Nghiên Cứu Áp Dụng Mô Hình Ung Thư Da In Vivo Vào Khảo Sát Tác Động Kháng U Da Của Cao Chiết Từ Lá Tía Tô Perilla Frutescens.pdf

i ỦY BAN NHÂN DÂN TP HCM BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TT KHOA HỌC CÔNG NGHỆ DƢỢC SÀI GÒN CHƢƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NG[.]

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM BỘ Y TẾ - ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP.HCM

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TT KHOA HỌC CÔNG NGHỆ DƯỢC SÀI GÒN

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Nghiên cứu áp dụng mô hình ung thư da in vivo

vào khảo sát tác động kháng u da của cao chiết

từ lá Tía tô (Perilla frutescens (L.) Britt)

Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Khoa học Công nghệ Dược Sài Gòn

Chủ nhiệm nhiệm vụ: PGS TS Huỳnh Ngọc Trinh

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

THÁNG 11/ 2018

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM BỘ Y TẾ - ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP.HCM

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TT KHOA HỌC CÔNG NGHỆ DƯỢC SÀI GÒN

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Nghiên cứu áp dụng mô hình ung thư da in vivo

vào khảo sát tác động kháng u da của cao chiết

từ lá Tía tô (Perilla frutescens (L.) Britt)

(Đã chỉnh sửa theo kết luận của Hội đồng nghiệm thu

ngày 31/10/2018)

Chủ nhiệm nhiệm vụ:

PGS TS Huỳnh Ngọc Trinh

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

BÁO CÁO THỐNG KÊ 1

MỞ ĐẦU 9

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12

1.1 Ung thư da 12

1.1.1 Sự hình thành và phát triển ung thư da 12

1.1.2 Tác nhân gây ung thư da 12

1.1.3 Phân loại ung thư da 13

1.2 Mô hình gây u da 2 giai đoạn bằng hóa chất trên chuột thực nghiệm 14 1.2.1 Cơ chế tác động của các tác nhân gây u qua các giai đoạn thử nghiệm 14

1.2.2 Tác nhân hóa học chính trong mô hình gây u hai giai đoạn 16

1.2.3 Các mô hình gây u da hai giai đoạn bằng hóa chất trong các nghiên cứu trên thế giới 17

1.2.4 Đặc điểm mô học khối u trên da chuột 19

1.3 Hoạt chất có tác dụng kháng u được nghiên cứu 23

1.3.1 Imiquimod 23

1.3.2 Curcumin và các hợp chất curcuminoid 24

1.3.3 Tía tô 28

1.4 Tính cấp thiết của đề tài 30

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 Đối tượng nghiên cứu 32

2.1.1 Động vật thí nghiệm 32

2.1.2 Dược liệu tía tô 32

2.1.3 Hóa chất, thuốc thử 32

2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 33

2.2 Phương pháp nghiên cứu 33

2.2.1 NỘI DUNG 1: PHƯƠNG PHÁP GÂY UNG THƯ DA TRÊN CHUỘT NHẮT BẰNG DMBA VÀ CROTON OIL 33

2.2.2 NỘI DUNG 2: PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT ĐÁP ỨNG CỦA MÔ HÌNH VỚI CÁC TÁC NHÂN ĐIỀU TRỊ ĐỐI CHỨNG 35

2.2.3 NỘI DUNG 3: PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CỦA CAO TOÀN PHẦN TỪ LÁ TÍA TÔ 37

2.2.4 NỘI DUNG 4: PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG PHÒNG NGỪA/ĐIỀU TRỊ UNG THƯ DA CỦA CAO TÍA TÔ 44

2.2.5 NỘI DUNG 5: PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA CAO TÍA TÔ TRÊN DA CHUỘT BÌNH THƯỜNG 45

2.3 Xử lý số liệu 46

Chương 3 KẾT QUẢ 47

3.1 NỘI DUNG 1: KIỂM CHỨNG MÔ HÌNH UNG THƯ DA TRÊN CHUỘT NHẮT BẰNG DMBA VÀ CROTON OIL 47

3.1.1 Thể trạng chuột và những thay đổi ở vùng da bôi hóa chất 47

3.1.2 Các chỉ tiêu đánh giá thử nghiệm kiểm chứng mô hình ung thư da48 3.2 NỘI DUNG 2: KHẢO SÁT ĐÁP ỨNG CỦA MÔ HÌNH VỚI CÁC TÁC NHÂN ĐIỀU TRỊ ĐỐI CHỨNG 52

3.2.1 Đánh giá tác động phòng ngừa u da của curcumin 52

3.2.2 Đánh giá tác động điều trị u da của curcumin 4% và imiquimod 5% 59

3.3 NỘI DUNG 3: CHIẾT XUẤT VÀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CỦA CAO TOÀN PHẦN TỪ LÁ TÍA TÔ 64

3.3.1 Xác định dược liệu 64

3.3.3 Chiết xuất cao toàn phần từ lá tía tô 77

3.3.4 Xây dựng tiêu chuẩn cao toàn phần tía tô 77

3.4 NỘI DUNG 4: KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG PHÒNG NGỪA/ĐIỀU TRỊ UNG THƯ DA CỦA CAO TÍA TÔ 83 3.4.1 Đánh giá sự ảnh hưởng của aceton và glycerin 5% đối với da chuột 83 3.4.2 Đánh giá tác động phòng ngừa u da của cao toàn phần tía tô 10%89 3.4.3 Đánh giá tác động điều trị u da của cao tía tô 10% 95 3.5 NỘI DUNG 5: ĐÁNH GIÁ SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CAO TOÀN PHẦN TÍA TÔ 10% LÊN DA CHUỘT BÌNH THƯỜNG 99 Chương 4 BÀN LUẬN 101 4.1 MÔ HÌNH GÂY U DA HAI GIAI ĐOẠN BẰNG HÓA CHẤT 101 4.2 ĐÁP ỨNG CỦA MÔ HÌNH VỚI CÁC TÁC NHÂN ĐIỀU TRỊ ĐỐI CHỨNG 103 4.3 DƯỢC LIỆU TÍA TÔ 105 4.4 TÁC ĐỘNG DỰ PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ U DA CỦA CAO CHIẾT TOÀN PHẦN TỪ LÁ TÍA TÔ 107 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO 112

FDA Food and Drug Aministration Cục quản lý thực phẩm và

dƣợc phẩm Hoa Kỳ HPLC High Performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

NF-κB Nuclear factor kappa B Yếu tố nhân kappa B RNA Ribo Nucleic Acid

sBCC Superficial basal cell carcinoma Ung thƣ tế bào đáy thể bề mặt

TRUNG TÂM KHOA HỌC

Nghiên cứu áp dụng mô hình ung thư da in vivo vào khảo sát tác động

kháng u da của cao chiết từ lá Tía tô (Perilla frutescens (L.) Britt)

Thuộc: Chương trình Vật liệu mới và Công nghệ Dược

2 Chủ nhiệm nhiệm vụ:

Họ và tên: HUỲNH NGỌC TRINH

Ngày, tháng, năm sinh: 06/10/1981 Nam/ Nữ: nữ

Học hàm, học vị: Phó giáo sư, Tiến sĩ

Chức danh khoa học: Chức vụ

Điện thoại: (028) 38295 641 Nhà riêng: Mobile: 0907733259

Fax: E-mail: trinhbl81@yahoo.com

Tên tổ chức đang công tác: Khoa Dược, ĐH Y Dược Tp Hồ Chí Minh

Địa chỉ tổ chức: 41, Đinh Tiên Hoàng, Quận I, Tp Hồ Chí Minh

Địa chỉ nhà riêng: 127, đường số 1, khu dân cư Bình Hưng, huyện Bình

Kho bạc: Kho bạc nhà nước Quận 1 – Tp HCM

Tên cơ quan chủ quản đề tài: ĐH Y Dược TP HCM

Thời gian

(Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

Thời gian (Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

- Lý do thay đổi (nếu có):

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án:

(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xét duyệt, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện nếu có); văn bản của tổ chức chủ trì nhiệm vụ (đơn, kiến nghị điều chỉnh nếu có)

Số

TT

Số, thời gian ban hành

Ghi chú

4 Tổ chức phối hợp thực hiện nhiệm vụ:

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

5 Cá nhân tham gia thực hiện nhiệm vụ:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú

Chủ nhiệm đề tài

Quản lý và tham gia các thử nghiệm Tổng hợp và báo cáo kết quả

Đào tạo SĐH và ĐH

2 DS Đỗ

Thanh Hảo

DS Đỗ Thanh Hảo

Thử nghiệm tác dụng dƣợc lý

Mô hình ung thƣ da trên chuột

Tác động kháng u da

của thuốc đối chứng

và cao tía tô

3 ThS Hồ Thị

Thạch Thúy

ThS Hồ Thị Thạch Thúy

Thử nghiệm tác dụng dược lý

Mô hình ung thư da trên chuột

Tác động kháng u da của thuốc đối chứng

và cao tía tô

4 ThS Trần

Thủy Tiên

ThS Trần Thủy Tiên

Thử nghiệm tác dụng dược lý

Mô hình ung thư da trên chuột

Tác động kháng u da của thuốc đối chứng

và cao tía tô

5 DSTH Lưu

Thị Nghĩa

DSTH Lưu Thị Nghĩa

Thử nghiệm tác dụng dược lý

Lấy mẫu da chuột

6 Chị Trần Thị

Kim Hạnh

Chị Trần Thị Kim Hạnh Chị Lê Thị Mưu Huỳnh

Thử nghiệm tác dụng dược lý

Nuôi chuột thử nghiệm

Dược liệu Cao tía tô được tiêu

chuẩn hóa

8 TS Trần Văn

Thành

TS Trần Văn Thành

Bào chế Kem curcumin,

Dung dịch cao tía tô

- Lý do thay đổi ( nếu có): Chị Trần Thị Kim Hạnh nghỉ hưu từ tháng 03/2018 nên chị Lê Thị Mưu Huỳnh thay thế để nuôi chuột thử nghiệm

6 Tình hình hợp tác quốc tế:

Số

TT

Theo kế hoạch

(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa

điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn,

số lượng người tham gia )

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

1

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

1 Kiểm chứng 3 mô hình ung thư

da trên chuột nhắt trắng Swiss

albino bằng phối hợp

DMBA/croton oil

02/2017

08/2016-02/2016

06/2016-Huỳnh Ngọc Trinh

Đỗ Thanh Hảo Trần Thủy Tiên

Hồ Thị Thạch Thúy Trần Thị Kim Hạnh

2 Khảo sát đáp ứng của mô hình

với các tác nhân điều trị đối

chứng (Curcumin và Imiquimod)

06/2017

01/2017-07/2017

02/2016-Huỳnh Ngọc Trinh

Đỗ Thanh Hảo

Hồ Thị Thạch Thúy Lưu Thị Nghĩa Trần Thị Kim Hạnh

3 Tổng kết kết quả giai đoạn 1

07/2017-08/2017

11/2017 Huỳnh Ngọc Trinh

4 Chiết xuất và xây dựng tiêu

chuẩn của cao toàn phần từ lá tía

tô

09/2017

08/2017-07/2017

09/2017-03/2018

08/2017-Huỳnh Ngọc Trinh

Đỗ Thanh Hảo Trần Thủy Tiên Lưu Thị Nghĩa Trần Thị Kim Hạnh

Lê Thị Mưu Huỳnh

6 Khảo sát ảnh hưởng của cao

chiết lá tía tô trên da bình thường

07/2018

01/2018-05/2018

02/2018-Huỳnh Ngọc Trinh Trần Thủy Tiên Lưu Thị Nghĩa

Lê Thị Mưu Huỳnh

7 Tổng kết kết quả đề tài

08/2018-10/2018

Huỳnh Ngọc Trinh

- Lý do thay đổi (nếu có):

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA NHIỆM VỤ

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

1 Mô hình ung thƣ da bằng hóa chất

trên chuột nhắt trắng đã đƣợc

kiểm chứng

Mô hình 01 01 01

2 Tác động kháng u da của lá tía tô Tác dụng 01 01 01

3 Tiêu chuẩn cơ sở của dƣợc

liệu/cao chiết

Tiêu chuẩn

1 Bài báo khoa học 02-03 04

2 Đào tạo sau đại học 02 02

3 Đào tạo đại học 0 01

- Lý do thay đổi (nếu có):

- Lý do thay đổi (nếu có):

d) Kết quả đào tạo:

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp:

Theo

kế hoạch

Thực tế đạt được

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế

2 Đánh giá về hiệu quả do nhiệm vụ mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

Đề tài nhằm thiết lập mô hình ung thư da thực nghiệm trên chuột nhắt ổn định, có tính khả thi cao; có thể ứng dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm dược lý khác nhau Kết quả của để tài giúp phát triển mô hình dược lý thực nghiệm mới, góp phần vào việc sàng lọc, đánh giá hiệu quả điều trị của các hoạt chất/dược liệu trong

bệnh ung thư da

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

Đề tài này nhằm mục đích xây dựng một mô hình ung thư da không melanin ổn định, có thể áp dụng được trên chủng chuột nhắt trắng swiss albino và trong điều kiện thí nghiệm tại bộ môn Dược lý, khoa Dược, ĐH Y Dược TP HCM cũng như tại Việt Nam Đề tài hoàn thiện sẽ đóng góp thêm mô hình dược lý để đánh giá tác động của thuốc đồng thời giúp phát triển thêm một dược liệu quý trong dự

phòng/điều trị bệnh ung thư da, góp phần phát triển nguồn thuốc mới phục vụ cho công tác chăm sóc sức khỏe cho người dân, đồng thời góp phần giảm gánh nặng về sức khỏe cũng như về chi phí điều trị ung thư da tại Việt Nam

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của nhiệm vụ:

Số

Thời gian thực hiện

Ghi chú

(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ

trì…)

I Báo cáo tiến độ

Lần 1 04/2017 Đã xây dựng mô hình ung thƣ da trên chuột nhắt

Chủ trì: Huỳnh Ngọc Trinh Lần 2 04/2018 Đã đánh giá đáp ứng của mô hình với curcumin

và imiquimod

Đã chiết xuất và xây dựng tiêu chuẩn dƣợc liệu

và cao chiết Chủ trì: Huỳnh Ngọc Trinh

II Báo cáo giám

định

11/2017 Báo cáo tiến độ thực hiện và đề xuất tiếp tục

thực hiện đề tài theo kế hoạch III Nghiệm thu cơ sở 08/2018 Báo cáo tổng kết đề tài và đề xuất nghiệm thu đề

các nguồn thuốc mới; trong đó, việc phát triển các mô hình ung thư in vivo là nhu

cầu cấp thiết hiện nay

Ung thư da là một trong những loại ung thư có tỉ lệ mắc cao và có xu hướng ngày càng tăng trong những thập niên qua Ung thư da được chia làm 2 nhóm chính: ung thư hắc tố (ung thư tế bào hắc tố) và ung thư không hắc tố (gồm ung thư tế bào đáy

và ung thư tế bào gai), trong đó ung thư da không hắc tố thường gặp nhất2

Tuy ung thư da không hắc tố thường dễ điều trị nhưng nếu không phát hiện sớm và có những biện pháp ngăn chặn, khả năng gây tử vong cho bệnh nhân rất cao Các biện pháp điều trị ung thư da hiện nay chủ yếu dựa trên các biện pháp can thiệp như đông lạnh

mô bằng nito lỏng, phẫu thuật cắt mô, loại bỏ vùng da có khối u, dùng tia laser, Bên cạnh đó, phương pháp xạ trị hay hóa trị cũng được chỉ định Tuy nhiên, các phương pháp này thường gây nhiều độc tính trên bệnh nhân như rụng tóc, giảm cân, buồn nôn, nôn, tiêu chảy, mệt mỏi, chán ăn, táo bón, rối loạn vị giác,… Các thuốc hóa trị dùng ngoài giúp giảm thiểu các tác dụng phụ toàn thân nhưng lại khó tìm và giá thành còn tương đối cao như chế phẩm chứa 5-fluorouracil hay imiquimod Ngoài ra, các chế phẩm này cũng gây nhiều tác dụng phụ tại chỗ như sưng phù, đau,

đỏ vùng da bôi thuốc3… Vì vậy, việc nghiên cứu các liệu pháp điều trị mới, đặc biệt

là sử dụng các thuốc có nguồn gốc dược liệu ngày càng được quan tâm và phát triển

do hiệu quả trị liệu tốt, giảm tác dụng phụ và hạ thấp chi phí

Do đó, hiện có nhiều nghiên cứu trên thế giới đã phát triển các mô hình ung thư da trên thú thử nghiệm bằng cách dùng tia UV, hoặc bằng hóa chất hay sử dụng động vật biến đổi gen nhằm đánh giá tác động kháng ung thư da của các trị liệu khác

nhau4 Mô hình gây ung thư da hai giai đoạn bằng hóa chất đã được phát triển từ lâu

và hiện được sử dụng rộng rãi trên thế giới Đây được xem như một trong những mô hình hữu hiệu cho việc nghiên cứu về cơ chế sinh ung thư cũng như đánh giá hiệu quả dự phòng/điều trị của các tác nhân khác nhau5 Mô hình bắt đầu bằng việc bôi

tác nhân khởi phát (initiator) như N-nitroso-N-methylurea (NMU),

N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG), 7,12-dimethylbenz(a) anthracen (DMBA),

benzo[a]pyren, Tiếp theo là bôi lập lại tác nhân tăng hoạt (promoter) như croton

oil, TPA, anthralin, tween 60, acid iodo acetic,… giúp thúc đẩy sự phát triển của khối u6 Trong số các chất hóa học gây ung thư đã được biết đến, DMBA và croton oil là hai hợp chất được sử dụng phổ biến trong các mô hình gây ung thư da hai giai đoạn trên chuột nhắt Có nhiều thử nghiệm trên thế giới về mô hình gây ung thư da gây bởi DMBA và croton oil; tuy nhiên các thử nghiệm lại khác nhau về liều lượng của DMBA và croton oil, tần suất bôi croton oil cũng như thời điểm bôi croton oil sau khi đã bôi DMBA Ngoài ra, giống chuột, thời gian xuất hiện khối u cũng như thời gian thử nghiệm cũng rất khác nhau

Việc nghiên cứu và thẩm định mô hình ung thư da trên thú thử nghiệm là cần thiết

và có khả năng ứng dụng cao để phát triển cũng như cung cấp bằng chứng khoa học cho việc sử dụng các hoạt chất/dược liệu trong ngăn ngừa sớm/điều trị bệnh ung thư

da Bên cạnh đó, đề tài cũng áp dụng mô hình đã thẩm định để đánh giá tác động kháng ung thư da của lá tía tô và đối chứng với imiquimod và curcumin Theo kinh nghiệm sử dụng trong dân gian của người Việt Nam, lá tía tô được dùng để trị cảm mạo phong hàn, ho, khí suyễn buồn nôn, có thai nôn mửa, chữa trúng độc cua, cá Ngoài ra, trong một số bệnh lý ngoài da như da mẫn ngứa, mụn cóc, làm đẹp da,… Tuy nhiên, các nghiên cứu về tác dụng dược lý của lá tía tô vẫn chưa được thực hiện; trong khi đó, một số nghiên cứu trên thế giới cũng đã chứng minh tác động chống oxy hóa, kháng viêm và kháng ung thư da của các dịch chiết từ lá tía tô…7,8,9 Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm kiểm chứng mô hình ung thư da không melanin thực nghiệm bằng hóa chất trên chuột nhắt trắng, từ

đó áp dụng để đánh giá tác động kháng ung thư da của cao tía tô với các mục tiêu cụ thể như sau:

+ Kiểm chứng các mô hình ung thư da không melanin bằng phối hợp DMBA với croton oil trên chuột nhắt trắng Swiss

+ Khảo sát đáp ứng của mô hình với tác nhân điều trị đối chứng (Curcumin, Imiquimod 5%)

+ Áp dụng mô hình ung thư da đã kiểm chứng để đánh giá tác động kháng ung da của cao chiết toàn phần từ lá tía tô

Nội dung của đề tài và kết quả thực hiện

TT Các nội dung, công việc

chủ yếu cần được thực hiện

Kết quả cần đạt

Mức

độ đạt

1 Kiểm chứng 3 mô hình ung thư

da trên chuột nhắt trắng Swiss

2 Khảo sát đáp ứng của mô hình

với các tác nhân điều trị đối

chứng (Curcumin và Imiquimod)

Hiệu quả dự phòng/điều trị ung thư da của curcumin/ imiquimod

Đạt

3 Tổng kết kết quả giai đoạn 1 Mô hình gây ung thư da trên chuột

nhắt bằng DMBA và croton oil Báo cáo giám định

Đạt

4 Chiết xuất và xây dựng tiêu

chuẩn của cao toàn phần từ lá tía

da của cao tía tô

Hiệu quả phòng ngừa/điều trị ung thư da của lá tía tô

Đạt

6 Khảo sát ảnh hưởng của cao chiết

lá tía tô trên da bình thường

Đánh giá tính an toàn của cao chiết lá tía tô

Đạt

7 Tổng kết kết quả đề tài Báo cáo nghiệm thu đề tài Đạt

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Ung thư da

1.1.1 Sự hình thành và phát triển ung thư da

Ung thư da là biểu hiện của sự tăng trưởng không kiểm soát của tế bào da bình thường, được gây ra bởi các bất thường về ADN, làm tế bào da bị đột biến, tăng sinh nhanh chóng và hình thành các khối u lành tính hay ác tính Các gene tác động lên sự phát triển của khối u gồm 2 loại: gene gây u (oncogene) và gene ức chế u (tumor suppressor gene) Gene gây u là các gene mã hóa protein liên quan đến sự tăng sinh và phân chia tế bào Khi bị biến đổi, chúng sẽ hoạt hóa tín hiệu thúc đẩy

sự tăng trưởng làm tế bào tăng sinh quá mức và tạo thành các khối u Ngược lại, gene ức chế u mã hóa protein đóng vai trò kìm hãm sự tăng trưởng quá mức của tế bào Khi bị biến đổi, các gene này bị mất chức năng kiểm soát đối với sự tăng sinh

tế bào và dẫn đến ung thư da

Ras là một trong những gene gây u đầu tiên được nhận diện trong bộ gene người Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự biến đổi gene ras, đặc biệt là gene Harvey ras và Kristen ras, là nguyên nhân phổ biến trong bệnh lý ung thư không do hắc sắc tố Protein ras liên quan đến phần trong của màng tế bào và được cho là đóng một vai trò quan trọng trong con đường dẫn truyền tín hiệu liên quan đến sự tăng trưởng và biệt hóa10 P53 là gene ức chế u, mã hóa cho phosphoprotein 53-kDa, đảm nhiệm vai trò kiểm soát sự phiên mã và chu kỳ tế bào Gene p53 góp phần trong việc bảo

vệ ADN của tế bào khỏi những tổn thương từ tia UVB Sự biến đổi gene p53 được phát hiện trong hầu nhiều trường hợp mắc ung thư da tế bào đáy và ung thư da tế bào gai11

1.1.2 Tác nhân gây ung thư da

Tia tử ngoại mặt trời: cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế, trực thuộc WHO, phân

loại tia tử ngoại mặt trời vào nhóm 1- nhóm các tác nhân gây ung thư trên người12 Tia UV từ ánh nắng mặt trời có khả năng gây ra 90% trường hợp ung thư da không

do hắc sắc tố13 Các tác động của tia cực tím gây ra các đột biến gen, ung thư hóa,

cản trở hoặc ức chế sinh tổng hợp ADN, ARN, protein và ảnh hưởng tới chức năng miễn dịch của cơ thể14

Các chất hóa học: đóng vai trò quan trọng trong việc khởi phát nguy cơ ung thư

Các tác nhân này có thể là: hắc ín, bồ hóng, anthracene, arsenic,…15

Yếu tố nhân kappa B (NF-κB): NF-κB là yếu tố có khả năng gắn với một đoạn

intron của gene mã hóa cho chuỗi nhẹ kappa của immonoglobulin Trong nhân,

NF-κB khởi động hay điều hòa quá trình sao mã đáp ứng sớm bằng cách gắn vào vùng khởi động hay vùng tăng cường của các gene đặc hiệu Trong hầu hết các loại tế bào, NF-κB có vai trò điều hòa các tín hiệu sống sót cho tế bào Tuy nhiên, ở một số trường hợp, yếu tố này lại gây nên chết tế bào theo chu trình Quá trình điều hòa bất hợp lý NF-κB là nguyên nhân gây ra nhiều bệnh lý trong đó có ung thư NF-κB được hoạt hóa bởi nhiều tác nhân khác nhau như bức xạ cực tím, các cytokine, bụi công nghiệp, các thành phần của vi khuẩn và virus16

Ngoài ra còn nhiều yếu tố khác như: yếu tố gen, yếu tố nội tiết, yếu tố màu da,…

1.1.3 Phân loại ung thư da

Ung thư da được chia làm hai nhóm chính: Ung thư da không do hắc sắc tố và ung thư da hắc sắc tố Khoảng 90% các trường hợp ung thư da là loại ung thư không hắc sắc tố, trong đó chủ yếu là ung thư tế bào đáy và ung thư tế bào gai Ngoài ra còn có dày sừng quang hóa, bệnh Bowen, verruca và acanthoma nhưng chiếm tỷ lệ rất nhỏ17

1.1.3.1 Ung thư tế bào đáy – BCC (Basel cell carcinoma)

Là loại chiếm phổ biến nhất trong hầu hết các trường hợp ung thư da, BCC tiến triển chậm, hiếm khi gây di căn Bệnh gặp ở bất kì chỗ nào trên cơ thể, nhưng thường thấy nhất ở vùng đầu, mặt, đôi khi ở cổ, thân mình; hiếm khi khu trú ở lòng bàn tay, bàn chân; không bao giờ xuất hiện ở niêm mạc BCC có nhiều hình thái lâm sàng khác nhau như thể xơ cứng; thể nang, thể nhiễm sắc, thể nốt, thể nông, thể loét18

1.1.3.2 Ung thư tế bào gai – SCC (Squamous cell carcinoma)

Ở người, đây là loại ung thư da phổ biến thứ hai sau BCC Khác với BCC, SCC được hình thành ở phần phía trên của biểu bì, trong lớp tế bào gai SCC luôn luôn xuất hiện trên những thương tổn đã có từ trước, nhất là trên nhóm bệnh da tiền ung thư (Bowen, Paget), hiếm hơn là trên những vùng da có sẹo, viêm mạn hoặc dày sừng ở người già Bệnh xuất hiện tự nhiên, sau sang chấn nhiều lần lập đi lập lại hoặc sau khi điều trị không thích hợp Thương tổn lớn lên, lan rộng ra, lớp sừng dày lên, trên bề mặt bị loét, thâm nhiễm sâu xuống dưới, bờ nổi cao lên (những nụ thịt),

có quầng đỏ bao bọc xung quanh, có khi xuất hiện dạng như nhú sừng Tế bào SCC điển hình là tế bào hình đa giác giới hạn rõ, nhiều nguyên sinh chất, nhiều ty lạp thể, nhiều tổ chức sợi Có một, hai nhân bắt màu rõ và có mảng nhiễm sắc Các tế bào u xếp chồng chất lên nhau tạo thành dạng tế bào lát nối với nhau bằng một cầu

nối liên bào SCC có khuynh hướng lan rộng và xâm lấn hệ thống bạch huyết, xâm

lấn vào tổ chức lân cận, loét phá hủy phần mềm, sụn xương, mạch máu lớn và các dây thần kinh, nhiễm khuẩn phụ18

1.2 Mô hình gây u da 2 giai đoạn bằng hóa chất trên chuột thực nghiệm

1.2.1 Cơ chế tác động của các tác nhân gây u qua các giai đoạn thử nghiệm

1.2.1.1 Giai đoạn khởi phát (initiation)

Là giai đoạn cảm ứng bởi một gen đột biến quan trọng liên quan đến sự kiểm soát tăng sinh tế bào Các chất gây ung thư gây ra lỗi di truyền bằng cách thay đổi cấu trúc phân tử ADN, dẫn đến đột biến trong phân chia và tổng hợp ADN Các chất hóa học này được chia thành 2 nhóm:

- Nhóm tác động trực tiếp có khả năng tạo u, không cần thông qua các biến đổi hóa học: β-propiolacton, N-methyl-N-nitroso guanin,…

- Nhóm tác động gián tiếp (còn gọi là các chất tiền ung thư) cần có các biến đổi chuyển hóa để tạo thành các yếu tố mang khả năng tạo u thực sự: benzo[a]pyren; 7,12-dimethylbenzen[a]anthracen (DMBA)…

Giai đoạn khởi phát mang tính chất không thể hồi phục và cộng dồn Vì vậy , ở giai đoạn này, chất gây ung thƣ đƣợc bôi nhiều lần hay một lần duy nhất đều cho hiệu quả nhƣ nhau19,20

1.2.1.2 Giai đoạn tăng hoạt (promotion)

Các tế bào ở giai đoạn khởi phát cần đƣợc tác động gây tăng sinh và xáo trộn hơn nữa để có thể hình thành khối u Vì vậy, các chất tăng hoạt ở giai đoạn này sẽ kích thích vào tế bào nhiều hơn với tần suất lặp đi lặp lại và kéo dài, giúp các khối u phát triển hơn hoặc làm tăng số lƣợng khối u21

Các chất tăng hoạt hầu hết chỉ làm thay đổi biểu hiện gen mà không làm biến đổi cấu trúc ADN, dẫn đến việc kích thích các

tế bào tăng sinh, làm tái cấu trúc các mô và gây viêm nhiễm Kết thúc của giai đoạn này là sự hình thành papilloma22

Croton oil và 12-O-tetradecanolphorbol-13-acetat (TPA) là những chất tăng hoạt mạnh nhất và đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong các mô hình gây u da trên chuột Ngoài ra còn có tween 60, iodo acetic acid,…

Các biến đổi đƣợc gây ra ở giai đoạn tăng hoạt mang tính hồi phục, vì thế việc bôi lặp lại hóa chất trên da là cần thiết Nếu giảm tần suất bôi, hiệu quả gây u sẽ giảm hoặc mất Một nghiên cứu cho thấy hiệu quả gây papilloma và carcinoma tối đa khi croton oil đƣợc bôi 1 hay 2 lần/tuần nhƣng kết quả sẽ đạt sớm hơn nếu bôi 2 lần/tuần Nếu giảm tuần suất bôi còn một lần một tuần trong 4 tuần với tổng liều nhƣ trên thì không có khối u nào phát triển23

1.2.1.3 Giai đoạn tiến triển (progression)

Đây là quá trình không hồi phục, dẫn đến sự di căn của các khối u: papilloma chuyển thành carcinoma Ở giai đoạn này, các gene tiếp tục bị đột biến nhiều hơn nữa, bao gồm: hoạt hóa các gene gây ung thƣ và bất hoạt các gene ức chế tế bào u, dẫn đến sự biệt hóa tế bào và gây rối loạn thông tin di truyền24

1.2.2 Tác nhân hóa học chính trong mô hình gây u hai giai đoạn

1.2.2.1 DMBA (7,12-dimethylbenzen[a]anthracen)

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của 7,12-dimethylbenzen[a]anthracen (DMBA)

DMBA (Hình 1.1) là một tác nhân gây ung thư được sử dụng nhiều trong các mô hình gây u trên chuột thực nghiệm DMBA tác động lên nhiều cơ quan, bao gồm da, tuyến vú, khoang miệng, gan,…Trên da chuột, DMBA hoạt hóa gene gây u bằng cách gắn nhóm 12-methyl của nó lên N-7 của adenin, gây ra sự chuyển đảo adenin thành thymin trên codon 61 của gene c-H-ras và cuối cùng dẫn đến sự hình thành các papillomas25 DMBA thường đóng vai trò như một chất khởi phát – initiator, đặc biệt trong các mô hình gây u da 2 giai đoạn với chất tăng hoạt – promoter là croton oil hoặc TPA

1.2.2.2 Croton oil

Croton oil được chiết xuất từ hạt cây Ba Đậu, tên khoa học là Croton Tiglium, thuộc

họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Thành phần chính của croton oil là các ester phorbol, trong đó chiếm chủ yếu là TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetat) (Hình 1.2)

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA)

Croton oil là một chất gây phỏng rất mạnh: khi bôi lên da, da bị nóng bỏng và phồng lên, tạo mụn nước sau đó thành mụn tróc da Croton oil có tác dụng chậm, và chỉ tác dụng lên trên bề mặt da, sau khi khỏi mụn thì không để lại sẹo, trừ khi tại cùng một chỗ bôi nhiều lần26

Trong mô hình u da trên chuột, croton oil đóng vai trò là chất tăng hoạt nhờ khả năng gây viêm, làm thúc đẩy quá trình tăng sinh tế bào và sự hình thành khối u

1.2.3 Các mô hình gây u da hai giai đoạn bằng hóa chất trong các nghiên cứu trên thế giới

Đây là mô hình được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu về đánh giá tác động của các thuốc kháng u cũng như tìm hiểu bản chất các giai đoạn của ung thư biểu

mô Khác với mô hình sử dụng đơn chất, mô hình này sử dụng hai hóa chất gây u với mục đích và thời gian tác động khác nhau Hai chất được sử dụng chính trong

mô hình này gồm DMBA và croton oil (hoặc TPA) DMBA được sử dụng một lần duy nhất, dùng để gây đột biến gene ở giai đoạn khởi phát Croton oil sau đó sẽ được bôi lặp lại trong một khoảng thời gian thử nghiệm nhất định, đóng vai trò tăng hoạt quá trình viêm và kích thích sự tiến triển và hình thành khối u

Mô hình gây u này giúp quan sát được hai giai đoạn u riêng biệt, có lợi lớn trong việc theo dõi sự ảnh hưởng của yếu tố môi trường hoặc tác dụng của thuốc thử nghiệm lên các giai đoạn khác nhau của sự hình thành khối u Thời gian quan sát sự tiến triển của khối u có thể diễn ra trong suốt vòng đời của chuột Trong quá trình quan sát, có thể sử dụng các phương pháp không xâm lấn để đánh giá mức độ tiến triển u và cuối thử nghiệm có thể tiến hành giải phẫu vùng da giúp đánh giá một cách toàn diện, khách quan và cho kết quả tin cậy Các khối u gây ra bởi mô hình 2 giai đoạn có thể là papilloma lành tính hoặc có thể là carcinoma tế bào gai (SCC)

Vì vậy, mô hình này tạo cơ hội có thể theo dõi sự tiến triển sớm và muộn trong quá trình phát triển của khối u27

Tuy nhiên, giống chuột nhắt thử nghiệm, liều lượng chất gây ung thư, tần suất bôi, khoảng cách giữa giai đoạn khởi phát và kích hoạt thường thay đổi giữa các nghiên cứu Bảng 1.1 liệt kê tóm tắt một số mô hình ung thư da hai giai đoạn trên thế giới

Bảng 1.1 Một số mô hình ung thƣ da hai giai đoạn trên thế giới

Belman S

và cs., 197228

Chuột Swiss Millerton

6-8 tuần tuổi

Bôi 1 lần duy nhất DMBA (25µg) Sau 2 tuần, bôi 200µl croton oil 0,5% 3 lần/tuần

Khối u đầu tiên: tuần 6 100% số chuột bị u sau 14 tuần

Prashar R

và cs., 199429

Chuột Swiss albino

Villaseñor

I.M

và cs., 200230

Chuột Swiss Webster albino

Bôi 1 lần duy nhất DMBA (410 µg) Sau 4 ngày, bôi 200µl croton oil 0,03%, 3 lần/tuần trong 20 tuần

Khối u đầu tiên: tuần 9 100% chuột bị u ở tuần 20

Das R K

và cs., 200431

Chuột Swiss albino 5-6 tuần

Bôi 1 lần duy nhất DMBA (100µg) Sau 2 tuần, bôi 100 µl croton oil 1% 3 lần/tuần trong 16 tuần

Khối u đầu tiên: tuần 7 100% chuột bị u ở tuần 16

Khối u đầu tiên: tuần 6 66,7% chuột bị u ở tuần 11

Chaudhary

G

và cs., 201147

Chuột Swiss albino, 7-8 tuần tuổi

Bôi 1 lần duy nhất DMBA (100µg) Sau 2 tuần, bôi 100 µl croton oil 1% 3 lần/tuần trong 16 tuần

100% chuột bị u ở tuần 16

Arya P và

cs., 201150

Chuột Swiss albino 7 – 8

tuần tuổi

Bôi 1 lần duy nhất DMBA (100 µg) Sau 2 tuần, bôi 100 µl croton oil 1%, 3 lần/tuần trong 16 tuần

100% số chuột bị u papilloma vào tuần thứ 16

Khối u đầu tiên: tuần 6 44,4% chuột bị u sau

10 tuần Subramanian

V và cs,

201351

Chuột Swiss albino 8-10 tuần tuổi

Bôi 1 lần duy nhất DMBA (100 µg) Sau 2 tuần, bôi 100 µl croton oil 1% 3 lần/tuần trong 16 tuần

100% số chuột có u sau 16 tuần

Dựa trên các hướng dẫn về quy trình gây ung thư da trên chuột nhắt trong tài liệu của Cold Spring Harbor Protocols34, mô hình ung thư da hai giai đoạn trên chuột nhắt bao gồm bôi một lần duy nhất hóa chất khởi phát DMBA, tiếp theo bôi lặp lại hóa chất tăng hoạt TPA Khối u phát triển dưới dạng các papilloma lành tính sẽ thoái hóa hoặc tiến triển thành SCC, hoặc SCC phát triển mà không có một tổn thương trước đó Trong protocol này cũng đề nghị một số thông số liên quan đến khả năng gây mô hình:

 Liều dùng của DMBA và TPA: có thể thay đổi trong khoảng 100-400 nmol DMBA và 2-20nmol TPA tùy theo chế độ liều thấp hay cao Tham khảo các nghiên cứu khác nhau chúng tôi nhận thấy các mô hình gây ung thư da trên chuột nhắt thường sử dụng DMBA và croton oil với liều bôi lần lượt là 100 μL dung dịch DMBA 0,1% (tương ứng 100 μg/chuột) và 100 μL croton oil 1%35,36,37,38,39

 Khoảng cách giữa 2 tác nhân là 1 tuần, tức bôi 1 lần duy nhất DMBA, sau đó

1 tuần bắt đầu bôi lặp lại TPA Tuy nhiên, các công trình khác nhau lại có khoảng cách từ 4 ngày cho đến 14 ngày (2 tuần)

 Tần suất bôi TPA là 2 lần/tuần, tần suất ít hơn hay nhiều hơn sẽ làm giảm số lượng khối u Tuy nhiên, đa số các mô hình lại chọn cách bôi 3 lần/tuần

1.2.4 Đặc điểm mô học khối u trên da chuột

1.2.4.1 Cấu trúc da chuột

Da chuột nhìn chung tương tự da người về thành phần cấu tạo: đều có lớp biểu bì, trung bì, hạ bì và các phần phụ của da nhưng mỏng hơn và các nang lông phân bố dày đặc hơn (Hình 1.3) Lớp biểu bì da chuột trưởng thành thường rất mỏng (gồm 1 đến 2 lớp) nhưng vẫn bao gồm đầy đủ bốn lớp cấu tạo chính giống như da người: lớp tế bào đáy, lớp tế bào gai, lớp tế bào hạt và lớp sừng (Hình 1.4)

Hình 1.3 Cấu trúc da người (A) và da chuột (B)

Nằm trong cùng của lớp biểu bì là lớp đáy, gồm các tế bào hình trụ, nằm vuông góc với đường phân cách giữa biểu bì và chân bì Lớp đáy có chức năng tăng sinh và là nơi duy nhất diễn ra quá trình phân bào40

Lớp tế bào gai nằm trên tế bào đáy, là những tế bào đa diện, xếp sát nhau, trên bề mặt có những nhú bào tương giống những cái gai Các tế bào hạt nằm trên lớp gai có chứa các hạt sừng keratohyalin trong bào tương, có dạng hình dẹt và độ dày mỏng phụ thuộc vào quá trình sừng hóa Ngoài cùng là lớp sừng, các tế bào dẹt hoàn toàn, màng bào tương dày và nhân biến mất Các tế bào sừng chồng chất thành lớp lên nhau và tế bào ngoài cùng nhất

luôn bị bong ra

Hình 1.4 Cấu trúc lớp biểu bì của da 1.2.4.2 Đặc điểm mô học khối u trên da chuột

Trong tất cả các mô hình gây u da bằng hóa chất trên da chuột, hầu hết các khối u ác tính đều là loại SCC41

Tăng sản (hyperplasisa): là hiện tượng tăng sinh các lớp tế bào không keratin của

biểu bì, có các đặc điểm nhận biết điển hình (Hình 1.5A) sau42,43:

- Độ dày của lớp tế bào gai và lớp tế bào hạt tăng

- Tăng số lượng tế bào của lớp biểu bì, đặc biệt ở lớp tế bào gai

- Thường kèm theo sự hình thành rete ridge và dày sừng

- Có thể bao gồm lớp mô đệm của nang lông

- Lớp màng đáy còn nguyên vẹn

Với hiện tượng tăng sản không điển hình (Hình 1.5B):

- Độ dày lớp tế bào gai và lớp tế bào hạt tăng bất thường

- Không phân biệt được ranh giới giữa lớp tế bào đáy, tế bào gai và tế bào hạt

- Tế bào sừng không điển hình với nhân to, tăng nhiễm sắc xuất hiện trong lớp tế bào đáy và lớp tế bào gai

Tăng sản tế bào gai xảy ra do nhiều nguyên nhân, bao gồm sự viêm nhiễm hoặc viêm tự phát, sự kích ứng bởi độc chất, sự cọ xát liên tục lớp sừng bề mặt hay việc tiếp xúc lâu dài với tia UV Trường hợp hyperplasia được gây ra trực tiếp bởi hóa chất xảy ra trong các mô hình gây u da thử nghiệm có sử dụng các tác nhân tăng hoạt như TPA

U nhú (papilloma): trong mô hình gây u da trên chuột, papilloma không được đánh

giá như papilloma ở người44 Nó là các khối u nhú có hình dạng rõ hoặc khối mô

sống không bao gồm tế bào mỡ với các đặc điểm biệt hóa rõ (Hình 1.6 )như sau42,43:

- Khối u nhú cấu tạo bởi các tế bào gai keratin hóa bao phủ lên mô đệm

- Màng đáy còn nguyên vẹn, các tế bào đáy xếp khít nhau, vuông góc với màng đáy

- Tế bào gai và tế bào hạt bị biệt hóa và keratin hóa thành các lớp tế bào dày kèm sự gia tăng bất thường các hạt keratohyalin

- Thường xuất hiện sự phân bào

- Các lớp tế bào trên màng đáy có thể có hiện tượng keratin hóa sớm (dyskeratosis)

- Tăng sinh lớp sừng

- Có thể bị loét và viêm

Ung thư tế bào gai (SCC): sự tiến triển thành SCC trên chuột ở mô hình gây u da

rất giống với SCC của người về mặt mô học (Hình 1.7) với các đặc điểm42,43:

- Các tế bào biểu bì phá vỡ màng tế bào đáy và xâm lấn xuống lớp bì; các tế bào u

có thể xâm lấn đến lớp cơ dưới da

- Có sự biệt hóa tế bào gai ở các mức độ khác nhau

- Các tế bào của khối u có hình dạng đa giác có màng tế bào rõ và bị keratin hóa ở nhiều mức độ; kích thước nhân to và số lượng phân bào nhiều

- Thường có viêm và loét

Hình 1.7 SCC ở da chuột

1.3 Hoạt chất có tác dụng kháng u được nghiên cứu

1.3.1 Imiquimod

Hình 1.8 Cấu trúc hóa học của imiquimod

Imiquimod (Error! Reference source not found 1.8) là hợp chất thuộc nhóm

midazoquinolon, có đặc tính như tác nhân kích thích và sửa đổi đáp ứng miễn dịch tại chỗ Cơ chế tác động của imiqimod có liên quan đến sự cảm ứng các cytokin Imiquimod tác động bằng cách hoạt hóa đại thực bào thông qua sự liên kết với các thụ thể bề mặt tế bào, dẫn đến giải phóng các cytokin gây viêm, chủ yếu là alpha-interferon (IFN), và interleukin-12, từ đó kích hoạt hệ thống miễn dịch của cơ thể chống lại tế bào ung thư46

Năm 1999, Imiquimod được FDA đã chấp thuận chỉ định điều trị mụn cóc cơ quan sinh dục ngoài và vùng quanh hậu môn; năm 2004, FDA chấp thuận thêm chỉ định điều trị ung thư tế bào đáy thể bề mặt (sBCC)47 Imiquimod có tác dụng ngăn ngừa

sự phát triển khối u và làm giảm nguy cơ tái phát ung thư tế bào đáy sau phẫu thuật

do đốt điện hoặc nạo curette48,49

Ngoài ra, việc sử dụng imiquimod làm giảm chi phí điều trị so với phương pháp phẫu thuật ở những bệnh nhân bị ung thư tế bào đáy mức độ nhẹ50 Kem imiquimod 5% được bôi trực tiếp lên khối u và vùng da xung quanh khối u khoảng 1 cm liên tục 5 ngày/tuần và liên tục trong 6 tuần Imiquimod nên được bôi trước khi đi ngủ để thuốc có thể lưu lại trên da khoảng 8 tiếng, sau đó vùng da điều trị nên được rửa bằng xà phòng và nước sạch Cần theo dõi chặt chẽ tình trạng ung thư vì imiquimod không tiêu diệt được tế bào ung thư ở sâu dưới bề mặt da Các khối u mục tiêu để điều trị thường có kích thước tối đa 2 cm51

Bên cạnh đó, nhiều thử nghiệm trên mô hình thú thử nghiệm hay trên lâm sàng còn cho thấy imiquimod có hiệu quả cao trong điều trị ung thư tế bào gai SSC Trên mô hình ung thư da SSC gây bởi DMBA/croton oil hay papillomavirus trên chuột nhắt cho thấy imiquimod có tác dụng ức chế sự tăng trưởng khối u trên cả hai mô hình; tuy nhiên imiquimod dường như có khả năng làm chậm sự phát triển của khối u do tác nhân hóa học gây ra hơn52 Một trong những cơ chế góp phần vào tác dụng này của imiquimod là do ức chế sự sản xuất yếu tố hoại tử khối u (Tumor Necrosis Factor – TNF)53 Trên lâm sàng, imiquimod còn thể hiện hiệu quả cao trong điều trị

ung thư tế bào gai in situ hay bệnh Bowen (Bowen's Disease)54,55,56 Ngoài ra, một

số nghiên cứu về hiệu quả của imiquimod trong điều trị SCCs cho thấy thuốc làm giảm 80% trường hợp SCC tại chỗ khi bôi 5 lần 1 tuần trong 11 tháng và 71% trường hợp SCC xâm lấn khi bôi 5 lần 1 tuần trong 12 tháng57

Nhiều hợp chất thiên nhiên đã được nghiên cứu rộng rãi nhằm đánh giá tiềm năng trong việc dự phòng ung thư Trong đó, curcumin chiết xuất từ thân rễ cây nghệ vàng đã chứng minh là một hợp chất tự nhiên đầy hứa hẹn vì sự hiệu quả và an toàn của mình, được sử dụng trong phòng ngừa nhiều loại ung thư58

Thân rễ cây nghệ vàng (Curcuma longa L., thuộc họ Zingiberaceae) bao gồm các

thành phần chính như curcuminoid (3-5%), tinh dầu (zingiberon, atlanton và tumeron), đường, nhựa và protein59

Curcuminoid (Hình 1.9) là các hợp chất nhóm phenol, gồm chủ yếu 3 hợp chất tạo màu vàng cơ bản cho củ nghệ, bao gồm curcumin, demethoxycurcumin và bis-demethoxycurcumin, với những tỉ lệ khác nhau, trong đó, curcumin là thành phần chính và quan trọng nhất

(A)

(B)

(C)

Hình 1.9 Cấu trúc hóa học các hợp chất curcuminoid

(A) Curcumin (B) Demethoxycurcumin (C) Bis-demethoxycurcumin Curcumin có nhiều hoạt tính sinh học quan trọng như kháng viêm, chống oxy hóa, làm lành vết thương, kháng khuẩn, kháng nấm,… đặc biệt khả năng ức chế tân sinh mạch máu và kháng khối u Tuy nhiên nhược điểm lớn nhất của curcumin là khả năng thẩm thấu qua da cũng như sinh khả dụng sau khi uống thấp60,61

Các nghiên cứu về dược động học của curcumin cho thấy, mặc dù curcumin cho sinh khả dụng thấp nhưng nồng độ gây tác dụng dược lý của curcumin hoàn toàn có thể đạt được tại các mô trực tràng của bệnh nhân sử dụng đường uống hay đạt được tại các mô da, niêm mạc miệng khi sử dụng đường tại chỗ62

Hoạt tính chống oxy hóa và chống viêm

Hoạt tính chống oxy hóa của curcumin được chứng minh qua hai cơ chế: ức chế sự peroxid hóa lipid và thu nhặt các gốc tự do trong tế bào (bao gồm anion superoxid, hydrogen peroxid và gốc nitrit) Trong khi đó, tác dụng kháng viêm của curcumin liên quan đến khả năng ức chế NF-kappa B, đây là một yếu tố phiên mã điều tiết sự biểu hiện của một loạt các gien liên quan đến quá trình viêm, tăng sinh tế bào và sự sống của tế bào Yếu tố NF-kappa B được phóng thích khi tế bào đáp ứng lại cytokin, tia UV, gốc tự do, tình trạng thiếu oxy (như khói thuốc lá), và các kháng

nguyên Curcumin ngăn chặn sự phóng thích NF-kappa B từ tế bào chất, vì vậy yếu

tố này không thể đi vào nhân để kích thích sự biểu hiện gien Ngoài ra, curcumin còn có khả năng ức chế cyclooxygenase và lipoxygenase, nên ức chế sự chuyển hóa acid arachidonic thành các hóa chất trung gian gây viêm như leucotrien, prostaglandin, thromboxan…Khả năng thu gọn gốc tự do, làm giảm các tác nhân oxy hóa cũng góp phần vào tính chất chống viêm của curcumin Những tính chất dược lý trên được nghiên cứu trong nhiều bệnh thực thể như: alzheimer, tim mạch, tiểu đường, hen suyễn, viêm ruột, viêm khớp, viêm tụy, và bệnh thận63,64,65

Curcumin trong dự phòng và điều trị ung thư da

Xét về cơ chế hoạt động, các tác nhân hóa trị liệu trong ung thư thường được phân loại theo 3 nhóm: chống oxy hóa, ức chế sự tăng sinh tế bào và tác nhân khóa các gốc hóa học gây ung thư Curcumin nằm trong cả 3 nhóm này, đưa đến nhiều giả thuyết về cơ chế tác động trong dự phòng ung thư59

Cơ chế phòng chống ung thư của curcumin khá phức tạp và là kết quả của nhiều cơ chế sinh hóa có liên quan đến nhiều giai đoạn khác nhau của quá trình sinh ung thư:

- Trong giai đoạn khởi phát, curcumin thu dọn các gốc tự do có khả năng gây đột biến ADN, làm giảm tác động của tia UV lên ADN và cảm ứng chức năng sửa chữa ADN của tế bào

- Curcumin ức chế các yếu tố phiên mã tạo NF-kappa B và AP-1, các yếu tố này điều hòa sự biểu hiện một loạt gen liên quan đến sự kiểm soát tế bào và quá trình gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của các tế bào ung thư

- Trong chu kỳ tế bào, sự kết hợp hai yếu tố cyclin D1 và CDK 4, 6 dependent kinase, kinase phụ thuộc cyclin) thúc đẩy sự phân chia tế bào, curcumin

(cyclin-ức chế sự biểu hiện của cyclin D1 và sự liên kết của hai yếu tố này66,67

Bên cạnh đó, curcumin còn được chứng minh có tác dụng ức chế sự tạo mạch trong

mô ung thư bằng cách điều chỉnh các yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu, yếu tố

tăng trưởng nguyên bào sợi cơ bản và ảnh hưởng đến một số phân tử kết dính tế bào68

Nhiều nghiên cứu trên mô hình động vật đã chứng minh hiệu quả của curcumin trong việc dự phòng và ức chế quá trình tiến triển ung thư Một trong những cơ chế hợp lý nhất giải thích các tác động này có liên quan đến việc ức chế quá trình tăng hoạt khối u Nghiên cứu do Limtrakul P và cộng sự công bố vào năm 1997 đã đánh giá việc sử dụng thêm 1% curcumin trong chế độ ăn tiêu chuẩn của chuột bị gây u bằng mô hình gây ung da hai giai đoạn với hai tác nhân DMBA/croton oil69 Chế độ

ăn có curcumin đã làm giảm tỉ lệ chuột mọc u và ức chế đáng kể số lượng cũng như thể tích khối u trên lưng chuột hơn so với nhóm chuột gây bệnh dùng chế độ ăn tiêu chuẩn, đồng thời không thấy sự khác biệt về trọng lượng của chuột giữa các nhóm Nghiên cứu này đã cho thấy sự an toàn và khả năng dự phòng ung thư của curcumin trên chuột

Nghiên cứu của Sonavane và cộng sự năm 2012 còn cho thấy tác dụng kháng viêm của curcumin dạng kem bôi thể hiện rõ hơn so với đường uống khi sử dụng cùng nồng độ Thật vậy, thành phần kem nền được bào chế giúp curcumin thâm nhập vào lớp biểu bì tốt hơn Đồng thời, do tính chất da chuột mỏng hơn da người nên curcumin có thể thấm qua da nhanh hơn, thời gian lưu lại trên da ngắn, tạo điều kiện cho sự tiếp xúc lâu dài với các tế bào u da Nhóm tác giả nhận định rằng, khả năng kháng viêm tại chỗ của curcumin đã góp phần đáng kể vào hoạt động phòng ngừa ung thư, vượt sinh khả dụng đường uống của curcumin

Nghiên cứu của Kuttan và cộng sự (1987) đã chứng minh việc sử dụng curcumin 1% dạng thuốc mỡ bôi tại chỗ trong ung thư giúp làm giảm đáng kể mùi hôi trên vùng da bị tổn thương do ung thư (90%), các triệu chứng đau hay kích thước vùng tổn thương trên bệnh nhân (10%)59

Như vậy, curcumin có thể tiêu diệt tế bào ung thư thông qua nhiều cơ chế, tuy nhiên lại không ảnh hưởng trên tế bào bình thường nên đây là một nguồn nguyên liệu tiềm năng cho việc nghiên cứu và phát triển thuốc điều trị ung thư Tính đến thời điểm

này, đã có rất nhiều nghiên cứu trên động vật và thử nghiệm lâm sàng, tuy vậy, cần

có những nghiên cứu bổ sung thêm để có thể khai thác đầy đủ tác dụng của curcumin70

1.3.3 Tía tô

Tía tô (hay Tử tô) tên khoa học Perilla frutescens (L.) Britton, thuộc họ Hoa môi

Lamiaceae, là một loài thực vật được dùng làm gia vị phổ biến ở các nước châu Á như Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản,… Ở Việt Nam, theo Vũ Xuân Phương (2000), chi Perilla L hiện có 3 taxon: P frutescens (L.) Britt.,là cây mọc hoang dại ở các tỉnh miền núi phía Bắc (Lào Cai, Lạng Sơn, Hòa Bình…) và hai dưới loài71

citral Tinh dầu tía tô có tác dụng kháng khuẩn in vitro đối với một số vi khuẩn như

tụ cầu vàng, trực khuẩn lao, Bacillus mycoides, liên cầu tan máu, Salmonella typhi…Hơn nữa, tía tô còn có tác dụng gây trấn tĩnh, hạ nhiệt, làm toát mồ hôi, ức

chế co thắt cơ trơn ruột gây nên bởi histamin và acetylcholin, gây cảm ứng đối với interferon73

Terpenoid và sterol

Bao gồm monoterpen như acid perillic, các triterpenoid như acid ursolic, acid oleanolic và acid tormentic Các sterol gồm có β – sitosterol, stigmasterol và campesterol Một số terpenoid khác như β – caroten, luteolin, neoxanthin, antheraxanthin và violaxanthin cũng được tìm thấy trong lá tía tô Trong số các terpenoid trên, acid tormentic được chứng minh là có tác dụng kháng ung thư mạnh trên chuột được gây ung thư bằng DMBA và TPA74

Phenolic, cinnamat và phenylpropanoid

Lá tía tô chứa một hỗn hợp lớn phenolic và cinnamat Điển hình là những dẫn xuất của acid cinnamic, acid rosmarinic, acid caffeic và acid ferulic Hoạt chất α- và γ- tocopherol trong lá tía tô đƣợc xác định nhƣ là chất chống oxy hóa74,75

Flavonoid và anthrocyanin

Flavonoid điển hình trong tía tô gồm có apigenin, luteolin, scutellarein và dẫn chất glycosid của chúng Trong nghiên cứu về tác dụng ức chế của những thành phần flavonoid và phenolic trên sự tăng sinh tế tào màng nâng cuộn mao mạch nuôi cấy của chuột gây bởi cytokin, đã nhận xét thấy cao tía tô ức chế sự tổng hợp ADN của tế bào Các thành phần phenolic đƣợc phân lập từ cao tía tô là acid caffeic, methyl caffeat, acid rosmarinic và lutein-7-O-glucuronid-6-methyl ester; trong đó, các flavonoid phân lập từ tía tô, luteoin có hoạt tính chống tăng sinh mạnh nhất74

1.3.3.2 Tác dụng dƣợc lý

Kháng viêm, kháng dị ứng

Dịch chiết tía tô đƣợc chứng minh là có thể ức chế tế bào sản sinh TNF-α, làm giảm quá trình viêm gây ra bởi acid arachidonic Acid triterpen đƣợc phân lập từ tía tô cũng thể hiện tác động kháng viêm ở chuột76 Tác động kháng viêm cũng đƣợc thể hiện bởi acid rosmarinic77 Bên cạnh đó, luteolin cũng làm giảm đáng kể lƣợng histamin phóng thích từ tế bào dƣỡng bào ở chuột cống thử nghiệm78

Kháng ung thư

Tác động ức chế quá trình sinh ung thƣ da của acid tormentic và acid rosmarinic đã đƣợc chứng minh trên mô hình gây ung thƣ da thực nghiệm bằng DMBA phối hợp với TPA trên chuột nhắt79,80 Ngoài ra, tác động này cũng đƣợc ghi nhận khi bôi cao chiết lá tía tô và tác động này đƣợc cho là do tác động của hoạt chất chính luteolin trong cao chiết81

Cao chiết lá tía tô cũng đƣợc chứng minh có tác động kháng ung thƣ in vitro trên

các dòng tế bào ung thƣ khác nhau nhƣ: dòng tế bào HL-60 (ung thƣ bạch cầu)82, dòng HepG2 (ung thƣ gan)83

, dòng A549 và dòng H1299 (ung thƣ phổi không tế bào nhỏ)84, dòng HCT116 (ung thƣ đại tràng)85 Acid rosmarinic từ tía tô ức chế

tăng sinh tế bào Jurkat (ung thư máu) bằng cách thay đổi biểu hiện cyclin, các chất

ức chế cyclin phụ thuộc kinase và chết tế bào86

,87 Ngoài ra, một số thử nghiệm lâm sàng cũng đã khảo sát tác động kháng ung thư của

lá tía tô trên người, bao gồm tác động phòng ngừa ung thư da (pha II)88, điều trị ung thư vú di căn (pha II)89, ung thư tuyến tiền liệt không phụ thuộc androgen di căn (pha II)90, ung thư tế bào thần kinh đệm ác tính tái phát (pha I/II)91

Các tác dụng dược lý khác

Dịch chiết lá tía tô thể hiện tác động làm sáng da in vitro thông qua cơ chế ức chế

men tyrosinase, từ đó làm giảm quá trình tổng hợp melanin của tế bào melanin chuột nhắt92 Ngoài ra, lá tía tô còn làm giảm protein niệu và ức chế tăng sinh tế bào giang mạch trong bệnh lý viêm cầu thận tăng sinh tế bào giang mạch (mesangioproliferative glomerulo-nephritis) trên chuột cống93

Một số công trình nghiên cứu khác nhau cũng đã chứng minh tác động có lợi của dầu ép từ hạt tía tô trên thần kinh trung ương như tăng khả năng học hỏi94, chống trầm cảm95, thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt trên một số vi khuẩn gây bệnh răng

miệng hay kháng lại độc tố do vi khuẩn Staphylococcus aureus tiết ra96,97 Dầu tía

tô cũng làm giảm lượng cholesterol và triglycerid trên chuột cống98

1.4 Tính cấp thiết của đề tài

Ung thư là một trong những căn bệnh phổ biến, là nguyên nhân gây tử vong xếp hàng thứ 2 trên thế giới Trong đó, ung thư da là một trong 10 loại ung thư chiếm tỉ

lệ cao nhất trên thế giới cũng như tại Việt Nam99… Ở nước ta, tình hình ung thư da không melanoma đang gia tăng do thời gian chiếu sáng nhiều và tỷ lệ người dân tiếp xúc với ánh sáng mặt trời thường xuyên Ngoài ra, người dân tiếp xúc với các hóa chất độc hại trong môi trường, hoạt động nghề nghiệp, hay trong thức ăn ngày càng gia tăng Tuy nhiên, các sang thương ung thư hay tiền ung thư da vẫn chưa được quan tâm đúng mức Mặc dù nếu được phát hiện sớm thì có khả năng điều trị khỏi rất cao; tuy nhiên, nếu không được điều trị sớm hoặc điều trị không đúng, ung thư da sẽ ngày càng phát triển, có thể di căn đến những cơ quan khác và ảnh hưởng xấu đến tính mạng người bệnh

Các biện pháp điều trị ung thư da hiện nay chủ yếu dựa trên các biện pháp can thiệp như đông lạnh mô bằng nito lỏng, phẫu thuật cắt mô, loại bỏ vùng da có khối u, dùng tia laser, Bên cạnh đó, phương pháp xạ trị hay hóa trị cũng được chỉ định Tuy nhiên, các phương pháp này thường gây nhiều độc tính trên bệnh nhân như rụng tóc, giảm cân, buồn nôn, nôn, tiêu chảy, mệt mỏi, chán ăn, táo bón, rối loạn vị giác,… Các thuốc hóa trị dùng ngoài giúp giảm thiểu các tác dụng phụ này nhưng lại khó tìm và giá thành còn tương đối cao như chế phẩm chứa 5-Fluorouracil hay Imiquimod Ngoài ra, các chế phẩm này cũng gây nhiều tác dụng phụ tại chỗ như sưng phù, đau, đỏ vùng da bôi thuốc100… Do đó, việc sử dụng các dược liệu trong điều trị ung thư ngày càng được quan tâm và phát triển

Việc nghiên cứu và thẩm định mô hình ung thư da trên thú thử nghiệm là cần thiết, góp phần phát triển mô hình dược lý thực nghiệm mới,và có thể ứng dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm dược lý khác nhau Mô hình giúp sàng lọc, đánh giá hiệu quả

dự phòng và điều trị ung thư da của các hoạt chất/dược liệu nhằm phát hiện và phát triển các nguồn thuốc mới trong nước, góp phần giảm gánh nặng về sức khỏe cũng như về chi phí điều trị ung thư da tại Việt Nam

Đề tài cũng áp dụng mô hình đã thẩm định để đánh giá tác động kháng ung thư da của lá tía tô và đối chứng với hoạt chất thiên nhiên Curcumin từ củ nghệ Theo kinh nghiệm sử dụng trong dân gian của người Việt Nam, lá tía tô được dùng để trị cảm mạo phong hàn, ho, khí suyễn buồn nôn, có thai nôn mửa, chữa trúng độc cua, cá Ngoài ra, trong một số bệnh lý ngoài da như da mẫn ngứa, mụn cóc, làm đẹp da,… Tuy nhiên, các nghiên cứu về tác dụng dược lý của lá tía tô vẫn chưa được thực hiện, trong khi đó, một số nghiên cứu trên thế giới cũng đã chứng minh tác động chống oxy hóa, kháng viêm, kháng ung thư da của các dịch chiết từ lá tía tô

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng giống đực, chủng Swiss albino, hoàn toàn khỏe mạnh, không bị dị

tật, không có biểu hiện bất thường, được cung cấp bởi viện Vaccin và sinh phẩm Y

tế Nha Trang Trọng lượng khi bắt đầu thí nghiệm là từ 25 – 30 gram

Chuột được nuôi ổn định 1 tuần trước khi tiến hành thí nghiệm Trước khi tiến hành thí nghiệm 1 – 2 ngày, chuột được cạo lông trên phần diện tích 2 x 2 cm2 da lưng và cách đuôi 1,5 cm Sau đó, chuột được phân ngẫu nhiên vào các lô khác nhau Mỗi chuột được nuôi riêng trong các ô có kích thước 12 x 12 x 15 cm, 1 lồng 6 ô

Trong suốt quá trình thử nghiệm, chuột được cung cấp nước và thức ăn dạng viên

do Viện vaccin và sinh phẩm Y tế Nha Trang cung cấp

2.1.2 Dược liệu tía tô

Cây tía tô được thu hái từ Từ Liêm, Hà Nội vào tháng 03 năm 2017 Dược liệu sau khi thu hái được nhặt lấy lá, rửa sạch rồi phơi trong mát, tránh ánh sáng trong 2 ngày, sau đó sấy trong tủ sấy (40 – 50 0

C) cho đến khô Xay thô dược liệu đến kích thước khoảng 4 mm để tiến hành chiết xuất, điều chế thành cao Ngoài ra, 1 cây tía

tô có đầy đủ các bộ phận (rễ, thân, lá, hoa) được sử dụng để phân tính đặc điểm thực vật học và lưu mẫu tại BM Thực Vật, Khoa Dược, ĐH Y Dược TP HCM

2.1.3 Hóa chất, thuốc thử

DMBA (≥ 95%), croton oil, acid rosmarinic (≥ 98%), quercetin, pyrogallol, thuốc thử DPPH (Sigma – Aldrich, Đức)

Kem Imiquimod 5% (Imiquad® - Glenmark, Ấn Độ)

Curcumin ≥ 95% (Apollo Ingredients, Ấn Độ)

Gel vi nhũ tương curcumin 4% (BM Bào Chế – Khoa Dược, ĐH Y dược TP HCM)) Chất chuẩn luteolin ≥ 95% (BM Dược liệu – Khoa Dược, ĐH Y dược TP HCM) Thuốc thử Folin – Ciocalteu, acetonitril PA (Merck, Đức)

Ethanol 96%, ethyl acetat, aceton (Chemsol Việt Nam)

Diethyl ether, glycerin, formalin (Trung Quốc)

Các thuốc thử: vanillin – sulfuric (VS), sắt (III) clorid 10%

Bộ hóa chất phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật

Bộ thuốc nhuộm vi phẫu mô thực vật

Máy siêu âm Sonorex RK – 1028H

Mặt kính đồng hồ, đĩa petry, kim mũi mác, phiến kính, lá kính

Kính hiển vi quang học Olympus, kính hiển vi soi nổi

Micropipet 20 – 200 µl, 100 – 1000 µl

Thước kẹp điện tử Digitronic Caliper 110-WR Series

Lồng sắt 6 ô, bocal nhựa, bocal thủy tinh, nắp lưới tròn

Một số dụng cụ thông thường khác của phòng thí nghiệm: bộ dao kéo mổ chuột, dao lam, becher, lọ đựng mẫu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 NỘI DUNG 1: PHƯƠNG PHÁP GÂY UNG THƯ DA TRÊN CHUỘT NHẮT BẰNG DMBA VÀ CROTON OIL

Thiết kế thử nghiệm

DMBA được pha trong aceton tạo dung dịch có nồng độ 0,2% (w/v), croton oil được pha trong aceton tạo dung dịch có nồng độ 2% (v/v) Các dung dịch này được pha ngay trước khi bắt đầu bôi trên chuột

Vào ngày đầu tiên của thử nghiệm, chuột được bôi 50 µL dung dịch DMBA 0,2% (tương ứng 0,1 mg DMBA, ) đóng vai trò tác nhân khởi phát, 1 lần duy nhất Một

đến hai tuần sau khi bôi DMBA, chuột tiếp tục được bôi 50 µL dung dịch croton oil 2% (tương ứng 1 µL croton oil) lặp lại 2 – 3 lần/tuần trong vòng 20 – 22 tuần

Cách bôi DMBA và croton oil: dung dịch DMBA hay croton oil được bôi trên da chuột (trung bình 12 – 15 µl/cm2 da chuột) bằng micropipet 20-200 µL Kéo nhẹ vùng da lưng đã cạo lông, giữ micropipet thẳng đứng và nhỏ từ từ từ dung dịch hóa chất từ trung tâm và di chuyển micropipet dần ra xung quanh để đảm bảo hóa chất được phủ đều trên vùng da cần bôi

Chuột được chia ngẫu nhiên vào các lô như sau:

- Lô 1 - Mô hình 1 (n=22): bôi dung dịch DMBA một lần duy nhất Một tuần sau, bôi dung dịch croton oil 2 lần/tuần cho đến kết thúc thử nghiệm

- Lô 2 - Mô hình 2 (n=21): bôi dung dịch DMBA một lần duy nhất Hai tuần sau, bôi dung dịch croton oil 2 lần/tuần cho đến kết thúc thử nghiệm

- Lô 3 - Mô hình 3 (n=20): bôi dung dịch DMBA một lần duy nhất Một tuần sau, bôi dung dịch croton oil 3 lần/tuần cho đến kết thúc thử nghiệm

- Lô dung môi (n=6): bôi dung môi aceton 3 lần/tuần từ lúc bắt đầu cho đến kết thúc thử nghiệm

Chuột được theo dõi và ghi nhận các chỉ tiêu vào cuối mỗi tuần cho đến tuần 20 Cuối thử nghiệm, giết chuột bằng đá CO2 Tách phần da lưng đã bôi thuốc của chuột để phân tích những biến đổi về hình thái của tế bào

Từ thử nghiệm này, chúng tôi chọn ra mô hình gây u da bằng DMBA và croton oil tối ưu nhất để khảo sát đáp ứng của mô hình với điều trị là curcumin và imiquimod

Các chỉ tiêu đánh giá thử nghiệm

 Đánh giá trong quá trình thử nghiệm

Chuột được theo dõi mỗi ngày Ghi nhận những thông số sau vào cuối mỗi tuần:

- Tỉ lệ chuột sống sót sau mỗi tuần

- Tỉ lệ chuột mang u trong mỗi lô:

Tỉ lệ chuột mang u (%) = (Số chuột có ít nhất một khối u)×100 / (Số chuột còn sống sót)