GIỚI THIỆU TỔNG QUAN
Bối cảnh và động lực của nghiên cứu
Tình hình dịch bệnh ở Việt Nam và khu vực lân cận hiện đang rất phức tạp, với sự gia tăng của các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm như tay chân miệng, cúm gia cầm A(H5N1), A(H7N9), sốt xuất huyết và sởi Nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời, những bệnh này có thể dẫn đến tiên lượng nặng và bùng phát thành dịch Mặc dù một số bệnh trước đây đã được khống chế, nhưng hiện nay lại gia tăng do nhiều yếu tố như biên giới dài, gia tăng giao thương, biến đổi khí hậu, thay đổi thời tiết, và đô thị hóa, gây khó khăn cho việc kiểm soát và ngăn chặn dịch bệnh.
Theo thống kê của Bộ Y tế vào tháng 10 năm 2018, bệnh tay chân miệng đã lan rộng ra 63 tỉnh, thành phố với 61.821 trường hợp mắc, trong đó có 29.324 người phải nhập viện và 6 ca tử vong Một số địa phương ghi nhận số ca mắc cao và gia tăng nhanh chóng.
TP Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Bình Dương, Đồng Tháp, Bà Rịa - Vũng Tàu đang đối mặt với dịch sốt xuất huyết nghiêm trọng, với 67.414 trường hợp mắc bệnh trên toàn quốc và 11 ca tử vong chủ yếu ở miền Nam và miền Trung Những con số này nhấn mạnh sự cần thiết phải triển khai ngay các giải pháp hiệu quả Để đối phó, bên cạnh việc tăng cường công tác phòng chống dịch và cải thiện hệ thống y tế, cần phát triển các phương pháp nhanh chóng và hiệu quả trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm.
Nhiều bệnh truyền nhiễm như sốt xuất huyết và sốt rét trở nên nghiêm trọng và dẫn đến tử vong do bệnh nhân chủ quan, tự chữa trị tại nhà thay vì đến bệnh viện Phương pháp chẩn đoán hiện tại yêu cầu bệnh nhân phải đến cơ sở y tế để lấy mẫu xét nghiệm, nhưng nhiều người nhầm lẫn triệu chứng với cảm cúm thông thường và ngại chờ đợi tại bệnh viện quá tải Ở các vùng sâu vùng xa, việc tiếp cận bệnh viện cũng gặp khó khăn do khoảng cách địa lý Những thực tế này đã thúc đẩy nhóm nghiên cứu Lab-on-a-chip khoa Kỹ phát triển các giải pháp mới nhằm cải thiện khả năng chẩn đoán và điều trị bệnh.
Trường Đại học Quốc Tế đang phát triển một thiết bị xét nghiệm y sinh nhanh chóng và giá cả phải chăng, không cần phòng xét nghiệm Thiết bị này sẽ được phân phối rộng rãi, giúp phát hiện kịp thời các trường hợp nhiễm bệnh, ngăn chặn sự chuyển biến xấu và bùng phát dịch bệnh.
Một trong những giải pháp hiện nay trong lĩnh vực xét nghiệm là phát triển các xét nghiệm nhanh trên giấy (RDTs) dựa trên kỹ thuật ELISA để nhận biết sự hiện diện của kháng nguyên mầm bệnh Mặc dù RDTs có tiềm năng cao cho xét nghiệm tại chỗ, nhưng vẫn còn nhiều hạn chế, như bệnh nhân cần đến bệnh viện để lấy mẫu và các RDTs thường không hiệu quả với mật độ mầm bệnh thấp Để khắc phục những nhược điểm này, kỹ thuật PCR và Realtime-PCR được sử dụng, nhưng chúng không lý tưởng cho xét nghiệm tại chỗ do yêu cầu về thiết bị và môi trường phòng thí nghiệm Do đó, phản ứng khuếch đại ADN dạng vòng trong điều kiện đẳng nhiệt (LAMP) đã được phát triển, giúp rút ngắn thời gian xét nghiệm và cho phép đọc kết quả bằng mắt thường.
Phương pháp UV, được phát triển bởi các nhà khoa học tại công ty Eiken Chemical, Nhật Bản vào năm 2000, sử dụng kỹ thuật LAMP dựa trên sự tổng hợp ADN thay thế chuỗi Kỹ thuật này thực hiện bằng cách sử dụng ADN polymerase và hai cặp mồi trong và mồi ngoài được thiết kế đặc biệt Trong giai đoạn đầu của phản ứng LAMP, cả bốn mồi đều được sử dụng, nhưng sau đó chỉ có các mồi trong được áp dụng để tổng hợp ADN thay thế chuỗi trong suốt chu kỳ phản ứng.
Phản ứng LAMP yêu cầu nhiệt độ ổn định 65 o C, điều này tạo điều kiện lý tưởng cho các ứng dụng xét nghiệm tại chỗ Tuy nhiên, thách thức là cần phát triển công nghệ để chế tạo thiết bị xét nghiệm tại chỗ dựa trên phản ứng LAMP, nhằm thay thế các xét nghiệm hiện có tại bệnh viện Nghiên cứu này đề xuất sử dụng công nghệ phòng thí nghiệm trên chip (lab-on-a-chip) dựa trên công nghệ vi lưu để giải quyết vấn đề này.
Vi lưu là lĩnh vực nghiên cứu tập trung vào các dòng chất lỏng và khí ở kích thước siêu nhỏ, từ hàng trăm micromet đến vài nanomet Thiết bị Lab-on-a-chip (LOC) là một ví dụ điển hình của công nghệ này, tích hợp nhiều chức năng trong một chip nhỏ gọn.
Phòng thí nghiệm trên một mạch tích hợp (Lab-on-a-chip) có khả năng thực hiện 9 hoặc nhiều chức năng chỉ trong một chip nhỏ từ vài mm² đến cm², giúp tự động hóa và tăng năng suất Thiết bị này có thể hoạt động như một công cụ chẩn đoán tại chỗ với hệ vi lưu tích hợp, yêu cầu lượng mẫu và hóa chất tối thiểu, gần như tự động và không cần phòng thí nghiệm hay thiết bị hỗ trợ Lab-on-a-chip sử dụng hệ thống vi lưu để điều khiển dòng chảy của các chất phản ứng với lưu lượng cực nhỏ từ 10^-9 đến 10^-18 microlit, cho phép thực hiện các phản ứng y tế thông thường trên quy mô nhỏ Điều này không chỉ tiết kiệm chi phí mà còn đơn giản hóa quy trình và nâng cao hiệu suất, hiệu quả của các xét nghiệm.
Hiện nay, công nghệ Lab-on-chip đã được ứng dụng thành công trong chẩn đoán bệnh, với nhiều sản phẩm thương mại hóa phục vụ cuộc sống hàng ngày Hãng Opko Diagnostics đã phát triển thiết bị mChip, cho phép xét nghiệm máu chỉ trong 10 phút cho các bệnh truyền nhiễm và ung thư Hãng Elveflow đã tích hợp quy trình PCR vào thiết bị vi lưu để khuếch đại ADN, đồng thời nghiên cứu các phương pháp như RT-PCR Ngoài ra, hệ thống GenePoc™ sử dụng hiệu ứng quay ly tâm để chuẩn bị mẫu và chạy PCR, có khả năng xét nghiệm 8 mẫu khác nhau và kiểm tra 12 mầm bệnh trên mỗi mẫu Tương tự, hệ thống Cobas® Liat PCR từ Roche Diagnostics cũng mang lại giải pháp chẩn đoán hiệu quả.
Hình 1 Ví dụ về một thiết bị lab-on-a-chip điển hình tích hợp và tự động hóa một số chức năng của phòng thí nghiệm
Chip tích hợp dải thuốc thử cho phép chiết xuất ADN, thực hiện PCR và phát hiện kết quả nhanh chóng Hệ thống hiện có khả năng kiểm tra ADN của Streptococcus nhóm A hoặc RNA của virus cúm A/B Thiết bị này có thể phân tích một mẫu trong chỉ 20 phút nhờ vào lượng mẫu nhỏ.
Kỹ thuật quang khắc trên vật liệu cảm quan như Su-8 và polymer như PDMS hiện đang là phương pháp phổ biến nhất để chế tạo chip vi lưu Mặc dù nhu cầu phát triển vi lưu gia tăng, nhưng các kỹ thuật chế tạo vẫn yêu cầu thiết bị đắt tiền và điều kiện phòng thí nghiệm đặc biệt, như phòng sạch và hệ quang khắc cao cấp Quy trình chế tạo hiện tại đòi hỏi mức đầu tư lớn cho thiết bị và hóa chất, khiến cho nhiều phòng thí nghiệm non trẻ khó tiếp cận Do đó, mặc dù lab-on-chip có tiềm năng ứng dụng cao, số lượng sản phẩm thực tế trong y tế vẫn rất hạn chế, đặc biệt ở các nước đang phát triển như Việt Nam.
Để Lab-on-a-chip và hệ vi lưu trở thành xu hướng mới trong ngành xét nghiệm y tế tương lai, cần phát triển một phương pháp chế tạo đơn giản và tiết kiệm chi phí Mục tiêu là chế tạo các thiết bị xét nghiệm nhanh và tại chỗ cho các ứng dụng y sinh.
Chúng tôi đề xuất phát triển thiết bị lab-on-a-chip cho phép thực hiện phản ứng LAMP nhằm khuếch đại ADN để chẩn đoán bệnh sốt rét với chi phí thấp, hướng tới việc đưa phòng xét nghiệm đến gần bệnh nhân hơn.
Mục tiêu của nghiên cứu
Mục tiêu chính của dự án là phát triển thiết bị AMchip với chi phí thấp để thực hiện phản ứng LAMP khuếch đại ADN tại chỗ Thiết bị AMchip sẽ bao gồm hai thành phần chính: chip phản ứng vi lưu, có khả năng thực hiện các thao tác trộn ADN và các chất phản ứng LAMP, điều khiển dòng chảy và khuếch đại ADN, cùng với bộ cung cấp nhiệt độ cần thiết cho phản ứng.
• Các mục tiêu cụ thể của đề tài gồm có:
Để chế tạo một hệ vi lưu, việc tạo ra khuôn mẫu thành công là yếu tố quan trọng nhất Hiện nay, các phương pháp phổ biến để tạo khuôn thường yêu cầu kỹ thuật phức tạp, sử dụng thiết bị quang khắc hiện đại và cần có phòng thí nghiệm sạch.
Đề tài này tập trung vào việc phát triển quy trình chế tạo khuôn cho hệ vi lưu bằng vật liệu giá rẻ và kỹ thuật đơn giản, giúp đơn giản hóa quy trình sản xuất và giảm chi phí đáng kể Điều này tránh việc đầu tư vào phòng thí nghiệm quang khắc hiện đại với thiết bị đắt tiền Khuôn chế tạo sẽ được sử dụng để đúc vật liệu PDMS, phục vụ cho việc tạo chip.
Mục tiêu 2 là phát triển thiết bị AMchip với hệ vi lưu và bộ cung cấp nhiệt, nhằm thực hiện phản ứng LAMP để khuếch đại ADN tại chỗ, phục vụ cho các xét nghiệm chẩn đoán bệnh truyền nhiễm.
TỔNG QUAN VỀ LÝ THUYẾT
Cơ sở lý thuyết về các cấu trúc vi lưu
2.1.1 Tính chất vật lý của chất lưu ở kích thước vi mô
Khi giảm kích thước ống dẫn, các hiện tượng vi mô sẽ xuất hiện, cho phép thực hiện các kỹ thuật không khả thi ở kích thước thông thường Nghiên cứu về vi lưu giúp mô tả sự thay đổi của các hiện tượng này và cách chúng có thể được ứng dụng cho nhiều mục đích khác nhau.
Hình 2 thể hiện hai khối hình lập phương với độ dài một cạnh tương ứng là L và L/2
Tỉ lệ giữa tiết diện bề mặt với thể tích của khối đầu tiên là: 6𝐿 2
Tỉ lệ giữa tiết diện bề mặt với thể tích của khối thứ hai là:
Khi độ dài mỗi cạnh của hình lập phương giảm từ L xuống L/2, thể tích của khối giảm 1/8, còn lại L^3/8, và diện tích bề mặt giảm còn 3L^2/2 Từ đó, tỷ lệ giữa diện tích bề mặt và thể tích tăng từ 6/L lên 12/L, cho thấy sự thay đổi này tỉ lệ nghịch với chiều dài cạnh Trong hệ vi lưu, việc giảm kích thước chi tiết có thể tăng tỷ lệ diện tích bề mặt so với thể tích, từ đó cải thiện hiệu suất của các chất xúc tác, enzym và hiệu ứng truyền nhiệt.
Hình 2 Tỉ lệ tiết diện bề mặt và thể tích
Lực mao dẫn là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến dòng chảy của chất lỏng trong hệ vi lưu Hiện nay, các phương pháp chế tạo hệ vi lưu chủ yếu sử dụng công nghệ quang khắc trên mặt phẳng, dẫn đến việc hầu hết các kênh dẫn vi lưu có hình dạng là đường ống hình chữ nhật Các thông số như góc đo, kích thước kênh dẫn và áp lực mao dẫn có thể được diễn đạt một cách cụ thể.
Sức căng bề mặt của chất lỏng trong kênh dẫn, ký hiệu là γ, ảnh hưởng đến các yếu tố như độ cao (h) và chiều rộng (w) của kênh Bên cạnh đó, các góc thấm ướt (contact angle) tại bốn vị trí của kênh dẫn, bao gồm mặt trên (θt), mặt đáy (θb), thành trái (θl) và thành phải (θr), cũng đóng vai trò quan trọng trong việc xác định hành vi của chất lỏng trong kênh.
Trong hệ vi lưu, lực ma sát (tính nhớt) đóng vai trò chủ đạo, khác với lực quán tính, dẫn đến các hiện tượng vật lý đặc biệt như dòng chảy tầng, sự khuếch tán, lực mao dẫn và tính chất bề mặt Dòng chảy trong kênh dẫn vi lưu rất trơn tru với ít sự hòa trộn giữa các dòng chảy song song, trái ngược với dòng chảy hỗn độn, nơi các dòng chảy va chạm và hòa lẫn Số Reynolds (Re) là giá trị không thứ nguyên thể hiện sự tương quan giữa lực quán tính và lực ma sát trong dòng chảy, giúp mô tả và dự đoán tính chất dòng chảy bên trong hệ vi lưu.
Hình 3 minh họa dòng chảy của chất lỏng trong kênh dẫn vi lưu có mặt cắt hình chữ nhật, với các góc thấm ướt tương ứng ở các mặt bên là θ t, θ b, θ l và θ r.
Mật độ chất lỏng ρ (kg m -3), độ dài d (m), vận tốc trung bình dòng chảy ν (m s -1) và độ nhớt động à (kg m -1 s -1) là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tính chất của lưu chất trong ống dẫn Các tính chất này sẽ khác nhau tùy thuộc vào giá trị số Reynolds (Re) của từng hệ thống.
- Re > 1 Lực quán tính chi phối hoàn toàn (dòng chảy hỗn độn)
2.1.2 Các cấu trúc vi lưu thụ động (Passive microfluidic building blocks)
Hệ vi lưu thụ động loại bỏ sự cần thiết của các thiết bị ngoại vi để điều khiển dòng chảy, dựa vào nội lực bên trong để di chuyển chất lỏng, từ đó tăng cường khả năng tự động hóa và giảm thiểu sự can thiệp của người dùng Dòng chảy trong hệ thống này được điều khiển bởi lực mao dẫn Để tối ưu hóa các tính năng, một mạch vi lưu có thể tích hợp nhiều phần tử thiết yếu như van vi lưu, bơm vi lưu và kênh trộn vi lưu, tạo ra các cấu trúc đa dạng.
Hình 4 Dòng chảy tầng (laminar flow) và dòng chảy hỗn độn (turbulent flow).
2.1.2.1 Kênh trộn vi lưu Để một hệ vi lưu có thể thực hiện phản ứng sinh, hóa, các kênh trộn siêu nhỏ là thành phần tối quan trọng cần được tích hợp vào chip Như đã nhắc đến ở phần trước, số Re trong các kênh vi lưu là rất nhỏ, dẫn đến các dòng chảy bên trong kênh vi lưu là dòng chảy tầng hoàn
Hình 5 minh họa mô hình tượng trưng và bản thiết kế của hệ vi lưu, bao gồm nhiều phần tử vi lưu khác nhau như bơm mao dẫn và van kích hoạt.
Hình 6 Ví dụ về một thiết kế kênh trộn đơn giản hình zig-zag
16 toàn [22] Vì vậy, việc hòa trộn các dòng chất lỏng trong kênh vi lưu sẽ khó khăn hơn so với trong các ống dẫn ở kích thước bình thường
Cấu trúc kênh trộn trong hệ vi lưu được chia thành kênh trộn thụ động và kênh trộn chủ động Kênh trộn chủ động yêu cầu năng lượng và tín hiệu điều khiển từ thiết bị bên ngoài, thường kết hợp với cơ cấu chuyển động để hòa trộn dung dịch Ngược lại, kênh trộn thụ động sử dụng các cấu trúc vi mô với hình dạng khác nhau để tăng cường vùng tiếp xúc giữa các dòng chất lỏng, nâng cao hiệu quả hòa trộn Nguyên lý hoạt động của kênh trộn thụ động hỗ trợ quá trình khuếch tán tự nhiên của các chất, được mô tả bởi định luật Fick, liên quan đến thông lượng và sự thay đổi nồng độ theo thời gian và vị trí.
Thông lượng khuếch tán J trên mỗi đơn vị diện tích được xác định bởi công thức 𝜕𝑥 (5), trong đó C là nồng độ vật chất khuếch tán, x là vị trí, và D là hệ số khuếch tán Hệ số này phụ thuộc vào các yếu tố như nhiệt độ, độ nhớt, hình dạng và kích thước của phân tử khuếch tán.
Trong hệ vi lưu, xác định thời gian hòa trộn giữa hai chất lỏng là rất quan trọng Cụ thể, trong một kênh dẫn vi lưu với hai lớp chất lỏng chảy liền kề, chiều dài khuếch tán đặc trưng (độ dày của lớp chất lỏng) được ký hiệu là lD Thời gian cần thiết cho sự hòa trộn khuếch tán, ký hiệu là tD, có thể được biểu diễn theo công thức [25].
Figure 7 showcases various microchannel mixing designs that have been published, including T-mixers, Y-conjunctions, zig-zag patterns, split-and-recombine methods, hydrodynamic focusing, integrated obstacles, and chaotic advection techniques.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng hiệu quả khuếch tán trong kênh trộn thụ động có thể được gia tăng bằng cách giảm chiều dài khuếch tán lD hoặc tăng thời gian và diện tích tiếp xúc của các dòng chất lỏng Một số thiết kế kênh trộn phổ biến bao gồm kênh trộn hình chữ T (T-mixers), đầu nối chữ Y (Y-conjuctions), thiết kế chia tách-hợp nhất (split-and-recombine), và việc bổ sung chướng ngại vật trong kênh dẫn để phá vỡ sự trơn tru của dòng chảy phân tầng Các thiết kế hình zig-zag cũng được sử dụng để tối ưu hóa quá trình khuếch tán.
2.1.2.2 Các van vi lưu (microvalves)
Phương pháp chế tạo hệ vi lưu
Việc chế tạo một thiết bị vi lưu bao gồm 2 phần chính: chế tạo khuôn mẫu và nhân bản chip vi lưu từ khuôn mẫu có sẵn
2.1.3 Các phương pháp chế tạo khuôn mẫu cho hệ vi lưu
Khuôn vi lưu trên thế giới thường được sản xuất bằng công nghệ quang khắc, một quy trình phức tạp và tốn kém Trong quy trình quang khắc tiêu chuẩn, nguồn UV mạnh mẽ được chiếu qua lớp mặt nạ (photomask) để tác động lên lớp vật liệu cảm quang.
Hình 12 Khuôn mẫu vi lưu (trái) và thao tác chế tạo chip vi lưu từ khuôn có sẵn
Hình 13 Sơ đồ tối giản của một quy trình chế tạo khuôn mẫu bằng phương pháp quang khắc.
Ví dụ như Su-8, photoresist được sử dụng để tạo ra các chi tiết của hệ vi lưu trên lớp vật liệu Quá trình này yêu cầu môi trường phòng sạch tiêu chuẩn, dẫn đến chi phí vận hành cao Một số nghiên cứu đã đề xuất các phương pháp tiết kiệm hơn, như tránh kỹ thuật quang khắc trong chế tạo khuôn bằng cách sử dụng máy cắt để tạo chi tiết trên giấy đề-can, cắt laser, hoặc sử dụng polymer co rút và polyester-toner.
Các phương pháp như giấy-wax và keo NOA mặc dù được sử dụng, nhưng cho kết quả với độ phân giải và độ chính xác không cao, không thể cạnh tranh với kỹ thuật quang khắc truyền thống Trong khi đó, công nghệ in 3D nổi lên như một giải pháp tiềm năng để chế tạo khuôn vi lưu nhanh chóng và tiết kiệm chi phí Tuy nhiên, công nghệ này vẫn đối mặt với các thách thức như nâng cao độ phân giải, tương thích sinh học, và đạt được độ mịn cũng như chính xác ở kích thước vi mô.
Trên hết, kỹ thuật quang khắc vẫn là tiêu chuẩn vàng cho việc chế tạo khuôn mẫu chính xác
Nhằm giảm giá thành và đơn giản hóa quy trình sản xuất khuôn mẫu, các nỗ lực hiện tại đang tập trung vào việc thay thế nguồn sáng UV và loại mặt nạ Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu vẫn phải sử dụng vật liệu cảm quang tiêu chuẩn, đó là SU-8, với chi phí cao.
2.1.4 Chế tạo chip vi lưu
Sau khi khuôn mẫu được chế tạo, bước tiếp theo là đúc chip từ khuôn bằng các vật liệu như silicon, thủy tinh, PMMA, PDMS và giấy Hiện nay, kỹ thuật khắc mềm (soft-lithography) là phương pháp phổ biến để sản xuất các thiết bị vi lưu, được phát triển bởi nhóm Whitesides Trong quy trình này, một hợp chất tiền polyper như PDMS được đông cứng trên bề mặt khuôn, sau đó tấm PDMS có hình dạng khắc ngược của khuôn mẫu sẽ được kết hợp với một lớp đế, thường là kính, để tạo ra chip hoàn chỉnh.
Hình 14 Quy trình đúc chip bằng vật liệu PDMS
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nội dung 1: Xây dựng quy trình chế tạo khuôn cho hệ vi lưu theo phương pháp
phương pháp mới rẻ tiền
3.1.1 Tổng quan quy trình chế tạo khuôn:
Quy trình chế tạo khuôn mẫu trên cơ sở phương pháp quang khắc được thể hiện trên hình 15 dưới đây
Để bắt đầu quá trình quang khắc, bước đầu tiên là chế tạo mặt nạ (photomask) cho khuôn mẫu Hình dạng 2D của hệ vi lưu được thiết kế trên các phần mềm đồ họa máy tính như Solidworks, Inkscape, hay Corel Draw, sau đó sẽ được in ra trên một tấm phim trong suốt dưới dạng âm bản, được gọi là mặt nạ Vật liệu dùng để in phim và kỹ thuật thực hiện là rất quan trọng trong quá trình này.
Hình 15 Quy trình quang khắc được tối giản và sử dụng vật liệu giá rẻ
23 phương pháp in có ảnh hưởng lớn đến chất lượng khuôn mẫu chế tạo chip vi lưu Nhóm nghiên cứu đã xác định loại vật liệu tối ưu giúp ánh sáng UV xuyên qua hiệu quả, đồng thời lựa chọn phương pháp in phù hợp để đảm bảo mực in có khả năng cản ánh sáng UV và in được các chi tiết nhỏ, phức tạp mà không gặp sai lệch.
Nhóm đã sử dụng máy in laser văn phòng với độ phân giải 2400 dpi để in mặt nạ trên tấm phim PET trong suốt, nhưng kết quả in không đạt yêu cầu do các đường nét thiết kế bị gồ ghề và hở sáng Để khắc phục, nhóm đã áp dụng dung dịch tăng cường độ đậm bản in (SpraywayⓇ Toner Aide Enhancer), giúp lấp đi những khoảng hở và tạo ra lớp in đậm hơn, nhưng không giải quyết được tình trạng gồ ghề Do đó, kỹ thuật in chế bản offset đã được đề xuất, mang lại độ phân giải cao và độ chính xác tuyệt đối cho các đường nét thiết kế, tương tự như hình ảnh gốc trên máy tính.
• Bước 2: Phủ lớp khuôn gels
Nhằm thay thế các vật liệu cảm quang đắt tiền, nhóm nghiên cứu đã sử dụng gels UV, một loại vật liệu mới có giá thành thấp và dễ tìm ở Việt Nam, để chế tạo khuôn vi lưu Gels UV, thường được sử dụng trong ngành trang trí móng tay, có thành phần chính là Methacrylate (MA), cũng được áp dụng trong nha khoa Dạng lỏng của gels UV sẽ đông cứng khi tiếp xúc với tia UV, nhờ vào phản ứng hóa học từ các thành phần quang hóa (photo-initiators) trong vật liệu, dẫn đến sự kết đông (cross-link) và tạo ra lớp gels cứng chắc, không tan.
Một tấm lam kính kích thước 25 mm x 75 mm được rửa sạch bằng acetone, ethanol và nước cất Sau đó, một lớp viền bằng giấy đề-can dày 80 mm được dán lên tấm kính để xác định độ cao cho lớp gels Khoảng 1.2 ml UV gels được đổ lên tấm kính, rồi tấm phim âm bản được đặt lên trên để tiếp xúc với phần gels Cuối cùng, một thanh kim loại tròn được sử dụng để lăn đều và cán mỏng lớp gels trên tấm kính.
Tấm kính được phủ gels và mặt nạ âm bản sẽ được chiếu sáng bằng nguồn UV 365 nm trong 25 giây, khiến phần gels tiếp xúc với ánh sáng UV đông cứng và bám chắc vào kính, trong khi phần gels bị che bởi mực in vẫn giữ nguyên trạng thái lỏng.
Sau khi chiếu UV, tấm phim được gỡ nhẹ nhàng, và phần kính cùng gels được ngâm trong dung dịch acetone và ethanol theo tỉ lệ 5:1 để loại bỏ gels chưa đông cứng Để tăng tốc quá trình rửa trôi, chúng tôi sử dụng cọ mềm quét nhẹ lên khuôn Cuối cùng, khuôn sẽ được sấy khô bằng vòi xịt khí nén hoặc đặt trong lò nướng ở 100°C trong vài phút, tạo ra khuôn hoàn chỉnh với lớp gels đông cứng và các đường nét giống hệt thiết kế, dính chặt vào tấm kính.
3.1.2 Quy trình chế tạo chip vi lưu từ khuôn mẫu
Vật liệu chính để đổ khuôn chip vi lưu là Polydimethylsiloxane (PDMS), một loại polymer trong suốt Để chuẩn bị, PDMS được trộn với chất kết đông theo tỉ lệ 10:1, khuấy đều và loại bỏ bọt khí trong buồng hút chân không khoảng 10 phút Hỗn hợp sau đó được đổ vào khuôn gels và nướng ở 90°C trong 1 giờ để làm đông cứng Sau khi tách ra, tấm PDMS được rửa sạch với acetone, ethanol và nước cất, tạo ra hình dạng chip vi lưu Để hoàn thiện, tấm PDMS cần được gắn với lớp kính, nhưng do kích thước nhỏ của các kênh dẫn, keo dán thông thường không thể sử dụng Thay vào đó, phương pháp xử lý plasma được áp dụng để gắn kết hai bề mặt, tạo ra các nhóm SiOH trên bề mặt PDMS và kính sau khi oxi hóa trong môi trường plasma.
Hình 16 Sơ đồ mô tả quá trình chế tạo chip từ PDMS và khuôn gels
Liên kết Si-O-Si được hình thành khi 25 được áp vào nhau, giúp hai bề mặt gắn chặt Sau khi hoàn thành, chip vi lưu PDMS sẽ được kiểm tra về dòng chảy, độ thấm ướt và đảm bảo không có sự rò rỉ.
Nội dung 2: Thiết kế, chế tạo chip phản ứng với hệ vi lưu thực hiện các thao tác
Để thực hiện phản ứng LAMP, trước tiên cần ly trích ADN từ mẫu bệnh, sau đó hòa trộn sản phẩm với chất phản ứng LAMP và bộ mồi, ủ ở 65 o C trong 30 phút Kết quả sau phản ứng sẽ được kiểm tra bằng điện di, quan sát độ đục hoặc sự thay đổi màu sắc Chúng tôi đang thiết kế các cấu trúc vi lưu nhằm tự động hóa các thao tác của kỹ thuật LAMP, dựa trên các nghiên cứu trước về điều khiển dòng chảy thụ động như sử dụng van ngừng, van kích hoạt, bơm mao dẫn và áp lực chân không.
3.2.1 Thiết kế phản ứng với buồng đơn
Cấu trúc vi lưu đầu tiên được thiết kế để điều khiển thụ động các dòng chảy bên trong chip, có kích thước 75x25x5 mm và bao gồm hai ngõ vào.
Hình 17 Thiết kế chip vi lưu với buồng phản ứng đơn cho phản ứng LAMP
Chip phản ứng được thiết kế với hai ngõ vào, trong đó ngõ vào số 2 (second inlet) dùng để tải mẫu ADN và ngõ vào số 1 (first inlet) để đưa chất phản ứng và bộ mồi vào Chất lỏng từ ngõ vào số 2 sẽ dừng lại tại van kích hoạt (trigger valve), trong khi chất phản ứng và bộ mồi sẽ đi qua kênh trộn zig-zag dài 20 mm Hai dòng chất lỏng sẽ hòa trộn trong kênh trộn và cuối cùng tập trung tại buồng phản ứng hình trụ thể tích 25 µL.
Chip này chứng minh tính ứng dụng của cấu trúc vi lưu trong việc điều khiển dòng chảy chất lỏng và kết hợp nhiều cấu trúc để thực hiện phản ứng sinh học phân tử, thay thế các thao tác trong phòng thí nghiệm Tuy nhiên, để lab-on-chip thực sự hữu ích, cần tối giản các cấu trúc để người dùng dễ dàng sử dụng Phần tiếp theo sẽ trình bày các thiết kế tối ưu cho khả năng chẩn đoán tại chỗ.
3.2.2 Thiết kế phản ứng với cấu trúc đa kênh
Thay vì đưa mẫu bệnh và chất phản ứng vào chip cùng lúc, bộ mồi và chất phản ứng LAMP được hòa trộn và đông khô để lưu trữ trong buồng phản ứng của chip Khi cần sử dụng, người dùng chỉ cần nhỏ dung dịch chứa ADN vào chip, các kênh dẫn sẽ tự động dẫn chất lỏng vào buồng chứa, hòa tan chất phản ứng đã đông khô, sau đó chỉ cần ủ và đọc kết quả Dựa trên nguyên lý này, có hai thiết kế được phát triển: một cho xét nghiệm nhiều bệnh từ cùng một mẫu trên một chip, và một cho xét nghiệm nhiều mẫu cùng lúc trên một chip.
Hình 18 Góc nhìn từ mặt cắt ngang của thiết kế chip và cách tải mẫu phản ứng vào chip
3.2.2.1 Chip phản ứng đa kênh với cùng một ngõ vào
Chip vi lưu được thiết kế với bốn buồng phản ứng hình bán cầu cách xa nhau, kết nối qua bốn kênh dẫn, tạo thành một ngõ vào duy nhất ở trung tâm để tải mẫu bệnh Chất phản ứng và bộ mồi cho từng loại bệnh được đông khô trên giấy sợi thủy tinh Merck kích thước 3x3 mm, sau đó được đưa vào buồng phản ứng trong quá trình chế tạo chip Sau khi hoàn thành, chip vi lưu được bảo quản trong túi nhựa hút chân không cho đến khi cần sử dụng.
3.2.2.2 Chip phản ứng đa kênh riêng lẻ
Thiết kế thứ hai bao gồm từ 4 đến 6 buồng phản ứng hình bán cầu, mỗi buồng có ngõ vào riêng để tải mẫu xét nghiệm Chất phản ứng LAMP và bộ mồi được đông khô và chuẩn bị sẵn trong buồng phản ứng trong quá trình chế tạo Thiết kế này cho phép người dùng thực hiện kỹ thuật LAMP trên nhiều mẫu cùng lúc, mang lại hiệu quả cao trong việc xét nghiệm.
Hình 19 Thiết kế của chip phản ứng đa kênh với một ngõ vào.
Hình 20 Thiết kế chip với buồng phản ứng riêng lẻ
3.2.2.3 Thao tác chế tạo chip
Quy trình chế tạo chip đa kênh tương tự như quy trình đã mô tả trước đó, với khuôn mẫu được làm từ gels UV và các kênh dẫn vi lưu có độ cao 80 µm Các buồng phản ứng trên chip có hình dạng chóp cầu với độ cao 2 mm và đường kính 4 mm, nhằm đảm bảo đủ độ sâu (trên 800 µm) để kết quả thay đổi màu của LAMP có thể quan sát bằng mắt thường Kỹ thuật quang khắc truyền thống không thể tạo ra buồng phản ứng chóp cầu do hạn chế về độ dày của vật liệu SU-8 khi đông cứng dưới tia UV Tuy nhiên, gels UV trong nghiên cứu này đáp ứng yêu cầu thiết kế Sau khi chế tạo khuôn, một giọt gels UV được nhỏ vào trung tâm mỗi buồng phản ứng, và dưới tác động của trọng lực, lớp gels sẽ lan ra tạo thành hình chóp cầu Cuối cùng, khuôn này được phơi dưới tia UV trong 2 phút để đảm bảo đông cứng hoàn toàn.
Hình 21 Mô tả hình dạng khuôn mẫu vi lưu với buồng phản ứng hình chỏm cầu
Nội dung 3: Chế tạo khối điều khiển tự động nhiệt độ nhỏ gọn, di động
Hình 22 Chip phản ứng đã được chế tạo và tải chất lỏng vào bên trong để kiểm tra
Hình 23 Sơ đồ khối của thiết kế phần cứng.
Để gia nhiệt cho chip phản ứng, bộ điều khiển nhiệt độ cần có thiết kế bao gồm bộ vi xử lý điều khiển thuật toán PID, cảm biến nhiệt độ, nguồn pin, nút nhấn điều chỉnh, đèn báo hiệu và tấm điện trở nhiệt sử dụng dòng điện để nung nóng.
Cảm biến nhiệt độ được lắp đặt trên tấm điện trở nhiệt để theo dõi nhiệt độ tức thời và gửi dữ liệu về vi điều khiển Từ sai số giữa nhiệt độ hiện tại và nhiệt độ mong muốn, vi điều khiển điều chỉnh xung PWM cấp cho cực Gate của MOSFET (IRLB8743), nhằm thay đổi cường độ dòng điện qua tấm điện trở nhiệt, từ đó điều chỉnh nhiệt độ Nhờ nguyên lý này, thiết bị có thể đạt nhiệt độ 65 o C cho phản ứng LAMP trong vòng 5 phút.
Thiết bị sử dụng pin sạc 12V với 3 cells và dung lượng 2200 mAh, cung cấp nguồn cho mạch vi điều khiển qua mạch chuyển đổi điện áp từ 12V sang 5V, đồng thời kết nối với tấm điện trở nhiệt và cực Drain của MOSFET để gia nhiệt Khi pin cạn, người dùng có thể sạc thiết bị bằng adapter 12V, 2A Khi kết nối với bộ sạc, rơ-le trong mạch điều khiển sẽ ngắt kết nối pin với mạch điện để đảm bảo an toàn, cho phép thiết bị hoạt động bằng nguồn trực tiếp từ bộ sạc trong khi sạc pin.
Hình 24 Mô hình 3D của mạch điện (trên) và hình ảnh mạch điều khiển cùng với thiết bị được chế tạo (dưới)
Board mạch của thiết bị được thiết kế với mạch chính chứa mạch nguồn và vi điều khiển ở dưới, trong khi mạch nút nhấn và đèn LED báo hiệu nằm ở trên Vỏ hộp làm bằng nhựa bao gồm phần đế gắn board mạch, các cổng kết nối và pin sạc Nắp hộp có lỗ hình chữ nhật để gắn tấm điện trở nhiệt, được cố định trên đế (105x60 mm) làm từ nhựa ABS qua công nghệ in 3D, có rãnh cho cảm biến nhiệt độ Kích thước tổng thể của thiết bị là 160x100 mm.
Để tối ưu hóa trải nghiệm người dùng mà vẫn giữ được tính đa năng, vi xử lý được lập trình với 3 chế độ gia nhiệt khác nhau: 45 độ C trong 30 phút và 65 độ C.
Phản ứng LAMP được thực hiện trong 30 phút ở nhiệt độ 65 o C, trong khi quá trình ly trích ADN diễn ra ở 95 o C trong 15 phút Các thông số gia nhiệt đã được cài đặt sẵn, người dùng chỉ cần nhấn một nút duy nhất để bắt đầu quá trình gia nhiệt.
Hình 25 Thiết kế 3D của bộ phận cố định tấm điện trở nhiệt cùng với cảm biến nhiệt độ (trái) và thiết bị hoàn chỉnh (phải)
Hình 26 mô tả lưu đồ giải thuật cho chương trình điều khiển nhiệt độ Khi khởi động, thiết bị kiểm tra các nút nhấn chế độ; khi một nút được nhấn, mức logic của chân vi điều khiển chuyển về trạng thái Low, kích hoạt chương trình gia nhiệt Vi điều khiển đọc giá trị nhiệt độ từ cảm biến mỗi 0.5 giây, sử dụng giá trị này cùng với nhiệt độ mong muốn để thực hiện vòng lặp PID Kết quả của vòng lặp là xung PWM từ chân analog kết nối với MOSFET Khi cảm biến đạt giá trị nhiệt độ mong muốn, đèn LED sẽ sáng, báo hiệu người dùng đặt chip phản ứng vào ủ và tự động đếm thời gian, duy trì mức nhiệt độ cố định trong suốt quá trình hoạt động.
Nội dung 4: Khảo sát tính năng thực hiện phản ứng LAMP để phát hiện ADN mầm bệnh 32 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC
Việc chuẩn bị phản ứng LAMP cho chip vi lưu tương tự như quy trình LAMP trong phòng thí nghiệm, bao gồm các bước ly trích ADN, khuếch đại và đọc kết quả Trong dự án này, bước khuếch đại và đọc kết quả được tự động hóa và tích hợp trên chip, trong khi chiết xuất ADN được thực hiện tại phòng thí nghiệm Nguồn ADN sử dụng cho dự án là máu nuôi cấy ký sinh trùng do Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng TP.HCM cung cấp, và quá trình chiết xuất ADN sử dụng cột lọc với năm bước.
Hình 26 Lưu đồ giải thuật của phần mềm điều khiển nhiệt độ
Quá trình ly trích ADN bao gồm các bước chính: gắn ADN vào cột silica, rửa ADN và loại bỏ ethanol bằng cách làm khô, sau đó tách rửa ADN khỏi cột Nồng độ ADN được đo bằng máy đo quang phổ ở bước sóng UV 260 nm, và PCR được thực hiện để kiểm tra độ tinh khiết của ADN đã được ly trích Sản phẩm ADN sau khi ly trích sẽ được sử dụng làm mẫu phản ứng cho phương pháp LAMP.
In the amplification step, combine 6.25 µL of 2X Color LAMP master mix (New England BioLabs), distilled water for PCR, and 1.25 µL of a 10X primer mix containing 8 µM FIP and BIP, along with 4 µM of the Loop primers.
Hỗn hợp dương tính và âm tính được chuẩn bị từ F và Loop B, 2 àM F3 và B3, với mồi nhận diện gen Plasmodium falciparum 18S Sau khi nhỏ 7.5 àL hỗn hợp lên giấy sợi thủy tinh và để khô ở 37 oC qua đêm, các tấm giấy được cố định vào buồng phản ứng Khi sử dụng, dung dịch ADN được nhỏ vào chip phản ứng, chảy vào buồng và hòa tan các chất phản ứng đã khô Chip sau đó được ủ ở 65 oC trong 30 phút Kết quả được đọc thông qua Color LAMP 2X, với phenol đỏ thay đổi màu từ hồng sang vàng khi pH giảm do giải phóng H+ trong quá trình khuếch đại ADN Cuối cùng, phương pháp điện di gel agarose được sử dụng để xác nhận độ chính xác của sự thay đổi màu trong hỗn hợp phản ứng LAMP trước và sau khi ủ.
P.falciparum genbank accession nos AF145334.1 (5’ - >3’)
Bảng 1 Bộ mồi cho gene 18S rRNA gene [63]
Quy trình chế tạo khuôn
4.1.1 Mặt nạ quang khắc thay thế
Trong quy trình chế tạo khuôn cho hệ vi lưu tại các nước phát triển, mặt nạ thường được làm từ chrome với giá từ 100$ đến 500$ Một lựa chọn khác là mặt nạ bằng tấm phim trong suốt, được sản xuất bởi các công ty chuyên nghiệp như Micro Lithography Ltd., với giá dưới 100$ cho các chi tiết thiết kế nhỏ Tại Việt Nam, chưa có nhà sản xuất chuyên biệt cho sản phẩm này, do đó, nhóm đã nỗ lực tìm kiếm phương pháp thay thế để đáp ứng nhu cầu Việc in mặt nạ trên tấm phim trong suốt bằng máy in văn phòng hoặc kỹ thuật in offset mang lại hiệu quả kinh tế và tiết kiệm thời gian, với giá thành của một tấm phim offset kích thước A4 chỉ khoảng 20,000 đồng.
Các loại mặt nạ được phát triển nhằm thay thế cho mặt nạ đắt tiền, với sản phẩm khuôn tương ứng (A) Mặt nạ từ máy in laser có các chi tiết bị hở sáng và gồ ghề (B) Mặt nạ từ máy in laser được phủ dung dịch làm đậm, giúp lấp kín các khoảng hở sáng nhưng vẫn giữ các đường viền gồ ghề (C) Phim in bằng kỹ thuật offset mang lại các chi tiết sắc nét với độ tương phản cao và không có khoảng hở sáng.
Độ chính xác và độ phân giải của mặt nạ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng kỹ thuật quang khắc Hình 27 A cho thấy hình ảnh tấm phim in bằng máy in laser văn phòng với mực in không đồng đều, có nhiều khoảng hở và cạnh viền gồ ghề, điều này đã được nghiên cứu trước đây xác nhận Nguyên nhân là do bản chất của phương pháp in, khi đầu phun máy in phun ra các chấm mực tích điện kích thước micromet, không phủ kín hoàn toàn khu vực in, dẫn đến các khoảng hở nhỏ cho phép tia UV xuyên qua, gây đông cứng không đồng đều lớp gels bên dưới Việc sử dụng dung dịch xịt làm đậm mực (Hình 27 B) có thể lấp kín các khoảng hở, nhưng vẫn không cải thiện được phần cạnh viền, khiến lớp gels ở thành kênh dẫn không thẳng hàng Trong khi đó, phương pháp in offset (Hình 27 C) cho phép cả bề mặt và cạnh lớp gels đông lại đồng nhất và thẳng hàng, do đó, in offset là lựa chọn phù hợp cho quy trình chế tạo khuôn vi lưu giá thành thấp.
4.1.2 Nguồn sáng cho kỹ thuật quang khắc
Trong quy trình quang khắc chuẩn, hệ thống cố định mặt nạ và nguồn sáng UV từ bóng đèn cao áp thủy ngân được sử dụng để đông lớp gels Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chọn sử dụng đèn LED UV thông dụng nhằm tiết kiệm thời gian và chi phí Một thách thức là các thông số kỹ thuật của đèn LED UV trên thị trường thường không rõ ràng, gây khó khăn trong việc xác định khoảng cách và thời gian chiếu sáng hợp lý để đạt được kết quả khuôn tốt nhất Để giải quyết vấn đề này, chúng tôi đã áp dụng thiết bị đo cường độ sáng chuyên dụng để đo cường độ tại các khoảng cách khác nhau trong vùng chiếu sáng.
Hình 28 Kết quả đo lường cường độ sáng đơn vị mW/cm 2 tại các vị trí theo độ cao khác nhau từ nguồn sáng
Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng khi lớp gels dày 500 µm được đặt cách nguồn sáng UV 3 cm với cường độ sáng 18.5 mW/cm², lớp gels sẽ đông cứng đồng nhất và có khả năng tạo ra các chi tiết chính xác.
Chùm sáng từ đèn LED UV được sử dụng là chùm sáng phân kỳ, và nghiên cứu ảnh hưởng của góc phân kỳ đến việc tạo ra kênh dẫn vuông góc là cần thiết Qua việc thay đổi khoảng cách giữa nguồn sáng và lớp gels, chúng tôi đã đo và so sánh góc nghiêng của kênh dẫn so với mặt đáy Kết quả cho thấy, khi lớp gels được đặt gần nguồn sáng hơn, kênh dẫn trở nên vuông hơn, nhưng nếu khoảng cách quá nhỏ (< 1 cm), toàn bộ lớp gels sẽ đông cứng Cuộc khảo sát cho thấy với lớp gels dày 500 µm, khi đặt cách nguồn UV 3 cm trong 25 giây, kênh dẫn tạo ra có độ vuông góc tương đối cao (86.6° ± 1.55°).
Chúng tôi đã kiểm tra tính lặp lại của phương pháp bằng cách so sánh độ rộng các đường kênh dẫn với kích thước thiết kế Với lớp gel dày 500 µm, chiếu sáng bằng tia UV ở khoảng cách 3 cm trong 25 giây, kết quả cho thấy sự đồng nhất về kích thước với hệ số tương quan R² là 0.9992 Tỉ lệ giữa độ rộng mặt trên thiết kế và thực tế của các kênh dẫn từ 150 µm đến 1000 µm là 1±0.03, trong khi tỉ lệ giữa mặt đáy kênh dẫn thiết kế và thực tế là 0.97±0.03.
Khi chế tạo khuôn mẫu cho hệ vi lưu, độ dày của lớp gel quyết định chiều cao của kênh dẫn chất lỏng Hiện nay, các phương pháp tiên tiến áp dụng máy quay ly tâm để phủ lớp vật liệu cảm quan.
Tỉ lệ giữa độ rộng thiết kế và độ rộng đo được của các kênh dẫn ở các kích thước khác nhau được thể hiện qua Hình 29 Tất cả các kênh dẫn được thiết kế với độ cao 500 µm, được chiếu UV trong 25 giây từ khoảng cách 3 cm so với nguồn sáng (Trái), cùng với hình ảnh SEM mặt cắt của các kênh dẫn.
Để thực hiện kỹ thuật quang khắc, việc trang bị máy quay ly tâm và hệ thống hút chân không có thể khó khăn cho các phòng thí nghiệm sơ khởi Do đó, chúng tôi đã áp dụng kỹ thuật cán mỏng để thay thế Lớp gels được trải đều giữa lớp kính và tấm phim bằng cách lăn một thanh kim loại, với độ dày được xác định bằng lớp viền giấy đề-can Khi áp mặt nạ lên tấm kính, khoảng hở do lớp giấy đề-can tạo ra sẽ cho phép lớp gels phủ kín, giúp điều chỉnh độ cao của lớp gels tương ứng với độ dày của giấy đề-can Bằng cách thay đổi độ dày này, chúng tôi có thể tạo ra khuôn vi lưu với nhiều độ cao khác nhau từ 80 nm đến 1000 nm, điều này rất khó đạt được khi sử dụng phương pháp quang khắc truyền thống như vật liệu cảm quang SU-8.
Hình 30 Độ cao lớp gels phụ thuộc vào độ vao lớp giấy dề can dán trên lớp kính khi chế tạo
4.1.4 Khả năng tương thích của khuôn gels với việc chế tạo chip vi lưu
Hình 32 minh họa các thành phần của hệ vi lưu, bao gồm (A) khuôn gels và (B) hình ảnh chi tiết dưới kính hiển vi Ngoài ra, (C) chip vi lưu được trang bị bơm mao dẫn và (D) chip kết hợp nhiều phần tử như kênh trộn, van kích hoạt và bơm mao dẫn, tạo nên một hệ thống vi lưu hoàn chỉnh.
Hình ảnh trong Hình 31 cho thấy khuôn gels đã được áp dụng thành công trong việc chế tạo chip vi lưu với nhiều cấu trúc khác nhau, và các chip này đã được kiểm tra dưới kính hiển vi SEM.
Khuôn gels được chế tạo để đúc chip từ vật liệu PDMS, cho phép phần PDMS không bám dính vào khuôn, tạo ra các chi tiết chính xác với các kênh dẫn thông suốt và liền mạch Kết quả này chứng minh tính hữu dụng của phương pháp chế tạo khuôn mẫu Một số sản phẩm như bơm bao dẫn và kênh trộn mẫu đã được tạo ra với nhiều hình dáng và độ phức tạp khác nhau, với các đường nột cong và vuông góc có kích thước từ 150 – 200 µm được tạo thành rất chính xác Các chip vi lưu cũng được kiểm tra khả năng dẫn chất lỏng bằng cách cho dung dịch màu thực phẩm chảy vào bên trong.
Chip vi lưu cho phản ứng khuếch đại ADN
4.2.1 Chip phản ứng với buồng đơn
Sau khi thiết kế chip phản ứng, chúng tôi đã tiến hành chế tạo và thử nghiệm khả năng điều khiển dòng chảy của chip Đồng thời, chúng tôi cũng thực hiện giả lập trên phần mềm COMSOL để đánh giá và so sánh kết quả lý thuyết với thực tế Như hình 33 minh họa, hai dung dịch màu thực phẩm đỏ và xanh được đưa vào hai ngõ vào của chip, sau đó chúng chảy qua kênh dẫn, gặp nhau tại vùng tiếp xúc và hòa trộn tại kênh trộn trước khi tiến vào buồng phản ứng.
Hình 31 Mô hình chạy giả lập khả năng trộn mẫu của chip (trên) và hình ảnh trộn mẫu thực tế trên chip (dưới).
4.2.2 Chip phản ứng đa kênh Đối với chip phản ứng đa kênh, chip sau khi gia công sẽ được hút chân không dưới điều kiện áp suất 10 kPa trong hơn 1 giờ, không khí hòa lẫn bên trong cấu trúc vật liệu PDMS lúc này sẽ được hút ra ngoài làm cho nồng độ không khí bên trong chip giảm đi Khi sử dụng, người dùng lấy chip ra khỏi lớp bảo vệ, đặt trong môi trường không khí bình thường; lúc này nồng độ không khí bên trong PDMS sẽ có xu hướng tăng lên bằng cách hấp thụ không khí từ môi trường xung quanh bao gồm cả không khí bên trong kênh dẫn Việc hấp thụ không khí bên trong kênh dẫn và buồng phản ứng của chip PDMS tạo nên một lực hút giúp kéo chất lỏng ở ngõ vào của chip chảy vào trong buồng phản ứng, tại đây, chất lỏng bắt đầu thấm vào lớp giấy sợi thủy tinh và hòa tan chất phản ứng đã đông khô trước đó Bằng thực nghiệm và so sánh với các kết quả nghiên cứu trước đây, tốc độ của chất lỏng chảy trong kênh dẫn nhờ áp lực chân không có thể đạt tới 5 nL/s [39][39], [65] Hỡnh 34 Thể hiện một chip PDMS tải khoảng 60 àl màu thực phẩm vào 4 buồng phản ứng trong khoảng 1 giờ
Hình 32 Hình chụp quá trình tải chất lỏng vào trong chip dưới tác dụng của lwucj hút do hiện tượng khử khí
4.2.3 Khả năng hoạt động của bộ gia nhiệt Để đánh giá khả năng vận hành của thiết bị gia nhiệt, chúng tôi đã sử dụng thiết bị đo nhiệt độ chuyên dụng ( Fluke True RMS 87V Digital Multimeter) để đo nhiệt độ trên chip trong quá trình gia nhiệt và dùng kết quả này để hiệu chỉnh chương trình điều khiển nhiệt độ của thiết bị Việc đo nhiệt độ của chip và so sánh với giá trị nhiệt độ đo được từ thiết bị (nhờ cảm biến nhiệt độ đặt dưới tấm điện trở nhiệt) sẽ giúp chúng ta thấy được giả năng truyền tải nhiệt từ thiết bị sang chip
Hình 33 (A) Bộ gia nhiệt với chip vi lưu đặt trên tấm đện trở nhiệt (B) Phân bố nhiệt của chip vi lưu khi được nung nóng
Việc đảm bảo nhiệt độ toàn bộ chip vi lưu nóng lên đồng đều là rất quan trọng Để kiểm tra sự phân bố nhiệt, chúng tôi sử dụng camera hồng ngoại để quét bề mặt chip khi đặt trên tấm điện trở nhiệt Kết quả cho thấy, với chip kích thước 60x20 mm và 4 buồng phản ứng, nhiệt độ được phân bố đồng đều ở mức 65 ± 1 °C, và nhiệt độ này có thể duy trì ổn định trong suốt quá trình phản ứng LAMP.
Phản ứng LAMP trên chip
Chip vi lưu buồng đơn không có mẫu giấy tích hợp sẵn để chứa chất phản ứng, do đó cần tải đầy đủ chất phản ứng, bộ mồi và mẫu ADN khi sử dụng Trong thí nghiệm với chip này, tổng thể tích dung dịch đưa vào chip là 25 μL, bao gồm 12.5 μL standard mastermix 2X, 2.5 μL hỗn hợp mồi 10X và 9 μL nước cất.
Để tiến hành phản ứng LAMP, đầu tiên, 10 μL hỗn hợp ADN và nước cất được đưa vào ngõ vào số 2, nơi dung dịch chảy vào kênh dẫn và dừng lại tại van kích hoạt Tiếp theo, chất phản ứng LAMP và bộ mồi được nhỏ vào ngõ vào số 1 Khi dung dịch từ ngõ vào số 1 chảy vào kênh dẫn, van kích hoạt sẽ được kích hoạt, kéo theo dung dịch ADN vào kênh trộn, nơi hai dung dịch hòa trộn trước khi vào buồng phản ứng Hình 36 (a) minh họa quá trình tải chất phản ứng vào chip, trong khi Hình 36 (b) trình bày kết quả điện di cho phản ứng LAMP đối với gen Plasmodium falciparum 18S rRNA (gene bank M19173.1).
Chip phản ứng đa kênh sử dụng giấy sợi thủy tinh để đông khô mẫu phản ứng, giúp đơn giản hóa quy trình thao tác Người dùng chỉ cần lấy một mẫu ADN nhỏ cho vào ngõ vào của chip vi lưu và đặt lên thiết bị gia nhiệt để ủ Việc này giúp kiểm tra khả năng thực hiện phản ứng trên chip cũng như độ tin cậy của kết quả thu được.
Hình 34 (a) Hình ảnh hiển thị kết quả điện di của phản ứng LAMP trên chip, (b) Quá trình tải chất phản ứng vào trong chip
Tôi đã thực hiện kỹ thuật LAMP trên chip và bên ngoài ống nghiệm theo quy trình trong phòng thí nghiệm, với hai ống nghiệm cho mẫu đối chứng âm và dương Sau khi chip được gia nhiệt và phản ứng hoàn tất, nếu ADN có trong mẫu, màu sắc trong buồng phản ứng sẽ chuyển từ hồng sang vàng Color LAMP 2X chứa phenol red, một chỉ thị màu pH, sẽ thay đổi màu sắc tương ứng với sự giảm độ pH do sự giải phóng H+ trong quá trình khuếch đại ADN Kết quả này sau đó được xác nhận bằng phương pháp điện di.
Kết quả kiểm tra cho thấy mẫu giấy sấy khô chứa chất phản ứng rất hữu ích trong việc tối giản thao tác sử dụng chip vi lưu Phản ứng LAMP được thực hiện trên chip đã cho kết quả tương tự như quy trình truyền thống trên ống nghiệm.
Hình 35 mô tả quy trình sử dụng giấy sợi thủy tinh đã thấm chất phản ứng và sấy khô Bên trái hình ảnh là chip vi lưu đã tích hợp mẫu giấy chứa chất phản ứng cùng với ADN để khởi động phản ứng LAMP, trong khi bên phải là hai ống eppendorf chứa phản ứng LAMP cho đối chứng dương và âm Sau khi phản ứng LAMP kết thúc, cả chip và ống eppendorf đều chuyển sang màu vàng cho mẫu dương và giữ nguyên màu hồng cho mẫu âm Cuối cùng, kết quả điện di được so sánh giữa phản ứng trên chip và trong ống eppendorf nhằm chứng minh độ tin cậy của kết quả phản ứng trên chip.
Hình 36 mô tả quy trình thực hiện phản ứng với các bước như sau: (A) Tải mẫu thử để bắt đầu phản ứng; (B) Sử dụng chip phản ứng đa kênh với ngõ vào trước và sau trong quá trình thực hiện phản ứng; (C) Áp dụng chip phản ứng đa kênh riêng lẻ trước và sau khi thực hiện phản ứng; (D) Phân tích kết quả chạy điện di nhằm xác minh độ tin cậy của kết quả đọc được trên chip.
