Nghiên Cứu Bào Chế Mỹ Phẩm Gel Dương Cam Cúc Matricaria Chamomilla L Liposomes Hỗ Trợ Điều Trị Da Bị Viêm Và Dị Ứng.pdf

ỦY BAN NHÂN DÂN TP HCM ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRUNG TÂM KHCN DƯỢC SÀI GÒN BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU Tên đề tài NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ MỸ PHẨM "GEL DƯƠNG CAM CÚC (Matrica[.]

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP.HCM

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRUNG TÂM KHCN DƯỢC SÀI GÒN

BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ MỸ PHẨM "GEL DƯƠNG CAM CÚC (Matricaria chamomilla L.) – LIPOSOMES" HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ

DA BỊ VIÊM VÀ DỊ ỨNG

Chủ nhiệm đề tài: TS TRẦN VĂN THÀNH

Thời gian thực hiện: từ 12/2013 đến tháng 12/2016

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12 / 2016

II

TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Tại Việt Nam, Dương cam cúc (Matricaria chamomilla L.) (DCC) đã được di thực từ

những năm 60 Hiện nay, tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu bào chế các sản phẩm từ DCC chưa nhiều, chủ yếu do nhóm nghiên cứu của TS Trần Anh Vũ, khoa Dược, đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh thực hiện Đề tài này đã công bố hai dạng bào chế đi từ cao toàn phần và tinh dầu DCC là kem thoa da và gel rửa Tinh dầu

DCC ức chế in vitro Staphylococus aureus, Bacillus subtilis, ức chế những vi khuẩn

gram (+) mạnh hơn so với vi khuẩn gram (-) và ức chế sự nảy mầm của bào tử các men, mốc, nấm da thử nghiệm Tác dụng chống viêm của cao DCC đã được chứng minh trên chuột cống trắng và ban đỏ gây ra bởi tia tử ngoại ở chuột lang

Trong nghiên cứu này, cao DCC được kiểm tra về cảm quan, định tính flavonoid và định lượng apigenin-7-glucosid bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Tinh dầu DCC được kiểm tra về cảm quan, định tính và định lượng bisabolol oxid và chamazulene bằng sắc ký khí Nguyên liệu đạt tiêu chuẩn cơ sở trước khi được đưa vào nghiên cứu điều chế liposome-DCC

Về công thức điều chế LPS-DCC: Các kết quả nghiên cứu cho thấy vai trò của Tween

80 là cần thiết để tạo được hệ liposome có kích thước nhỏ và có sự phân bố kích thước tiểu phân 1 đỉnh Liposome được tạo thành là dạng MUV, được xác định thông qua các quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Mặt khác, cholesterol đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định màng liposome trong quá trình bảo quản Cholesterol giúp ổn định lượng cao DCC được nang hóa bên trong liposome theo thời gian Sau 1 tuần bảo quản lạnh, LPS-DCC vẫn chưa có thay đổi về cảm quan

Về qui trình điều chế LPS-DCC: 2 phương pháp điều chế đã được nghiên cứu là phương pháp hydrat hóa màng phim lipid và phương pháp tiêm ethanol Các thông số nghiên cứu đã được xác định để tạo được hệ LPS-DCC có kích thước nano (dưới 400 nm) chứa cao và tinh dầu DCC Tuy nhiên, phương pháp hydrat hóa màng phim lipid không phù hợp với cao DCC, trong quá trình bảo quản, hàm lượng cao DCC giảm và phổ sắc ký của apigenin-7-glucosid bị thay đổi Phương pháp tiêm ethanol giúp tạo được liposome có kích thước nhỏ, hiệu suất bắt giữ cao DCC là 14% và toàn bộ tinh dầu DCC đều nằm trong lớp màng lipid của liposome

Về công thức điều chế gel LPS-DCC: Tá dược poloxamer 407 phù hợp với nghiên cứu này vì có sự tạo gel thuận nghịch theo nhiệt độ Trong giai đoạn đầu tiên, dung dịch poloxamer được giữ lạnh ở trạng thái lỏng, phối hợp với hệ LPS-DCC dễ dàng thông qua việc khuấy trộn Sau khi hệ poloxamer - LPS-DCC được phối hợp đồng nhất Sự gia tăng nhiệt độ về nhiệt độ phòng sẽ làm tăng độ nhớt và chuyển hỗn hợp trên về thể gel trong suốt Các thử nghiệm đánh giá cho thấy hệ gel LPS-DCC có tác dụng làm sạch da, giữ ẩm, kháng viêm và kháng khuẩn Thừ nghiệm độ ổn định ở điều kiện thực cho thấy trong thời gian khảo sát là 12 tháng gel LPS-DCC vẫn ổn định

SUMMARY OF RESEARCH CONTENT

In Vietnam, Matricaria chamomilla L (DCC) were acclimatized from 1960 Today,

the publication on DCC is limited, mainly by Dr Tran Anh Vu, Faculty of Pharmacy, University of Medicine and Pharmacy in Ho Chi Minh City These publications have announced two dosage forms oil and gel skin lotion containing of DCC extraction

DCC oil shows in vitro inhibition of Staphylococus aureus, Bacillus subtilis, inhibition

of gram (+) bacteria stronger than Gram (-) and inhibits the germination of spores, yeast, mold, fungal skin High anti-inflammatory effects of DCC extraction was demonstrated on white rats and erythema caused by ultraviolet rays in guinea pigs

In this study, DCC extraction were tested for sensory, qualitative and quantitative of apigenin-7-glucosid by means of high-performance liquid chromatography DCC oils were tested for sensory, qualitative and quantitative of chamazulene and bisabolol oxide by gas chromatography

For the formulation of LPS-DCC: Results of the study showed that Tween 80 is necessary to create a small sized liposome system with 1 peak of particle size distribution Liposomes are formed of MUV, which is determined through observations under the transmission electron microscopy (TEM) On the other hand, cholesterol plays an important role in stabilizing the liposome membrane during storage Cholesterol help stabilize DCC encapsulated inside liposomes After 1 week

of preparation, LPS-DCC has not changed the outlook

For the preparation process of LPS-DCC: 2 methods have been studied as method lipid film hydration and ethanol injection method The parameters studied were determined

to create LPS-DCC system nanoscale (below 400 nm) and high DCC oil containing However, film hydration method is inconsistent with DCC extraction, the chromatographic spectrum of apigenin-7-glucosid was altered Ethanol injection method helps create small sized liposomes, high encapsulation efficiency of DCC extraction (14%) and the entire DCC oil are encapsulated within the lipid layer of liposomes membrane

For the preparation of gel LPS-DCC: poloxamer 407 is suitable for this study because

of the reversible gelling temperature phenomenons In the first phase, poloxamer solution is kept in a liquid state by cold temperature, that could mixed easily with the LPS-DCC through agitation After poloxamer-LPS-DCC systems are homogeneous, the rise in the temperature to the room temperature will increase the viscosity and can transfer the mixture into transparent gel The experimental evaluation showed that gel LPS-DCC system had skin cleansing, moisturizing, anti-inflammatory and antibacterial effect Stability testing in real conditions showed that after 12-month LPS-DCC gel remained stable

1.2.7 Đánh giá kết quả các công trình nghiên cứu đã công bố về thành

phẩm DCC

12

2.1 DUNG MÔI, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ SỬ DỤNG

TRONG NGHIÊN CỨU

14

2.2 KIỂM NGHIỆM NGUYÊN LIỆU CAO DƯƠNG CAM CÚC VÀ

TINH DẦU DƯƠNG CAM CÚC

15

2.3 NGHIÊN CỨU ĐIÊU CHẾ LIPOSOME CHỨA CAO VÀ TINH

DẦU DƯƠNG CAM CÚC (DCC-LPS)

18

2.3.1 Nghiên cứu điều chế liposome chứa cao và tinh dầu Dương cam cúc

bằng phương pháp hydrat hóa màng phim

18

2.3.2 Nghiên cứu điều chế liposome chứa cao và tinh dầu Dương cam cúc

bằng phương pháp tiêm ethanol

20

2.4 NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ GEL DƯƠNG CAM CÚC –

LIPOSOMES

27

2.5 NGHIÊN CỨU ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA GEL LIPOSOME-DƯƠNG

CAM CÚC TRONG ĐIỀU KIỆN THỰC

37

II

3.1 KIỂM NGHIỆM NGUYÊN LIỆU CAO DƯƠNG CAM CÚC VÀ

TINH DẦU DƯƠNG CAM CÚC

38

3.2 KẾT QUẢ ĐIỀU CHẾ HỆ LIPOSOME CHỨA CAO VÀ TINH

DẦU DƯƠNG CAM CÚC

40

3.2.1 Điều chế liposome chứa cao DCC và tinh dầu DCC bằng phương

pháp hydrat hóa màng phim lipid

40

3.2.2 Điều chế liposome chứa cao DCC và tinh dầu DCC bằng phương

pháp tiêm ethanol

44

3.2.4 Công thức, qui trình điều chế và tiêu chuẩn cơ sở cho bán thành

phẩm LPS-DCC

65

3.4 ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA GEL LIPOSOME DƯƠNG CAM

CÚC TRONG ĐIỀU KIỆN THỰC

84

concentration

Nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn

IV

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1 4 Điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao định lượng hàm lượng

apigen-7-glucosid trong cao toàn phần DCC

4

Bảng 1 6 Một số chế phẩm chứa DCC (Matricaria chamomilla L.) trên thế

giới

13

Bảng 3 4 Hàm lượng bisabolol oxid A, B và chamazulen trong tinh dầu

DCC

40

Bảng 3 6 Các công thức bào chế liposome với thời điểm thêm Tween 80

khác nhau

41

Bảng 3 8 Các công thức bào chế liposome với nồng độ Tween 80 khác nhau 42

Bảng 3 15 Các công thức và kết quả đánh giá liposome với lượng lipid khác

nhau

49

Bảng 3 16 Các công thức bào chế liposome với lượng Tween 80 khác nhau 50

Bảng 3 18 Các công thức và kết quả đánh giá liposome với tỉ lệ lipid/cao

DCC khác nhau

52

Bảng 3.33 Kết quả đánh giá 3 mẫu liên tiếp điều chế bằng phương pháp tiêm

ethanol

65

Bảng 3.36 Kết quả khảo sát tỷ lệ phối hợp giữa hệ liposome và dung dịch

poloxamer 407 ở các nồng độ khác nhau

67

Bảng 3.40 Kết quả độ bền vật lý của gel liposome bào chế theo công thức 10 71

VI

Bảng 3.53 Định tính khả năng kháng khuẩn (đường kính vòng kháng khuẩn,

mm)

80

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1.1 Các dạng mỹ phẩm chứa Dương cam cúc: (A) dịch cất chứa tinh dầu DCC

dùng rửa mặt, (B) sản phẩm tẩy trang, (C) gel rửa, (D) và (E) kem thoa dưỡng da kết

hợp nhiều thành phần giúp phục hồi da tổn thương và giảm nếp nhăn trên da

1

Hình 1.2 Công thức cấu tạo các thành phần hóa học chính trong tinh dầu DCC 1 Hình 1.3 Công thức cấu tạo các hoạt chất có hoạt tính sinh học trong cao DCC 3 Hình 1.4 Cấu trúc của các loại liposome khác nhau (A) dạng liposome thường quy,

(B) dạng liposome có gắn chuỗi polymer thân nước trên bề mặt, (C) dạng liposome

biến đổi cấu tạo từ các polymer lưỡng tính và (D) dạng liposome tích điện dương phù

hợp cho việc vận chuyển các hoạt chất vào trong tế bào tác dụng trên các ADN tích

Hình 1.7 Mặt cắt ngang của gel tạo thành với vài liposome và 1 polymer thân nước

được chuyển dạng thành sơ nước (loại ABA)

12

Hình 2.1 Sắc ký đồ mẫu chuẩn apigenin-7-glucosid (a) và cao DCC (b) 17 Hình 2.2 Sơ đồ tóm tắt các bước khảo sát bào chế liposome chứa cao DCC 19 Hình 2.3 Đánh giá khả năng kháng khuẩn trên thạch 34 Hình 2.4 Hình ảnh quan sát da bằng thiết bị Air-micro 36 Hình 3.1 Sắc ký lớp mỏng A: Apigenin-7-glucosid chuẩn và B: cao Dương Cam

Cúc trong (1) thuốc thử NaOH/MeOH, (2) soi UV 254 nm

Hình 3.5 Kết quả đánh giá liposome chứa cao và tinh dầu DCC điều chế bằng

phương pháp hydrat hóa màng phim lipid: (A) phân bố kích thước hạt, (B) sắc ký lớp

mỏng giữa cao toàn phần (bên trái) và cao chiết từ liposome (bên phải), (C) tinh dầu

DCC – vết 2, P90G – vết 3 và tinh dầu DCC từ liposome – vết 4

44

Hình 3.6 Kết quả phân bố cỡ hạt của các công thức C1 (1), C2 (2), C3 (3), C4 (4) 48 Hình 3.7 Kết quả đánh giá phân bố cỡ hạt của các công thức có tỉ lệ lipid khác nhau 49 Hình 3.8 Kết quả đánh giá phân bố cỡ hạt của các công thức chứa Tween 80 khác

Hình 3.11 (a) Sắc ký đồ mẫu trắng, (b) sắc ký đồ mẫu placebo-LPS, (c) sắc ký đồ

mẫu chuẩn, (d) sắc ký đồ mẫu tự tạo – LPS, (e) sắc ký đồ mẫu thử LPS – DCC

58

Hình 3.12 (a) Phổ UV-Vis và biểu đồ minh họa độ tinh khiết pic A7G trong mẫu

chuẩn, (b) trong mẫu thử LPS – DCC

58

Hình 3.16 Sắc ký đồ mẫu thử LPS – DCC do người phân tích 1 chuẩn bị (a), Sắc ký

đồ mẫu thử LPS – DCC do người phân tích 2 chuẩn bị (b)

61

Hình 3.17 (a) Sắc ký đồ mẫu tự tạo – LPS thêm chuẩn 80%, (b) Sắc ký đồ mẫu tự tạo

– LPS thêm chuẩn 100%, (c) Sắc ký đồ mẫu tự tạo – LPS thêm chuẩn 120%

62

Hình 3.18 Sắc ký khối phổ của (A) Guaizulene đối chiếu, (B) tinh dầu DCC, (C) sắc

ký đồ của mẫu placebo không có Borneol và Guaizulene, (D) mẫu LPS đã xử lý có

Borneol và Guaizulene, (E) LPS chưa xử lý, (F) Borneol đối chiếu

63

Hình 3.19 Sơ đồ điều chế LPS-DCC bằng phương pháp tiêm ethanol 66 Hình 3.20 Gel liposome (1) trước khi cách thủy; (2) sau khi cách thủy ở 600C 68 Hình 3.21 Sơ đồ phương pháp bào chế gel liposome DCC 69 Hình 3.22 Hình chụp TEM của gel liposome sau khi hòa với nước (1:1) 71 Hình 3.23 Sắc ký lớp mỏng của (1) Tinh dầu nguyên liệu, (2) Gel liposome DCC với

hệ dung môi triển khai CHCl3: Toluen (75:25) với thuốc thử Anisaldehyd

72

Hình 3.24 (a) Sắc ký đồ mẫu trắng, (b) sắc ký đồ mẫu placebo – gel, (c) sắc ký đồ

mẫu chuẩn, (d) sắc ký đồ mẫu tự tạo – gel, (e) sắc ký đồ mẫu gel LPS – DCC

74

Hình 3.25 Phổ UV – Vis và biểu đồ minh họa độ tinh khiết pic A7G trong mẫu

chuẩn (a) và trong mẫu gel LPS – DCC (b)

74

Hình 3.27 (a) Sắc ký đồ mẫu thử gel LPS – DCC do người phân tích 1 chuẩn bị, (b)

Sắc ký đồ mẫu thử LPS – DCC do người phân tích 2 chuẩn bị

76

Hình 3.28 (a) Sắc ký đồ mẫu tự tạo – gel thêm chuẩn 80%, (b) sắc ký đồ mẫu tự tạo

– gel thêm chuẩn 100%, (c) sắc ký đồ mẫu tự tạo – gel thêm chuẩn 120%

77

Hình 3.29 Kết quả thử nghiệm đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí với nồng độ pha loãng

chất thử 1/10

78

Hình 3.30 Kết quả thử nghiệm tìm Staphylococcus aureus và Pseudomonas

aeruginosa trong môi trường nuôi cấy sau 72 giờ

78

Hình 3.31 Kết quả thử nghiệm tìm Enterobacteria 79 Hình 3.32 Kết quả thử nghiệm đếm tổng số nấm mốc, nấm men 79 Hình 3.33 Kết quả định tính khả năng kháng khuẩn 80

Hình 3.35 Kết quả đánh giá độ sưng phù chân chuột vào ngày thứ tư 81

PHẦN MỞ ĐẦU

THUYẾT MINH ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI

1 Tên đề tài: Nghiên cứu bào chế mỹ phẩm "Gel Dương Cam Cúc(Matricaria

chamomilla L.)-Liposomes" hỗ trợ điều trị da bị viêm và dị ứng

2 Mã số:

3 Dạng đề tài: R&D

4 Thời gian thực hiện: 36 tháng kể từ ngày được phê duyệt

5 Tổng kinh phí: 746.000.000 VNĐ (bảy trăm bốn mươi sáu triệu đồng), trong

đó:

a Từ ngân sách sự nghiệp khoa học của thành phố: 676.000.000 VNĐ

b Từ nguồn khác: (tài trợ của công ty TNHH ANH TÚ) 70.000.000 VNĐ

6 Chương trình đăng ký: Vật liệu mới và Công nghệ Dược

Tự đề xuất

7 Chủ nhiệm đề tài:

 Họ và tên: Trần Văn Thành

 Chức vụ: Giảng viên

 Tên cơ quan đang công tác: Khoa Dược – đại học Y Dược TP.HCM

 Địa chỉ cơ quan: 41, Đinh Tiên Hoàng, Q.1., TP.HCM

 Địa chỉ nhà riêng: B502, chung cư Him Lam, đường số 14, ấp 4B, Bình Hưng, Bình Chánh

 Điện thoại di động : 0919 000 008 E-mail: thanhpharm@gmail.com

8 Cơ quan chủ trì đề tài

 Tên cơ quan chủ trì đề tài Trung Tâm Khoa học Công nghệ dược Sài Gòn (SARPHARCEN)

 Điện thoại: 08 3829 5641

 Địa chỉ: 41 Đinh Tiên Hoàng, Quận 1, TP Hồ Chí Minh

 Số tài khoản: 3713.0.3017044.00000 tại Kho bạc Nhà Nước

 Mã quan hệ ngân sách: 3017044

BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU

Tên đề tài: NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ MỸ PHẨM "GEL DƯƠNG CAM CÚC

(Matricaria chamomilla L.) – LIPOSOMES" HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ DA BỊ VIÊM VÀ DỊ

ỨNG

Chủ nhiệm đề tài: TS Trần Văn Thành

Nhóm nghiên cứu: PGS.TS Huỳnh Văn Hóa

TS Trần Anh Vũ

TS Trần Văn Thành

Cơ quan chủ trì: Trung tâm khoa học công nghệ Dược Sài Gòn

Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 12/2013 đến tháng 12/2016

Mục tiêu theo đề cương đã duyệt

Đề tài nhằm mục đích ứng dụng công nghệ liposome để bào chế được chế phẩm gel Dương cam cúc – liposomes dưới dạng mỹ phẩm dùng trên da bị viêm và dị ứng Bốn mục tiêu chính của đề tài bao gồm:

- Xây dựng được công thức bào chế bán thành phẩm liposome có chứa tinh dầu và cao DCC (DCC-LPS) đạt kích thước nano

- Nghiên cứu bào chế và đánh giá chế phẩm gel DCC-LPS ở quy mô phòng thí nghiệm

- Nghiên cứu nâng cấp cỡ lô nghiên cứu

- Theo dõi độ ổn định của chế phẩm gel DCC-LPS

Những nội dung theo đề cương đã duyệt:

Danh mục sản phẩm khoa học và công nghệ dạng kết quả III, IV

ký

Kết quả đã đạt được

Danh mục sản phẩm khoa học và công nghệ dạng kết quả I, II

TT Tên sản phẩm đã đăng

ký

Số lượng và chỉ tiêu kinh tế - kỹ thuật đã đăng ký

Kết quả đã đạt được

cao DCC, tinh dầu DCC

theo tiêu chuẩn cơ sở

1 Kết quả kiểm nghiệm cao DCC và tinh dầu DCC đạt tiêu chuẩn cơ sở

Bảng kết quả kiểm nghiệm cao DCC đạt tiêu chuẩn cơ

- Khả năng tải ít nhất 10% cao DCC và 5%

tinh dầu DCC

- Đạt tiêu chuẩn cơ sở đề

ra như độ ổn định, khả năng tải DCC

Đã điều chế được trên 50

mẻ thí nghiệm 50 ml hệ phân tán DCC-LPS có kích thước hạt nhỏ dưới 400 nm (khoảng 140 nm), có khả năng tải ít nhất 10% cao DCC (12%) và 5% tinh dầu DCC (100% tinh dầu được bắt giữ trong liposome) dựa trên sự qui đổi về chất chuẩn trong cao DCC và tinh dầu DCC

Đạt độ ổn định trong vòng 1 tuần ở điều kiện 2-8°C

bào chế bán thành phẩm

DCC-LPS

1 Công thức và qui trình để đạt được DCC-LPS đạt yêu cầu như đã nêu trên

Công thức bào chế bán thành phẩm DCC-LPS Qui trình bào chế bán thành phẩm DCC-LPS

thành phẩm DCC-LPS

1 Bảng tiêu chuẩn cơ sở

Bảng tiêu chuẩn cơ sở cho bán thành phẩm DCC-LPS

Bào chế được gel DCC-LPS

ở qui mô phòng thí nghiệm đạt chỉ tiêu cơ sở đề ra về độ dàn mỏng, khả năng bám dính trên da, định tính, định lượng

DCC-LPS

1 Bảng tiêu chuẩn cơ sở

Bảng tiêu chuẩn cơ sở của sản phẩm

của sản phẩm

bào chế gel DCC-LPS ở

qui mô phòng thí nghiệm

Công thức bào chế gel DCC-LPS

Qui trình bào chế gel DCC-LPS

Công thức bào chế gel DCC-LPS

Qui trình bào chế gel LPS

cứu

2kg gel DCC-LPS đạt tiêu chuẩn cơ sở

Đã bào chế được gel LPS ở qui mô 2kg đạt chỉ tiêu chất lượng giống sản phẩm

lô nghiên cứu liên tiếp khác nhau không có ý nghĩa thống kê

Công thức bào chế gel DCC-LPS qui mô 2kg Qui trình bào chế gel DCC-LPS qui mô 2kg

Tiến hành điều chế 3 lô liên tiếp, kết quả không khác biệt

viêm, kháng khuẩn, giữ

ẩm da, làm sạch da

Kết quả đánh giá tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn, giữ ẩm da, làm sạch da

Sản phẩm có tác dụng kháng viêm nhẹ, kháng khuẩn, giữ ẩm da, làm sạch

Sản phẩm đạt độ ổn định sau 12 tháng ở điều kiện bảo quản thường

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 DƯƠNG CAM CÚC

Tại Việt Nam, Dương cam cúc (Matricaria chamomilla L.) (DCC) đã được di thực từ

những năm 60 Năm 1978, Trung tâm trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt đã bước đầu nghiên cứu thành công kỹ thuật trồng di thực Hiện nay, tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu bào chế các sản phẩm từ DCC chưa nhiều, chủ yếu do nhóm nghiên cứu của

TS Trần Anh Vũ, khoa Dược, đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh thực hiện Các công bố này thuộc đề tài nghiên cứu sinh của TS Trần Anh Vũ Đề tài này đã công bố hai dạng bào chế đi từ cao toàn phần và tinh dầu DCC là kem thoa da và gel rửa [1,2,3,4] Trên thế giới, nghiên cứu về DCC chủ yếu tập trung vào việc phân lập các hoạt chất [5], ứng dụng trong thực phẩm [6] hay thử nghiệm hoạt tính trị liệu dựa trên thành phần hoạt chất phân lập được [7,8] DCC còn được bán dưới dạng dược liệu khô, cao toàn phần hoặc dầu chiết được từ DCC [9] Ứng dụng chủ yếu hiện nay của DCC là điều chế thành

các loại mỹ phẩm (Hình 1.1.)

Hình 1.1 Các dạng mỹ phẩm chứa Dương cam cúc: (A) dịch cất chứa tinh dầu DCC

dùng rửa mặt, (B) sản phẩm tẩy trang, (C) gel rửa, (D) và (E) kem thoa dưỡng da kết hợp nhiều thành phần giúp phục hồi da tổn thương và giảm nếp nhăn trên da

1.1.1 Thành phần hóa học

1.1.1.1 Tinh dầu Dương cam cúc

Tinh dầu Dương cam cúc có thể được điều chế bằng phương pháp cất kéo hơi nước hoặc bằng phương pháp CO 2 siêu tới hạn từ hoa khô Dương cam cúc Hàm lượng tinh dầu thay đổi từ 0,2- 1,8% Thành phần có hoạt tính sinh học mạnh nhất trong tinh dầu DCC là chamazulen, guaizulen

và α- bisabolol (Hình 1.2.) Ngoài ra trong tinh dầu DCC còn có các terpen hydrocarbon,

sesqniterpen (farnesen, cadinen), sesquiterpen alcol (bisabolol), một alcol ceton chưa no

C 15 H 24 O 2 , oxyd bisabolol C 13 H 26 O 2 , furfural và parafin

a.Bisabolol oxid A b.Bisabolol oxid B c.α-bisabolol d.Chamazulen

Hình 1.2 Công thức cấu tạo các thành phần hóa học chính trong tinh dầu DCC

Các phương pháp định tính và định lượng tinh dầu Dương cam cúc được đề cập trong

Phương pháp định lượng hàm lượng -bisabolol và chamazulen trong tinh dầu Dương cam cúc bằng thiết bị sắc ký khí sử dụng trong nội dung này đã được thẩm định và sử dụng trong công bố khoa học trước đó (1)

Định tính bằng sắc ký lớp mỏng

Định tính tinh dầu DCC bằng sắc ký lớp mỏng trong BP, USP được trình bày trong Bảng

1.1 Điều kiện tiến hành và kết quả định tính yêu cầu tương tự nhau

Bảng 1 1 So sánh định tính tinh dầu theo USP 38 và BP 2016

Thuốc thử phát hiện Anisaldehyd

bornyl acetat, borneol

mẫu chuẩn

1.1.1.2 Cao Dương cam cúc

Fabiana và cộng sự phân tích thành phần dịch chiết hoa DCC bằng sắc ký điện di mao

quản, xác định được 11 hợp chất phenolic hoạt tính sinh học thể hiện trong Bảng 1.2 và

Hình 1.3

Bảng 1 2 Hợp chất phenolic có hoạt tính sinh học trong cao DCC

luteolin-7-O-glucoside); flavonol (quercetin, rutin) và flavanone (naringenin)

Hình 1.3 Công thức cấu tạo các hoạt chất có hoạt tính sinh học trong cao DCC

Các phương pháp định tính định lượng flavonoid của hoa DCC được đề cập đến trong USP, BP (2,3,7,8,9)

Bảng 1 3 So sánh định tính flavonoid theo BP 2016 và Eu Phar 8

Sắc ký đồ chuẩn có vết phía trên là apigenin, vết giữa là apigenin-7-glucosid

Sắc ký đồ thử có 2 vết tương đương mẫu chuẩn

Định tính bằng phản ứng hóa học

Định tính thành phần flavonoid trong cao DCC bằng các thuốc thử chung

Định tính bằng sắc ký lớp mỏng

Định tính flavonoid bằng sắc ký lớp mỏng theo Bảng 1.3

Định tính định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Trong USP 38, BP 2016, định lượng apigeni-7-glucosid dựa vào diện tích hay chiều cao đỉnh của mẫu khảo sát so với mẫu chuẩn trong điều kiện thực nghiệm Điều kiện định lượng apigenin-7-glucosid theo như bảng với thiết bị nghiên cứu dùng đã được thẩm định

chi tiết và đầy đủ trong công bố khoa học trước đó (Bảng 1.4.)

Bảng 1 4 Điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao định lượng hàm lượng

apigen-7-glucosid trong cao toàn phần DCC

Chi tiết

phosphoric loãng đến pH = 2,55 và hỗn hợp acetonitril-methanol (65:35)

1.1.2.1 Tinh dầu dương cam cúc

Tinh dầu DCC ức chế in vitro Staphylococus aureus, Bacillus subtilis, ức chế những vi

khuẩn gram (+) mạnh hơn so với vi khuẩn gram (-) và ức chế sự nảy mầm của bào tử các men, mốc, nấm da thử nghiệm

Tác dụng chống viêm của tinh dầu cùng với cao DCC và những thành phần phân lập

trong nhiều nghiên cứu in vivo đã được chứng minh trên sốt gây bởi men bia ở chuột

cống trắng và ban đỏ gây ra bởi tia tử ngoại ở chuột lang

1.1.2.2 Cao dương cam cúc

Cao DCC ức chế sự phát triển in vitro của Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans,

Leptospira icterohemorrhagiae, Strepsalivarius, Bacillus megatherium Cao DCC ức chế

in vitro cả cyclooxygenase và lipoxygenase và do đó ức chế sự tạo thành prostaglandin

và leukotrien là những chất gây viêm Cao toàn phần DCC có tác dụng chống viêm khi dùng tại chỗ (1)

Những thành phần chính chống viêm và chống co thắt của DCC là những hợp chất terpen: matricin, chamazulen, (-) –α-bisabolol oxyd A và B, và (-)-α-bisabolol Cao toàn phần DCC và phân đoạn flavonoid rất có hiệu quả làm giảm viêm tại chỗ

Hoạt tính chống co thắt của DCC được quy cho apigenin, apigenin-7-glucosid và bisabolol, có hoạt tính tương tự papaverin

(-)-α-Cao DCC có tác dụng làm giảm kích thước của vết thương và làm khô vết thương nhanh hơn trong sự tái biểu mô hóa và sự chảy nước của vết thương

1.2 LIPOSOME

1.2.1 Tình hình nghiên cứu về liposome trên thế giới và tại Việt Nam

Trên thế giới

Liposome là những tiểu phân nhân tạo hình cầu có kích thước nano được cấu tạo cơ bản

từ các thành phần phospholipd tự nhiên và cholesterol Năm 1961, nhà khoa học người Anh Alec D Bangham đã phát hiện ra rằng khi các phân tử phospholipd kết hợp với nước sẽ lập tức hình thành những quả cầu được cấu tạo bởi những màng kép do cấu trúc phân tử phospholipd với một đầu phân tử hòa tan được trong nước, trong khi đó đầu kia của phân tử không hòa tan trong nước [10] Từ đó, các thế hệ liposome khác nhau đã

được điều chế và nghiên cứu ứng dụng (Hình 1.4.)

Bảng 1 5 Một số chế phẩm liposome trên thị trường thế giới

* Tính theo năm được chấp thuận bởi FDA

Liposome thường quy bao gồm các phân tử lipid, trong đó hoạt chất thân nước được bao bọc trong lõi thân nước, các hoạt chất thân dầu nằm giữa các lớp lipid Để tăng thời gian liposome lưu lại trong cơ thể, các phân tử polymer thân nước (thường dùng nhất là PEG) được gắn kết lên bề mặt liposome Ngoài ra, nhằm định hướng vào các tế bào ung thư, tấn công các phân tử ADN để phá hủy quá trình tự nhân đôi tế bào, các liposome với các phân tử lipid tích điện dương cũng được sử dụng Trong các ứng dụng về mỹ phẩm, liposome dạng thường quy được sử dụng nhiều nhất trong các dạng dùng ngoài

Nghiên cứu về liposome trong bào chế dược phẩm không chỉ dừng lại ở việc công bố trên hàng chục ngàn bài báo khoa học mà đã tiến đến bào chế các dược phẩm, mỹ phẩm ứng dụng trong thực tiễn Một số ví dụ về chế phẩm liposome trên thị trường được trình bày

trong Bảng 1.5 Riêng tổng lợi nhuận mang về của ba sản phẩm 1, 2 và 3 trong năm 2010

đã mang về là 1,04 tỉ USD tại thị trường Mỹ

Hình 1.4 Cấu trúc của các loại liposome khác nhau (A) dạng liposome thường quy, (B)

dạng liposome có gắn chuỗi polymer thân nước trên bề mặt, (C) dạng liposome biến đổi cấu tạo từ các polymer lưỡng tính và (D) dạng liposome tích điện dương phù hợp cho việc vận chuyển các hoạt chất vào trong tế bào tác dụng trên các ADN tích điện âm [13] Trong suốt thập kỷ qua, hệ phân tán liposome được dùng nhiều như là chất mang trong các dạng dược mỹ phẩm để chăm sóc da hay trị bệnh về da [10,11], đã có nhiều nghiên cứu chứng minh rằng, liposome bào chế dưới dạng thuốc mềm bôi qua da có nhiều ưu điểm hơn các công thức truyền thống Trước hết, dạng liposome dùng ngoài giúp hạn chế tác dụng phụ của thuốc và tương kỵ giữa các thành phần công thức Liposome giúp hạn chế kích ứng do cấu trúc màng phospholipid của liposome đồng thời cũng là cấu trúc màng sinh học của cơ thể sống, do vậy liposome có tính an toàn cao [11] Đặc biệt, liposome có khả năng làm thay đổi dược động học của hoạt chất, khi dùng bôi ngoài da liposome làm tăng đáng kể lượng thuốc hấp thu qua da và duy trì tác động lâu hơn so với dạng bào chế thông thường, nhờ vào ái lực của liposome với lớp thượng bì [12] Ngoài

ra, khác với các dạng bào chế truyền thống, lipsome là chất mang hữu hiệu có thể đưa cả hoạt chất thân nước, hoặc sơ nước hấp thu qua da, nhờ vào cấu trúc túi lipid kép Các dược chất hoà tan trong nước được giữ ở các lõi thân nước bên trong, cũng như các dược chất hoà tan trong dầu được gắn kết với lớp màng phospholipid kép

Tại Việt Nam

Trong giai đoạn trước năm 2000, do giới hạn về trang thiết bị nghiên cứu, kinh phí đầu tư

và nguồn nhân lực nên các nghiên cứu về liposome hầu như không có Từ sau năm 2000, các nghiên cứu về liposomes đã được tiến hành và bắt đầu có một số công bố trên tạp chí quốc gia hoặc các đề tài khóa luận, luận văn Điển hình là các công bố tạo liposome chứa các hoạt chất như doxorubicin, acyclovir, nifedipin của nhóm nghiên cứu đại học Dược

Hà Nội Ngoài ra, nghiên cứu bào chế liposome chứa Etoposide và Paclitaxel thuộc nhóm

đề tài đặt hàng nghiên cứu của chương trình quốc gia KC.10/11-15 bắt đầu thực hiện từ năm 2014

Trên thị trường dược phẩm Việt Nam, các chế phẩm liposome trước đây hoàn toàn được nhập khẩu Hiện nay có một số nhà máy sản xuất đã liên doanh với các xí nghiệp dược

phẩm nước ngoài để sản xuất chế phẩm liposome Tuy nhiên, sản phẩm liposome do chính Việt Nam sản xuất hoàn toàn chưa có

1.2.2 Phân loại

Dựa vào thông số cấu trúc (kích thước và số lớp vỏ của liposome)

- Liposome một lớp (màng đơn): vỏ chỉ có 1 lớp phospholipid

+ Loại nhỏ: SUV (small unilamellar vesicle): có đường kính từ 20-50 nm

+ Loại vừa: MUV (medium unilamellar vesicle): có đường kính từ 40-80 nm +Loại lớn: LUV (large unilamellar vesicle) :có đường kính từ 100-1000 nm

- Liposome nhiều lớp (màng đa): MLV (multiamellar vesicle): gồm nhiều lớp lipid nhiều ngăn nước đồng tâm, kích thước 400-3500 nm

Dựa vào thời gian tồn tại của liposome trong tuần hoàn cơ thể

- Liposome thường: có thời gian tồn tại trong tuần hoàn ngắn từ vài giờ đến vài ngày

- Liposome phóng thích kéo dài: độ ổn định cao hơn, tồn tại trong tuần hoàn từ vài ngày đến vài tuần

Dựa vào mục đích trong lâm sàng

Liposome dùng trong chẩn đoán bệnh, điều trị bệnh, công nghệ mỹ phẩm

Dựa vào đặc tính tích điện của bề mặt liposome

Liposome có bề mặt tích điện dương, bề mặt tích điên âm hay bề mặt không tích điện

Các liposome đặc biệt

- Liposome hướng đích: do đặc điểm kích thước và bề mặt gắn thêm các ligand như: gắn PEG, heparin, folate, kháng thể, transferrin, peptid… hướng tới tập trung và phóng thích tại đích

- Liposome nhạy cảm (cảm biến) với nhiệt độ, pH, từ tính, năng lượng quang học

- Liposome vector: mang gene, mang enzyme hay mang hemoglobin vận chuyển oxygen

- Virosome (liposome có bề mặt cải tiến dung hợp với vỏ protein virus tăng khả năng thấm tế bào) dùng trong sản xuất vaccine

1.2.3 Thành phần cấu tạo liposome

Thành phần chính của liposome là phospholipid (Hình 1.5.) gồm các loại:

- Phospholipid tự nhiên: phosphatidylcholine (lecithin của trứng hoặc đậu nành), phosphatidyl serin L, γ-phosphatidyl choline dilauryl…

- Phospholipid tổng hợp: phosphatidyl inositol, dipalmitoyl phosphatidylcholine, dipalmoyl phosphatidyl ethanolamine, distearoyl phosphatidyl choline, dioleoyl phosphatidyl choline…

- Phospholipid được gắn với chất mang phù hợp với mục đích bào chế liposome như phospholipid gắn với polyethylene glycol, polyvinyl pyrolidone, polyacryl amid, poly (2-methoxy–2-oxazolin)…

- Cholesterol và dẫn chất được thêm vào phospholipid trong bào chế liposome với tỉ lệ phù hợp Cholesterol có tác dụng làm tăng tính ổn định của lớp vỏ liposome Trong cấu trúc màng kép của liposome, phospholipid và cholesterol tương tác liên kết với nhau qua

các cầu nối acyl

Ngoài ra, trong quá trình bào chế lớp vỏ liposome còn có các thành phần khác như: + Chất tích điện: tạo lực đẩy tĩnh điện giữa các lớp vỏ của liposome nhằm tăng dung tích khoang nước, do đó làm tăng khả năng đưa các dược chất thân nước vào liposome Chất làm liposome tích điện âm như acid phosphatidic, dicetyl phosphate… Chất tích điện dương như stearylamin

+ Các ligand (phối tử) như folate, kháng thể…

a Phosphatidylcholine c Phosphatidyl inositol

b Phosphatidylserin d Dipalmitoyl phosphatidylcholine

Hình 1.5 Cấu trúc của một vài phospholipid tự nhiên và tổng hợp

+ Liposome trơ về mặt sinh học và hoàn toàn phân hủy sinh học

+ Dạng thuốc liposome có thể vận chuyển được nhiều dược chất tan trong nước cũng như dược chất tan trong dầu

+ Cấu trúc màng phospholipid của liposome tương tự cấu trúc màng sinh học của cơ thể sống, không có độc tính, tính kháng nguyên, tính sinh nhiệt nên liposome là chế phẩm y học có tính an toàn cao

+ Liposome có thể điều chế với kích thước, thành phần khác nhau tùy theo ứng dụng + Liposome có thể thay đổi hoàn toàn các đặc điểm dược động học của hoạt chất, cải thiện sinh khả dụng của dược chất hơn hẳn so với việc dùng thuốc dạng tự do phải qua quá trình dược động học thông thường

+ Liposome có tác dụng bảo vệ và giải phóng hoạt chất một cách có kiểm soát

+Trong điều trị ung thư, liposome hướng thuốc tới đích là tế bào ung thư, hạn chế thuốc

ảnh hưởng đến tế bào lành

+ Với vai trò là chất mang, lipospme phát huy tốt khả năng chứa và vận chuyển những vật chất như gene, hemoglobin, mà dạng thuốc khác không thể làm được hoặc không hiệu quả bằng

- Độ ổn định của dạng phân tán lỏng liposome không cao, chủ yếu do tác động của nhiệt

độ Do đó thông thường dạng liposome cần được ổn định thông qua các tác động của tá dược tạo điện tích, tạo sự cản trở không gian, tá dược tạo sự vững chắc của màng hoặc phối hợp vào các chế phẩm như gel hoặc kem

1.2.5 Phương pháp bào chế

1.2.5.1 Phương pháp Bangham (phương pháp hydrat hóa film)

Tên gọi khác: Phương pháp cất quay

Đây là phương pháp được sử dụng nhiều vì tính tiện ích, không đòi hỏi thiết bị cao, dễ bổ sung cải tiến

- Siêu âm với tần số phù hợp hoặc dùng sắc ký cột lọc gel

- Kết hợp quá trình đông lạnh- rã đông tuần hoàn: liposome sau khi bào chế đem đông lạnh ở nhiệt độ rất thấp sau đó rã đông ở nhiệt độ cao trên nhiệt độ chảy của lipid, lặp lại 5-10 vòng

1.2.5.2 Phương pháp Batzri và Korn

Tên khác: Phương pháp hòa tan ethanol, phương pháp tiêm

Nguyên tắc:

+ Hòa tan phospholipid và các thành phần tạo màng vào ethanol

+ Bơm nhanh dung dịch ethanol vào dung dịch kali clorid 0.1 -0.2 M (hoặc dung dịch khác tương đương ví dụ các hệ đệm) sẽ tạo thành liposome

+ Siêu lọc để loại ethanol và tinh chế liposome

Hạn chế:

Liposome kích thước không đều, một số lipid không tan trong ethanol, khó loại hoàn toàn ethanol ra khỏi hệ phân tán liposome

1.2.5.3 Phương pháp Deamer và Bangham

Khác phương pháp Batzri và Korn, người ta thay thế ethanol bằng ether

Nguyên tắc:

+ Hòa tan các thành phần tạo màng liposome vào ether

+ Bơm từ từ dung dịch ether vào dung dịch nước từ phía đáy

+ Bốc hơi ether tạo liposome có kích thước lớn

Ưu điểm: dễ thực hiện, dễ loại ether ra khỏi hỗn hợp liposome

Hạn chế: hiệu suất thấp, kích thước liposome lớn, dược chất phải tiếp xúc với nhiệt

1.2.5.4 Phương pháp Szoka và Papahadjopoulos

Tên khác: Phương pháp bốc hơi pha đảo

Nguyên lý của phương pháp là do sự hình thành của các giọt nước bao quanh bởi dung dịch lipid trong dung môi hữu cơ

Nguyên tắc:

+ Hòa tan phospholipid trong dung môi hữu cơ (hay dùng ether)

+ Thêm dung dịch nước, siêu âm ở tần số phù hợp tạo nhũ tương mịn nước/dầu

+ Bốc hơi dung môi hữu cơ dưới áp suất giảm thu liposome một hay nhiều lớp

Hạn chế: hiệu suất thấp, liposome có kích thước tiểu phân lớn, không phù hợp với dược chất không bền với nhiệt và năng lượng siêu âm

1.2.5.5 Phương pháp pha loãng polyol

Nguyên tắc:

+ Hòa tan các lipid trong các polyol (propylene glycol, ehthylen glycol…) ở nhiệt độ cao + Thêm dung dịch đệm phosphat ở cùng nhiệt độ

+ Pha loãng hệ phân tán này bằng dung dịch đệm đến thể tích thích hợp

+ Khuấy kỹ ở nhiệt độ cao, rồi làm lạnh ở nhiệt độ phòng

+ Ép lọc nhiều lần qua màng polycarbonate với kích thước nhỏ dần (lọc bậc thang) sẽ thu được liposome

Ưu điểm: dễ thực hiện

Hạn chế: liposome có kích thước tiểu phân lớn, phân bố kích thước không đồng đều

1.2.5.6 Phương pháp hòa tan và thẩm tách chất diện hoạt

Chất diện hoạt dùng có thể là anion, cation hoặc trung tính

Trước hết, bào chế micel chất diện hoạt-lipid theo các cách sau:

- Các dung dịch đậm đặc lipid trong dung môi hữu cơ được phân tán trong dung dịch đậm đặc chất diện hoạt để tạo thành các hạt micel, làm bay hơi dung môi hữu cơ thu được các micel

- Tráng phim các lipid, sau khi bay hơi hết dung môi hữu cơ hydrat hóa bằng dung dịch chất diện hoạt đậm đặc thu được các micel

Sau đó pha loãng hỗn hợp micel trên bằng dung dịch thân nước hoặc dung dịch đệm có

pH phù hợp Khuấy kỹ hỗn hợp này sẽ hình thành các liposome Sau đó loại bỏ chất diện hoạt bằng cách lọc thẩm tách sẽ thu được các liposome có kích thước lớn, vỏ nhiều lớp

Có thể dùng các kỹ thuật làm giảm kích thước và số lớp vỏ liposome như ép đùn bậc thang dưới áp lực cao qua các màng lọc có cỡ lọc giảm dần hoặc siêu âm với tần số thích hợp

Hạn chế: khó loại bỏ hoàn toàn chất diện hoạt

Ngoài ra còn có các phương pháp khác như phương pháp đông khô, phương pháp vi hóa lỏng, phương pháp màng tiếp hợp, phương pháp phun hỗn hợp chất lỏng hòa tan trong khí siêu tới hạn, phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới hạn cũng được sử dụng để điều chế liposome

1.2.6 Dạng bào chế gel liposome

Các dạng thuốc mềm bào chế theo kỹ thuật truyền thống thường có kích thước tiểu phân lớn hơn micromet, thường giới hạn khả năng giải phóng hoạt chất và giới hạn khả năng thấm sâu, khả năng kéo dài tác dụng trên da kém Do đó, người dùng phải bôi nhiều lần, gây bất tiện trong quá trình điều trị cũng như không mang lại hiệu quả kinh tế Do vậy, một dạng thuốc bào chế mới chứa các tiểu phân có kích thước siêu nhỏ cỡ nanomet giúp chế phẩm đạt độ đồng nhất cao và thuốc có thể thấm sâu và kéo dài tác dụng trên da là một yêu cầu cấp thiết của bào chế hiện đại, đó cũng là lý do các nhà nghiên cứu bào chế dạng gel liposome

Phương pháp bào chế gel liposome

Để bào chế gel liposome, trước tiên hệ phân tán liposome được tiến hành điều chế bằng các phương pháp thích hợp Hệ phân tán liposome sau khi điều chế phải đạt yêu cầu về kích thước tiểu phân, khả năng bắt giữ hoạt chất, điện thế bề mặt, hình dạng, độ ổn định hoạt chất, độ ổn định vật lý của tiểu phân

Hệ phân tán liposome sẽ được kết hợp với tá dược tạo gel bằng một trong hai phương pháp sau:

+ Phân tán tá dược tạo gel vào hệ liposome, khuấy đều trương nở tá dược tạo gel

+ Hệ gel đã được bào chế bằng cách gel hóa tá dược tạo gel thích hợp, có thể tiến hành trộn hệ phân tán liposome với gel bằng máy khuấy từ với tốc độ vòng và thời gian xác định Gel liposome sau khi bào chế cũng được tiến hành đánh giá như gel thông thường

Gel liposome cải tiến với sự hiện diện của các polymer thông minh

Một trong những lý do làm cho liposome chưa được đưa vào sản xuất hàng loạt là vấn đề

ổn định của chế phẩm Trong quá trình bảo quản,liposome không bền cả về mặt hóa học

và vật lý

- Về hóa học: Phospholipid, thành phần chính của vỏ liposome là hợp chất dễ bị oxi hóa Quá trình oxy hóa tăng nhanh do tác động của các yếu tố: nhiệt độ, ánh sáng, ion kim loại, pH môi trường…

- Về vật lý: có hiện tượng giảm tính thấm của vỏ liposome trong quá trình bảo quản gây

rò rỉ dược chất và sự kết vón liposome làm thay đổi động học giải phóng dược chất khi dùng [2]

Bào chế gel liposome với sự hiện diện của các polymer thông minh được mô tả lần đầu tiên vào năm 1996 Phương pháp này được đánh giá cao bởi vì giúp liposome ổn định trong chế phẩm Sự hiện diện của các polymer , ở đây là copolymer khối kiểu ABA, hay những copolymer khối không thuộc kiểu ABA thân nước được chuyển thành dạng sơ nước, chính phần thân nước của polymer (ví dụ PEG) đã làm nới rộng khoảng cách giữa hai tiểu phân liposome trong hệ phân tán liposome, dễ dàng hình thành cầu nối Phần kỵ nước còn lại của polymer (ví dụ stearic acid hay cholesterol) sẽ nhanh chóng, tự động

chèn vào màng kép của tiểu phân liposome (Hình 1.6.) Theo cách này, các polymer

thông minh đã tạo nên một cấu trúc nano phức tạp hơn Sự xuất hiện của nhiều polymer

sẽ tạo nên mạng lưới ba chiều kết nối các tiểu phân liposome (Hình 1.7.)

A: phần sơ nước ( như cholesterol (chol) hay acid stearic)

B: phần thân nước ( như polyethylene glycol (PEG))

Hình 1.6 Mặt cắt ngang 2 liposome với 1 polymer thân nước được chuyển dạng thành sơ

nước (loại ABA)

Hình 1.7 Mặt cắt ngang của gel tạo thành với vài liposome và 1 polymer thân nước được

chuyển dạng thành sơ nước (loại ABA)

1.2.7 Đánh giá kết quả các công trình nghiên cứu đã công bố về thành phẩm DCC

Trên thế giới

Đối với các công trình đã công bố trên thế giới, các nghiên cứu không tập trung vào DCC

di thực mà phân tán trên nhiều cây Cúc cùng họ Nghiên cứu phân lập hoạt chất trên

DCC di thực (Matricaria chamomilla L.) được công bố trên các tạp chí Science Direct

chưa đến 30 bài báo Ngoài ra còn gần khoảng 30 bài báo trên tạp chí Science Direct về các thử nghiệm dược lý từ các chiết xuất từ DCC, trong số đó, không có công trình nào

liên quan đến việc bào chế thành phẩm cụ thể

Một số sản phẩm tiêu biểu hiện có trên thế giới được trình bày trong Bảng 1.6 DCC

thường được sử dụng dưới dạng tinh dầu hoặc phối hợp vào các mỹ phẩm dùng trên da

Tại Việt Nam

Đối với các công bố trong nước, nhóm nghiên cứu TS Trần Anh Vũ tập trung vào vấn đề nguyên liệu từ việc trồng trọt, thu hái, chế biến, bảo quản cho đến phân lập cao toàn phần, tinh dầu từ nguyên liệu DCC Các kết quả khởi đầu nhằm đảm bảo nguồn nguyên liệu ổn định và có chất lượng Vấn đề tiếp theo là tiến hành bào chế các sản phẩm hiệu quả ứng dụng trên thị trường: kem thoa da và gel rửa

Thành phẩm kem thoa da bao gồm 2% cao DCC, 0,5% tinh dầu DCC và 1% dầu Nghệ Tác dụng kháng viêm chống sưng phù chân chuột thể hiện rõ ở ngày thứ tư của đợt điều trị (giảm hơn 1/2 so với lô chứng) Ngoài ra kem này còn có tác dụng trên các chủng vi

khuẩn gây bệnh ngoài da, MIC trên Streptococcus haemolyticus  là 6,4 g/ml, tác dụng mạnh hơn trên Staphylococcus aureus MIC đạt 1,6 g/ml, đặc biệt có tác dụng đối với

Pseudomonas aeruginosa, một vi khuẩn ít kháng sinh điều trị và đề kháng với nhiều loại

kháng sinh

Thành phẩm gel rửa bao gồm 0,2% tinh dầu DCC Sản phẩm gel rửa không làm thay đổi

độ ẩm trên da sau 8 giờ sử dụng và làm giảm độ nhờn kéo dài trong 8 giờ và hoàn toàn không gây kích ứng da

Hiện nay trên thế giới và tại Việt Nam chưa có sản phẩm nào kết hợp đồng thời dạng bào chế liposome với dược chất DCC

Bảng 1 6 Một số chế phẩm chứa DCC (Matricaria chamomilla L.) trên thế giới

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 DUNG MÔI, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU

Bảng 2 1 Hóa chất, dung môi dùng trong nghiên cứu

Hóa chất dùng phân tích: anisaldehyd, acid

hydrocloric, acid phosphoric, amoniac, cloroform,

methanol, ethyl acetat, hexan, toluen, acid acetic

Fisher Scientific

- Mỹ

Thụy Sĩ

Kali dihydrophosphate, Natri benzoate TCNSX Việt Nam

Bảng 2 2 Thiết bị dùng trong nghiên cứu

Trace 1310 Gas Chromatography Mass

Selective Detector

Thermo Scientific, Mỹ

Scarlar Airmicro, Nhật

2.2 KIỂM NGHIỆM NGUYÊN LIỆU CAO DƯƠNG CAM CÚC VÀ TINH DẦU DƯƠNG CAM CÚC

2.2.1 Cao Dương cam cúc

Cảm quan: Chất lỏng màu nâu, mùi thơm đặc trưng, vị đắng, không có bã dược liệu

Độ tan: Cân khoảng 2g cao Dương cam cúc cho vào ống nghiệm, thêm dần dần 10 ml

ethanol 60% vào, đánh giá khả năng hòa tan của cao Dương cam cúc trong ethanol 60% Thí nghiệm được lặp lại 3 lần Cao Dương cam cúc phải tan hoàn toàn trong ethanol 60%

Tro toàn phần: Nung chén sứ đã rửa sạch ở lò nung 550 – 600 °C đến trọng lượng không

đổi Để nguội ở bình hút ẩm và cân phân tích chính xác đến 0,0001g Cho vào chén sứ 5g mẫu thử Cho tất cả vào lò nung và nâng nhiệt độ từ từ cho đến 550 – 600 °C Nung cho đến tro trắng Để nguội trong bình hút ẩm và cân Tiếp tục nung thêm ở nhiệt độ trên trong 30 phút rồi để nguội trong bình hút ẩm và cân cho đến trong lượng không đổi Tỉ lệ tro toàn phần được xác định bằng tỉ lệ cắn nung và khối lượng cao ban đầu

Yêu cầu không quá 13%

Định tính flavonoid

- Định tính bằng phản ứng hóa học theo thuốc thử chung nhóm flavonoid

Với AlCl3 1% trong/ MeOH: Tăng màu

Với Chì acetat trung tính: Tủa màu vàng cam

Với thuốc thử diazonium: Tạo màu vàng cam

Với FeCl3 1%: Tạo màu xanh rêu

Với thuốc thử HCl 1%: Tạo màu vàng cam

Với Mg/HCl đđ: Tạo màu đỏ tía

Với NaOH 1%: Tăng màu

- Định tính bằng sắc ký lớp mỏng

+ Chuẩn bị mẫu:

Dung dịch thử: cao Dương cam cúc

Dung dịch chuẩn: Hòa tan 2,5 mg apigenin-7-glucosid trong 10 ml methanol

+ Hệ dung môi khai triển: Ehtyl acetat – methanol – nước (100:17:13)

+ Tiến hành: Chấm riêng biệt lên bảng mỏng khoảng 10 l mỗi dung dịch chuẩn và thử Sau khi triển khai bảng mỏng, để bay hơi hết dung môi Thuốc thử phát hiện là kali hydroxid trong ethanol 96%, kiểm tra dưới đèn UV ở bước sóng 365 nm

+ Yêu cầu: Trên sắc ký đồ, mẫu thử phải có các vết có cùng Rf và màu sắc tương ứng với các vết có trên sắc ký đồ mẫu chuẩn

Định lượng flavonoid toàn phần, apigenin-7-glucosid trong Dương cam cúc

- Định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp cân:

+ Tiến hành: cân chính xác khoảng 10 g Cao dương cam cúc Cô cách thủy đến khô Hòa tan cắn với 20 ml nước nóng, 2 lần Chiết bằng ethyl acetat nhiều lần, mỗi lần khoảng

7 ml cho đến khi dịch ethyl acetat không còn phản ứng flavonoid (phản ứng cyanidin) Gộp chung các dịch chiết ethyl acetat Bốc hơi ethyl acetat đến khô Sấy ở 105 °C trong 3 giờ Cho vào bình hút ẩm Cân và tính tỷ lệ phần trăm flavonoid toàn phần

+ Tính kết quả: Tỷ lệ phần trăm hàm lượng flavonoid toàn phần theo công thức:

F(%) = 100*f/m

m: khối lượng cao Dương cam cúc (g)

Yêu cầu: Hàm lượng flavonoid toàn phần không dưới 12 % (kl/kl)

- Định lượng apigenin-7-glucosid bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao:

+ Chuẩn bị mẫu: Cân chính xác khoảng 50 mg apigenin-7-glucosid chuẩn, cho vào bình định mức 50 ml, hòa tan trong methanol vừa đủ thể tích, lắc đều Lấy chính xác 5 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 50 ml, thêm hỗn hợp methanol-nước (1:1) (dịch A) Từ dịch A, pha một dãy gồm 5 nồng độ apigenin-7-glucosid chuẩn (5, 15, 25, 50 và

Hỗn hợp acetonitril và methanol tỷ lệ 65/35 Sử dụng chương trình gradient (Bảng 2.3.) Nhiệt độ cột: 40 °C, detector: photodiode array; bước sóng phát hiện: 335 nm (Hình

2.1.)

+ Tiến hành: Lần lượt tiêm dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống

+ Kết quả: Nồng độ apigenin-7-glucosid trong cao Dương cam cúc được tính dựa trên đường tuyến tính của dung dịch apigenin-7-glucosid chuẩn

Bảng 2 3 Chương trình gradient chạy sắc ký định lượng apigenin-7-glucosid

Hình 2.1 Sắc ký đồ mẫu chuẩn apigenin-7-glucosid (a) và cao DCC (b)

Qui trình định lượng apigenin-7-glucosid trong cao DCC đã được thẩm định trong luận

án Tiến sĩ của Trần Anh Vũ nên trong nghiên cứu này sử dụng và trình bày lại kết quả thẩm định

Giới hạn nhiễm khuẩn:

Tổng số vi sinh vật không quá 500 khuẩn lạc/g, không được có Candida albicans,

Pseudomonas và Staphylococcus aureus theo QĐ 1110/QLD-CL, QĐ 3113/1999/BYT

và TCVN 6972-2001

2.2.2 Tinh dầu Dương cam cúc

Cảm quan: Tinh dầu Dương cam cúc là chất lỏng màu xanh dương, mùi đặc trưng

Định tính tinh dầu Dương cam cúc bằng sắc ký lớp mỏng

+ Chuẩn bị mẫu

Dung dịch thử: Hòa tan 20 l tinh dầu Dương cam cúc vào 1 ml toluen

Dung dịch chuẩn: Hòa tan khoảng 1 mg borneol và 2 mg guaiazulen trong hai ống nghiệm riêng biệt có chứa sẵn 1 ml toluen

Chất hấp phụ: Silica gel F254 bản nhôm tráng sẵn 0,25 mm

Hệ dung môi khai triển: Ethyl acetat – toluen (5:95)

+ Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng khoảng 10 l mỗi dung dịch chuẩn và dung dịch thử Sau khi triển khai bản mỏng, để bay hơi hết dung môi Sau đó phun thuốc thử anisaldehyd, để khô Sấy ở 105-110 °C trong 5-10 phút Quan sát dưới ánh sáng

trên mẫu chuẩn

Định lượng bisabolol oxid A, B và chamazulen trong tinh dầu

Xác định hàm lượng bisabolol oxid A, B và hàm lượng chamazulen trong tinh dầu Dương cam cúc bằng sắc ký khối phổ (GC/MS)

Mẫu được pha loãng với dicloromethan (1/100) Điều kiện chạy trên máy GC/MS MD

8000 series (Fisson, Anh) Chạy ở nhiệt độ 60 °C tăng lên 280 °C, tốc độ 6 °/phút đến nhiệt độ 280 °C dừng lại 4 phút Các thông số nhiệt độ buồng tiêm và detector 240 °C, áp suất khí mang heli là 21 PSI, thể tích tiêm là 1 l, cột sắc ký BPx5 dài 30 m, đường kính 0,25 mm, phim 0,25 m

Qui trình định lượng bisabolol oxid và chamazulen trong tinh dầu DCC đã được thẩm định trong luận án Tiến sĩ của Trần Anh Vũ nên trong nghiên cứu này sử dụng và trình bày lại kết quả thẩm định

Yêu cầu:

Hàm lượng (%) bisabolol oxid A, B trong tinh dầu không dưới 30 %

Hàm lượng (%) chamazulen trong tinh dầu không dưới 1,66 %

2.3 NGHIÊN CỨU ĐIÊU CHẾ LIPOSOME CHỨA CAO VÀ TINH DẦU DƯƠNG CAM CÚC (DCC-LPS)

2.3.1 Nghiên cứu điều chế liposome chứa cao và tinh dầu Dương cam cúc bằng phương pháp hydrat hóa màng phim

2.3.1.1 Các thông số cố định trong quy trình điều chế

Với nguyên liệu chính là phospholipon 90G (P90G), chọn nhiệt độ hydrat hoá lớn hơn Tg

Các thông số điều kiện về tốc độ quay của máy cô quay khi tráng phim và hydrat hóa, thời gian cô quay, thời gian hydrat hóa, vv… được xác định qua thực nghiệm khi thử nghiệm mỗi thông số các giá trị khác nhau, từ chất lượng của màng phim lipid sau khi tráng và khả năng phim phân tán đều khi hydrat hóa (quan sát bằng mắt thường) Các

thông số cố định được tóm tắt theo Bảng 2.4

Đầu tiên, cần xác định loại dung môi hoà tan pha lipid Dung môi thường dùng trong phương pháp này là ethanol, chloroform hoặc hỗn hợp chloroform : methanol Ethanol và chloroform là hai dung môi dễ bay hơi (nhiệt độ sôi của chloroform là 61,62 °C ; và ethanol là 78,5 °C) được lựa chọn Mỗi ống nghiệm được cho vào 10ml dung môi ethanol hoặc chloroform, sau đó thêm vào mỗi ống khoảng 0,1g P90G và 2 giọt tinh dầu DCC Lắc ống nghiệm trên máy lắc xoáy Quan sát độ trong của các ống nghiệm sau 5 phút

Bảng 2 4 Tóm tắt các thông số quy trình tráng phim và hydrat hoá phim

Khảo sát bào chế liposome với sự thay đổi các thành phần trong công thức và các thông

số kỹ thuật trong quy trình bào chế thể hiện qua hình Hình 2.2 Qui trình được mô tả cụ

thể qua các bước sau:

- Cân và hòa tan các thành phần: phospholipon 90G, Tween 80 trong 50ml dung môi có chứa hoặc không chứa tinh dầu Dương cam cúc

- Cho dung dịch lipid trên vào bình cô quay có dung tích 1000 ml Tiến hành cô quay ở

nhiệt độ phù hợp với tốc độ quay phù hợp theo Bảng 2.4 Sau khi dung môi bay hơi hết,

tiếp tục cô quay để dung môi bay hơi hoàn toàn Thời gian cô quay phù hợp

- Hydrat hóa lớp màng phim lipid bằng cao DCC trong hệ đệm pH 4,5 Nhiệt độ hydrat hóa, tốc độ quay và thời gian hydrat hóa phù hợp

- Chuyển mẫu liposome từ bình cô quay sang cốc thuỷ tinh Mẫu được đem đi đồng nhất hoá bằng thiết bị Ultra-turrax Tốc độ đồng nhất hóa được khảo sát

- Mẫu liposome tiếp tục được đánh siêu âm trong bể siêu âm với thời gian siêu âm phù hợp (10, 30, 60 phút)

- Mẫu liposome trên được ủ nhiệt khoảng 40 °C trên bếp khuấy từ với tốc độ khuấy nhẹ

- Thành phẩm liposome cuối cùng được đóng lọ thủy tinh màu nâu, bảo quản tránh ánh sáng ở nhiệt độ 2-8 °C

Hình 2.2 Sơ đồ tóm tắt các bước khảo sát bào chế liposome chứa cao DCC

2.3.1.2 Các khảo sát nghiên cứu thành phần công thức và qui trình điều chế

- Khảo sát ảnh hưởng chất diện hoạt Tween 80 trong công thức liposome: khảo sát công thức chứa 1% Tween 80 hoặc không chứa Tween 80 Công thức điều chế được đánh giá bằng phân bố kích thước hạt trước khi đồng nhất hóa

- Khảo sát thời điểm cho Tween 80 vào trong quy trình bào chế liposome: Tween 80 được thêm vào pha dầu trước khi tráng màng phim hoặc cho vào pha nước trong quá trình hydrat hóa tạo liposome Công thức điều chế được đánh giá bằng phân bố kích thước hạt trước khi đồng nhất hóa

- Khảo sát nồng độ của P90G khi có Tween 80 trong công thức liposome: khảo sát nồng

độ P90G ở các nồng độ 1%, 2% và 3% Yêu cầu phải đạt màng phim có độ dày đồng nhất, không có các vị trí dày, mỏng khác nhau khi quan sát bằng cảm quan

- Khảo sát tỉ lệ nồng độ Tween 80 trong công thức liposome: nhằm mục đích làm giảm lượng Tween 80 trong công thức để tránh sự tạo bọt khi đồng nhất hóa và tránh sự tạo thành các thể micelle, các công thức có tỉ lệ Tween 80 lần lượt là 0,24%, 0,5%, 0,74% và 1% được điều chế và đánh giá

- Khảo sát các thông số kỹ thuật trong quy trình làm giảm kích thước tiểu phân liposome:

từ công thức cơ bản đã xác định, tiến hành đồng nhất hóa (ĐNH) ở các tốc độ 11000 vòng / phút (v/p), 15000 v/p và 19000 v/p Công thức điều chế được đánh giá bằng kích thước liposome thu được Đối với phương pháp siêu âm bể, thời gian đánh siêu âm được khảo sát là 15 phút, 30 phút và 60 phút

2.3.2 Nghiên cứu điều chế liposome chứa cao và tinh dầu Dương cam cúc bằng phương pháp tiêm ethanol

2.3.2.1 Nghiên cứu thông số quá trình điều chế liposome chứa cao và tinh dầu Dương cam cúc bằng phương pháp tiêm ethanol

Qui trình điều chế được đề nghị: pha nước và pha ethanol chứa các thành phần thích hợp

phương pháp phù hợp Ủ nhiệt, đóng gói, bảo quản

Các thông số được cố định trong quy trình

 Đồng nhất hóa để giảm kích thước hạt: Máy Ultra turrax với tốc độ 15000

Lựa chọn kỹ thuật nang hóa tinh dầu DCC vào liposome

Tinh dầu DCC có thể nang hóa vào liposome trong quá trình bào chế hoặc ủ tinh dầu DCC với liposome bào chế sẵn Tiến hành đánh giá cảm quan các mẫu liposome của các mẫu cùng một công thức nhưng khác cách bổ sung tinh dầu DCC

- Mẫu LP1: cho tinh dầu DCC vào pha ethanol trước khi bào chế, mẫu sau khi khuấy từ cho bay hơi ethanol mới tiến hành đồng nhất hóa

- Mẫu LP2: cho tinh dầu DCC vào pha ethanol, đồng nhất hóa mẫu ngay khi cho pha ethanol vào pha nước

- Mẫu LP3: cho tinh dầu DCC vào liposome đã bào chế xong

2.3.2.2 Nghiên cứu thành phần công thức bào chế liposome DCC

Các thông số kích thước hạt, phân bố kích thước hạt và hiệu suất bắt giữ là những thông

số quan trọng để khảo sát thành phần công thức bào chế liposome DCC

Đánh giá kích thước hạt để khảo sát lần lượt:

+ Sự ảnh hưởng của Tween 80: khảo sát công thức có hoặc không có Tween 80

+ Tỉ lệ thể tích ethanol tuyệt đối/đệm

+ Tỉ lệ lipid/ethanol tuyệt đối

Đánh giá kích thước tiểu phân liposome, hiệu suất nang hóa cao toàn phần DCC để khảo sát sự ảnh hưởng của:

+ Tỉ lệ Tween

+ Tỉ lệ giữa phospholipon 90G và cholesterol

+ Tỉ lệ cao toàn phần DCC/lipid

Đánh giá cảm quan và định tính tinh dầu DCC để khảo sát ảnh hưởng của

2.3.3.2 Phương pháp đánh giá sơ bộ kích thước tiểu phân

Đánh giá sơ bộ kích thước tiểu phân bằng kính hiển vi (KHV) điện tử có hỗ trợ chụp hình ảnh và đo được kích thước Mẫu liposome được chuẩn bị trên lam kính và quan sát dưới KHV vật kính dầu x100, thị kính x10, quan sát mẫu trên nền phản pha Sử dụng thiết bị Moticam 1000 để chụp ảnh lại

2.3.3.3 Phương pháp đánh giá phân bố kích cỡ tiểu phân

Kích thước tiểu phân liposome được xác định bằng phương pháp tán xạ laser Sử dụng máy phân tích kích thước hạt Malvern Instrument

Dung dịch Z: Cho 10 l tinh dầu hòa tan trong 1 ml toluen

- Định tính cao DCC: Tiến hành chấm sắc ký hai dung dịch X và Y lên bản mỏng, triển khai sắc ký trong hệ dung môi Ethylacetat-Methanol-Nước (100:17:13), để khô rồi quan sát dưới ánh sáng đèn UV 254 nm

- Định tính tinh dầu DCC: Tiến hành chấm sắc ký hai dung dịch Y và Z lên bản mỏng, triển khai sắc ký trong hệ dung môi Ethyl acetat – toluen (5:95), để bay hơi hết dung môi Sau đó phun thuốc thử anisaldehyd, để khô Sấy 105-110 °C trong 5-10 phút Quan sát dưới ánh sáng thường

2.3.3.7 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng apigenin -7- glucoside trong liposome DCC

Do cả hai liposome điều chế bằng phương pháp hydrat hóa lớp màng phim lipid hoặc bằng phương pháp tiêm ethanol đều có thành phần công thức bào chế giống nhau, do đó, kết quả xây dựng và thẩm định định lượng apigenin-7-glucosid trong liposome được trình bày dựa trên liposome được điều chế bằng phương pháp tiêm ethanol

Khảo sát quy trình xử lý mẫu thử LPS – DCC bằng aceton

 Mẫu thử LPS – aceton: hút 0,5 ml LPS – DCC cho vào eppendorf, thêm 1,0 ml

cho vào chén sứ, tiếp tục thêm 1,0 ml aceton vào phần cắn trong eppendorf, lắc xoáy trong 30 giây rồi đem ly tâm lần 2 ở cùng điều kiện trên, gộp dịch lần 2 cho vào chén sứ đang chứa dịch 1, cô đến cắn Cắn này được xử lý theo 2 quy trình sau:

màng lọc 0,45 m

10 ml, thêm 1 ml triton X 10% lắc đều, định mức đến vạch bằng hỗn hợp methanol – nước (1:1), lọc qua màng lọc 0,45 m

Tiến hành sắc ký mẫu thử LPS – aceton A và B theo điều kiện sắc ký theo Bảng 2.5

Điều kiện sắc ký: Cột Gimini C18, 250 x 4,6 mm : 5 m; pha động: Dung dịch I: Dung dịch kali dihydrophosphat 5 mM Chỉnh về pH 2,5 bằng acid phosphoric; dung dịch II: Hỗn hợp acetonitril và methanol tỷ lệ 65/35 Sử dụng chương trình gradient Nhiệt độ cột: 40 °C, detector: photodiode array; bước sóng phát hiện: 335 nm

Bảng 2 5 Chương trình chạy gradient định lượng apigenin-7-glucosid

Khảo sát quy trình xử lý mẫu thử LPS – DCC bằng triton X

 Mẫu thử LPS – triton: Hút chính xác 1,0 ml LPS – DCC cho vào bình định mức

20 ml, thêm 1,0 ml triton X 10%, lắc đều đến khi dung dịch trong suốt, thêm hỗn hợp

 Tiến hành sắc ký mẫu thử LPS – triton theo điều kiện sắc ký sau khi đã chọn lựa

với dung môi pha mẫu thay đổi lần lượt như sau:

 Chuẩn bị mẫu thử LPS – protamine theo quy trình xử lý mẫu sau, với các thông

số: X (thể tích salin), Y (thời gian ủ mẫu), Z (tốc độ ly tâm) thay đổi để tìm ra quy trình

xử lý mẫu cho kết quả chính xác nhất

 Mẫu thử LPS – protamine: Hút 0,1 ml LPS – DCC cho vào eppendorf, thêm

0,1 ml dịch protamine 10 mg/ml vào eppendorf trên Hỗn hợp được lắc xoáy trong 60 giây, để ở nhiệt độ phòng 3 phút Thêm X (ml) dung dịch salin vào hỗn hợp trên, lắc xoáy trong 60 giây, ủ trong thời gian Y (phút), sau đó ly tâm với tốc độ Z (vòng/phút)

protamine Hút dịch nổi sau ly tâm (là dịch môi trường chứa A7G tự do) đem xử lý theo 2 quy trình sau:

 Dịch sau ly tâm A (SLTA): Dịch sau ly tâm lọc qua màng lọc 0,45 µm

 Dịch sau ly tâm B (SLTB): Hút 0,5 ml dịch sau ly tâm vào eppendorf, thêm

50 µl triton X 10%, lắc xoáy, lọc qua màng lọc 0,45 µm

 Tiến hành sắc ký dịch SLTA và SLTB theo điều kiện sắc ký sau khi đã chọn lựa

với các điều kiện xử lý mẫu thay đổi lần lượt như Bảng 2.6 để định lượng A7G tự do

trong phức hợp LPS – DCC

Bảng 2 6 Các thông số xử lý mẫu LPS – DCC Thời gian ủ mẫu Tốc độ ly tâm (vòng/phút) Thể tích salin (ml)

 Diện tích pic ở 2 dịch SLTA và SLTB khác nhau không có ý nghĩa

Tính hiệu suất nang hóa cao DCC vào liposomes

Hiệu suất nang hóa cao DCC vào liposomes được xác định bằng phương pháp gián tiếp: định lượng hoạt chất A7G toàn phần trong LPS – DCC và A7G tự do trong môi trường

đã tách hoàn toàn liposomes Liposomes chứa cao DCC được tách ra khỏi môi trường chứa cao DCC tự do bằng cách kết tụ protamine

Hiệu suất nang hóa cao DCC trong liposomes được tính theo công thức:

% EF = (m(tp) − m(td))/ m(tp) × 100

Trong đó:

 m(tp): lượng A7G toàn phần trong 1 ml LPS – DCC (µg)

 m(td): lượng A7G tự do trong 1 ml môi trường đã loại hoàn toàn liposomes (µg)

 % EF: hiệu suất nang hóa

Thẩm định quy trình định lượng A7G trong phức hợp LPS-DCC bằng phương pháp HPLC

 Điều kiện sắc ký

Thẩm định quy trình định lượng A7G trong phức hợp LPS – DCC bằng phương pháp HPLC theo điều kiện sắc ký sau khi đã được chọn lựa

 Chuẩn bị các dung dịch mẫu

 Mẫu chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 5,0 mg A7G chuẩn, cho vào bình định mức

250 ml, thêm hỗn hợp methanol – nước (1:1) lắc đều cho tan, định mức đến vạch, trộn đều Dung dịch thu được có nồng độ khoảng 20 µg/ml

 Mẫu chuẩn: Hút chính xác 5,0 ml mẫu chuẩn gốc cho vào bình định mức 20 ml,

thêm hỗn hợp methanol – nước (1:1) đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45

m Dung dịch thu được có nồng độ khoảng 5 µg/ml

 Mẫu thử cao DCC: Lấy chính xác 1,0 ml cao DCC cho vào bình định mức 50 ml,

hòa tan trong khoảng 35 ml methanol, siêu âm 15 phút, để nguội bổ sung thể tích đến vạch, lắc đều Lấy chính xác 1,0 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 20