Nghiên cứu đa hình gen leptin và tương quan giữa đa hình gen leptin với năng suất chất lượng sữa và một số chỉ tiêu sinh sản trên bò lai hướng sữa có tỷ lệ máu lai holstein friesian trên 87,5 phần trăm

ỦY BAN NHÂN DÂN PHÂN VIỆN CHĂN NUÔI NAM BỘ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CNSH CHĂN NUÔI SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP

ỦY BAN NHÂN DÂN PHÂN VIỆN CHĂN NUÔI NAM BỘ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CNSH CHĂN NUÔI

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH GENE LEPTIN VÀ TƯƠNG QUAN GIỮA ĐA

HÌNH GENE LEPTIN VỚI NĂNG SUẤT, CHẤT LƯỢNG SỮA VÀ MỘT SỐ

CHỈ TIÊU SINH SẢN TRÊN BÕ LAI HƯỚNG SỮA CÓ TỶ LỆ MÁU LAI

HOLSTEIN FRIESIAN TRÊN 87,5%

Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: TT CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHĂN NUÔI

Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS NGUYỄN NGỌC TẤN

Thành phố Hồ Chí Minh - 2018

ỦY BAN NHÂN DÂN PHÂN VIỆN CHĂN NUÔI NAM BỘ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CNSH CHĂN NUÔI

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH GENE LEPTIN VÀ TƯƠNG QUAN GIỮA ĐA HÌNH GENE LEPTIN VỚI NĂNG SUẤT, CHẤT LƯỢNG SỮA VÀ MỘT

SỐ CHỈ TIÊU SINH SẢN TRÊN BÕ LAI HƯỚNG SỮA CÓ TỶ LỆ MÁU

LAI HOLSTEIN FRIESIAN TRÊN 87,5%

(Đã chỉnh sửa theo kết luận của Hội đồng nghiệm thu ngày 29/05/2018)

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT i

DANH MỤC CÁC BẢNG ii

DANH MỤC CÁC HÌNH iv

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 1.1 Chiến lược cải thiện các tính trạng kinh tế trên bò sữa Error! Bookmark not defined.

1.2 Tổng quan một số nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử trên bò sữa Error! Bookmark not defined.

1.3 Thông tin về gene leptin và chức năng sinh lý của leptin ở mức độ protein

Error! Bookmark not defined 1.4 Tóm lược một số chức năng sinh lý của leptin Error! Bookmark not defined.

1.5 Một số nghiên cứu trên thế giới sử dụng gene Leptin trên bò Error! Bookmark not defined.

1.6 Một số nghiên cứu trong nước về sử dụng chỉ thị phân tử trên vật nuôi Error! Bookmark not defined.

1.7 Mục tiêu của đề tài Error! Bookmark not defined CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined.

2.1 Nội dung 1: Phân tích thăm dò đa hình SNPs gene LEP bằng phương pháp

PCR-RFLP Error! Bookmark not defined.

2.1.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm thực hiện Error! Bookmark not defined.

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu cho nội dung 1 Error! Bookmark not defined.

2.1.3 Phương pháp tách chiết và đánh giá DNA hệ gene: Error! Bookmark not defined.

2.1.4 Quy trình ly trích DNA từ mẫu máu (sử dụng phương pháp

phenol-chloroform), các bước thực hiện như sau: Error! Bookmark not defined 2.1.5 Tiến hành định tính và định lượng DNA Error! Bookmark not defined 2.1.6 Phương pháp lựa chọn, thiết kế primer đặc hiệu đoạn gene LEP: Error! Bookmark not defined.

2.1.7 Phương pháp PCR khuếch đại đặc hiệu đoạn gene Error! Bookmark not defined.

2.1.8 Các chỉ tiêu theo dõi Error! Bookmark not defined.

2.1 Nội dung 2: Phân tích đa hình và xác định các thông số kiểu hình liên quan năng suất, chất lượng sữa và sinh sản của bò lai hướng sữa tại một số trang

trại Error! Bookmark not defined.

2.2.1 Đối tượng lấy mẫu và phương pháp thực hiện phân tích đa hình: Error! Bookmark not defined.

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu cho thu thập chỉ tiêu kiểu hình Error! Bookmark not defined.

2.2.3 Phương pháp chăm sóc nuôi dưỡng: Error! Bookmark not defined.

2.3 Nội dung 3 Phân tích mối quan hệ giữa đa hình gen LEP với các tính trạng

kiểu hình về sản xuất sữa và sinh sản Error! Bookmark not defined CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined.

3.1 Nội dung 1 Phân tích thăm dò đa hình SNPs gene LEP bằng phương pháp

PCR-RFLP Error! Bookmark not defined 3.1.1 Ly trích DNA tổng số Error! Bookmark not defined.

3.1.2 Tối ưu phản ứng PCR khuếch đại đoạn gene leptin với các cặp primer khác nhau theo điều kiện nhiệt độ bám của phản ứng và sản phẩm PCR của

các mẫu Error! Bookmark not defined.

Kết quả Hình 3.6 cho thấy ở nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 64oC và sử dụng nhiệt

độ này để thực hiện phản ứng PCR, kết quả trình bày ở Hảng 3.7 Error! Bookmark not defined.

3.1.3 Phân tích trình tự gene Error! Bookmark not defined 3.1.4 Kết quả phản ứng RFLP để nhận biết đa hình Error! Bookmark not defined.

3.2 Nội dung 2 Phân tích đa hình và xác định các thông số kiểu hình liên quan năng suất, chất lượng sữa và sinh sản của bò lai hướng sữa tại một số trang trại

Error! Bookmark not defined 3.2.1 Phân tích đa hình gene Leptin trên 100 cá thể bò Error! Bookmark not defined.

3.2.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR và phân cắt enzyme Error! Bookmark not defined.

3.2.2 Kết quả theo dõi năng suất, chất lượng sữa và một số chỉ tiêu sinh sản trên bò thí nghiệm Error! Bookmark not defined

3.2.3 Một số chỉ tiêu sinh sản của bò tại hai trại Error! Bookmark not defined.

3.3 Phân tích tương quan giữa kiểu gene LEP với năng suất, chất lượng sữa và

một số chỉ tiêu sinh sản Error! Bookmark not defined.

3.3.1 Phân tích ảnh hưởng của đa hình gene leptin ở locus LEPsig và LEPe3.1

đến năng suất và sản lượng sữa Error! Bookmark not defined.

3.3.2 Phân tích ảnh hưởng của đa hình gene Leptin ở locus LEPsig và

LEPe3.1 đến một số chỉ tiêu chất lượng sữa Error! Bookmark not defined.

3.3.3 Phân tích ảnh hưởng của đa hình gene Leptin ở locus LEPsig và

LEPe3.1 đến một số chỉ tiêu sinh sản Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined 4.1 Kết luận Error! Bookmark not defined.

4.2 Đề nghị: Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO Error! Bookmark not defined PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined Phụ lục 1 Nồng độ DNA và giá trị t số OD260 280 đo đƣợc ở mẫu Error! Bookmark not defined.

Phụ lục 2: Kết quả phân cắt bằng enzyme cắt giới hạn Error! Bookmark not defined.

PHÂN VIỆN CHĂN NUÔI NAM BỘ

TRUNG TÂM CNSH CHĂN NUÔI

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Bình dương, ngày 20 tháng 03 năm 2018

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN

I THÔNG TIN CHUNG

1 Tên nhiệm vụ: Nghiên cứu đa hình gene Leptin và tương quan giữa đa hình gene leptin với năng suất, chất lượng sữa và một số chỉ tiêu sinh sản trên bò lai hướng sữa có t lệ máu lai Holstein Friesian trên 87,5%

Thuộc: Chương trình lĩnh vực (tên chương trình/lĩnh vực):

Tên tổ chức đang công tác: Bộ môn Công nghệ Sinh học – Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh

Địa chỉ tổ chức: Phường Linh Trung, quận Thủ Đức, Tp Hồ Chí Minh

Địa chỉ nhà riêng: 439 46 39 đường Nguyễn Văn Khối, phường 8, quận Gò

1 Thời gian thực hiện nhiệm vụ:

- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 11 năm 2017

- Thực tế thực hiện: từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 05 năm 2018

Thờigian

(Tháng, năm)

Kinhphí (Tr.đ)

Thờigian (Tháng, năm)

Kinhphí (Tr.đ)

3 Đợt cuối 195 T5/2018 20,52 20,52

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:

Đối với đề tài:

Số, thời gian ban

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1 Viện CNSH

Việt nam

Viện CNSH Việt nam

Nội dung 1 01 chuyên

đề

5 Cá nhân tham gia thực hiện nhiệm vụ:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1 TS Nguyễn

Ngọc Tấn

TS Nguyễn Ngọc Tấn

Điều hành chung, phân tích dữ liệu sữa và sinh sản

2 TS Nguyễn

Thị Diệu Thúy

TS Nguyễn Thị Diệu Thúy

Nội dung 1 Chuyên đề về

thăm dò đa hình gene LEP

3 CN Nguyễn

Thị Thủy Tiên

CN Nguyễn Thị Thủy Tiên

Phân tích mẫu sữa Viết báo cáo chuyên đề

Tham gia thực hiện 03 chuyên

Thu thập dữ liệu kiểu hình trên 60 cá thể

bò tại TTG

6 Ths Lê Thị

Thu Hà

Ths Lê Thị Thu Hà

Tham gia thực hiện nội dung 2.1

7 BSTY Thái

Xuân Tiến

(Nội dung, thời gian, kinh phí,

địa điểm, tên tổ chức hợp tác,

số đoàn, số lượng người tham

1

- Lý do thay đổi (nếu có):

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

(Nội dung, thời gian,

kinh phí, địa điểm )

Ghi chú*

1 01 hội thảo, 60 người 01 hội thảo, 70 người và

03 báo cáo tham luận

Đạt 116,7%

- Lý do thay đổi (nếu có):

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

60 mẫu máu; 5 cặp primers, 11 enzyme phân cắt Chọn được

LEPsig/HhaI và LEPe3.1/BsaAI

Viện CNSH Việt nam

TT CNSH Chăn nuôi

Xác định thông số kiểu hình về năng suất, chất lượng sữa, sinh sản của

100 cá thể nghiên cứu

Chọn lấy mẫu 100 cá thể từ 2 trại (An Phú và TTG)

Thu thập thông tin về năng suất sữa đến 120 ngày của 100 cá thể

Phân tích chất lượng sữa

TT CNSH Chăn nuôi; Trại TTG và Trại An Phú

3 Phân tích mối

quan hệ giữa đa

hình gen LEP với

các tính trạng kiểu

hình về sản xuất

sữa và sinh sản

- Mức độ tương quan di truyền giữa đa hình gen LEP với tính trạng năng suất chất lượng sữa

- Mức độ tương quan di truyền giữa đa hình gen LEP với tính trạng sinh sản

- Phân tích ảnh hưởng của đa hình gene LEP tại locus LEPsig/HhaI

và LEPe3.1/BsaAI đến năng suất, chất lượng sữa Có 01 đa hình tại LEPsig HhaI có ảnh hưởng đến năng suất sữa nhưng không ảnh hưởng bất lợi đến sinh sản được tìm thấy

TT CNSH Chăn nuôi

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA NHIỆM VỤ

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

Thực tế đạt được

01 chuyên đề Đã thông qua

Hội đồng giám định

Xác định đƣợc tần

số allen, kiểu gen

Thăm dò trên 5 locus gene với 5 cặp primer và 11 enzyme phân cắt

Chọn đƣợc 02 vị trí

đa hình tại LEPsig/HhaI và LEPe 3.1/BsaAI

Thăm dò 6 primer (KH: 05) đạt 120%)

Sử dụng 11 enzyme (KH: 05) đạt 220%

01 chuyên đề

100 cá thể, 02 trại:

An Phú và Trung tâm Giống

Đạt 100% về số lượng cá thể bò thí nghiệm

- Báo cáo tương quan

di truyền giữa kiểu gen LEP với năng suất, thành phần chất lượng sữa và một số chỉ tiêu sinh sản trên bò sữa

- Đề xuất phương pháp xác định kiểu gen mong muốn phục vụ cho hỗ trợ chọn lọc cá thể giống bò sữa

01 chuyên đề Kiểu gene đề xuất:

Aa tại locus

LEPsig/HhaI

Tại locus Lepsig/HhaI,

bò mang kiểu gene có sản lượng sữa cao nhất và chưa thấy có bất lợi

về sinh sản

5 Đề xuất giải - Giải pháp được ứng Từ phương pháp Hai gene:

nghiên cứu của đề tài này, TTG đã triển khai phương pháp PCR-RFLP khảo sát đa hình gene chịu nhiệt

trên bò sữa

ATP1A1 thực hiện trong năm

chuyên đề

6 Bài báo Tạp chí chuyên ngành

trong nước (ưu tiên đăng trên Tạp chí quốc tế)

01 bài đăng trên tạp chí của hội nghị FAVA (có phản biện)

7 Đào tạo sau

đại học

Thạc sỹ 01 Thạc sỹ sẽ bảo

vệ vào tháng 7/2018

- 04 Đĩa CD chứa đựng toàn bộ thông tin liên quan đến đề tài khoa học công nghệ được nghiệm thu

01 báo cáo tổng hợp; 01 báo cáo tóm tắt; 01 báo cáo

TP xếp loại KHÁ

1

- Lý do thay đổi (nếu có):

d) Kết quả đào tạo:

(Vƣợt 100%)

Tốt nghiệp

2016

- Lý do thay đổi (nếu có):

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp:

Theo

kế hoạch

Thực tế đạt đƣợc

- Lý do thay đổi (nếu có):

e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế

Phân tích hai gene HSP70 và ATP1A1

2 Đánh giá về hiệu quả do nhiệm vụ mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

- Hoàn thiện quy trình PCR-RFLP, làm chủ quy trình thiết kế primers và lựa chọn enzyme cắt giới hạn bằng các phần mềm sinh tin

- Bước đầu đánh giá được ảnh hưởng của kiểu gene LEP tại hai locus khác nhau đến năng suất, chất lượng sữa và một số chỉ tiêu sinh sản Chọn được

đa hình tại locus LEPsig/HhaI có ảnh hưởng đến năng suất sữa nhưng không

có ảnh hưởng bất lợi đến sinh sản làm tiền đề cho hỗ trợ chọn lọc

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

- Đây là nghiên cứu đầu tiên kết hợp giữa di truyền số lượng và chỉ thị phân tử trong chọn lọc giống bò lai HF trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh, mở ra

cơ hội cho việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong hỗ trợ chọn lọc giống bò lai hướng sữa nhằm giảm chi phí về thời gian

- Thông qua hội thảo, đã chuyển tại thông tin đến cho người chăn nuôi, cán bộ

kỹ thuật khuyến nông và Thú y, cán bộ quản lý, giảng viên và sinh viên về ứng dụng chỉ thị phân tử trong hỗ trợ chọn lọc giống vật nuôi nói chung và giống bò sữa nói riêng

- Đã hỗ trợ đào tạo được 01 kỹ sư Công nghệ Sinh học (đã tốt nghiệp) và 01 học viên cáo học (dự kiến bảo vệ vào tháng 7/2018), góp phần đáng kể vào việc đào tạo nguồn nhân lực có trình độ cao cho xã hội

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của nhiệm vụ:

I Báo cáo tiến độ

Lần 1

II Báo cáo giám định

02 chuyên đề nhưng thiếu nội dung 2.1

2.1 Chọn được 2 primer và

02 enzyme cắt tương ứng là HhaI và BsaAI

III Nghiệm thu cơ sở

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

(Chữ viết tắt, kí hiệu chuyên ngành)

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

Dntp Deoxynucleoside Triphosphate Deoxynucleosit triphotphat

EDTA Ethylenediamine Tetraacetic acid Axit ethylene diamin tetracetic

TBE Tris – boric acid – EDTA Đệm TBE

TE Tris – Ethylen Diamin Tetra Acetic Đệm TE

TTG

Trung tâm Giống Vật nuôi, cây trồng và Thủy sản Tp Hồ Chí Minh

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Bản quyền các trình tự DNA liên quan tính trạng sản lượng sữa ở bò Error! Bookmark not defined Bảng 1.2 Nghiên cứu về đa hình các gene ứng cử liên quan đến khả năng cho sữa ở

bò Error! Bookmark not defined Bảng 1.3 Các đa hình gene LEP liên quan khả năng cho sữa và sinh sản ở bò đã được nghiên cứu Error! Bookmark not defined.

Bảng 2.1 Thông tin về cặp primer đã sử dụng để thăm dò đa hình 18

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR Error! Bookmark not defined Bảng 2.3 Chu trình nhiệt và tối ưu điều kiện theo nhiệt độ bắt cặp 19

Bảng 2.4 Thông tin về enzyme phân cắt tương ứng với cặp primer đã sử dụng 19

Bảng 3.1 Kích thước phân tử của các băng DNA và kiểu gene tương ứng 31

Bảng 3.2 Kích thước phân tử của các băng DNA và kiểu gene tương ứng 36

Bảng 3.3 Năng suất và sản lượng sữa tích lũy 90 ngày đầu chu kỳ sữa 37

Bảng 3.4 Bảng tổng hợp số lượng, tần số xuất hiện kiểu gene và kiểu allen (LEPsig/HhaI) 43

Bảng 3.5 Bảng tổng hợp số lượng, tần số xuất hiện kiểu gene và kiểu allen (LEPe3.1/BsaAI) 44

Bảng 3.6 Sản lượng và năng suất sữa đàn bò thí nghiệm 44

Bảng 3.7 Kết quả phân tích mỡ sữa và protein sữa 46

Bảng 3.8 Kết quả phân tích về chỉ tiêu VCK, Lactose và SNF trong sữa 48

Bảng 3.9 Tổng khối lượng béo, protein, lactose SNF sản xuất cho 120 ngày (kg) 49

Bảng 3.10 Một số chỉ tiêu sinh sản tại hai trại khảo sát 49

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của kiểu gen LEPsig HhaI đến năng suất và sản lượng sữa đến 120 ngày 51

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của kiểu gen LEPe3.1 BsaAI đến năng suất và sản lượng sữa 52

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của kiểu gen LEPsig HhaI đến chất lượng sữa 53

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của kiểu gen LEPe3.1/BsaAI đến chất lượng sữa 54

Bảng 3.15 Ảnh hưởng kiểu gene LEPsig HhaI đến tổng khối lượng các thành phần

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc gene Leptin Error! Bookmark not defined.

Hình 1.2 Cấu trúc không gian của phân tử protein LEP.Error! Bookmark not defined.

Hình 1.3 Cấu trúc các thụ thể leptin Error! Bookmark not defined Hình 3.1 Điện di sản phẩm DNA tổng số đƣợc tách chiết từ mẫu máu bò 23

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gene LB (kích thước 496

bp) với nhiệt độ gắn primer từ 52-58oC 24

Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR cặp primer LB_F & LEPe3_R1 (kích thước

496 bp) với Ta tối ƣu = 56oC 25

Hình 3.4 Kết quả tối ƣu phản ứng PCR với cặp primer LEP sig_F và LEPsig_R1

(kích thước 467 bp) với nhiệt độ gắn primer từ 54-60o

C 25

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR cặp primer LEPsig_F&LEPsig_R1 (kích

thước 467 bp) với Ta tối ƣu = 56ºC 26

Hình 3.6 Kết quả tối ƣu phản ứng PCR với primer LEPi2 (490 bp) với nhiệt độ gắn

Hình 3.13 Trình tự đoạn DNA khuếch đại bởi cặp mồi LB_F và LEPe3_R1 kích

thước phân tử 496 bp 29

Hình 3.14 Trình tự đoạn gene khuếch đại bởi cặp mồi LEPe3.1 BsaAI_F và

LEPe3.1 BsaAI_R kích thước phân tử 523bp 30

Hình 3.15 Trình tự đoạn DNA khuếch đại bởi cặp mồi LEPsig_F và LEPsig_R1

kích thước phân tử 467 bp 31

Hình 3.16 Trình tự đoạn gene khuếch đại bởi cặp mồi LEPi2_F2 và LEPi2_R2 kích

thước phân tử 490 bp 31

Hình 3.17 Kết quả kiểm tra vị trí cắt của enzyme HhaI trên đoạn gene chứa cặp

primer LEPsig_F; LEPsig_R1 bằng phần mềm Nebcutter 33

Hình 3.18 Sản phẩm cắt đoạn gene LEPsig bằng HhaI trên bò lai HF 33

Hình 3.19 Kết quả phản ứng RFLP sử dụng enzyme ClaI 34

Hình 3.20 Kết quả phản ứng RFLP sử dụng enzyme Kpn2I 35 Hình 3.21 Kết quả kiểm tra vị trí cắt của enzyme Kpn2I trên đoạn gene chứa cặp

primer LEPsig_F; LEPsig_R1 bằng phần mềm Nebcutter 36

Hình 3.22 Kết quả phản ứng RFLP sử dụng enzyme HphI 36 Hình 3.23 Kết quả phân tích các điểm nhận biết enzyme cắt hạn chế trên đoạn gene

523 bp Vị trí cắt của enzyme cắt giới hạn BsaAI (Ppu21I) trên đoạn gene LEPe3.1 38

Hình 3.24 Sản phẩm cắt đoạn gene LEPe3.1 bằng BsaAI trên bò lai HF; 39 Hỉnh 3.25 Điện di sản phẩm geneomic DNA 41 Hình 3.26 Điện di đồ sản phẩm PCR với cặp primer LEP.sig 41 Hình 3.27 Điện di kết quả ủ enzyme cắt HhaI 42 Hình 3.28 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp primer LEPe3.1 42 Hình 3.29 Hình ảnh điện di kết quả ủ enzyme cắt BsaAI 43

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Sản xuất sữa và thành tích sinh sản là hai yếu tố quyết định trong chăn nuôi bò sữa Có những tranh luận giữa người chăn nuôi và nhà nghiên cứu về sự đối lập có thể có giữa năng suất sữa cao và thành tích sinh sản Ở hầu hết những quốc gia đã tiến hành chọn lọc di truyền cho tính trạng sản xuất sữa cao thì kế tiếp theo sau đó là sự giảm khả năng sinh sản đã được nhận thấy [1] Kết quả khảo sát từ nhiều nguồn nghiên cứu khác nhau cho thấy năng suất sữa tăng đáng kể trong vòng 2 thập k qua nhưng đồng thời hiệu quả sinh sản cũng giảm đi rõ rệt T lệ thụ thai và các chỉ tiêu sinh sản khác ở bò sữa giảm đáng kể ở các nước như Mỹ [2], ở Anh [3] và ở Nhật [4]

Có nhiều nguyên nhân gây nên việc giảm khả năng sinh sản trên bò sữa năng suất cao và tầm quan trọng của những yếu tố ấy thay đổi tùy theo từng quốc gia Theo Lotthammer (1991) [5] có nhiều nguyên nhân ảnh hưởng đến khả năng sản xuất sữa

và sinh sản; trong đó quan trọng nhất là nuôi dưỡng (70%), di truyền (20%) và khoảng 10% là do bệnh tật

1.1 Chiến lược cải thiện các tính trạng kinh tế trên bò sữa

Có nhiều cách để chọn lọc giống bò sữa dựa trên các tính trạng như sản xuất sữa, sinh sản Cách thứ nhất đó là chọn giống bằng di truyền số lượng dựa trên kiểu hình của cá thể chính là tổng hợp của các yếu tố ảnh hưởng (kiểu gene/môi trường)

đã mang lại hiệu quả đáng kể cho ngành chăn nuôi Và thông thường trên bò sữa thì

bò đực sử dụng trong sản xuất tinh thường được áp dụng theo cách này bằng cách dựa vào ước lượng giá trị giống của những bò cái sinh ra từ đực giống được kiểm tra Tuy vậy, nó cũng bộc lộ một số hạn chế nhất định, cụ thể đối với các tính trạng khó xác định dựa trên kiểu hình (tính thích nghi, kháng bệnh), hoặc các tính trạng chỉ biểu hiện ở giai đoạn muộn khi cá thể đã trưởng thành (khả năng cho sữa, sinh sản) và các tính trạng có hệ số di truyền thấp (0,02-0,1) thì phải cần số lượng lớn cá thể được sử dụng để có được tính chính xác cao Vì thế, việc chọn lọc dựa trên phương pháp di truyền số lượng đòi hỏi thời gian nhiều hơn, đặc biệt đối với những gia súc có khoảng cách thế hệ dài như bò

Cách thứ 2 đó là chọn lọc dựa vào tính đa hình của những gene chuyên biệt

và hoặc các đoạn gene trên nhiễm sắc thể Một khi các tính trạng được kiểm soát khác nhau bởi sự khác nhau của các allele thì những allele đó có thể được sử dụng cho chọn lọc di truyền Meuwissen và Goldard (1996) [6] chỉ ra rằng chọn lọc có thể được cải thiện bằng cách kết hợp giữa thông tin di truyền và thông tin về giá trị kiểu hình đã xác định được Như vậy, sử dụng chỉ thị phân tử hỗ trợ chọn giống giúp khắc phục được các hạn chế trên của chọn lọc truyền thống Cơ sở khoa học của phương pháp nghiên cứu này dựa theo hai cách tiếp cận khác nhau: (1) phân tích các vùng gene trên nhiễm sắc thể liên quan đến các tính trạng kinh tế (Quantitative Trait Loci – QTL), cụ thể là cơ sở dữ liệu phong phú của chương trình nghiên cứu geneome vật nuôi thế giới được phổ biến rộng rãi theo địa chỉ sau:

(http://cn.animalgeneome.org/cgi-bin/QTLdb/BT/summary?summ=clas&qtl=7,091&pub=404&trait=441) Tuy nhiên, cách tiếp cận này phải sử dụng nhiều marker (chỉ thị) cùng một lúc nhưng ảnh hưởng đáp ứng của gene đó thì thường chưa được biết Sự gần nhau của các chỉ thị phân tử thường là một số lượng lớn của gene (hoặc nhiều gene) có thể định vị và chỉ có một vài nghiên cứu sử dụng kỹ thuật nhân bản gene vị trí được nhận biết; (2) cách tiếp cận thứ hai đó là phát hiện các đột biến trên các gene ứng

cử, thường là các gene có vai trò, chức năng sinh học đối với tính trạng quan tâm và kết hợp nghiên cứu giữa mối tương quan di truyền giữa các đột biến được phát hiện với các tính trạng kinh tế mong muốn Vì thế, ứng dụng các chỉ thị phân tử trong hỗ trợ chọn giống bằng phân tích tương quan giữa các chỉ thị di truyền, các gene ứng

cử liên quan với tính trạng kinh tế quan tâm đã và đang thu hút sự nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới nhằm đẩy nhanh hơn nữa tiến bộ di truyền về chọn lọc vào thực tiễn sản xuất

1.2 Tổng quan một số nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử trên bò sữa

Đối với bò, bản đồ QTL hiện tại chứa 7.0091 chỉ thị QTLs liên quan đến 441 tính trạng khác nhau, trong đó 1.907 chỉ thị liên quan đến các tính trạng sữa như sản lượng sữa, thành phần sữa (protein, mỡ), thời gian tiết sữa ở bò và sinh sản Trên cơ

sở đó, đa hình di truyền một số gene đã được xác nhận liên quan đến tính trạng năng

suất sữa, sinh sản ở bò và đã được đăng ký bản quyền (Error! Reference source not found.)

ảng 1.1 Bản quyền các trình tự DNA liên quan tính trạng sản lượng sữa ở bò [7]

Gene Kiểu đa hình Tính trạng liên quan Nhiễm sắc

thể

Thời gian đăng ký

và protein sữa đã được tiến hành (Error! Reference source not found.) Trong số

đó phải kể đến các gene thuộc họ casein sữa (α-, β-, và κ-casein), β-latoglobulin, lactoferin, prolactin, thụ thể prolactin,… Các đa hình gene nằm ở các vị trí khác nhau của gene (vùng mã hoá - exon, vùng không mã hoá: intron, 5’-UTR hoặc 3’-UTR), vì thế có thể dẫn đến làm thay đổi hoặc không thay đổi trình tự axit amin trong phân tử protein Phương pháp chủ yếu sử dụng để phát hiện các đột biến là phương pháp sử dụng các enzyme cắt hạn chế hoặc đọc trình tự gene

ảng 1.2 Nghiên cứu về đa hình các gene ứng cử liên quan đến khả năng cho sữa ở bò [8]

Gene Sản phẩm gene Thông tin đa hình Tính trạng ảnh hưởng CASA1 αS1-casein A/G (E192G), exon 17 MY, PY

A G, 5’-UTR, MaeIII MY, FC, PC CASB β-casein C/A (H67P; H106E; S122R)

Sản lượng sữa, hàm lượng chất béo và protein

CASA2 αS2-casein C/T, promoter (-1084), MaeII -

CASK κ-casein 2 đột biến (T36I; D148A), exon

Pit1 Yếu tố phiên mã

C/T(R/C), exon 2, Kpn2I MY, PY

C/T (A/N), exon 3, HphI MY, PY

MY: Sản lượng sữa (Milk yield); FY: Sản lượng chất béo (Fat yield – kg); FC: Hàm lượng chất béo (Fat content - %); PY: Sản lượng protein (Protein yield – kg); PC: Hàm lượng protein (Protein content - %)

Kiến thức về bản chất di truyền của các tính trạng phức tạp, cụ thể là tác động của các đột biến điểm SNP (single nucleotide polymorphism) thuộc các gene ứng

cử đến biểu hiện kiểu hình được xem là rất có ý nghĩa để hiểu thêm được về cơ chế sinh lý học của các tính trạng [9] Cùng với nhiều gene khác, LEP là gene ứng cử thu hút sự quan tâm nghiên cứu trong những năm gần đây vì có ảnh hưởng đáng kể đến các tính trạng kinh tế ở bò

1.3 Thông tin về gene leptin và chức năng sinh lý của leptin ở mức độ protein

Leptin (LEP) là một trong những gene ứng cử đã được xác nhận liên quan đến các tính trạng số lượng ở bò như khả năng tăng trưởng, chất lượng thịt (hàm lượng

mỡ, chỉ số marbling), các tính trạng về khả năng cho sữa và sinh sản ở bò Gene mã hoá cho protein LEP-một loại hormone tiết ra bởi các tế bào mỡ trắng (white fat cell)-định vị trên nhiễm sắc thể 4q32 ở bò [10] Cấu trúc exon-intron của gene LEP bao gồm 3 exon, 2 intron với kích thước khoảng 18,9 kb (Hình 1.1) Trong đó, exon

1 không được phiên mã thành phân tử protein, chỉ có exon 2 và exon 3 phiên mã thành leptin 16 kDa

Hình 1.1 Cấu trúc gene Leptin [11]

Hình 1.2 Cấu trúc không gian của phân

tử protein LEP: bao gồm 146 axit amin tạo nên cấu trúc 4 sợi helix (A-B-C-D) với một cầu nối disunfit Hai axit amin Cystein ở vị trí 96 và 146 tạo nên cầu disulfit có vai trò trong việc ổn định cấu trúc của phân tử LEP [12]

Thụ thể gene leptin (Ob-R) được phát hiện vào năm 1995, nằm trên HSA 1p31

ở người, MMU 4C6 ở chuột và BTA 3q33 ở bò Ob-R là một glycoprotein xuyên

màng có khoảng 20 exon (4kb) với chiều dài khoảng 170 kb trên người Ob-R gồm

6 loại: Ob-Ra, Ob-Rb, Ob-Rc, Ob-Rd, Ob-Re, Ob-Rf Ob-Ra xuất hiện ở mô não,

mô mỡ, nhau thai, chức năng điều tiết sự vận chuyển phân tử leptin qua màng mạch máu não và nhau thai Ob-Rb dài nhất và chịu trách nhiệm các chức năng sinh học, xuất hiện ở vùng vùng dưới đồi (Hypothalamus)-vùng não chuyên điều khiển thân nhiệt, cảm giác ăn uống và các mô ngoại vi như lá lách, tuyến ức và bạch cầu, nhau thai, chức năng truyền tín hiệu Ob-Rc, Ob-Rd, Ob-Re và Ob-Rf đóng vai trò quan trọng trong sự tương tác hormone và vận chuyển Ob-Rc có mặt ở vỏ não và tiểu não, mô mỡ, chức năng vận chuyển leptin qua màng mạch máu não Ob-Re có ở tim, mô mỡ, nhau thai, chức năng như một protein liên kết với leptin để vận chuyển leptin qua thai nhi

Hình 1.3 Cấu trúc các thụ thể leptin

Các Ob-R thuộc nhóm thụ thể cytokine và hoạt động thông qua các JAK STAT (Janus kinase hoạt hóa tín hiệu và là chất kích thích của con đường phiên mã STAT) Cơ chế dẫn truyền tín hiệu đi theo con đường sau: Ob-R được nhị trùng hóa và liên kết với leptin đi vào trong môi trường nội bào, sau đó những protein

JAK sẽ phosphoryl hóa tyrosine, tạo liên kết với protein STAT Protein STAT đã hoạt hóa nhị trùng và di chuyển đến nhân tế bào và kích hoạt phiên mã Khi JAK STAT hoạt hóa sẽ điều khiển tín hiệu lên MEK MAPK làm tăng sinh tế bào Trình tự thụ thể của leptin giữa người, heo, cừu và một phần trên bò có sự khác nhau ở khu vực ngoại bào (82%), màng (86-90%) và tế bào chất (72-78%) Những đột biến xuất hiện ở thụ thể leptin làm thay đổi cấu trúc nối bình thường dẫn đến làm giảm các tín hiệu STAT được truyền đi Ở chuột, sự đột biến ở thụ thể leptin có liên quan đến sự béo phì, tuy nhiên ở người hầu hết chúng không có liên quan đến béo phì hay tiểu đường

1.4 Tóm lược một số chức năng sinh lý của leptin

Vai trò sinh lý và sinh học của LEP cũng đã được nghiên cứu [13] LEP là một protein bao gồm 167 axit amin, với kích thước phân tử khoảng 16 kDa (Hình 1.2)

có vai trò then chốt trong điều khiển trọng lượng cơ thể thông qua việc điều khiển lượng thức ăn bởi tính thèm ăn và kích thích tiêu hao năng lượng Mức độ LEP trong máu là dấu hiệu cho hệ thống thần kinh trung ương đối với nguồn năng lượng

cơ thể Sự thiếu hụt hàm lượng LEP dẫn tới hàng loạt các bệnh béo phì di truyền ở động vật Leptin thường ảnh hưởng tới sự chuyển hóa năng lượng, mức tăng trưởng, sinh sản, thành phần cấu tạo và khả năng miễn dịch của cơ thể [14] Cơ chế tác động của leptin lên quá trình trao đổi chất và tăng trưởng rất phức tạp với nhiều kích ứng lên các mô và hệ thống nội tiết Leptin điều hòa thể trọng thông qua việc điều chỉnh trạng thái ăn uống, sự đói, thân nhiệt và sự tiêu hao thức ăn Thí nghiệm tiêm leptin trên chuột làm giảm lượng thức ăn và khối lượng cơ thể đến 50% sau một tháng, tuy nhiên chỉ khối mỡ giảm mà không ảnh hưởng tới khối lượng nạc Sự giảm lượng leptin trong cơ thể thường kèm theo các đáp ứng sinh lý như đói, thèm

ăn, giảm tiêu hao năng lượng

Leptin và sự thành thục về tính: Hàm lượng protein leptin trong huyết thanh tăng lên trong suốt quá trình thành thục về tính ở chuột [15], bò tơ và heo [16][17] Nhiều nghiên cứu cho rằng vai trò của leptin không phải là tín hiệu gây nên sự thành thục về tính mà nó chủ yếu đóng vai trò như là tín hiệu cho phép sự thành

thục về tính xuất hiện [18][19] Ở gia súc nhai lại, cho ăn hạn chế trong thời gian ngắn làm giảm sự biểu hiện của gene leptin cũng như leptin protein ở mô mỡ trắng nhưng làm gia tăng sự biểu hiện của thụ thể Ob trên vùng dưới đồi Điều này kết hợp với việc giảm hàm lượng nhịp tiết của hormone insulin, IGF-1 và LH [20][21] Việc phân tiết leptin và tình trạng sinh sản: Thay đổi khối lượng cơ thể hoặc tình trạng dinh dưỡng được nhận biết bởi sự thay đổi của ở mức độ protein trong huyết thanh của nhiều hormone hoặc yếu tố tăng trưởng Nhiều nghiên cứu cho thấy gia tăng sự biểu hiện của gene leptin sau khi chích glucocorticoid hoặc insulin và điều này cho thấy những hormone này có thể là trung gian điều hòa tình trạng dinh dưỡng gây nên sự thay đổi về phân tiết leptin [22][23] Cho nhịn ăn trong 48 giờ hoặc cho ăn hạn chế trong thời gian dài dẫn đến giảm đáng kể lượng leptin và LH ở cừu [24] và bò [25] Một nghiên cứu khác cho thấy khi cho heo trưởng thành đã cắt buồng trứng ăn hạn chế trong thời gian 7 ngày dẫn đến giảm đống thời leptin và LH [26] Ở bò tơ và bò trưởng thành, hàm lượng leptin trong huyết thanh giảm trong giai đoạn cuối của pha hoàng thể và đầu của pha nang noãn phát triển của chu kỳ động dục Điều này kết hợp với việc giảm biểu hiện gene leptin ở mô mỡ trắng [17]

Ở cừu, việc phân tiết LH phụ thuộc vào nhịp phân tiết của leptin Những nghiên cứu trên chứng minh bằng những bằng chứng sinh lý về sự thay đổi hàm lượng leptin trong hệ tuần hoàn trong chu kỳ động dục cũng như sự thành thục về tính và sự kết hợp giữa leptin với sự phân tiết LH đã khẳng định được vai trò sinh lý sống còn của leptin trong việc kiểm soát trao đổi biến dưỡng liên quan đến chức năng sinh sản

Bên cạnh đó, LEP còn điều khiển quá trình nội tiết tố và nhất là với việc điều hoà việc tiết prolactin, là một hormone liên quan quá trình tiết sữa ở động vật Tiết sữa là quá trình đi kèm với việc tăng khẩu phần thức ăn, trao đổi chất và sử dụng các nguồn năng lượng dự trữ từ mô mỡ, vì thế tương tác giữa điều khiển hormone động vật có vú với sản lượng sữa cũng như tương tác giữa năng lượng sử dụng và trao đổi chất béo có vai trò quan trọng Leptin cũng đóng vai trò là chìa khóa trong sự điều hòa sự sinh sản thông qua việc kích thích GnRH, FSH và giải phóng LH Sự thiếu dinh dưỡng sẽ làm giảm chức năng sinh sản do leptin có khả năng làm tăng sự tiết hocmon hướng dục GnRH (Gonadotropin releasing hocmon) từ đó làm tăng tiết

hocmon kích sinh nang noãn FSH (Follicle stimulating hocmon) và hocmon sinh hoàng thể LH (luteinizing hocmon) Thí nghiệm cho thấy nếu được tiêm leptin, chuột

sẽ có hiện tượng thành thục tính dục và sinh sản sớm hơn so với không tiêm leptin LEP còn có vai trò quan trọng trong điều khiển đáp ứng miễn dịch, kháng viêm, làm lành vết thương Leptin thúc đẩy sự tăng sinh và biệt hóa tế bào máu, thay đổi sự sản xuất cytokine do tế bào miễn dịch, kích thích sự phát triển tế bào nội mạc mạch máu, tăng sinh mạch máu và đẩy nhanh sự làm lành vết thương Leptin không chỉ là một tín hiệu nội tiết trong não và những mô ngoại vi khác như tế bào nội mạc mạch máu, lympho T mà chúng còn hoạt động như những tín hiệu có tác dụng tại chỗ trong các mô có nguồn gốc từ con người, động vật nhai lại và một số loài gặm nhấm Ngoài ra, chúng cũng tham gia vào việc quy định tình trạng dinh dưỡng, chức năng sinh sản, điều hòa sự phát triển của thai nhi, giúp giảm lượng thức ăn đối với một số loài động vật và đóng một vai trò trong sự tiêu hao năng lượng [27]

Như vậy leptin một phân tử sinh học có hiệu quả nhất để ứng dụng trong việc nhận dạng những cá thể có khả năng thích nghi và cho năng suất cao trong chăn nuôi

1.5 Một số nghiên cứu trên thế giới sử dụng gene Leptin trên bò

Kể từ khi cấu trúc phân tử và trình tự gene LEP được phân tích, hàng loạt các đột biến điểm (SNPs-single nucleotide polymorphism) thuộc các exon và intron đã được nhận dạng ở rất nhiều giống bò khác nhau [28][29][30][31]

Nghiên cứu ảnh hưởng của đa hình gene Leptin lên các tính trạng sữa ở bò: đa

hình di truyền gene Leptin có ảnh hưởng dương tính (tăng) sản lượng sữa (milk yield) và sản lượng protein sữa (protein yield) nhưng lại không có ảnh hưởng đến

các tính trạng khác như sản lượng mỡ sữa, hàm lượng mỡ sữa và hàm lượng protein

trong sữa (Error! Reference source not found.) Và hàng loạt vị trí đa hình thuộc

gene LEP liên quan với sản lượng sữa đã được nghiên cứu (Bảng 1.3)

Ngoài ra, một số nghiên cứu khác chỉ ra rằng gene LEP có thể được sử dụng như chỉ thị di truyền trong việc cải thiện các tính trạng năng suất ở bò như tăng trọng, chất lượng thịt, khả năng sinh sản, năng suất và chất lượng sữa [32][33] do

LEP tham gia vào quá trình điều khiển tình trạng dinh dưỡng và chức năng sinh sản

Tế bào biểu mô tuyến vú bò tổng hợp LEP trong quá trình mang thai và quá trình thiết lập tiết sữa [34] Ở bò sữa, tăng sản lượng sữa đồng nghĩa với việc làm giảm cân bằng năng lượng ở giai đoạn đầu của quá trình tiết sữa Nồng độ hormone LEP thường cao ở giai đoạn muộn của quá trình mang thai và giảm thấp nhất khi sinh Điều này cho thấy việc giảm hàm lượng LEP trong quá trình tiết sữa là do tiêu hao năng lượng vào quá trình sản sinh sữa Chính vì vậy, hàng loạt đa hình SNP thuộc gene LEP đã được phân tích và bộc lộ mối tương quan giữa đa hình này với khả

năng cho sữa và sinh sản ở bò (Bảng 1.3)

ảng 1.3 Các đa hình gene LEP liên quan khả năng cho sữa và sinh sản ở bò

13 giống bò (22)

G: 0,02 - C/T(Ex2+101) C: 0,59;

[36]

Charolais (55) C: 0,66;

T: 0,34 Hereford (22) C: 0,45;

T: 0,55 Simmental

số SSC cao hơn kiểu gene CC

[37]

Ayrshire (17) C: 0,38;

T: 0,62 Brown Swiss

(21)

C: 0,55;

T: 0,45 Canadi nne

(9)

C: 0,89;

T: 0,11 Guernsey (16) C: 0,94;

T: 0,06 Jersey (20) C: 0,47;

T: 0,53

C/T (Ex2+101)

Charolais x Holstein (168)

T: 0,65 - A/T (Ex2+48) Charolais x

A: 0,24 Hariana (60) G: 0,72;

A: 0,28

C/T (Int2)

HF x Hariana (205)

C: 0,82;

T: 0,18

HF (17) C: 0,60;

T: 0,40 Jersey (40) C: 0,44;

T: 0,56 Hariana (60) C: 1,0;

T: 0,0 C/T (Int1-102)

Bò vùng Iceland

A: 0,05

C: năng suất sữa và hàm lƣợng protein cao hơn T

G/A (Int2+21) C: 0,65;

T: 0,35 - A59V

Jersey (181)

C: 0,72;

T: 0,28

C: sản lƣợng sữa, mỡ sữa và protein sữa cao hơn T

[41]

C/T (Int2) C: 0,59;

T: 0,41

Không có sự khác biệt

C/T

(Promoter-963)

Polish HF (309)

C: 0,56;

T: 0,44 Liên quan đến t lệ

cá thể không động dục lại sau 56 ngày

kể từ lần phối giống đầu tiên (56 day-non return rate- NRR56)

[42]

A/T (Ex2+252) A: 0,98;

T: 0,02 T/C (Ex2+305) T: 0,45;

C: 0,55 C/T (Ex3) C: 0,72;

T: 0,28 G/A (Int2-Ex3) Holstein (52) A: 0,40;

Mazandarani (53)

T: 0,13 Hungarian

Simmental (481)

C: 0,75;

T: 0,25

CC: hàm lượng protein sữa cao hơn

C/T (Int2)

Pinzgau (85) A: 0,69;

B: 0,31 AA: sản lượng sữa,

protein sữa và mỡ sữa cao nhất

Slovak Sported (110)

A: 0,83;

(-): Không phân tích; SSC: hàm lượng chất rắn tan (Soluble solid score)

Ngoài các nghiên cứu liên quan đến năng suất và chất lượng sữa, các đa hình SNP gene LEP được xác nhận có liên quan đến khả năng sinh sản ở bò [46][47][48][14][49], trọng lượng bê sơ sinh và lúc cai sữa [47][14], tử vong tiền sinh của bò sữa [50] Các đột biến thuộc gene LEP có ảnh hưởng đến chỉ tiêu

khoảng cách lứa đẻ (calving interval-CI), trọng lượng cơ thể ở lứa đẻ đầu tiên (weight at first calving-WFC) ở giống bò lai 5 8 Aberdeen x 3 8 Nelore [47]

Nghiên cứu của Liefers và cs (2002) [46] tiến hành nghiên cứu tương quan di truyền kiểu gene LEP với các tính trạng năng suất, chất lượng sữa, trọng lượng cơ thể qua

15 tuần đầu của quá trình tiết sữa trên 613 bò cái HF kéo dài trong thời gian 7 năm (1990-1997) Kết quả chỉ ra cá thể bò mang allele có lợi RFLP1-B cho năng suất sữa cao hơn cá thể không mang allele này và không ảnh hưởng đến cân bằng năng lượng và khả năng sinh sản của bò cái thí nghiệm Trong số 14 SNPs thuộc vùng promoter gene LEP, ba SNPs được xác nhận có liên quan đến khả năng sinh sản và cân bằng năng lượng ở bò sữa [51] Điều này gợi ý cho việc sử dụng các chỉ thị này trong chương trình chọn giống bò sữa cải thiện khả năng sinh sản và cân bằng năng lượng mà không có ảnh hưởng đến sản lượng sữa Komisarek và cs (2007) [49] đã tiến hành phân tích tương quan di truyền giữa 3 SNPs [R4C, A59V và C(-963)T]

thuộc gene LEP với tính trạng sinh sản (tuổi đẻ lứa đầu-age at first calving; thời gian từ lúc đẻ đến lúc thụ thai - days open; khoảng cách giữa các lứa đẻ-calving interval; số lần gieo tinh trên lần thai đậu-number of inserminations per conception, thời gian mang thai - gestation length) trên 219 bò giống Jersey Tương quan di

truyền có ý nghĩa thống kê với P < 0,05 chỉ tìm thấy ở đột biến A59V, cụ thể là: Cá thể mang kiểu gene TT ưu thế cho khoảng thời gian giữa các lứa đẻ và thời gian từ lúc sinh đến lúc thụ thai ngắn hơn so với cá thể mang kiểu gene CT và CC Đồng thời, số lần gieo tinh trên lần thai đậu thấp hơn ở các các cá thể mang kiểu gene

đồng hợp tử A59V-TT

Đột biến LEP Sau3AI không chỉ ảnh hưởng đến các tính trạng sản lượng sữa, protein sữa và mỡ sữa (P < 0,05) mà còn liên quan đến tuổi sinh sản (P < 0,01) ở giống bò sữa Slovak Spotted và Pinzgau [52] Đa hình di truyền ba SNPs thuộc exon 2 và exon 3 gene LEP đã được phân tích trên giống bò sữa Ấn Độ (Frieswal và Sahiwal) [53] Kết quả phân tích tương quan cũng chỉ ra tương quan di truyền có ý nghĩa giữa đa hình gene LEP với các tính trạng năng suất sữa và khả năng sinh sản

ở cả 2 giống bò nghiên cứu Đồng thời, mối tương quan di truyền giữa các tổ hợp kiểu gene haplotype với các tính trạng sản lượng sữa, protein, lactose, tuổi đẻ lứa đầu của bò Ấn Độ cũng được xác nhận Các nghiên cứu trên chỉ ra tiềm năng sử dụng LEP gene như là gene ứng cử liên quan với tính trạng sản lượng sữa và khả năng sinh sản ở nhiều giống bò sữa, và cần xem xét đưa vào hỗ trợ chương trình

chọn giống bò sữa cải thiện khả năng sản xuất sữa ở bò sữa

Tuy nhiên, một điểm cần lưu ý là khả năng sản xuất sữa và sinh sản còn phụ thuộc vào tác động rất nhiều yếu tố khác như giống bò, chất lượng giống, dòng, lứa, tuổi bò sữa, mùa vụ và các điều kiện dinh dưỡng, chăm sóc khác Việc ứng dụng các mô hình thống kê để ước đoán tương quan di truyền giữa đa hình gene LEP với khả năng cho sữa, chất lượng sữa và sinh sản cũng sẽ được quan tâm xem xét sử dụng trong nghiên cứu này

1.6 Một số nghiên cứu trong nước về sử dụng chỉ thị phân tử trên vật nuôi

Các nghiên cứu trong nước đã tiến hành đánh giá phân tích đa hình di truyền

và tương quan một số gene liên quan tính trạng sản lượng sữa như GH, k-casein, lactoglobulin, Pit-1 ở các giống bò Nghiên cứu của Trần Xuân Hoàn và cs [54] phân tích đa hình di truyền gene GH, GHR và DGAT1 của các quần thể bò cái lai ở

b-Ba Vì, bò cái HF ở Mộc Châu và Tuyên Quang, bò đực giống ở Moncada Kết quả

nghiên cứu cho thấy trong cả ba quần thể bò sữa các kiểu gene AA và LL của gene

GH đều chiếm t lệ cao Bò cái HF ở Mộc Châu mang kiểu gene AA từ sau chu kỳ

3 cho sản lượng sữa cao hơn so với bò mang kiểu gene AB và BB (P < 0,01) Đối với gene DGAT1 kiểu gene KA chiếm t lệ cao trong cả 3 quần thể bò sữa, bò cái

HF ở Mộc Châu mang kiểu gene AA có xu thế cho sản lượng sữa thấp hơn bò mang kiểu gene KA và KK ở tất cả các chu kỳ, tuy nhiên sự sai khác về sản lượng sữa là

không có ý nghĩa (P > 0,05) Phân tích gene GHR bằng AluI cho thấy t lệ tần số

alen + và - tương đương nhau trong các quần thể bò cái và bò đực giống

Kết quả nghiên cứu của Lê Thị Thúy và cs (2005) [55] khi phân tích hàm lượng sữa và mỡ sữa cho thấy gene k-casein của cá thể bò mang kiểu gene dạng bình thường AA cho sản lượng sữa cao nhất, nhưng hàm lượng protein sữa lại

có xu hướng thấp nhất Ngược lại, những cá thể bò mang kiểu gene đột biến BB tuy có hàm lượng protein sữa cao hơn kiểu gene AA, nhưng sản lượng sữa thấp hơn Đối với kiểu gene dị hợp AB, cả về năng suất sữa và hàm lượng protein đều ở mức trung bình

Trịnh Thị Kim Thoa và cs (2002) [56] cũng đã nghiên cứu ứng dụng PCR/RFLP để điều tra phân tích geneotype gene protein sữa kappa -casein, β-lactoglobulin ở bò sữa Việt Nam

Nguyễn Trọng Ngữ và cs (2010) [57] đã tiến hành phân tích đa hình gene GH

và phân tích mối liên kết của điểm đa hình này với các chỉ tiêu năng suất và chất lượng sữa của giống bò lai HF Kết quả phân tích mối liên quan giữa kiểu gene và kiểu hình cho thấy, bò mang kiểu gene CC cho sữa nhiều hơn (P < 0,01) so với bò

có các kiểu gene CT và TT (3451; 3139 và 2778 kg chu kỳ con) Đối với các chỉ tiêu chất lượng sữa, không có mối liên kết nào được tìm thấy giữa kiểu gene với thành phần đạm, mỡ, đường và chất rắn không mỡ trong sữa

Nguyễn Thị Thu và cs (2013) [58] đã tiến hành phân tích đa hình đột biến điểm gene Pit-1 và mối tương quan di truyền gene với năng suất sữa ở đàn bò Holstein Friesian đang khai thác sữa nuôi tại Lâm Đồng Kết quả phân tích cho thấy

có sự đa hình ở 2 vị trí thuộc exon 2 (TaqI) và exon 6 (HinfI) Kết quả phân tích

tương quan di truyền chỉ ra mối liên quan giữa đa hình gene thuộc exon 6 gene Pit-1

với các tính trạng năng suất sữa và số ngày cho sữa (P < 0,05) ở đàn bò nghiên cứu Điều này cho thấy tiềm năng sử dụng đa hình gene Pit-1 trong hỗ trợ chọn giống bò sữa năng suất cao bằng ứng dụng chỉ thị di truyền phân tử

Tóm lại: Cho đến hiện tại, có nhiều nghiên cứu về chỉ thị phân tử gene leptin

được công bố trên thế giới với đối tượng là các giống bò thuần Còn rất ít thông tin trong nước công bố về đa hình gene leptin cũng như quan hệ giữa gene leptin với một số tính trạng về năng suất, chất lượng sữa và khả năng sinh sản trên bò lai hướng sữa ở Việt nam Vì thế, nghiên cứu này tập trung vào giải quyết vấn để để xem xét tính đa hình của gene leptin trên bò lai hướng sữa HF có t lệ máu lai trên 75% và đánh giá khả năng sử dụng chỉ thị phân tử gene leptin như là công cụ hỗ trợ

cho chọn lọc giống bò lai hướng sữa

1.7 Mục tiêu của đề tài

a Mục tiêu tổng quát: Chọn lọc cá thể bò sữa có khả năng cho sữa cao nhưng không ảnh hưởng bất lợi đến sinh sản bằng phương pháp chọn lọc hỗ trợ bởi chỉ thị phân tử gen leptin kết hợp với phương pháp chọn lọc truyền thống

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung 1: Phân tích thăm dò đa hình SNPs gene LEP bằng phương pháp PCR-RFLP

2.1.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm thực hiện

- Đối tượng: Bò lai HF có t lệ máu lai HF ≥ 87,5%

- Số lượng mẫu: 60 mẫu máu

- Thời gian: Từ tháng 1 năm 2015 đến tháng 11 năm 2016

- Địa điểm lấy mẫu: Công ty TNHH MTV Bò sữa Củ chi (An Phú)

- Địa điểm thực hiện: Phòng nghiên cứu gene động vật-Viện Công nghệ Sinh học Việt nam; Trung tâm Công nghệ Sinh học Chăn nuôi

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu cho nội dung 1

- Đối tượng chọn và lấy mẫu máu là bò lai HF có t lệ máu lai ≥ 87,5%, lứa đẻ 2-4, bò đang mang thai trên 4 tháng Mẫu được chọn mang tính đại diện được (i) nhóm giống đang và sẽ chiếm đa phần trong quần thể bò lai HF của khu vực (trên 75% máu HF) và (ii) năng suất sữa: gồm 2 nhóm là năng suất cao (bình quân trên 15 lít và thấp dưới 15 lít)

- Địa điểm lấy mẫu: Trại bò sữa của Công ty TNHH MTV Bò sữa Tp Hồ Chí Minh (60 mẫu cho nội dung 1)

- Phương pháp lấy mẫu: Mẫu máu được lấy ở tĩnh mạch cổ hoặc động mạch đuôi bằng kim 18G gắn với syringe 10cc, sau khi lấy máu được cho vào ống nghiệm chứa EDTA vào bảo quản ở 4oC đưa về phòng thí nghiệm dùng cho ly trích DNA (trong quá trình lấy máu cho nội dung này khá thuận lợi nên không lấy mẫu mô như trong thuyết minh)

2.1.3 Phương pháp tách chiết và đánh giá DNA hệ gene:

Các mẫu máu sau khi chuyển về phòng thí nghiệm của Trung tâm Công nghệ Sinh học Chăn nuôi để xử lý sơ bộ và được bảo quản trong tủ -20oC cho đến khi chuyển đến phòng thí nghiệm gene động vật của Viện Công nghệ Sinh học-Viện

hàn lâm Khoa học Việt nam để thực hiện thăm dò đa hình gene Leptin theo nội dung 1 trong thuyết minh đề tài

2.1.4 Quy trình ly trích DNA từ mẫu máu (sử dụng phương pháp chloroform), các bước thực hiện như sau:

phenol-B1 Thêm 500 µL PBS vào ống tube (tube thứ 1) có chứa 200 µL máu, lắc đều, ly tâm 12.000 vòng phút trong 15 phút Bỏ dịch nổi

B2 Thêm vào ống tube 700 µL Lysis buffer, lắc đều, ủ tại 37oC trong 1 giờ B3 Bổ sung 5 µL Proteinase K 20mg mL vào ống tube, lắc đều Đem ủ tại 56oC qua đêm B4 Thêm 700 µL phenol bão hòa, lắc đều Ly tâm 12.000 vòng phút ở 4oC Chuyển dịch nổi qua một ống tube mới (ống thứ 2)

B5 Lặp lại B4

B6 Bổ sung 700 µL Chloroform : Isoamyl ancohol (24:1), đảo nh ống tube

Ly tâm 12.000 vòng phút ở 4o C Chuyển dịch nổi qua một ống tube mới (ống thứ 3) B7 Thêm 2 lần thể tích ethanol 100% lạnh Đảo nh ống tube Ủ tại -20ºC trong 2 giờ B8 Ly tâm 12.000 vòng phút trong 20 phút tại 4oC, thu kết tủa

B9 Rửa tủa bằng cách thêm 500 µL ethanol 70%, vortex Ly tâm 12.000 vòng phút trong 5 phút tại 4o

C

B10 Lặp lại B9

B11 Để tủa khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng Thêm 50 µL TE và bảo quản ở -30oC

2.1.5 Tiến hành định tính và định lượng DNA

 Phương pháp định lượng DNA bằng quang phổ kế

Hàm lượng DNA trong mẫu được xách định bằng cách đo mật độ quang Optical Density) bằng máy đo OD ở hai bước sóng 260 nm và 280 nm Đọc độ hấp thụ trên máy đo quang phổ ở bước sóng 260 nm, 280 nm

(OD- Phương pháp định tính DNA bằng điện di trên agarose

Kiểm tra sự hiện diện của DNA bằng cách điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 100V trong 20 phút sau đó gel được nhuộm với ethidium bromide Quan sát và chụp hình gel dưới tia UV