen Đồng thời, ADSC còn ngăn sự hoạt hóa của tế bào hình sao

1.5 HGF- Yếu tố tăng trưởng tế bào gan

Vào năm 1984, khi mới được phát hiện, HGF (hepatocyte growth factor) được biết đến như là nhân tố kích thích sự nhân đôi của tế bào nhu mô gan [41, 43] Tuy nhiên, hiê ̣n nay, nhắc tới HGF, các nhà khoa ho ̣c nghĩ về HGF như mô ̣t cytokine với nhiều chức năng như là: nhân tố kích thích sự phân bào, nhân tố liên quan đến sự phát sinh hình thái [9, 20] Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng HGF là mô ̣t ligand cần thiết cho sự phát triển và tái ta ̣o của mô gan [16, 20, 51]

HGF được sản xuất bởi các tế bào không thuô ̣c lớp nhu mô, bao gồm nguyên bào sợi, đa ̣i thực bào Tuy nhiên, thu ̣ thể của HGF la ̣i là c-met, được biểu hiê ̣n ở các tế bào thuô ̣c lớp nhu mô [9, 20, 51]

HGF được phân lâ ̣p lần đầu tiên vào năm 1984 như là mô ̣t nhân tố kích thích tế bào gan trưởng thành nhân đôi [41, 49] HGF là mô ̣t heterodimer, được cấu thành bởi chuỗi

α có kích thước 69-kD và mô ̣t chuỗi β có kích thước 34-kD [42, 43] Thu ̣ thể của HGF, c-met, là mô ̣t sản phẩm của oncogene Cấu trúc của c-met bao gồm hai thành phần chính: mô ̣t chuỗi α nă ̣ng 50-kD và mô ̣t chuỗi β nă ̣ng 145-kD Khi HGF gắn lên c-met, phức hợp tyrosine kinase được hoa ̣t hóa, qua đó kích thích các hoa ̣t đô ̣ng của tế bào như quá trình nhân đôi, motogenic hay kích thích sự phát sinh hình thái thông qua mô ̣t chuỗi các phản ứng phosphoryl hóa

Hình 1 5 Cấu trúc của HGF (A) và Tương tác giữa HGF và thụ thể c-met (B) [37]

HGF là nhân tố điều hòa chức năng của MSC thông qua kích thích MSC di cư đến

mô tổn thương Vào năm 2004, tác giả Sabine Neuss cùng cô ̣ng sự cho thấy rằng MSC vừa có khả năng tiết HGF vừa biểu hiê ̣n thu ̣ thể của HGF là c-met ở mức phiễn mã và dịch mã [45] Theo nghiên cứu vào năm 2006 của Forte và cô ̣ng sự, khi ông tiến hành thử nghiê ̣m khả năng di cư của MSC ở mức in vitro khi được xử lý trong môi trường có bổ sung HGF, ông đưa ra kết luâ ̣n rằng HGF có khả năng kích thích sự di cư của MSC đến vi ̣ trí tổn thương [19] Kết quả này hoàn toàn tương tự như công bố của Sabine Neuss vào năm 2004 [45], Sabrina Valente vào năm 2015 [63]

1.6 PRP- Huyết tương giàu tiểu cầu

Huyết tương giàu tiểu cầu (Platelet Rich Plasma – PRP) là huyết tương có nồng độ tiểu cầu cao hơn mức bình thường Thực tế PRP có nồng độ cao hơn ít nhất 5 lần so với nồng độ tiểu cầu bình thường (1 triệu tế bào / ml)

Hiện nay, nhiều quy trình phân lập, nuôi cấy tế bào gốc trung mô MSC ứng dụng trên lâm sàng sử dụng môi trường nuôi bổ sung thêm FBS/FCS để kích thích sự tăng sinh của tế bào Tuy nhiên, FBS/FCS là huyết thanh có nguồn gốc từ động vật và có chứa nhiều protein ngoại lai [56] Do đó, đây là nguồn tiềm ẩn nhiều nguy cơ gây nhiễm

vi sinh vật, đặc biệt là vi rút hay prion [4] Ngoài ra, khi tiến hành cấy ghép vào cơ thể bệnh nhân, FBS/FCS có thể gây ra đáp ứng miễn dịch [52] Chính vì vậy, để giải quyết vấn đề trên, vào năm 2007, Asli Kocaoemer cùng cộng sự đã tiến hành thử nghiệm việc thay thế FCS/FBS bằng PRP là huyết tương giàu tiểu cầu có nguồn gốc từ người Để thực hiện nghiên cứu này, ông tiến hành thu 10 mẫu tế bào gốc trung mô từ mô mỡ người, sau đó tiến hành nuôi hADSC này trong các môi trường khác nhau: một là môi trường nuôi có bổ sung 10% FCS và hai là môi trường nuôi có bổ sung 10% PRP Kết quả cho thấy rằng PRP hoàn toàn có thể thay thế cho FCS, ngoài ra PRP còn hỗ trợ hADSC tăng sinh mạnh hơn, giúp hADSC duy trì tính gốc, duy trì sự biểu hiện các marker đặc trưng cho hADSC sau một thời gian dài nuôi cấy in vitro [30]

Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng PRP có khả năng kích thích quá trình sửa chữa, tăng sinh và biệt hóa của tế bào, giúp tái tạo mô vì PRP có chứa ít nhất 7 yếu tố tăng trưởng Các nhân tố này bao gồm yếu tố tăng trưởng biểu mô (EGF - Epidermal growth factor), yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu (P-DGF – Platelet-derived

growth factor), yếu tố tăng trưởng chuyển đổi (TGF-β – Transforming growth factor), yếu tố tăng trưởng nội mạch (VEGF - Vascular endothelial growth factor), yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (FGF – Fibroblast growth factor), yếu tố tăng trưởng tương tự Insulin (Insulin-likeGF – Insulin-like growth factor), yếu tố (keratinocyteGF – keratinocyte growth factor) [12, 65]

Trong nghiên cứu vào năm 2013, tác giả Phuc Van Pham cùng cộng sự đã tiến hành

so sánh hiệu quả của liệu pháp ghép tế bào gốc trung mô từ mô mỡ người được nuôi trong môi trường có bổ sung PRP và trong môi trường có bổ sung FBS trên mô hình chuột NOD/SCID chấn thương sụn Phuc Van Pham đã đưa ra kết luận rằng liệu pháp ghép hADSC được nuôi trong môi trường có bổ sung PRP giúp điều trị tốt hơn so với môi trường bổ sung FBS, thông qua kích thích sự tăng sinh và biệt hóa của hADSC thành tế bào sụn [64]

VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chuột nhắt trắng đực (Mus musculus var Albino), 7-8 tuần tuổi được mua từ Viện

Pasteur thành phố Hồ Chí Minh Chuột được nuôi trong điều kiện 12 giờ sáng tối, cho

ăn bằng thức ăn viên và uống nước sinh hoạt Chuột được nuôi ổn định 1 tuần trước khi tiến hành nghiên cứu ở điều kiện phòng thí nghiệm

Tế bào hADSC P3 được đông lạnh và lưu trữ tại Viện Tế Bào Gốc, trường Đại học Khoa học Tự Nhiên ĐHQG TP.HCM

2.1.2 Hoá chất

Hóa chất gây xơ hóa gan

Carbon tetrachloride – CCl4 dạng lỏng, có phân tử lượng 153,82 g/mol, độ tinh khiết 99,9% (Trung Quốc)

Dầu olive (Việt Nam)

Hóa chất xét nghiệm sinh hóa: ALT, AST, Albumin

ALT (GPT) stable liquid reagent kit (IFCC Mod.LiquiUV test)

AST (GOT) stable liquid reagent kit (IFCC Mod.LiquiUV test)

QuantiChrome BCG Albumin Assay kit (Bioassay System, USA)

Hóa chất trong sinh thiết

Dung dịch Iod sát khuẩn (Việt Nam)

Thuốc mê Zoletil 50 (Virbac)

Đệm Formalin – Phosphate

Hóa chất trong nhuộm mô

Harris Haematoxylin (Merck)

Eosin (Merck)

Paraformadehyde (Merck)

Picrosirius Red Stain Kit (Polysciences)

Hóa chất tách chiết RNA tổng số

Easy _ BLUE Total RNA Extraction Kit (INTRON Biotechnology, Korea)

Chloroform (Merck)

Isopropanol (Merck)

Ethanol (Merck)

H2O cất xử lý DEPC

Hóa chất RT-PCR (Reverse transcription – PCR)

RT-PCR PreMix Kit one step (Intron)

Primer: fibronectin, GAPDH, integrin, TGFβ, Nt5e, procollagen (sigma)

Hóa chất thu nhận tế bào

Dung dịch đệm rửa tế bào PBS

Dung dịch ly giải hồng cầu

Dung dịch tách tế bào – Trypsin/EDTA 0.25%

Thuốc nhuộm Trypan blue 0,4%

Môi trường nuôi tế bào gốc trung mô (MSC) từ tủy xương chuột

DMEM/F12 (51445C-1000ML, Sigma)

FBS (10082-139, Gibco)

Antibiotic-antimycotic (A5955, Sigma)

Bảo quản 40C, sử dụng trong 1 tháng

Hóa chất chạy Flow cytometry

Môi trường biệt hóa mỡ

Thuốc nhuộm Alizarin red

Thuốc nhuộm Oil red

2.1.3 Dụng cụ-thiết bị

Dụng cụ

7 Bình định mức (1000ml 100ml, 10ml) Schott Đức