Nghiên Cứu Bào Chế Và Tiêu Chuẩn Hóa Sản Phẩm Chứa Tinh Dầu Chuẩn Hóa Lá Trầu Không Hỗ Trợ Điều Trị Bệnh Tay Chân Miệng.pdf

ÑEÀ CÖÔNG NGHIEÂN CÖÙU ỦY BAN NHÂN DÂN TP HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CÔNG TY CỔ PHẦN DƯỢC PHẨM OPC BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ TIÊU CHUẨN HÓA SẢN PHẨM CHỨA TINH DẦU CHUẨN HÓA LÁ TRẦU (P[.]

Trang 1

BÁO CÁO NGHIỆM THU

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ TIÊU CHUẨN HÓA SẢN PHẨM CHỨA TINH DẦU CHUẨN

HÓA LÁ TRẦU (Piper betle L.), HỖ TRỢ

ĐIỀU TRỊ BỆNH TAY CHÂN MIỆNG

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: THS DS HÀ ĐỨC CƯỜNG

Trang 2

Đặt vấn đề

Cho đến nay, chưa có thuốc đặc trị điều trị bệnh TCM, chỉ điều trị triệu chứng Nguồn dược liệu Lá Trầu có sẵn trong nước, rất dễ trồng, trồng hay mọc hoang khá phổ biến trên khắp lãnh thổ của Việt Nam, và một số quốc gia trên thế giới

Thực hiện sự chỉ đạo của Thường trực Thành ủy TP Hồ Chí Minh tại thông báo số TB/VPTU ngày 26/10/2012 và chỉ đạo của Ủy ban nhân dân TP Hồ Chí Minh tại công văn số 8812/VP-CNN ngày 06/11/2012 về đăng ký đề tài nghiên cứu khoa học “Đặc trưng trị liệu của tinh dầu Lá Trầu Hóc Môn” Do đó đề tài nghiên cứu một sản phẩm chứa tinh dầu chuẩn hóa Lá Trầu để góp phần hỗ trợ điều trị bệnh TCM là cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn

214-Đề tài này là 1 trong 4 đề tài liên quan đến Lá Trầu thực hiện theo hợp đồng đặt hàng với Sở Khoa học và Công nghệ TP Hồ Chí Minh, 3 đề tài còn lại như sau:

- Đề tài: “Xây dựng quy trình canh tác cây Trầu (Piper betle L., họ Hồ tiêu, Piperaceae) theo hướng hữu cơ sinh học trên địa bàn Huyện Hóc môn”, Đơn vị Chủ trì: Trung tâm Công

nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh, Chủ nhiệm đề tài: Ths Phan Diễm Quỳnh

- Đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất tinh dầu Lá Trầu (Piper betle L., họ Hồ tiêu, Piperaceae) bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ở quy mô pilot đạt chất lượng làm bất hoạt được virus Tay Chân Miệng EV71” Đơn vị chủ trì: Viện Phát triển Công

nghệ và Đào tạo, Chủ nghiệm đề tài: Ts Huỳnh Kỳ Trân

- Đề tài “Nghiên cứu tác dụng ức chế virus EV71, kháng viêm, kháng khuẩn và độc tính của thuốc chứa dịch chiết Lá Trầu trên thực nghiệm” Đơn vị chủ trì: Công ty Cổ phần Dược phẩm OPC, Chủ nhiệm đề tài là PGS.Ts Nguyễn Phương Dung

Mục tiêu tổng quát của đề tài này là nhằm nghiên cứu công thức, xây dựng quy trình sản xuất và tiêu chuẩn chất lượng phù hợp để sản xuất một sản phẩm chứa tinh dầu chuẩn hóa Lá Trầu Kết quả sản phẩm của đề tài làm cơ sở nghiên cứu dược lý và nghiên cứu lâm sàng nhằm đánh giá tính an toàn và hiệu quả của sản phẩm trong việc hổ trợ điều trị bệnh TCM

Các câu hỏi nghiên cứu của đề tài là:

- Để tiện dụng cho đối tượng là trẻ em, dạng bào chế dự kiến là dạng siro chứa tinh dầu Tinh dầu chuẩn hóa Lá Trầu không tan được trong nước, vậy có thể dùng phương pháp hòa tan đặc biệt bằng cách sử dụng một chất diện hoạt để giúp hòa tan tinh dầu Lá Trầu vào chất dẫn là một dung dịch đường trong nước

- Khảo sát các công thức ở quy mô pilot, cỡ lô 3 lít, chọn công thức phù hợp, tỷ lệ của chất diện hoạt lựa chọn sẽ là bao nhiêu để cho một siro thuốc bền vững trong suốt thời gian lưu hành thuốc

- Sau đó nghiên cứu quy trình sản xuất để nâng cỡ lô lên 400 lít, sản xuất 3 lô trên dây chuyền của Nhà máy OPC và tiến hành thẩm định quy trình sản xuất

- Sản phẩm khi theo dõi độ ổn định ở điều kiện thường phải đạt các chỉ tiêu theo tiêu chuẩn chất lượng đã nghiên cứu, đặc biệt là thành phần nhóm Phenolic và 4-APCD

Để trả lời các câu hỏi nghiên cứu trên, các mục tiêu cụ thể của đề tài là:

Trang 3

2 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng

3 Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất tại Nhà máy OPC

4 Triển khai sản xuất tại Nhà máy OPC và thẩm định quy trình sản xuất

5 Theo dõi độ ổn định sản phẩm

Đối tượng nghiên cứu:

Nguyên liệu tinh dầu chuẩn hóa Lá Trầu do Viện phát triển công nghệ và đào tạo TP Hồ Chí Minh cung cấp, cùng với tá dược và bao bì sẵn có tại Công ty OPC Việc nghiên cứu trên pilot và sản xuất thử được tiến hành tại Nhà máy OPC

Phương pháp nghiên cứu:

- Xây dựng công thức: Dựa trên kinh nghiệm bào chế Siro thuốc chứa hoạt chất tinh dầu của Công ty OPC, tiến hành xây dựng công thức, pha chế ở quy mô Pilot (cỡ lô 3 lít) và khảo sát

tỷ lệ chất diện hoạt phù hợp (đánh giá bằng các chỉ tiêu: độ nhớt, tỷ trọng dịch thuốc, pH, độ bền dịch thuốc, độ phân tán hàm lượng Phenolic (Chavibetol, Chavibetol acetat và 4-APCD)) Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho sản phẩm: Xây dựng các chỉ tiêu tính chất, thể tích, tỷ trọng ở 200C, giới hạn Natri benzoat, giới hạn nhiễm khuẩn Riêng chỉ tiêu định tính và định lượng hàm lượng Phenolic (Chavibetol, Chavibetol acetat và 4-APCD) và 4-APCD bằng GC/MS thì hợp tác với Công ty Sắc ký Hải Đăng thực hiện

- Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất tại Nhà máy OPC: Dựa vào đặc điểm thiết bị của Công ty OPC để nâng cấp từ cỡ mẫu Pilot 3 lít lên cỡ lô sản xuất thử 400 lít, khảo sát và điều chỉnh các thông số trong quy trình sản xuất cho phù hợp nhất

- Triển khai sản xuất tại Nhà máy OPC và thẩm định quy trình sản xuất: Triển khai sản xuất 3 lô 001NC, 002NC, 003NC ở Xưởng sản xuất (cỡ lô 400 lít) để thẩm định quy trình sản xuất Các thông số của quy trình sản xuất phải đạt yêu cầu và có tính lặp lại

- Theo dõi độ ổn định của sản phẩm: Sản phẩm của 3 lô 001NC, 002NC và 003NC được theo dõi độ ổn định ở điều kiện thường Kết quả kiểm nghiệm mẫu sau khi sản xuất, sau 3 tháng, sau 6 tháng, sau 9 tháng, sau 12 tháng, sau 18 tháng và sau 24 tháng phải đạt tất cả các chỉ tiêu theo tiêu chuẩn chất lượng đã nghiên cứu

Kết quả:

Công thức phù hợp

Tiêu chuẩn chất lượng

Quy trình công nghệ sản xuất và

Kết quả triển khai sản xuất 3 lô và kết quả thẩm định quy trình sản xuất

Kết quả theo dõi độ ổn định sản phẩm

Kết luận: Nhóm đề tài đã hoàn thành các nội dung của đề tài

Từ khóa: Tay – chân – miệng, Lá Trầu, EV71, Siro thuốc

Trang 4

Introduction:

Up till now, there has not been any specialized drug treating Hand Foot and Mouth disease, only those treating symptoms The herbal sources of Betle leaf is nationally available, easy to cultivate, planted or wildly grown throughout Vietnam and some other countries in the world

At the behest of Steering Board of Ho Chi Minh City People’s Committee, according to Report No 214-TB/VPTU dated on October 26th, 2012 and that of Ho Chi Minh City People’s Committee, according to Official Correspondence No 8812/VP-CNN dated on November 6th,

2012 on the registration for Science Research Thesis named “Typical therapeutic features of essential oil extracted from Betle leaf cultivated in Hocmon District” Therefore, it is really crucial and practically meaningful to carry out a Research Thesis on a pharmaceutical product containing standardized essential oil extracted from Betle leaf, in an effort to supportively treat Hand Foot and Mouth disease

The thesis is one of four dissertations related to Betle leaf conducted based on the contract for goods with Ho Chi Minh City Department of Science and Technology, the left 3 theses are as follow:

Thesis: “Building the cultivating process for Piper betle L., Piperaceae following the

organic and biologic directions in Hocmon District” Directive Organization: Biological Technology Center of Ho Chi Minh City, Chairman of thesis: Quynh Phan Diem MA

Thesis: “Research for building the manufacturing process of essential oil extracted from

Betle leaf (Piper betle L., Piperaceae) with the distillation method in pilot scale so that the

essential oil conforms to the quality that can inactivate the Hand Foot and Mouth virus EV71” Directive Organization: Institute of Technology Development and Education, Chairman of thesis: Tran Huynh Ky PhD

Thesis: “Research on experimental antiviral EV71, anti-inflammatory, anti-bacterial effects and toxicity of the pharmaceutical product containing the essential oil extracted from Betle leaf” Directive Organization: OPC Pharmaceutical Joint-Stock Company, Chairman of thesis: Dung Nguyen Phuong, Asc.Prof.PhD

The general objects of this thesis is to find out the adequate formula, build up the suitable product manufacturing process and decent quality standard in order to make a product containing standardized essential oil extracted from Betle leaf The achievement of the thesis will pave the way to Pharmacological and Clinical researches for evaluating the safety and effectiveness of the product in supportively treating Hand Foot and Mouth disease

Some research questions of this thesis:

- To be convenient for use in children, we are going to choose the syrup preparation Standardized essential oil extracted from Betle leaf is soluble in water; thus, it is possible to use a surfactant to support the solubility of the essential oil into the solvent – the solution of sugar in water

Trang 5

concentration of the surfactant for the stability of the syrup during the drug’s shelf life

- Afterwards, research to build up the manufacturing process to scale up to the lot size of 400 liters, manufacture 3 lots in the manufacturing chain of OPC Pharmaceutical Manufacturing Plant and carry out the validation of the manufacturing process

- The product, after being tested the stability at real-life condition, has to comply with all the specifications in the product standard, especially the two ingredients, Phenolic groups and 4-Allylpyrocatechol diacetate

In order to answer questions above, we have to accomplish such specific targets as follow:

1 Build up an appropriate formula

2 Build up a decent Product Standard

3 Build up the Technological manufacturing process at OPC Pharmaceutical manufacturing plant

4 Carry out the production at OPC Pharmaceutical Manufacturing Plant and the validation of manufacturing process

5 Investigate the stability of the product

Research subjects:

The material, standardized essential oil extracted from Betle leaf, is supplied by Technology Developing Institute of Ho Chi Minh City, along with excipients and packages available at OPC Pharmaceutical Joint-Stock Company The research duty in Pilot scale and trial production are conducted at OPC Pharmaceutical Manufacturing Plant

Research methods:

- The building of formula: based on the experiences of producing medicated syrups containing essential oil of OPC, build up an appropriate formula, prepare the syrup in Pilot scale (with the lot size of 3 liters) and examine the suitable concentration of the surfactant (evaluated through such specifications as: viscosity, density of the product fluid, pH, stability of the product fluid, deviation of phenolic content)

- The building of product quality standard: build up such specifications as Appearance, Volume, Density at 200C, Sodium benzoate limitation and Microbes limitation The testing method for the two specifications left, Identification and Assay of Phenolic groups and 4-allylpyrocatechol diacetate, are carried out by Hai Dang Chromatography Company with the method of Gas Chromatography/ Mass Spectrophotometry

- The building of technological manufacturing process at OPC Pharmaceutical Manufacturing Plant: based on characteristics of the machinery at OPC Pharmaceutical Joint-Stock Company, scale up the lot size from 3 liters to 400 liters, examine and modify the parameters in the manufacturing process to the greatest extent

- Carry out the manufacturing process at OPC Pharmaceutical manufacturing plant and the validation of manufacturing process: produce 3 lots, 001NC, 002NC and 003NC, at the manufacturing plant, with the lot size of 400 liters, for the validation of manufacturing

Trang 6

requirements and are repetitive

- The investigation of product stability: the finished products of the 3 lots 001NC, 002NC, 003NC are tested the real-time stability The tested results of the products right after the production and 3 months, 6 months, 9 months, 12 months, 18 months, 24 months afterwards have to comply with all the specifications of the product standard which was researched

Results:

A suitable formula

A decent product standard

Technological manufacturing process and

The result of the manufacturing process for 3 lots and the report of validation for the manufacturing process

The stability testing report of the product

Conclusion: The research group has accomplished all the contents of the thesis

Key words: Hand Foot and Mouth, Betle leaf, EV71, medicated syrup

Trang 7

TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Trang a

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Trang 7

2.2.1.2- Danh mục thiết bị chính dùng trong nghiên cứu lô 3 lít Trang 11

2.2.3- Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất tại Nhà máy OPC Trang 14

Trang 8

2.2.4.2- Thẩm định quy trình sản xuất Trang 14

3.3- Kết quả xây dựng quy trình công nghệ sản xuất tại Nhà máy OPC Trang 27

3.3.5- Kiểm soát các bước trung gian và thông số sản phẩm Trang 30 3.4- Triển khai sản xuất tại Nhà máy OPC và thẩm định quy trình sản xuất Trang 31

Trang 9

4-APCD : 4-Allyl Pyrochatechol Diacetat

Công ty sắc ký Hải đăng : Công ty Dịch vụ KHCN Sắc ký Hải Đăng

GSP (Good Storage Practice)

GLP (Good Laboratory Practice),

Hàm lượng Phenolic : Gồm Chavibetol, Chavibetol acetat và

4-Allyl Pyrochatechol Diacetat

Nhà máy OPC : Nhà máy Dược phẩm OPC Bình Dương đạt tiêu chuẩn GPs

Phòng Kiểm nghiệm Công ty OPC : Phòng Kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn GLP, Công ty

Cổ phần Dược phẩm OPC

RSD : Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)

Trang 10

Số TÊN HÌNH TRANG

Hình 2.2- Thùng inox cánh khuấy 2500 lít CYH - VN Trang 09

Hình 3.1- Hình sản phẩm sản xuất tại Nhà máy OPC Trang 32

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Thiết bị dùng trong nghiên cứu lô 3 Lít Trang 07

Bảng 2.2 Thiết bị dùng trong nghiên cứu lô 400 Lít Trang 08

Bảng 2.3 Các tiêu chuẩn chất lượng của sản phẩm được đánh giá Trang 15

DANH SÁCH SƠ ĐỒ

DANH SÁCH PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Kết quả xây dựng quy trình phân tích và hồ sơ thẩm định phương

pháp định lượng hàm lượng Phenolic (Chavibetol, Chavibetol

acetat và 4-APCD) và thành phần 4-APCD trong sản phẩm của

Công ty Sắc ký Hải Đăng

Trang 056

Phụ lục 2 Tiêu chuẩn sản phẩm và hồ sơ thẩm định tiêu chuẩn Trang 151

Phụ lục 3 Tiêu chuẩn nhà sản xuất và độ ổn định tinh dầu chuẩn hóa Lá Trầu Trang 171

Phụ lục 5 Phiếu kiểm nghiệm độ ổn định của sản phẩm lô 001NC Trang 191

Trang 11

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ TIÊU CHUẨN HÓA SẢN PHẨM CHỨA TINH DẦU

CHUẨN HÓA LÁ TRẦU (Piper betle L.), HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ BỆNH TAY CHÂN MIỆNG

Chủ nhiệm đề tài : Ths.Ds Hà Đức Cường

Cơ quan chủ trì : Công ty Cổ phần Dược phẩm OPC

Thời gian thực hiện đề tài : 06/2014 – 06/2016

(Theo Hợp đồng số 96/HĐĐH-SKHCN ngày 12/09/2014)

Kinh phí dược duyệt:

Tổng kinh phí: 580.000.000 đ (Năm trăm tám mươi triệu đồng), trong đó:

- Từ ngân sách sự nghiệp khoa học của Thành phố: 380.000.000 đ

- Từ nguồn khác (Công ty CPDP OPC) : 200.000.000 đ

Kinh phí đã cấp: Đợt 1 - 190.000.000 đồng(Một trăm chín mươi triệu đồng)

(theo thông báo số 125/TB-SKHCN ngày 12/08/2014)

Đợt 2: 152.000.000 đồng (Một trăm năm mươi hai triệu đồng)

(theo thông báo số 185/TB-SKHCN ngày 16/09/2015)

Mục tiêu tổng quát

Mục tiêu tổng quát của đề tài này là nhằm nghiên cứu công thức, xây dựng quy trình sản xuất và tiêu chuẩn chất lượng phù hợp để sản xuất một sản phẩm chứa tinh dầu chuẩn hóa Lá Trầu Kết quả sản phẩm của đề tài làm cơ sở nghiên cứu dược lý và nghiên cứu lâm sàng nhằm đánh giá tính an toàn và hiệu quả của sản phẩm trong việc hổ trợ điều trị bệnh TCM

Mục tiêu cụ thể

1 Xây dựng công thức

Nội dung: (Theo đề cương đã duyệt)

TT Các nội dung, công việc chủ yếu cần được thực hiện

1 Xây dựng công thức

Trang 12

TT Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện

1 Xây dựng công thức -Đã xây dựng công thức phù hợp dựa trên việc

khảo sát 6 CT ở quy mô pilot, cỡ lô 3 lít, chọn được công thức có tỷ lệ chất diện hoạt phù hợp, đảm bảo các thông số độ nhớt, tỷ trọng, pH, độ phân tán hàm lượng Phenolic (Chavibetol, Chavibetol acetat và 4-APCD) đạt yêu cầu

cho sản phẩm

-Đã hợp tác với Công ty Sắc ký Hải đăng tiến hành xây dựng quy trình phân tích và hồ sơ thẩm định phương pháp định lượng hàm lượng Phenolic (Chavibetol, Chavibetol acetat và 4-APCD) và thành phần 4-APCD trong sản phẩm -Đã xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho sản phẩm

-Đã tiến hành thẩm định tiêu chuẩn sản phẩm tại Viện kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh

3 Xây dựng quy trình công nghệ

sản xuất tại Nhà máy OPC

-Dựa trên các thông số kỹ thuật của quy trình pha chế lô 3 lít, tiến hành xây dựng quy trình công nghệ sản xuất trên dây chuyền Nhà máy OPC, cỡ

-Đã xây dựng đề cương và tiến hành thẩm định quy trình sản xuất cho 3 lô sản xuất nêu trên: Đạt yêu cầu

5 Theo dõi độ ổn định thuốc -Đã xây dựng đề cương và tiến hành theo dõi độ

ổn định thuốc ở điều kiện thường Kết quả sản phẩm sau khi sản xuất, sau 3 tháng, sau 6 tháng, sau 9 tháng, sau 12 tháng, sau 18 tháng, sau 24 tháng, đạt tất cả các chỉ tiêu trong tiêu chuẩn chất lượng đã nghiên cứu Độ ổn định sản phẩm đến nay được 24 tháng

5 Nghiệm thu đề tài

Trang 13

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1-Bệnh Tay – Chân – Miệng (TCM) [12]

1.1.1-Bệnh Tay – Chân – miệng

- Bệnh TCM là bệnh truyền nhiễm lây từ người sang người, dễ gây thành dịch do vi rút đường

ruột gây ra Hai nhóm tác nhân gây bệnh thường gặp là Coxsackie virus A16 và Enterovirus

71 (EV71) Biểu hiện chính là tổn thương da, niêm mạc dưới dạng phỏng nước ở các vị trí đặc biệt như niêm mạc miệng, lòng bàn tay, lòng bàn chân, mông, gối Bệnh có thể gây nhiều biến chứng nguy hiểm như viêm não - màng não, viêm cơ tim, phù phổi cấp dẫn đến tử vong nếu không được phát hiện sớm và xử trí kịp thời Các trường hợp biến chứng nặng thường do EV71

- Bệnh lây chủ yếu theo đường tiêu hoá Nguồn lây chính từ nước bọt, phỏng nước và phân của

trẻ nhiễm bệnh

- Bệnh TCM gặp rải rác quanh năm ở hầu hết các địa phương Tại các tỉnh phía Nam, bệnh có

xu hướng tăng cao vào hai thời điểm từ tháng 3 đến tháng 5 và từ tháng 9 đến tháng 12 hàng năm

- Bệnh có thể gặp ở mọi lứa tuổi nhưng thường gặp ở trẻ dưới 5 tuổi, đặc biệt tập trung ở nhóm

tuổi dưới 3 tuổi Các yếu tố sinh hoạt tập thể như trẻ đi học tại nhà trẻ, mẫu giáo, đến các nơi trẻ chơi tập trung là các yếu tố nguy cơ lây truyền bệnh, đặc biệt là trong các đợt bùng phát

1.1.2-Điều trị

Nguyên tắc điều trị:

- Hiện nay chưa có thuốc điều trị đặc hiệu, chỉ điều trị hỗ trợ (không dùng kháng sinh khi

không có bội nhiễm)

- Theo dõi sát, phát hiện sớm và điều trị biến chứng

- Bảo đảm dinh dưỡng đầy đủ, nâng cao thể trạng

Điều trị cụ thể: Phụ thuộc vào tình trạng bệnh nhân thuộc mức độ nào theo như phân loại phân độ

lâm sàng của bệnh

1.1.3-Phòng bệnh

Nguyên tắc phòng bệnh:

- Hiện chưa có vắc xin phòng bệnh đặc hiệu

- Áp dụng các biện pháp phòng ngừa đối với bệnh lây qua đường tiêu hoá, đặc biệt chú ý tiếp

xúc trực tiếp với nguồn lây

Phòng bệnh tại các cơ sở y tế:

- Cách ly theo nhóm bệnh

- Nhân viên y tế: Mang khẩu trang, rửa, sát khuẩn tay trước và sau khi chăm sóc

Trang 14

- Khử khuẩn bề mặt, giường bệnh, buồng bệnh bằng Cloramin B 2% Lưu ý khử khuẩn các ghế

ngồi của bệnh nhân và thân nhân tại khu khám bệnh

- Xử lý chất thải, quần áo, khăn trải giường của bệnh nhân và dụng cụ chăm sóc sử dụng lại

theo quy trình phòng bệnh lây qua đường tiêu hoá

Phòng bệnh ở cộng đồng:

- Vệ sinh cá nhân, rửa tay bằng xà phòng (đặc biệt sau khi thay quần áo, tã, sau khi tiếp xúc với

phân, nước bọt)

- Rửa sạch đồ chơi, vật dụng, sàn nhà

- Lau sàn nhà bằng dung dịch khử khuẩn Cloramin B 2% hoặc các dung dịch khử khuẩn khác

- Cách ly trẻ bệnh tại nhà Không đến nhà trẻ, trường học, nơi các trẻ chơi tập trung trong

10-14 ngày đầu của bệnh

1.2-Dược liệu Lá Trầu (Piper betle L., họ Hồ tiêu, Piperaceae).[4]

1.2.1-Vùng trồng:

- Trầu (Piper betle L., họ Hồ tiêu, Piperaceae) là một loại thực vật dễ trồng, có nguồn gốc ở

miền Trung và Đông Maylaysia ; được trồng từ 2.500 năm trước, sau lan sang Madagascar và Đông Phi Ngày nay, Trầu còn gặp ở trạng thái hoang dại; mà đã được trồng phổ biến khắp các nước nhiệt đới ở vùng Nam Á và Đông Nam Á như Ấn Độ, Srilanca, Malaysia, Thái Lan…

- Ở Việt Nam, Trầu đã được biết đến từ rất sớm Trầu đã được nhắc đến trong truyện cổ “Trầu

– Cau” từ thời các vua Hùng, cách đây khoảng 2.000 năm Hiện nay, cây được trồng ở khắp nơi Việc trồng Trầu ở Việt nam cũng như các nước châu Á khác thường gắn liền với tục ăn trầu của người dân bản xứ

- Theo Y học cổ truyền, dược liệu Lá Trầu có vị cay nồng, mùi thơm hắc, tính ấm, vào các

kinh: phế, tỳ, vị, có tác dụng trừ phong thấp, chống lạnh, hạ khí, tiêu đờm, tiêu viêm, sát trùng

1.2.2-Thành phần hóa học Lá Trầu

- Lá Trầu tươi chứa nước (85,4%), protein (3,1%), chất béo (0,8%), carbohydrat (6,1%), chất

xơ (2,3%), chất vô cơ (2,3%), canxi (230mg), phospho (40mg), sắt (7mg), sắt ion hóa (3,5mg), caroten (9600 đơn vị quốc tế), thiamin (70microgram), riboflavin (30mg), acid nicotinic (0,7mg), vitamin C (5mg) tính trên 100g Ngoài ra, còn chứa kali nitrat với hàm lượng cao.[4]

- Trong lá có đường và tinh dầu Đường khử (glucose): 1,4 – 3,2%, đường không khử (sucrose): 0,6 – 2,5%, đường toàn phần 2,4 – 5,6%, tinh bột 1,0 – 1,2%, tannin 1,0 – 1,3%.[4]

Trang 15

- Thành phần tinh dầu trong Lá Trầu khoảng 0,8 – 1,8%, có khi đến 2,4%, tinh dầu tỷ trọng

0,958 – 1,057 thơm mùi creozot (củi đốt), vị nóng Trong tinh dầu người ta đã xác định có các nhóm hoạt chất Chavibetol, Chavitol và 1 số hoạt chất Phenolic khác.[5]

Chavibetol Chavitol

1.2.3-Tác dụng dược lý

- Cao và tinh dầu Lá Trầu có hoạt tính ức chế in vitro các chủng vi khuẩn: tụ cầu vàng, phế

cầu, Staphylococcus albus, Bacillus subtilis, B anthracis, liên cầu tan máu, E coli, Salmonella typhi, phẩy khuẩn tả, Shigella flexneri, Shigella Shgae, Proteus vulgaris, Sarcina lutea và Erwinia carotovora, các chủng nấm: Candida albicans, C stellatoides, Aspergillus niger, A flavus, A oryzae, Curvularia lunata, Fusarium oxysporum và Rhizopus cans Hoạt

tính diệt nấm có thể so sánh với resorcinol Nước cất lá có tác dụng ức chế sự phát triển của trực khuẩn lao in vitro trong thử nghiệm pha loãng với nồng độ ức chế thấp nhất 1:5000.[4]

- Thành phần trong Lá Trầu được cho là có tác dụng kháng sinh rất mạnh đối với các loại vi khuẩn: tụ cầu khuẩn, liên cầu khuẩn, song cầu khuẩn, vi khuẩn subtilis và trực trùng coli.[15]

- Gần đây nhất, theo báo cáo của đề tài “ Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất tinh dầu Lá

Trầu (Piper Betle L.) bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ở quy mô pilot đạt chất lượng làm bất hoạt được virus Tay Chân Miệng EV 71” do TS Huỳnh Kỳ Trân làm chủ nhiệm đề tài Kết quả thử nghiệm ở Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh cho thấy tinh dầu Lá Trầu

có hàm lượng Phenolic (Chavibetol, Chavibetol acetat và 4-APCD) là 75% và ở nồng độ 200 ppm có chỉ số CCID50 (Cell Culture Infective Dose 50%) = 105,45 (CCID50 của virus sau khi có tác dụng tinh dầu trầu) nhỏ hơn chỉ số CCID50 = 106,5 (CCID50 của virus chưa trung hòa bằng tinh dầu lá trầu ), nghĩa là tinh dầu Lá Trầu có khả năng trung hòa virus EV71 Vì thế, Trầu có nhiều hứa hẹn trở thành nguồn nguyên liệu để bào chế thuốc phòng chống lây lan

và điều trị bệnh TCM

- Một số kết quả nghiên cứu khoa học trong những năm gần đây cũng công bố những tác dụng dược lý đặc biệt của cao chiết Lá Trầu trên hệ miễn dịch của động vật (bao gồm cả người) và hoạt tính trên tế bào của chúng.[16][17]

- Nhìn chung các nghiên cứu trong và ngoài nước đều khẳng định hoạt tính kháng oxy hóa và

kháng khuẩn rất tốt của tinh dầu [1][3][6][9][11][13]. Nhóm nghiên cứu tại Viện phát triển

Trang 16

Công nghệ và Đào tạo cho thấy tinh dầu Lá Trầu Hóc môn có hoạt tính ức chế vi khuẩn với

Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis và E.Coli ở nồng độ pha loãng 10-8, với

Pseudomonas aeruginosa ở nồng độ pha loãng 10-5, với nấm men Candida albicans ở nồng

độ pha loãng 10-7[8]

- Tuy nhiên, những kết quả nghiên cứu kể trên vẫn ở dạng tiền đề, mới chỉ khảo sát hoạt tính in

vitro trên dịch chiết Để có thể trở thành sản phẩm thương mại, rất cần có các nghiên cứu về dạng bào chế, đánh giá hiệu quả in vitro, in vivo, độc tính tiền lâm sàng, cũng như các nghiên cứu về hiệu quả, tính an toàn của sản phẩm từ Lá Trầu trên lâm sàng

1.3-Dạng bào chế

- Từ những đặc điểm bệnh học của bệnh TCM, nhận thấy rằng khi mắc bệnh TCM các vùng

mô mềm xung quanh và bên trong miệng thường xuất hiện những mụn nước nhỏ, các mụn nước này thường trượt vỡ rất nhanh tạo ra những vết loét lan rộng gây đau rát và làm bệnh nhân rất khó ăn uống Hơn nữa, bệnh lại thường gặp ở trẻ em, đối tượng rất khó khăn trong việc lựa chọn dạng thuốc sử dụng Với những lý do như nêu trên, nên dạng bào chế đề xuất của thuốc phải tối thiểu hóa được sự kích ứng đối với niêm mạc miệng và phù hợp với nhóm đối tượng sử dụng chính là trẻ nhỏ

- Qua nghiên cứu tài liệu, nhóm nghiên cứu đề tài hướng đến bào chế một sản phẩm thuốc

uống dạng lỏng, trong đó dược chất chính là tinh dầu chuẩn hóa Lá Trầu sẽ được phân tán đều trong hệ chất nền siro

1.4- Hoạt chất và tá dược sử dụng

1.4.1-Tinh dầu chuẩn hóa Lá Trầu [2]

Định nghĩa:

- Tinh dầu chuẩn hóa Lá Trầu là chất chiết từ Lá Trầu tươi, tên khoa học Piper betle L., họ Hồ

tiêu, Piperaceae Chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước

Trang 17

Góc quay cực riêng:

- 1,01 – 1,06

Kim loại nặng:

- Chì (Pb) : Không phát hiện (LOD = 0,01)

- Cadimi (Cd) : Không phát hiện (LOD = 0,005)

- Thủy ngân (Hg) : Không phát hiện (LOD = 0,01)

- Arsen (As) : Không phát hiện (LOD = 0,01)

- Chất diện hoạt X là chất trợ tan và nhũ hóa không mang điện tích, được ứng dụng trong các

dạng bào chế đường uống, đường dùng tại chỗ trên da, niêm mạc và ngoài đường tiêu hóa

- Chất diện hoạt X thường được ưu tiên sử dụng làm tác nhân hòa tan cho các vitamin tan trong

dầu, tinh dầu và các dược chất sơ nước khác Chất diện hoạt X có mùi rất nhẹ và hầu như không có vị Trong dung dịch cồn – nước hoặc dung dịch nước, chất diện hoạt X thường được dùng để hòa tan các vitamin, tinh dầu và nhiều loại dược chất khác Sử dụng 1 ml dung dịch 25% chất diện hoạt X trong nước (tt/tt), nó có khả năng hòa tan xấp xỉ 88 mg Vitamin A palmitat, hoặc xấp xỉ 160 mg Vitamin A propionate Những dược chất khác có thể được ứng dụng tương tự (dùng dung dịch chất diện hoạt X làm chất trợ tan) như alfadolone, alfaxalone, anise oil, clotrimazole, diazepam, eucalyptol, gramicidin, hexachlorofene, hexetidine, levomepromazine, miconazole, propanidid, sage oil và thiopental

- Chất diện hoạt X còn được ứng dụng làm chất diện hoạt cho các acid béo và các hợp chất

alcol

- Chất diện hoạt X còn được sử dụng làm chất phụ gia để tăng cường sự phóng thích dược chất

trong các dạng bào chế thuốc đạn

Mô tả:

- Chất diện hoạt X có màu trắng đến màu vàng, có dạng bột nhão bán rắn ở 200C, chảy lỏng ở nhiệt độ 300C Chất diện hoạt X có mùi đặc trưng rất nhẹ và hầu như không có vị trong dung dịch nước

Trang 18

Tính ổn định và điều kiện bảo quản:

- Dung dịch của chất diện hoạt X trong cồn – nước hoặc trong dung dịch nước thì bền vững

Các dung dịch này trở nên hơi đục khi đun nóng Dung dịch của chất diện hoạt X được đun nóng trong thời gian dài có thể bị tách thành 2 pha rắn, lỏng khi làm lạnh Tuy nhiên, khi tác động lực để phân tán thì dung dịch có thể trở lại trạng thái đồng nhất ban đầu

- Chất diện hoạt X phải được bảo quản trong thùng kín, nạp đầy, tránh ánh sang và để ở nơi

khô, mát

Tính tương kỵ:

- Trong dung dịch acid hay kiềm mạnh, phần ester của chất diện hoạt X sẽ dễ bị xà phòng hóa

Trong dung dịch nước, chất diện hoạt X ổn định với phần lớn chất điện giải ở nồng độ thường dùng, trừ với thủy ngân clorid Chất diện hoạt X không bị ảnh hưởng bởi các muối tạo nên độ cứng của nước

Tính an toàn:

- Chất diện hoạt X được dùng trong nhiều công thức thuốc tiêm, thuốc uống, thuốc dùng tại

chỗ Thử nghiệm độc tính cấp và mạn đã cho thấy chất này không độc và không gây kích ứng Đã có một số báo cáo về các trường hợp choáng phản vệ trên người và động vật sau khi dùng đường tiêm nhưng chưa biết được cơ chế xảy ra phản ứng này

- LD50 (chuột nhắt, IV): > 12g/kg

- LD50 (chuột, uống): > 16g/kg

1.4.3- Caramen [14]

Mô tả:

- Caramen là dung dịch đậm đặc được điều chế bằng cách đun nóng đường trắng hoặc glucose

cho đến khi hết vị ngọt và tạo nên một khối đồng nhất có màu nâu đen

- Caramen có màu đen ánh đỏ nâu, thơm mùi đường, vị hơi đắng

Tính chất đặc trưng:

- Tỷ trọng ở 200C là 1,17 – 1,30

Ứng dụng:

- Caramen là chất tạo màu được ghi trong Dược điển Mỹ (USP-NF) Chất tạo màu có vai trò

làm thay đổi về thị giác so với màu nguyên thủy của sản phẩm Điều này giúp tạo lợi thế cho

Trang 19

nhà sản xuất để sản phẩm của mình dễ phân biệt với sản phẩm của nhà sản xuất khác, tạo thuận lợi cho người bệnh dễ nhận biết khi phải dùng nhiều thuốc điều trị Ngoài ra, chất tạo màu còn giúp nâng cao hình ảnh của sản phẩm, dễ nhận dạng trên thị trường, chống hàng giả, hàng nhái

Điều kiện bảo quản:

- Bảo quản kín, nơi khô ráo, tránh tiếp xúc với nhiệt độ cao

Tính an toàn:

- Caramen được cho phép sử dụng làm chất tạo màu trong các công thức thuốc uống và dùng

tại chỗ hoặc trong mỹ phẩm, thực phẩm, có tính an toàn cao và được ghi trong Dược điển Mỹ (USP-NF)

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1- Đối tượng

2.1.1- Nguyên liệu

Hoạt chất và tá dược dùng pha chế

- 1 - Tinh dầu chuẩn hóa

Lá Trầu

TC NSX (Phụ lục 3 – Trang 171)

Viện phát triển công nghệ và đào tạo TP Hồ Chí Minh

- 2 - Chất diện hoạt X USP36-2013 BASF – Đức

- 3 - Đường trắng DĐVN IV Công ty cổ phần Bourbon – Tây Ninh

- 4 - Natri benzoat DĐVN IV Công ty Emerald Performance Materials - USA

(Phụ lục 4 – Trang 188)

Công ty Cổ phần Dược phẩm OPC

- 6 - Nước tinh khiết DĐVN IV Công ty Cổ phần Dược phẩm OPC

- Các tá dược: Chất diện hoạt X, đường trắng, Natri benzoat, Caramen, Nước tinh khiết, sử dụng loại có sẵn tại Nhà máy OPC

- Vật liệu bao bì: Chai thủy tinh 100 ml, nắp, nút, sử dụng loại có sẵn tại Nhà máy OPC

2.1.2- Trang thiết bị chính

Bảng 2.1: Thiết bị dùng trong nghiên cứu lô 3 Lít (Phòng pilot)

1 B010000 Thiết bị phân tán Erweka -Dung tích 2 lít, đáy hình bầu dục

-Tốc độ cánh khuấy 60 vòng/phút

Trang 20

2 B010001 Bình pha chế inox có cánh khuấy dung

tích 5 lít

-Dung tích 5 lít

-Tốc độ cánh khuấy 60 vòng/phút

- Ngoài ra còn có bếp điện, nồi nấu inox, máy lọc giấy chân không,…

Bảng 2.2: Thiết bị dùng trong nghiên cứu lô 400 Lít (Dây chuyền sản xuất của Nhà máy OPC)

1 Nối nấu siro 2 vỏ 500 L B000001

- Dung tích 500 lít

- Tốc độ cánh khuấy 60 vòng/phút

Công ty chế tạo máy Cơ

Y Hóa - Việt Nam

2 Nồi cánh khuấy 200 lít

Y Hóa - Việt Nam

3 Thùng inox cánh khuấy 2500

Y Hóa - Việt Nam

4 Thiết bị lọc CYH-VN B130003

- Tốc độ lọc: 700-1300 lít/giờ

-Vật liệu lọc có kích thước lỗ lọc 0,5 micromet

Y Hóa - Việt Nam

5 Thùng inox 1000 L B270005 -Dung tích 1000 L Công ty chế tạo máy Cơ

Y Hóa - Việt Nam

Trang 21

Hình ảnh thiết bị chính

Hình 2.1- Nồi cô cánh khuấy 200 lít CYH - VN

Hình 2.2- Thùng inox cánh khuấy 2500 lít CYH - VN

Trang 22

Hình 2.3- Hệ thống chiết chai tự động CYH – VN

2.2- Phương pháp nghiên cứu

2.2.1- Xây dựng công thức

2.2.1.1-Công thức cơ bản (lô 3 lít)

Theo nghiên cứu tài liệu và kinh nghiệm thực tế, công thức cơ bản được đề nghị như sau:

- (*) số 0,27 g là lượng tinh dầu chuẩn hóa Lá Trầu đã quy về hàm lượng 4-APCD 45%

- Cỡ lô pha chế là 3 lít

- Pha chế tại Phòng pilot Nhà máy OPC

Trang 23

2.2.1.2-Danh mục thiết bị chính dùng trong nghiên cứu lô 3 Lít: Xem Bảng 2.1

2.2.1.3-Phương pháp pha chế lô 3 lít:

- Dùng thiết bị phân tán Erweka, phối hợp toàn bộ lượng tinh dầu chuẩn hóa Lá Trầu vào chất diện hoạt X, tốc độ 60 vòng/phút, trong 5 phút Khuấy trộn thêm 5 phút sau khi cho hết tinh dầu vào (HH1)

- Dùng bếp điện và nồi inox, Nấu hỗn hợp Đường – Chất bảo quản - Caramen – Nước tinh khiết cho tan hoàn toàn, để nguội (HH2)

- Dùng bình pha chế inox có cánh khuấy dung tích 5 lít, cho HH2 vào trước, cho tiếp từ từ HH1 vào, duy trì tốc độ cánh khuấy 60 vòng/phút, trong 5 phút Khuấy trộn thêm 10 phút sau khi cho hết HH 1 vào

- Tỉ lệ đường trắng 70% (kl/tt) : Không thay đổi Theo chuyên luận siro thuốc của Dược điển

Việt Nam IV và theo kinh nghiệm công thức một số siro đang sản xuất tại OPC thì nồng độ đường 70% là phù hợp vì tạo được sản phẩm có thể chất, mùi vị và độ ổn định Đặc biệt, với nồng độ đường trắng 70%, tạo một dịch thuốc có độ nhớt và tỷ trọng phù hợp với yêu cầu của thông số kỹ thuật của Hệ thống chiết chai tự động CYH – VN trên Nhà máy OPC

- Tỉ lệ chất bảo quản Natri benzoat: Không thay đổi Theo quy định nồng độ chất bảo quản

- Tỷ lệ Caramen: Không thay đổi Theo kinh nghiệm, với tỷ lệ này tạo được sản phẩm có màu

phù hợp

Thời gian phân tán tinh dầu vào chất diện hoạt X, thời gian phối hợp HH1 và HH2 không

thay

b/Thông số thay đổi:

Tỷ lệ chất diện hoạt X: Theo tài liệu và theo kinh nghiệm một số công thức siro chứa tinh dầu

tương tự đang sản xuất tại OPC, tỉ lệ chất diện hoạt X đề nghị thay đổi theo các mức sau: 4,0%; 4,5%; 5,0%; 5,5%; 6,0%; 6,5%

c/Các thông số khảo sát:

+ Độ nhớt dịch thuốc:

- Thiết bị: Thiết bị đo độ nhớt kiểu trục quay, máy Brookfield LVDV-I prime

- Lấy mẫu: sau khi pha chế, số lượng 1 mẫu, 100 ml/ 1 mẫu, dùng muỗng inox cho vào chai

thủy tinh sạch có nắp

Trang 24

- Đo mẫu và ghi kết quả

- Kết quả độ nhớt phải phù hợp với siro thuốc, phù hợp với yêu cầu kỹ thuật của Hệ thống

chiết chai tự động CYH - VN

- Đo mẫu và ghi kết quả

- Kết quả tỷ trọng phải phù hợp với siro thuốc, phù hợp với yêu cầu kỹ thuật của Hệ thống

chiết chai tự động CYH - VN

- Tiêu chuẩn chấp nhận là : Chọn công thức có thời gian tách lớp lâu nhất

+ Độ phân tán hàm lượng Phenolic (Chavibetol, Chavibetol acetat và 4-APCD):

- Lấy mẫu: Sau khi khuấy đủ thời gian , tiến hành lấy mẫu 3 vị trí trên giữa dưới của bình pha

chế, mỗi vị trí 2 mẫu (tổng cộng 6 mẫu), 20 ml/1 mẫu Dùng muỗng inox và chai thủy tinh sạch có nắp

- Tiến hành định lượng hàm lượng Phenolic (Chavibetol, Chavibetol acetat và 4-APCD) trong

dịch thuốc theo quy trình định lượng đã xây dựng trong phần nghiên cứu tiêu chuẩn

- Tiêu chuẩn chấp nhận là : Đánh giá độ phân tán hàm lượng của hàm lượng Phenolic

(Chavibetol, Chavibetol acetat và 4-APCD) bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD ≤ 2%

Trang 25

2.2.2- Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng

Phần nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cho sản phẩm có 2 giai đoạn:

- Tham khảo các Dược điển, tiêu chuẩn Nhà cung cấp

- Máy móc thiết bị tại Phòng Kiểm nghiệm Công ty OPC

- Hoạt chất: tinh dầu chuẩn hóa Lá Trầu do Viện phát triển công nghệ và đào tạo TP Hồ Chí

Minh

- Tá dược: Có sẵn tại Công ty OPC

Phương pháp:

Nghiên cứu lý thuyết:

- Tham khảo các Dược điển, tiêu chuẩn Nhà cung cấp, xây dựng tiêu chuẩn dự thảo cho hoạt

chất, tá dược và thành phẩm

Thử nghiệm thực tế:

- Dựa trên tiêu chuẩn dự thảo, tiến hành các thử nghiệm

- Xây dựng tiêu chuẩn thực tế phù hợp với điều kiện trang thiết bị tại Phòng Kiểm nghiệm

Trang 26

2.2.3-Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất tại Nhà máy OPC

Tiến hành nâng cấp lên cỡ lô 400 Lít (Theo quy định GMP, cỡ lô phải ≥ 1/10 cỡ lô 2000 lít đang sản

xuất tại Nhà máy OPC) Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất gồm các giai đoạn sau:

a Xây dựng công thức lô

b Xác định Danh mục thiết bị

c Mô tả quá trình sản xuất

d Sơ đồ quy trình sản xuất (dự kiến)

e Kiểm soát các bước trung gian và thông số sản phẩm

2.2.4 Triển khai sản xuất tại Nhà máy OPC và thẩm định quy trình sản xuất

2.2.4.1-Triển khai sản xuất tại Nhà máy OPC

- Triển khai sản xuất 3 lô 001NC, 002NC, 003NC, cỡ lô 400 lít (4444 chai 90 ml/ 1 lô) Theo quy trình công nghệ gồm có các giai đoạn như trên

d Kế hoạch lấy mẫu

2.2.4.2.2-Kết quả thẩm định từ 3 lô, cỡ lô 400 lít

Kết luận: Việc nâng cỡ lô 400 lít được kết luận là thành công khi các thông số thẩm định nằm trong

giới hạn chấp nhận và có tính lặp lại giữa 3 lô

2.2.5- Theo dõi độ ổn định sản phẩm

2.2.5.1-Phương tiện

- Phòng lưu mẫu độ ổn định

- Dụng cụ thí nghiệm tại phòng Kiểm Nghiệm Công ty OPC, riêng chỉ tiêu định tính và định

lượng hợp tác với Công ty Sắc ký Hải đăng thực hiện

- Nguyên liệu: Mẫu theo dõi độ ổn định từ 3 lô sản xuất 001NC, 002NC và 003NC

2.2.5.2-Phương pháp

- Theo dõi độ ổn định ở điều kiện thường: Lưu mẫu tại phòng lưu mẫu độ ổn định điều kiện

thường (nhiệt độ 30oC ± 2oC, độ ẩm 75% ± 5%) Định kỳ các thời điểm ban đầu, sau 3 tháng, sau 6 tháng, sau 9 tháng, sau 12 tháng, sau 18 tháng, sau 24 tháng,… lấy mẫu, kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm đã nghiên cứu

Trang 27

Bảng 2.3-Các tiêu chuẩn chất lượng của sản phẩm được đánh giá

1 Tính chất Chất lỏng sánh, màu nâu nhạt, trong suốt, không có cặn, không

tách lớp, mùi thơm đặc trưng, vị ngọt

2 Độ đồng đều thể tích 90 ml +10 %

3 Tỷ trọng ở 20 o C 1,22 – 1,32

4 Định tính Thể hiện phép thử định tính của tinh dầu Lá Trầu

5 Giới hạn Natri benzoat Không quá 1,2 mg/ml

6 Định lượng

Hàm lượng Phenolic (Chavibetol, Chavibetol acetat và 4-APCD) trong sản phẩm phải đạt từ 200 mg/100 ml – 270 mg/100 ml, trong đó hàm lượng 4-APCD ≥ 120 mg/100 ml

7 Giới hạn nhiễm khuẩn

Đạt yêu cầu mức 4 của Dược điển Việt Nam IV, về giới hạn

nhiễm khuẩn của các sản phẩm dùng uống

+Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được: không quá 104/ml

+Tổng số Enterobacteria: không quá 500/ml

+Nấm: không quá 100/ml

+Không được có Escherichia coli, Salmonella, Pseudomonas

aeruginosa, Staphylococcus aureus trong 1ml

Kết luận:

Sản phẩm được xem là ổn định khi tại các thời điểm lấy mẫu ban đầu, sau 3 tháng, sau 6 tháng, sau 9 tháng, sau 12 tháng, sau 18 tháng , sau 24 tháng,… sản phẩm phải đạt tất cả các chỉ tiêu theo tiêu

chuẩn đã nghiên cứu Từ đó suy ra độ ổn định của sản phẩm

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1-Kết quả xây dựng công thức:

Trang 28

- (*) số 0,27 g là lượng tinh dầu chuẩn hóa Lá Trầu đã quy về hàm lượng 4-APCD 45%

- Cỡ lô pha chế là 3 lít Cách pha chế được nêu tại mục 2.2.1

- Thăm dò 6 công thức với tỉ lệ chất diện hoạt X được đề nghị thay đổi theo các mức sau: 4,0%; 4,5%; 5,0%; 5,5%; 6,0%; 6,5%

Bảng 3.2-Thành phần 6 công thức khảo sát

CT01 CT02 CT03 CT04 CT05 CT06

- 1 - Tinh dầu chuẩn hóa Lá Trầu

(quy về hàm lượng 4-APCD

Đánh giá các chỉ tiêu chất lượng như đã mô tả

Bảng 3.3-Kết quả thăm dò 6 công thức

Công thức Độ nhớt

(cP)

Tỷ trọng

CT02 148,4 1,287 5,5 Không tách

lớp

CT2.T1 = 254,6 CT2.T2 = 259,4 CT2.G1 = 261,4 CT2.G2 = 257,3 CT2.D1 = 255,3 CT2.D2 = 262,9 RSD=1,29%

Trang 29

CT03 148,5 1,283 5,5 Không tách

lớp

CT3.T1 = 254,4 CT3.T2 = 257,0 CT3.G1 = 258,6 CT3.G2 = 262,8 CT3.D1= 261,2 CT3.D2 = 256,6

RSD=1,21%

CT04 148,3 1,290 5,5 Không tách

lớp

CT05 148,8 1,280 5,5 Không tách

lớp

CT06 148,7 1,281 5,5 Không tách

lớp

- Sau khi làm thử nghiệm như mô tả, 6 công thức đều không tách lớp

Độ phân tán hàm lượng tinh dầu:

- 6 công thức thăm dò đều đạt độ phân tán hàm lượng tinh dầu (RSD <2%)

- CT01 và CT02 có độ phân tán hàm lượng không bằng các CT còn lại

- Trong số các CT03, CT04, CT05 và CT06, độ phân tán hàm lượng là tương đương nhau,

nhưng chọn CT03 do có hàm lượng chất diện hoạt thấp nhất trong 4 CT

Trang 30

Bảng 3.4-Công thức dịch thuốc được chọn

3.2- Kết quả xây dựng tiêu chuẩn chất lượng

3.2.1-Giai đoạn 1: Kết quả xây dựng quy trình phân tích và hồ sơ thẩm định phương pháp định

lượng hàm lượng Phenolic (Chavibetol, Chavibetol acetat và 4-APCD) và thành phần 4-APCD trong sản phẩm do Công ty Sắc ký Hải đăng thực hiện (Xem Phụ lục 1 – Trang 56)

Tóm tắt nội dung thực hiện như sau:

Đối tượng áp dụng

Quy trình này được áp dụng để định lượng hàm lượng Phenolic (Chavibetol, Chavibetol acetat

và 4-APCD) và 4-APCD trong mẫu sản phẩm chứa tinh chuẩn hóa Lá Trầu do Công ty OPC cung cấp

Chất chuẩn, hóa chất, dung môi, trang thiết bị

Trang 31

Trang thiết bị

- Máy GCMS-QP 2010 của Shimadzu kết hợp bộ tiêm mẫu tự động AOC-5000 của Shimadzu

- Cột sắc ký: DB-5MS UI(30m x ID 0,25mm x độ dày lớp film 0,25µm)

- Cân phân tích 5 số lẻ và 3 số lẻ có thang đo nhỏ nhất lần lượt là ±0,01mg, ±0,001g

- Cột sắc ký: DB-5MS UI(30m x ID 0.25mm x độ dày lớp film 0.25µm)

- Nhiệt độ buồng tiêm: 250oC, tỷ lệ chia dòng 15:1

- Nhiệt độ cột: giữ ở 60oC trong 4 phút, tăng đến 80oC với tốc độ gia nhiệt 2oC/phút; tiếp tục tăng đến 180oC với tốc độ gia nhiệt 5oC/phút, giữ ở nhiệt độ này trong 3 phút; tiếp tục tăng đến 310oC với tốc độ gia nhiệt 20oC/phút, giữ ở nhiệt này trong 2 phút

- Tốc độ dòng: 1,24 ml/phút

- Detector:

 Detector Voltage (điện thế detector) 1,35 kV, absolute

 Interface Temp (nhiệt độ giao diện) 250oC

 Ion Source Temp (nhiệt độ nguồn ion hóa) 200oC

- Thể tích tiêm mẫu: 1 µL

Chuẩn bị mẫu:

- Dung dịch chuẩn gốc đơn (10000 µg/ml): cân chính xác khoảng 100 mg từng chất chuẩn

Chavibetol, Chavibetol acetat, APC diacetat vào mỗi bình định mức 10 ml Định mức đến vạch bằng aceton

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp thứ cấp 1 (1000 µg/ml): rút chính xác 1 ml từng dung dịch chuẩn gốc

đơn 10000 µg/ml vào bình định mức 10 ml Định mức đến vạch bằng aceton

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp thứ cấp 2 (100 µg/ml): rút chính xác 1 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp

thứ cấp 1 (1000 µg/ml) vào bình định mức 10 ml Định mức đến vạch bằng aceton

- Dung dịch nội chuẩn Isoeugenol (1000 µg/ml): cân chính xác khoảng 10 mg chất chuẩn

isoeugenol vào bình định mức 10 ml Định mức đến vạch bằng aceton

Trang 32

- Dung dịch chuẩn làm việc: lấy chính xác 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp thứ cấp

1 (1000 µg/ml), 0,05; 0,1; 0,2 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp thứ cấp 2 (100 µg/ml) vào mỗi bình định mức 10 ml Thêm tiếp chính xác 0,1 ml dung dịch nội chuẩn Isoeugenol (1000 µg/ml), định mức đến vạch bằng aceton Nồng độ dung dịch chuẩn làm việc tương ứng lần lượt là 0,5; 1; 2, 5,

10, 20, 50 µg/ml

- Mẫu thử: cân chính xác khoảng 0,5 g sản phẩm vào ống Hatch 10 ml Cho thêm vào 1 ml dung

dịch NaCl bão hòa, vortex nhẹ Cho qua cột CHROMABOND XTR (5 g bột XTR + 1,5 g

Na2SO4 khan), tráng ống Hatch bằng dung dịch NaCl bão hòa (0,5 ml x 2 lần) Sau 20 phút, rửa giải cột bằng 40 ml diethylether khan (rửa giải nhiều lần, mỗi lần 10 ml) vào bình cầu Cô quay (không dùng chân không) và thổi khô bằng khí N2 Tiến hành tráng bình cầu nhiều lần bằng aceton, chuyển toàn bộ vào bình định mức 5 ml Định mức đến vạch bằng aceton Rút chính xác

1 ml dịch chiết vào bình định mức 10 ml, thêm 0,1 ml nội chuẩn isoeugenol 1000 µg/ml Định mức đến vạch bằng aceton, lắc đều, chuyển dịch chiết vào vial

Tiến hành:

- Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn làm việc và mẫu thử Ghi nhận các sắc ký đồ và diện tích

các pic

Tính kết quả:

- Từ kết quả của các dung dịch chuẩn làm việc, tính toán sự tương quan và vẽ đường chuẩn giữa

nồng độ mỗi hoạt chất Chavibetol, Chavibetol acetat và APC diacetat với hệ số F (tỉ lệ diện tích của hoạt chất đó so với diện tích pic isoeugenol trong sắc ký đồ tương ứng)

- Dựa vào đường chuẩn trên và diện tích các pic của mẫu thử, tính nồng độ (Ci, g/ml) của từng hoạt chất Chavibetol, Chavibetol acetat và APC diacetat trong dung dịch tiêm mẫu của mẫu thử

- Hàm lượng (Xi%, kl/tt) của từng hoạt chất Chavibetol, Chavibetol acetat và APC diacetat trong sản phẩm được tính theo công thức sau:

1001000)

i



- Hàm lượng Phenolic (Chavibetol, Chavibetol acetat và 4-APCD) (X%, kl/tt) trong sản phẩm

được tính theo công thức sau:



 X i tt

kl

X(%, / )Trong đó:

Ci : Nồng độ của từng hoạt chất Chavibetol, Chavibetol acetat và APC diacetat trong sản phẩm (g/ml)

Trang 33

Xi : Hàm lượng của từng hoạt chất Chavibetol, Chavibetol acetat và APC diacetat trong sản phẩm (%, kl/tt)

X : Hàm lượng Phenolic (Chavibetol, Chavibetol acetat và 4-APCD) trong sản phẩm (%, kl/tt)

D : Độ pha loãng của mẫu thử

 : Khối lượng riêng của sản phẩm ở 25 oC (g/ml), được xác định theo DĐVN IV, phụ lục 6.5

m : Khối lượng cân của mẫu thử (g)

Đánh giá phương pháp, gồm những nội dung sau: (Xem Phụ lục 1 – Trang 56)

- Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

Kết quả đánh giá phương pháp:

Phương pháp phân tích xây dựng được đạt các yêu cầu về tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác và độ đúng theo quy định của Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc, phụ lục 8, Quyết định của Cục trưởng Cục Quản lý Dược, Bộ Y tế số 07/QĐ – QLD ngày 11 tháng

01 năm 2013 Như vậy, đề nghị áp dụng phương pháp đã trình bày ở trên trong định lượng các hoạt chất Chavibetol, Chavibetol acetate và 4-APCD trong sản phẩm chứa tinh dầu chuẩn hóa Lá Trầu do Công ty OPC cung cấp

Trang 34

3.2.2-Giai đoạn 2: Dựa vào kết quả Giai đoạn 1, Nhóm đề tài sẽ xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho

Thay thế số:

SẢN PHẨM CHỨA TINH DẦU CHUẨN HÓA LÁ TRẦU

YÊU CẦU KỸ THUẬT

Công thức: Cho 1 chai 90 ml

Tinh dầu chuẩn hóa Lá Trầu (quy về hàm lượng 4-APCD 45%) 0,27 g

Chất diện hoạt X 4,50 g

Đường trắng 63,00 g

Natri benzoat 0,09 g

Caramen 0,90 g

Nước tinh khiết vđ 90 ml

Tiêu chuẩn nguyên liệu

Tinh dầu chuẩn hóa Lá Trầu

Extractum Folium Piper bettle Đạt Tiêu chuẩn NSX

Nước tinh khiết Aqua purificata Đạt Tiêu chuẩn DĐVN IV

Chất lượng thành phẩm

lớp, mùi thơm đặc trưng, vị ngọt

Giới hạn Natri benzoat : Không quá 1,2 mg/ml

Trang 35

Định lượng : Hàm lượng Phenolic (Chavibetol, Chavibetol acetat và 4-APCD)

trong sản phẩm phải đạt từ 200 mg/100 ml – 270 mg/100 ml, trong đó hàm lượng 4-APCD ≥ 120 mg/100 ml

Giới hạn nhiễm khuẩn : Đạt yêu cầu mức 4 của DĐVN IV về giới hạn nhiễm khuẩn của các sản phẩm dùng uống

- Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được: không quá 104 / ml

- Tổng số Enterobacteria: không quá 500 / ml

- Nấm: không quá 100 / ml

- Không có Escherichia coli, Salmonella, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus

trong 1 ml

PHƯƠNG PHÁP THỬ

Tính chất: Thử bằng cảm quan, sản phẩm phải đạt các yêu cầu đã nêu

Thể tích: Thử theo Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 11.1 - “Giới hạn cho phép về thể tích, nồng độ, hàm lượng thuốc của các dạng bào chế” mục “Giới hạn cho phép về thể tích”, trang PL-220

Tỷ trọng ở 20 0 C: Thử theo Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 6.5.- “Xác định Khối lượng riêng và Tỷ

trọng”, phương pháp dùng picnomet

Định tính: Ở phần định lượng, sắc ký đồ của dung dịch thử phải cho các pic có cùng thời gian lưu

với các pic Chavibetol, Chavibetol acetat và 4-APCD ở sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu

Giới hạn Natri benzoat: Không quá 1,2 mg/ml

Dung môi, hóa chất:

- Chất chuẩn natri benzoat (ĐC)

- Acetonitril (tinh khiết sắc ký)

- Pha động: Acetonitril – đệm phosphat

Tiến hành sắc ký theo chương trình trong bảng sau:

Trang 36

Thời gian (phút) Acetonitril (%) Đệm phosphat (%)

- Dung môi pha mẫu: Hỗn hợp acetonitril – nước (35 : 65)

- Dung dịch đối chiếu: Cân chính xác khoảng 25 mg natri benzoat (ĐC) cho vào bình định mức

50 ml, hòa tan và bổ sung đến vạch bằng dung môi pha mẫu, lắc đều Lấy chính xác 2,0 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 50 ml, bổ sung dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm

- Dung dịch thử: Lấy chính xác 2,0 ml mẫu thử cho vào bình định mức 100 ml, thêm 70 ml

dung môi pha mẫu, lắc kỹ trong 5 phút, bổ sung đến vạch với cùng dung môi Lọc qua màng lọc 0,45 µm

T C C T

V D S

D C m S ml mg X

Trong đó :

ST , SC : Lần lượt là diện tích của pic natri benzoat ở sắc ký đồ của dung dịch

thử và dung dịch đối chiếu

mC : Khối lượng cân của chất đối chiếu natri benzoat (mg)

CC : Hàm lượng tính trên nguyên trạng của chất đối chiếu natri benzoat

DT, DC : Lần lượt là độ pha loãng của dung dịch thử và dung dịch đối chiếu

VT : Thể tích lấy của mẫu thử (ml)

Định lượng: Bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS)

Dung môi, hóa chất:

- Chất chuẩn Chavibetol (ĐC)

- Chất chuẩn Chavibetol acetat (ĐC)

Trang 37

- Chất chuẩn APC diacetat (ĐC)

- Chất chuẩn Isoeugenol (ĐC)

- Diethylether (TT)

- Aceton (tinh khiết sắc ký)

- Nước cất 2 lần (đạt tiêu chuẩn dùng cho sắc ký khí)

- Dung dịch natri clorid bão hòa (TT)

- Natri sulfat khan (TT)

Điều kiện sắc ký:

- Cột sắc ký: DB-5MS UI(30m x ID 0,25mm x độ dày lớp film 0,25µm)

- Nhiệt độ buồng tiêm: 250 oC, tỷ lệ chia dòng 15:1

- Nhiệt độ cột: giữ ở 60 oC trong 4 phút, tăng đến 80 oC với tốc độ gia nhiệt 2oC/phút; tiếp tục tăng đến 180 oC với tốc độ gia nhiệt 5 oC/phút, giữ ở nhiệt độ này trong 3 phút; tiếp tục tăng đến

310 oC với tốc độ gia nhiệt 20 oC/phút, giữ ở nhiệt này trong 2 phút

- Tốc độ dòng: 1,24 ml/phút

- Detector:

 Detector Voltage (điện thế detector) 1,35 kV, absolute

 Interface Temp (nhiệt độ giao diện) 250oC

 Ion Source Temp (nhiệt độ nguồn ion hóa) 200oC

- Thể tích tiêm mẫu: 1 µl