Nghiên cứu cải tiến môi trường tạo stroma nhộng trùng thảo cordyceps militais trung tâm nghiên cứu và phát triển nông nghiệp công nghệ cao

ăm 2015, đề tài nuôi trồng stroma Nhộng trùng thảo đã được thực hiện với môi trường sử dụng nguồn đạm là nhộng tằm.. àm lượng hoạt chất cordycepin và adenosine có trong stroma Nhộng trùn

HCM

TRUN T M N N ỨU V P T TR ỂN N N N P N N O

BÁO CÁO NGHI M THU

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN M TRƯỜNG TẠO STROMA

NHỘNG TRÙNG THẢO (Cordyceps militaris)

KS Nguyễn Thị Ngọc Sương

Th nh ph h inh, h ng 01/2017

BAN QU N LÝ KHU NÔNG NGHI P CÔNG NGH CAO

TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHI P CÔNG NGH CAO

BÁO CÁO NGHI M THU

(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đ ng nghiệm thu)

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN M TRƯỜNG TẠO STROMA

NHỘNG TRÙNG THẢO (Cordyceps militaris)

TÓM TẮT

Nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris) là một loại dược liệu quí với hàm lượng

hoạt chất cao ăm 2015, đề tài nuôi trồng stroma Nhộng trùng thảo đã được thực hiện với môi trường sử dụng nguồn đạm là nhộng tằm Tuy nhiên nhộng tằm là dạng nguyên liệu không phổ biến, thời gian bảo quản ngắn gây khó khăn cho công tác đảm bảo nguồn nguyên liệu sản xuất Nghiên cứu này được thực hiện nhằm nguy n liệu th y thế th ch hợp làm tăng năng suất strom mà v n đảm ảo hàm lượng hoạt chất c o Kết quả thu được là nguyên liệu ye st e tr ct kết hợp với l ng đ trứng gà được ch n làm nguy n liệu

th y thế cho nhộng tằm hối lượng nguy n liệu th ch hợp cho việc nuôi trồng hộng trùng thảo là 0,3017 g/bình ye st e tr ct kết hợp 4,4653 g/bình l ng đ trứng gà ăng suất strom thu được 17,98 g nh, tr ng lượng khô c strom 2,69 g nh, hàm lượng cordycepin 6,7041 mg g, hàm lượng denosine 4,5059 mg g

MỤ LỤ

Trang

r ng phụ .i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH SÁCH B NG vi

DANH SÁCH HÌNH vii

ĐỀ TÀI 1

MỞ ĐẦU 2

hương ỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về Cordyceps militaris 3

1.1.1 Phân loại nấm Cordyceps militaris 3

1.1.2 Đặc điểm sinh h c nấm Cordyceps militaris 3

1.2 Một số hoạt chất sinh h c c a Cordyceps 4

1.2.1 Nucleotides 4

1.2.2 Sterol 5

1.2.3 Protein và các amino acid 5

1.2.4 Acid béo 6

1.2.5 Polysaccharide 6

1.3 Một số tác dụng dược lý c a nấm Cordyceps 6

1.3.1 Hiệu quả chống ung thư 7

1.3.2 ác động điều hòa miễn dịch 7

1.3.3 ác động bảo vệ gan 7

1.3.4 ác động bảo vệ thận 7

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo thành stroma C militaris 8

1.4.1 Nhu cầu dinh dưỡng cho sự hình thành và phát triển stroma 8

1.4.2 nh hưởng c a các yếu tố môi trường 9

1.5 Nuôi trồng Cordyceps militaris trên các nguyên liệu khác nhau 10

1.5.1 Trên nhộng tằm 11

1.5.2 Trên các nguyên liệu khác 11

1.6 Nguyên liệu l ng đ trứng trong nuôi cấy nấm ký sinh côn trùng 12

hương ỘI DUNG NGHIÊN CỨU 13

2.1 Thời gi n và đị điểm thực hiện 13

2.2 Vật liệu và thiết bị 13

2.2.1 Vật liệu 13

2.2.2 hiết ị 13

2.3 ội dung nghi n cứu 13

2.4 hương pháp nghi n cứu 14

2.4.1 Nội dung 1: Khảo sát nguồn nguyên liệu thay thế cho nguyên liệu nhộng tằm 14

2.4.2 Nội dung 2: Xác định khối lượng nguyên liệu thay thế thích hợp 15

hương III KẾT QU VÀ TH O LUẬN 18

3.1 Nội dung 1: Khảo sát nguồn nguyên liệu thay thế cho nguyên liệu nhộng tằm 18

3.1.1 Hiệu quả tạo stroma Nhộng trùng thảo c a các nguyên liệu thí nghiệm 18

3.1.2 àm lượng hoạt chất cordycepin và adenosine có trong stroma Nhộng trùng được nuôi cấy tr n các nguy n liệu khác nhau 20

3.2 Nội dung 2: Xác định khối lượng nguyên liệu thay thế thích hợp 24

hương V Ế Ậ VÀ ĐỀ Ị 29

4.1 Kết luận 29

4.2 Đề nghị 29

TÀI LI U THAM KH O 30

DANH SÁCH HÌNH

nh 3.1 Strom hộng trùng thảo C militaris tr n các môi trường khác nh u 22

nh 3.2 Strom hộng trùng thảo tr n các môi trường có khối lượng ye st e tr ct kết hợp

THÔNG T N ĐỀ T

1 n đề tài dự án: ghi n cứu cải tiến môi trường tạo strom hộng trùng thảo

(Cordyceps militaris)

2 h nhiệm đề tài dự án: guyễn hị g c Sương

3 ơ qu n ch tr : rung tâm ghi n cứu và hát triển ông nghiệp ông nghệ c o

4 hời gi n thực hiện: 12 tháng

5 inh ph được duyệt: 143.027.000 đồng

6 Mục ti u: Xác định được nguồn nguy n liệu th y thế cho nguy n liệu nhộng tằm và cải tiến công thức môi trường tạo strom hộng trùng thảo nhằm làm tăng t nh ổn định trong sản uất và làm tăng năng suất và độ đồng đều về k ch thước strom ừ đó ứng dụng vào quy mô sản uất lớn

7 ội dung đề tài:

ội dung 1: hảo sát nguồn nguy n liệu th y thế cho nguy n liệu nhộng tằm

ội dung 2: Xác định khối lượng nguy n liệu th y thế th ch hợp

8 Sản phẩm c đề tài dự án: Strom hộng trùng thảo và báo cáo kho h c

MỞ ĐẦU

Nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris) thuộc chi Cordyceps là loài nấm dược liệu

quý hiếm Nhộng trùng thảo được biết đến như một thuốc quý, giúp tăng cường sức kh e,

hỗ trợ hệ miễn dịch, chống suy nhược, mệt m i, phòng chống ung thư, ảo vệ tim, gan, thận… Hiện nay, Nhộng trùng thảo đ ng được quan tâm nghiên cứu và sản xuất in vitro

để tạo nguồn dược liệu cho việc sản xuất thuốc hỗ trợ điều trị bệnh, thực phẩm chức năng

ăm 2015, chúng tôi đã thực hiện đề tài “ ghi n cứu môi trường tạo stroma Nhộng

trùng thảo (Cordyceps militaris)” với kết quả là Nhộng trùng thảo tạo mầm trên môi

trường gạo lức có bổ sung nhộng tằm, khoáng và vitamin sau 30 ngày cấy ở nhiệt độ

20oC, ánh sáng 150 - 300 lx, thời gian chiếu sáng 12 giờ Trong nghiên cứu này sử dụng nguồn đạm là nhộng tằm Đây là dạng nguyên liệu không phổ biến, thời gian bảo quản ngắn gây khó khăn cho công tác đảm bảo nguồn nguyên liệu sản xuất h m vào đó số lượng stroma tạo ra nhiều nhưng chiều dài stroma ngắn gây ảnh hưởng đến chất lượng cảm qu n Do đó cần tìm nguồn nguyên liệu phổ biến, dễ bảo quản để đảm bảo nguồn nguyên liệu cho sản xuất và tạo được stroma có chất lượng cảm quan tốt hơn

Do đó đề tài “ ghi n cứu cải tiến môi trường tạo stroma Nhộng trùng thảo

(Cordyceps militaris)” được thực hiện nhằm tăng t nh ổn định trong sản xuất và tăng chất

lượng cảm quan cho stroma Nhộng trùng thảo tr n môi trường nuôi trồng

Chương I TỔN QU N

1.1 iới thiệu về Cordyceps militaris

1.1.1 Phân loại nấm Cordyceps militaris

Giới: Fungi Ngành: Ascomycota ớp: Sord riomycetes ộ: Hypocreales : Clavicipitaceae

Chi: Cordyceps Loài: Cordyceps militaris Chi nấm Cordyceps thuộc ngành nấm túi, là loại nấm ký sinh trên côn trùng và một

số động vật chân khớp (Kobayashi, 1941) Cordyceps đã được thu m u và miêu tả trên

400 loài khác nhau ở các vùng khác nhau trên thế giới rong đó có nhiều loài được chú ý

nhiều đến dược lý và dùng làm thuốc chữa bệnh với 2 loài chính là Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris

1.1.2 Đặc điểm sinh học nấm Cordyceps militaris

Loài nấm Cordyceps militaris phân bố rộng rãi ở độ cao từ 0 đến hơn 2000 m so với

mực nước biển (Shrestha, 2012) oài này thường được biết đến là loài nấm màu cam ký

sinh tr n sâu ướm Cordyceps militaris được nghiên cứu nhiều như một nguồn thay thế cho C sinensis do thành phần hóa h c và dược tính c chúng tương tự nhau (Shrestha, 2012) Quả thể c a C sinensis và C militaris rất có giá trị và có chứa những chất chuyển

hóa khác với sợi nấm sinh dưỡng

Cordyceps militaris là loài được biết đến nhiều nhất trong chi Cordyceps (Shrestha, 2012) Sự đ dạng về hình thái và ký ch giúp cho C militaris có mặt ở nhiều vùng địa lý

và vùng sinh thái khác nhau trên thế giới (Kobayashi, 1941; Mains, 1958; Sung và Spatafora, 2004) Các ký ch phổ biến nhất trong tự nhiên bao gồm ấu trùng và nhộng cánh vẩy, các ký ch hiếm gặp khác là côn trùng cánh cứng, cánh màng và hai cánh

1.2 Một số hoạt chất sinh học của Cordyceps

Các hoạt chất sinh h c có trong nấm Cordyceps, quan tr ng nhất là nhóm chất acid

cordycepic, cordycepin và polysaccharide có tác dụng rất tốt trong điều trị bệnh ung thư

và các bệnh do virus Ngoài ba thành phần trên khi phân tích nấm người ta còn phát hiện rất nhiều hợp chất có giá trị N-acetylgalactosamine, adenosine và exopolysaccharide, chitinase, cicadapeptins và myriocin, các chất có hoạt tính sinh h c là saccharide (trehalose và polysaccharides), nucleosides (adenosine, inosine và cordycepin), manitol

và strerols (ergosterol)

1.2.1 Nucleotides

Nucleotides (gồm có adenosine, uridine và guanosine) là các thành phần khá đ

dạng trong nấm Cordyceps Nhiều nghiên cứu cho rằng guanosine có hàm lượng cao nhất

trong tất cả các m u tự nhiên và khi nuôi cấy trong điều nhân tạo hàm lượng c a

nucleotide thường c o hơn Cordyceps spp tự nhiên Nucleotide trong Cordyceps tự nhiên

bắt nguồn từ sự phân rã c a nucleoside trong suốt quy trình bảo quản, tiếp đó các nhà nghiên cứu cũng t m r rằng độ ẩm có thể làm tăng đáng kể hàm lượng nucleotide trong

Cordyceps khi nuôi tr n môi trường rắn (Zhoua, 2009)

denosine được cho là có tác dụng điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch

(Shashidhara, 2013) Trong hệ sợi và quả thể c a hầu hết các loài Cordyceps có hàm

lượng denosine c o và d o động từ 0,28 tới 14,15 mg g àm lượng adenosine trong

stroma c a C militaris là 2,45 ± 0,03 mg g và được chứng minh là c o hơn hàm lượng adenosine trong quả thể c a C sinensis tự nhiên (1,643 ± 0,03 mg/g) Trong khi hệ sợi lên men c a C militaris và C sinensis có hàm lượng denosine tương tự nhau (Lo, 2013) Cordycepin lần đầu ti n được tách ra từ C militaris năm 1950 do unningh m và ctv thực hiện, s u đó chúng cũng được tìm thấy ở C sinensis và C kyushuensis Cordycepin từ C.militaris có hoạt tính sinh h c như ức chế tổng hợp RNA và DNA và

ngăn chặn sự nhân lên c a virus (Kuo, 1994) Cordycepin có khả năng kháng nấm, kháng ung thư và kháng virus Gần đây, cordycepin cũng cho thấy khả năng điều hòa sản phẩm

c a interleukins trong tế bào lympho T (Masuda, 2006) Cordycepin phát huy tác dụng

gây độc tế bào thông qua methyl hóa nucleic acid, ức chế sự phát triển c a Clostridium

paraputrificum và Clostridium perfingens, nhưng không tác động nào tới Bifidobacterium spp và Lactobacillus spp (Seok, 2009; Lu, 2012)

Cordyceps tự nhi n có hàm lượng cordycepin khoảng 0,006 – 6,36 mg/g (Lo, 2013)

Các nhà khoa h c cho biết khi thu nhận trong tự nhiên, nồng độ cordycepin trong quả thể

C militaris c o hơn C sinensis với hàm lượng lần lượt là 2,65 và 1,64 mg/g

Trong quả thể và hệ sợi nấm C militaris có sự khác nhau về hàm lượng adenosine

và cordycepin (Yun, 2003) àm lượng adenosine trong quả thể là 0,18% và trong hệ sợi nấm là 0,06% Và hàm lượng cordycepin trong quả thể là 0,97% và trong hệ sợi nấm là 0,36% (Hur, 2008)

1.2.2 Sterol

Ergosterol là sterol duy nhất c a nấm và là tiền chất thiết yếu c a vitamin D2, có giá

trị dược liệu quan tr ng àm lượng ergosterol trong quả thể nhân tạo c a Cordyceps rất

cao (10,68 mg/g) và c o hơn nhiều so với hệ sợi nấm (1,44 mg/g) (Zhoua, 2009)

1.2.3 Protein và các amino acid

àm lượng amino acid tổng c a C militaris trong quả thể c o hơn trong hệ sợi nấm Các amino acid nhiều nhất c a C militaris là lysine, glutamic acid, proline và threonine

trong quả thể, proline và lysine trong hệ sợi nấm Chang và ctv (2001) đã áo cáo rằng

những amino acid nhiều nhất trong hệ sợi C militaris là acid aspartic (2,66 mg/g), valine

(2,21 mg/g) và tyrosine (1,57 mg/g) (Chang, 2001) Những kết quả này cho thấy rằng có

sự khác nhau về thành phần amino acid trong sợi nấm được lên men và quả thể

Nấm Cordyceps có hàm lượng protein thô trong khoảng 29,1 – 33% Protein này

bao gồm 18 loại amino acid, gồm có aspartic, threonine, serine, glutamate, proline, glycine, valine, methionine, isoleucine, leucine, tyrosine, phenylalanien, lysine, histidien, cystine, cysteine và tryptoph n àm lượng amino acid sau khi th y phân hầu hết là 20 – 25%, lượng thấp nhất là 5,53% và cao nhất là 39,22% àm lượng cao nhất là glutamate, arginine và acid aspartic Các thành phần có tác dụng dược lý chính là arginine,

glutamate, tryptophan và tyrosine (Zhoua, 2009) Các ch ng Cordyceps spp cũng chứa

các loại protein, peptide, polyamine và tất cả các amino acid thiết yếu Thêm nữa,

Cordyceps spp cũng chứa các loại dipeptide vòng hiếm gặp gồm có cyclo-[Gly-Pro],

cyclo-[Leu-Pro], cyclo-[Val-Pro], cyclo-[Ala-Leu], cyclo-[Ala-Val] và cyclo-[Thr-Leu] Một lượng nh poly mines như 1,3-diamino propane, cadavarine spermidine và putrescine cũng được tìm thấy (Holiday, 2008)

1.2.4 Acid béo

Cordyceps chứa nhiều acid béo không no (57,84%) như C16:1, C17:1, C18:1,

18:2 rong đó, có chất béo cần thiết như acid linoleic (C18:2) chiếm hàm lượng cao nhất (38,44%), tiếp đó là acid oleic 17,94% Các acid béo no chiếm 42,16% bao gồm: C14, C15, C16, C17, C18, C20 và C22 Acid palmitic và acid octadecanoic chiếm hàm lượng cao nhất lần lượt là 21,86% và 15,78% Các acid béo không no có chức năng giảm lipid máu và phòng ngừa bệnh tim mạch (Holiday, 2005)

1.2.5 Polysaccharide

Nấm Cordyceps spp được đánh giá c o về giá trị dinh dưỡng trong sản xuất thực

phẩm chức năng và sản xuất thuốc trong phòng và trị bệnh Chúng chứa rất nhiều loại đường, bao gồm mono-, di- và các oligosaccharide và nhiều polysaccharide phức tạp gồm

có cyclofur ns (đường 5C, mạch v ng, chư rõ chức năng), et -glucans, beta-mannans

và phức hợp polysaccharides có cả đường 5 và 6C cùng tham gia vào các chuỗi nhánh, dùng cả cầu nối alpha- và beta- (Holiday, 2008; Lu, 2012; Hardeep, 2014)

Polysaccharide có nguồn gốc từ vách tế bào nấm đã được chứng minh kháng khối u, trong khi polysaccharide thu nhận từ thực vật lại không có đặc điểm này Các polysaccharide có khả năng chống lại hoạt động c a tế ào ung thư là homopolyme có cấu tạo đơn giản đến phức tạp bao gồm glucose, galactose, mannose, xylose, arabinose, fucose, ribose và acid glucuronic (Holiday, 2008; Lu, 2012)

Acid cordycepic hay D-mannitol trong Cordyceps có hàm lượng là 7 – 29%, thành

phần này khác nhau trong từng gi i đoạn phát triển c a quả thể hông thường, hàm

lượng mannitol có trong quả thể Cordyceps sp là 29 -85 mg g, lượng mannitol chứa trong

hệ sợi nấm c a Cordyceps c o hơn trong quả thể (Zhoua, 2009)

1.3 Một số tác dụng dƣợc lý của nấm Cordyceps

Nấm Cordyceps được cho là có khả năng chống ung thư, chống di căn, điều hòa

miễn dịch, chống oxy hóa, chống viêm, diệt khuẩn, hạ đường huyết, chống lão hóa, bảo

vệ thần kinh và bảo vệ thận (Shashidhara, 2013) Cordyceps là một loại dược liệu quý

trong y h c phương đông hững nghiên cứu gần đây cho thấy những tác dụng dược lý

c a Cordyceps militaris như tăng cường hệ thống miễn dịch và ức chế khối u (Zhao,

2006b), hiệu quả chống oxy hóa, kháng viêm và kháng tạo mạch có trong cả hệ sợi và

trong quả thể C militaris

1.3.1 Hiệu quả chống ung thƣ

Khả năng ức chế sự phát triển c a các khối u được phát hiện ở nhiều chi c a loài

Cordyceps Các thành phần hoạt tính sinh h c có tác động chống ung thư ch yếu là

polysaccharide, sterol và denosine rong đó, sterol và denosine là các ch đề nghiên cứu đ ng được quan tâm nhất về khả năng chống ung thư ho tới nay, các nhà khoa h c

chư thể biết ch nh ác cơ chế ức chế sự phát triển c a tế ào ung thư c a Cordyceps, cơ

chế này có thể là tăng cường chức năng c a hệ thống miễn dịch và miễn dịch tự nhiên; ức chế có ch n l c tổng hợp RNA, từ đó ảnh hưởng tới tổng hợp protein; hoạt động chống oxy hóa và chống các gốc tự do; chống đột biến; làm nhiễu quá trình sao chép c a virus cảm ứng khối u; cảm ứng methyl hóa acid nucleic (Zhoua, 2009)

1.3.2 Tác động điều hòa miễn dịch

ác tác động chính c a Cordyceps lên hệ thống miễn dịch vào các tế ào như đáp

ứng tăng sinh lympho, tế bào giết tự nhiên (NK) và kích thích tạo thành ngưng kết tố thực vật (PHA) interleukin-2 (IL-2) và tác nhân hoại tử tế ào ung thư ( F-α) tr n các tế bào đơn nhân ở người, đây là kết quả c a sự sản xuất cytokines ác tác động hỗ trợ ngăn chặn bệnh tự miễn, dị ứng cũng có li n qu n đến tác động điều hòa miễn dịch (Zhoua, 2009)

1.3.3 Tác động bảo vệ gan

Bệnh về g n là căn ệnh đe d a chính tới sức kh e c con người và ảnh hưởng tới chất lượng cuộc sống Các thử nghiệm tr n động vật và dữ liệu từ phòng khám cho thấy,

Cordyceps có tác động bảo vệ gan trong các bệnh viêm gan virus A, viêm gan B mãn tính,

viêm gan C và ơ g n húng làm tăng các tế bào có chức năng điều h , đư trạng thái HbeAg-dương t nh về HbeAg-âm tính, tăng cường chức năng g n và ức chế ơ g n (Zhoua, 2009)

1.3.4 Tác động bảo vệ thận

ác tác động bảo vệ thận được trình bày ch yếu là tác động trị liệu lên thận tổn thương độc thận; bảo vệ, chống lại sự sai h ng chức năng mãn t nh ở thận; đảo ngược tác dụng c a viêm tiểu cầu thận (Zhoua, 2009)

Trong những năm gần đây, Cordyceps trở thành nguồn nguyên liệu rất quan tr ng

cho làm thuốc và thực phẩm chức năng Do đó, giá thành c chúng tăng l n rất nhanh kéo theo nhu cầu nuôi trồng tăng cao Hầu hết các hoạt chất sinh h c chiết xuất từ

Cordyceps như cordycepin, acid cordycepic và polys cch ride đều là các chất chống lão

hóa và tác động giúp điều hòa giấc ng cũng đã được cấp phép như một nguồn thuốc mới bởi SFDA (State Food and Drug Administration) c a Trung Quốc Vì vậy, với việc sử

dụng sinh khối Cordyceps và cả dịch chiết, chúng ta có thể phát triển rất nhiều sản phẩm

nhờ công nghệ hiện đại Các sản phẩm này có rất nhiều chức năng ch yếu tập trung vào các phương diện: tăng cường thể chất, chống lão hóa, chống ung thư, ảo vệ tim mạch, cải thiện giấc ng , tăng ngon miệng và tăng cường miễn dịch

1.4 ác yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo thành stroma C militaris

1.4.1 Nhu cầu dinh dưỡng cho sự hình thành và phát triển stroma

Sự hình thành và phát triển stroma nhân tạo c a C militaris được nghiên cứu trong

phòng thí nghiệm trên ấu trùng và nhộng c a những loài côn trùng khác nh u, thường là

trên nhộng tằm Bombyx mori (Gu, 1987) Những loài côn trùng khác được sử dụng cho việc sản xuất stroma nhân tạo là Antherea pernyi (Gu, 1987), Mamestra brassicae (Harada, 1995; Sato, 2002b); Ostrinia nubilalis (Liang, 1987), Heliothis virescens, H zea

và Spodotera frugiperda (Sánchez-Peña, 1990)

ơ chất hữu cơ

Do côn trùng có giá thành cao, không có nguồn cung liên tục (Lin, 2006b), thêm vào

đó th o tác tr n côn trùng khó và dễ nhiễm khuẩn nên những cơ chất hữu cơ th y thế

được thử nghiệm cho việc sản xuất thương mại stroma C militaris Một số loại ngũ cốc

được bổ sung một số chất hữu cơ khác được chứng minh là nguồn thay thế tốt cho côn

trùng o y shi (1941) đã nghi n cứu tạo stroma C militaris trên gạo , từ đó gạo được

sử dụng như thành phần chính cho việc nuôi trồng stroma C militaris (Chen, 1990; Sung,

1993; Zhao, 1997)

Độ xốp c môi trường tạo stroma ảnh hưởng đến sự phát triển tơ và sản lượng strom Độ xốp tăng theo k ch cỡ hạt Độ xốp giảm khi tăng tỷ lệ nước và hạt trong quá trình chuẩn bị môi trường gạo hi môi trường không có khe hở, tơ nấm hầu như m c trên bề mặt, vì vậy chúng không thể hấp thu đ dinh dưỡng từ cơ chất (Kobayashi , 1941)

Tỷ lệ nước và gạo từ 1:1 đến 1:1,35 là tối ưu cho sự h nh thành strom nhưng tỷ lệ tối ưu phụ thuộc vào giống gạo và độ dính c a chúng (Sung, 1999; Lin, 2006b)

Các nguyên liệu hữu cơ khác được sử dụng cho việc sản xuất stroma C militaris là

bột đậu, hạt bắp, lõi bắp, v hạt bông, hạt k , c o lương, hạt ho hướng dương và hạt lúa

mì (Chen, 1990; Zhang, 1997; Li, 2002; Gao, 2008) Gạo phối trộn với nhộng tằm được chứng minh là ưu việt hơn những cơ chất khác và hiện n y nó thường được sử dụng (Ren, 1998; Chen, 2002; Sung, 2002; Shrestha, 2004)

Thành phần khoáng của môi rường

Những loại muối khoáng K+, Mg2+ và Ca2+ ở nồng độ 0,1 g/L có thể làm tăng sản lượng stroma (Sung, 2002)

Thời gian nuôi tr ng

Stroma c a C militaris được hình thành trong khoảng thời gian từ 35 – 70 ngày

(Zhang, 1997; Sung, 1999; Du, 2010; Yue, 2010) Zh ng và iu (1997) đã áo cáo rằng thời gi n h nh thành strom tr n môi trường gạo là 35 – 45 ngày và tr n môi trường khác như ắp, hạt kê và gạo tussah là 40 – 70 ngày Tuy nhiên, thời gian nuôi trồng phụ thuộc vào hình dạng, thể t ch nh nuôi và lượng môi trường Wu và ctv (1996) thu được 25 g

strom tươi C militaris từ 50 g môi trường gạo, trong khi theo nghiên cứu c a Zhang và

Liu (1997), tỷ lệ chuyển hóa sinh h c trên gạo là 61%, trên hạt kê và gạo tussah là 58 – 59

% và trên bắp là 42 %

1.4.2 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường

Nhiệ độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành stroma c a C militaris Nhiệt độ cao

(khoảng 25oC) cho tốc độ l n tơ tối đ nhưng nhiệt độ thấp hơn trong khoảng 18 - 22oC

kích thích và duy trì sự hình thành stroma (Sung, 1999; Gao, 2000; Zhao, 2006a)

Ánh sáng và thời gian chiếu sáng

Ánh sáng là yếu tố môi trường quan tr ng nhất ảnh hưởng đến sự tạo thành stroma

c a C militaris và không có strom nào được tạo thành trong điều kiện tối (Sato, 2002b)

Gao và ctv (2000 ) thu được strom dưới cường độ ánh sáng c o tương đương 4500 lx nhưng S to và Shim zu (2002 ) chỉ ra rằng giới hạn trên là 1400 l , thông thường cường

độ 500-1000 l được xem là tối ưu (Sung, 1999; Gao, 2000; Zhao, 2006a) Chu kỳ chiếu sáng 12 giờ sáng/tối với cường độ 500-1000 lx (Sung, 2002; Chen, 2011a) Mu và ctv (2010) đã nhận thấy rằng 18 giờ sáng ở 200 lx là tối ưu cho h nh thành sắc tố và tạo mầm, trong khi 10 giờ chiếu sáng thì thích hợp cho phát triển strom và năng suất

Sự rao đổi kh v độ ẩm

Sự tr o đổi khí cao giúp cho sự phát triển hệ sợi, tạo mầm và năng suất sinh khối (Zhang, 2010a) Sự hình thành mầm cần độ ẩm cao 70 – 90% Độ ẩm thấp làm cho môi trường nhanh khô Do vậy, khi nuôi trồng trong phòng với độ ẩm thấp cần có máy tạo độ

ẩm để duy tr độ ẩm

1.5 Nuôi trồng Cordyceps militaris trên các nguyên liệu khác nhau

Trong chi Cordyceps, C militaris tăng trưởng tốt tr n môi trường nhân tạo Đặc điểm nuôi cấy stroma in vitro được nghiên cứu bằng cách sử dụng dòng C militaris

Korean Bên cạnh những nghiên cứu về nuôi trồng, kỹ thuật phân tử cũng được áp dụng

để tìm hiểu kiểu bắt cặp và sự phát sinh loài c a các loài Cordyceps khác nhau Tuy nhiên

đối với sự tạo stroma ở số lượng lớn như trong tr ng trại, các d ng đ ào tử là nguồn

m u ch yếu bởi vì không có những kỹ thuật chuyên biệt cho sự phân lập cũng như dụng

cụ bảo quản cho các dòng phân lập khác nhau bắt cặp (Shrestha, 2004)

Ngoài côn trùng ra, stroma dạng chai c a C militaris có thể hình thành trong môi trường khoai tây nuôi cấy lâu ngày S u đó, strom màu c m lớn c a C militaris được tìm

thấy trong các môi trường khác như môi trường agar dịch chiết lúa mạch, agar và gelatine với pepton, urine, dịch chiết đậu h y nước thịt hay sữ non đông tụ Hiệu quả c a một số

môi trường và yếu tố dinh dưỡng trong quá trình tạo stroma in vitro c a C militaris đã

được nghiên cứu h m vào đó, sự đ dạng c a stroma dạng ch i cũng được quan sát trong môi trường có chứa nồng độ cao c a phức hợp nguồn đạm hữu cơ như pepton, hemoglobin và c sein rong khi đó, một lượng ít hoặc không hình thành thể đệm khi có

bổ sung các aminoacid riêng lẻ với nồng độ khác nhau

1.5.1 Trên nhộng tằm

Tại Hàn Quốc, Sung (1996) báo cáo rằng một lượng lớn stroma C militaris được tạo

r tr n môi trường gạo lức bổ sung nhộng tằm được cấy ch ng nuôi l ng Hiệu quả c a

một số chất dinh dưỡng và môi trường đối với sự phát triển hệ sợi và tạo stroma c a C militaris được nghiên cứu Nhiệt độ thấp khoảng 18 – 22oC thích hợp cho sự tạo stroma in vitro Mặc dù C militaris tạo được strom trong môi trường gạo lức nhưng khi nuôi cấy

in vitro từ các dòng phân lập khác nhau và từ các dòng cấy chuyền có nhiều biến động

cho dù trong cùng một điều kiện môi trường Đây là vấn đề chính cho sự nuôi cấy khối

lượng lớn C militaris

Sung và ctv (2004) sử dụng môi trường SD Y roth (S our ud de trose ye st) để

nhân giống C militaris Và môi trường tạo stroma có thành phần gồm 60 – 80 g gạo lức,

10 g nhộng tằm và 90 – 120 m nước Trong nghiên cứu này, C militaris được nuôi ở

nhiệt độ 20o , cường độ ánh sáng 500 – 1000 l và độ ẩm 70 – 90% trong 50 – 60 ngày Phạm Quang Thu và ctv (2015) đã nghi n cứu xây dựng quy trình nuôi trồng nấm

Đông trùng hạ thảo C militaris (L :Fr.) Link có giá trị dược liệu và thương mại cao

Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu đã thu thập được 243 m u nấm Đông trùng hạ

thảo thuộc chi Cordyceps và một số loài khác ở gi i đoạn vô t nh, trong đó có 8 m u nấm được ác định là C militaris Môi trường sản xuất giống là môi trường nhộng tằm, pH giá

thể từ 6,5 – 8, nhiệt độ nuôi cấy 20 -25oC, ẩm độ không khí 85 – 90%, cường độ ánh sáng

là 700 lx thích hợp cho sự sinh trưởng c a mầm stroma và stroma phát triển

Vũ Xuân ạo và ctv (2014) đã nghi n cứu ảnh hưởng c a một số yếu tố lên sự sinh

trưởng c a nấm Đông trùng hạ thảo C militaris Điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng c a nấm C militaris gi i đoạn nhân giống là môi trường PDA có bổ sung 5% nhộng tằm và

5% nước dừa, nhiệt độ 20o , độ ẩm 80%, p 6,5 Điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng c a

nấm C militaris gi i đoạn tạo strom là môi trường 20 g gạo, 7 g nhộng tằm, 30 m nước

dừa, 20 m vi lượng, nhiệt độ 20 – 25 oC với cường độ chiếu sáng 1000 lx

1.5.2 Trên các nguyên liệu khác

Kobayashi (1941) nghiên cứu sự tạo hành stroma in vitro c a C miliraris trong môi trường gạo có 10 g gạo và 25 m nước cất Môi trường nền tạo stroma c a C militaris là

môi trường 100 g gạo lức và 160 m nước được sử dụng để nghiên cứu hiệu quả c a chất

bổ sung vào

Liang và ctv (2013) đã nuôi trồng tạo stroma C militaris Giống C militaris được cấy tr n môi trường cấp I, cấp và môi trường tạo stroma Giống C militaris cấp được

cấy tr n môi trường thạch đĩ D (pot to de trose g r) iến đổi Giống cấp được cấy

tr n môi trường D (pot to de trose roth) và được nuôi lắc (70 rpm) ở 23oC, trong 3 ngày Giống cấp được cấy vào môi trường tạo stroma gồm 10 g gạo và 10 mL PDB biến đổi và được nuôi ở 23oC trong tối S u khi tơ l n k n môi trường gạo, các bình nuôi cấy được chiếu sáng với chu kỳ 9 giờ sáng và 15 giờ tối Strom được thu hoạch sau 45 ngày chiếu sáng

Kang và ctv (2014) đã nghi n cứu tối ưu hó l n men rắn cho sự phát triển stroma

và sản xuất cordycepin c a C militaris ơ chất tối ưu cho C militaris là gạo lức Giá trị

pH 5,5 tối ưu cho sự phát triển strom nhưng p 6,0 – 6,5 tối ưu cho sản xuất cordycepin Thành phần môi trường tối ưu cho sự phát triển stroma là 40 g/L glucose, 5 g/L peptone, 1,5 g/L MgSO4.7H2O, 1,5 g/L K2HPO4, 1,0 mg/L NAA; cho sản xuất cordycepin là 10 g/L glucose, 10 g/L peptone, 1,0 g/L MgSO4.7H2O, 1,0 g/L K2HPO4, 1,0 mg/L NAA Ngô Xuân Nghiễn và ctv (2015) đã nghi n cứu công nghệ nuôi trồng Nhộng trùng

thảo (Cordyceps militaris L.ex Fr.) Nhóm tác giả thực hiện nghiên cứu môi trường sử

dụng để nuôi trồng nấm, ác định loại cơ chất nền thích hợp và khảo sát ảnh hưởng số lần nuôi cấy đến sự thoái hóa giống

1.6 Nguyên liệu lòng đỏ trứng trong nuôi cấy nấm ký sinh côn trùng

Trong nghiên cứu về nấm ký sinh trên rệp đậu đũ Aphis craccivora, các loài nấm

ký sinh côn trùng được nuôi cấy trên môi trường Sabouraud dextrose agar bổ sung lòng

đ trứng và sữa (80 ml/L l ng đ trứng và 120 ml/L sữa) (Ibrahim, 2011) B oleae và C

capitata được nuôi cấy tr n môi trường có thành phần 40% đường, 10% nấm men th y

phân, 5% l ng đ trứng (Sabbour, 2012)

hương

NỘ DUN N N ỨU

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

2.1.1 Thời gian thực hiện 12 tháng

2.1.2 Địa điểm thực hiện Thí nghiệm được thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu và

Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao

2.2 Vật liệu và thiết bị

2.2.1 Vật liệu

- h ng Cordyceps militaris thuộc bộ sưu tập ch ng giống vi sinh vật c a Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao

- Môi trường đối chứng: môi trường thích hợp cho nuôi trồng Cordyceps militaris đã

nghiên cứu vào năm 2015 với t n đề tài là “ ghi n cứu môi trường tạo stroma Nhộng

trùng thảo (Corydyceps militaris)” có thành phần là gạo lức 30 g, nhộng tằm tươi 5 g và

dung dịch dinh dưỡng 45 mL có thành phần CaCl2 0,1 g/L và acid folic 5 µg/L

- Các nguyên liệu thay thế cho nhộng tằm sử dụng cho thí nghiệm: peptone – Merck,

yeast extract – imedi , l ng đ trứng (trứng gà V.food, ông ty Vĩnh hành Đạt)

- Môi trường thí nghiệm: gạo 30 g, nguyên liệu thay thế X g và dung dịch dinh

dưỡng 45 ml có thành phần CaCl2 0,1 g/L và acid folic 5 µg/L

- ác môi trường sử dụng: PDB (potato dextrose broth) có thành phần gồm khoai

tây 200 g, dextrose 20 g, 1000 mL nước cất

2.2.2 Thiết ị

cấy n toàn sinh h c cấp – Shinseang

ồi hấp utocl uve – Hirayam

2.3 Nội dung nghi n cứu

Nội dung 1: Khảo sát nguồn nguyên liệu thay thế cho nguyên liệu nhộng tằm

Nội dung 2: Xác định khối lượng nguyên liệu thay thế thích hợp

2.4 Phương pháp nghi n cứu

2.4.1 Nội dung 1: Khảo sát nguồn nguyên liệu thay thế cho nguyên liệu nhộng tằm

- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ng u nhiên gồm 7

nghiệm thức, 3 lần lặp, 10 bình/NT

- Các nghiệm thức như sau:

Tiến hành

Nguyên liệu nhộng tằm và l ng đ trứng được sử dụng trong thí nghiệm được đem phân t ch hàm lượng N tổng số và hàm lượng acid amin tổng số tại Viện Công nghệ Hóa

h c với kết quả phân tích n dưới (Bảng 2.1) àm lượng N tổng số c a nguyên liệu

ye st e tr ct và peptone được sử dụng trong thí nghiệm được lấy từ Certificate of Analysis do nhà sản xuất cung cấp

Bảng 2.1 Kết quả phân tích hàm lượng N tổng số của các nguy n liệu thí nghiệm