Nghiên Cứu Áp Dụng Kỹ Thuật Pcr Điện Di Phát Hiện Tác Nhân Gây Hội Chứng Ahpnd Ems Ở Tôm.pdf

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu) NGHIÊN CỨU ÁP DỤNG KỸ[.]

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM

TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

NGHIÊN CỨU ÁP DỤNG KỸ THUẬT PCR ĐIỆN DI PHÁT HIỆN TÁC NHÂN GÂY HỘI CHỨNG AHPND/EMS Ở TÔM

CHỦ NHIỆM NDNC

(Ký tên)

PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương

ThS Đoàn Thị Quỳnh Hương

CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ

(Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận)

TÓM TẮT ĐỀ TÀI

Hội chứng tôm chết sớm - EMS (Early Mortality Syndrome) hay là bệnh hoại tử gan tụy cấp – AHPND (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease) mới xuất hiện trên tôm nhưng đã nhanh chóng lan rộng ra và ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của ngành thủy sản của nhiều quốc gia, trong đó có Việt Nam Để góp phần giảm thiểu tác hại của dịch bệnh, nghiên cứu này đã được tiến hành nhằm xây dựng phương pháp PCR điện di phát hiện tác nhân gây bệnh AHPND trên tôm với độ nhạy và độ đặc hiệu cao Khi áp dụng trên mẫu thực tế, các phương pháp PCR định tính này cho thấy có sự tương đồng rất cao giữa phương pháp PCR với các phương pháp phát hiện AHPND khác hiện có

Từ khóa: Bệnh hoại tử gan tụy cấp, AHPND/EMS, PCR điện di,

ABSTRACT

Early Mortality Syndrome – EMS or Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease- AHPND has appeared on shrimp in recent years, which spreads quickly and causes serious effects on the development of aquaculture industry in many countries, including Vietnam To reduce the effects of this disease, two sensitive and specific PCR methods namely electrophoresis PCR were developed to detect pathogens causing AHPND on shrimp When being applied in experimental samples, it was shown that PCR method produced highly similar results to other available AHPND detection methods

Key word: Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease, AHPND/EMS, electrophoresis PCR

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nuôi tôm tại Việt Nam

1.2 Hội chứng tôm chết sớm - hoại tử gan tụy cấp (EMS/AHPND)

1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu

Chương 2 – NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung 1: Xây dựng qui trình PCR điện di phát hiện tác nhân gây

hộichứng AHPND/EMS ở tôm

2.2 Nội dung 2: Xác định các thông số kỹ thuật của qui trình PCR điện di

phát hiện tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm

2.3 Nội dung 3: Bước đầu đánh giá hiệu quả sử dụng của phương pháp

PCR điện di phát hiện tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS trên mẫu tôm

bệnh

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nội dung 1: Xây dựng quy trình PCR điện di phát hiện tác nhân gây

hội chứng EMS/AHPND ở tôm

3.1.1 Kiểm tra các cặp mồi phát hiện EMS theo công trình của Tim Flegel

3.1.2 Thiết kế chứng nội IC – Internal Control

3.1.3 Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR

3.2 Nội dung 2: Xác định các thông số kỹ thuật của qui trình PCR điện di

phát hiện tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm

i

ii

iv

v vii

3.3 Nội dung 3: Bước đầu đánh giá hiệu quả sử dụng của phương pháp

PCR điện di phát hiện tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS trên mẫu tôm

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

EMS Early Mortality Syndrome - Hội chứng tôm chết sớm

AHPND Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - Chứng hoại tử gan

- tụy cấp

OIE World Organisation for Animal Health - Tổ chức chăm sóc

sức khỏe thú y quốc tế

IC Internal Control - Chứng nội

LOD Limit of Detection - Giới hạn phát hiện

FDA Food and Drug Administration

DANH SÁCH BẢNG, ĐỒ THỊ

1.1 Tổng hợp diện tích nuôi của cả nước trong 10 tháng đầu năm 2014 1

1.2 Các tỉnh trọng điểm về nuôi tôm tại Đồng bằng Sông Cửu Long năm

2014

2

2.1 Trình tự các cặp mồi phát hiện EMS theo công trình của Tim Flegel 7

2.3 Thành phần và nồng đô ̣ hóa chất phản ứng PCR tối ưu hóa nhiệt độ lai 9

2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR tối ưu hóa nhiệt độ lai 10

2.5 Thành phần và nồng đô ̣ hóa chất phản ứng PCR tối ưu hóa nồng độ

Mg2+

10

2.6 Chu trình nhiệt củaphản ứng PCR tối ưu hóa nồng độ Mg2+ 11

2.7 Thành phần và nồng đô ̣ hóa chất phản ứng PCR so sánh độ nhạy của

phản ứng AP3 có IC và không có IC

11

2.8 Thành phần và nồng đô ̣ hóa chất phản ứng PCR so sánh độ đặc hiệu

của phản ứng AP3 có cặp mồi chứng nội IC

12

3.1 Thông số trên lý thuyết của 3 cặp mồi AP1R – AP1F, AP2R – AP2F,

3.3 Kết quả đánh giá độ nhạy phân tích – LOD50 của qui trình PCR điện di

phát hiện tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm

25

3.4 Kết quả đánh giá độ đặc hiệu phân tích của qui trình PCR điện di phát

hiện tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm

28

3.5 Kết quả đánh giá độ lặp lại của qui trình PCR điện di phát hiện tác 29

nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm (lần 1)

3.6 Kết quả đánh giá độ lặp lại của qui trình PCR điện di phát hiện tác

nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm (lần 2)

30

3.7 Kết quả đánh giá độ lặp lại của qui trình PCR điện di phát hiện tác

nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm (lần 3)

31

3.8 Kết quả đánh giá độ lặp lại của qui trình PCR điện di phát hiện tác

nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm (lần 4)

32

3.9 Kết quả so sánh phương pháp phát hiện AHPND/EMS bằng PCR sử

dụng cặp mồi AP3 với Kit IQ 2000 và phương pháp soi gan

34

DANH SÁCH HÌNH

1.1 Bản đồ thể hiện các tỉnh trọng điểm về nuôi tôm tại Việt Nam 2

1.2 Bản đồ dịch bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm năm 2012, 2013 và 9

tháng đầu năm 2014 tại Việt Nam

3

1.3 Cấu trúc mô gan tụy của tôm khi phân tích bằng kỹ thuật mô bệnh

học

4

1.4 Dấu hiệu tôm thẻ chân trắng nhiễm bệnh Hoại tử gan tụy 5

3.4 Kết quả kiểm tra hoạt động thực tế của cặp mồi AP1 19

3.5 Kết quả kiểm tra hoạt động thực tế của cặp mồi AP2 19

3.6 Kết quả kiểm tra hoạt động thực tế của cặp mồi AP3 20

3.7 Kết quả sắp gióng cột trình tự của sản phẩm PCR với trình tự chuẩn 22

3.8 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của cặp mồi AP3 23

3.9 Kết quả khảo sát nồng độ Mg2+ của cặp mồi AP3 24

3.10 Kết quả so sánh phản ứng có IC và không có IC của cặp mồi AP3 24

3.11 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng PCR có cặp mồi chứng

nội IC

25

3.12 Kết quả điện di đánh giá độ đặc hiệu phân tích của qui trình PCR điện

di phát hiện tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm

29

3.13 Kết quả điện di đánh giá độ lặp lại của qui trình PCR điện di phát

hiện tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm (lần 1)

30

3.14 Kết quả điện di đánh giá độ lặp lại của qui trình PCR điện di phát 31

hiện tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm (lần 2)

3.15 Kết quả điện di đánh giá độ lặp lại của qui trình PCR điện di phát

hiện tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm (lần 3)

32

3.16 Kết quả điện di đánh giá độ lặp lại của qui trình PCR điện di phát

hiện tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm (lần 4)

33

3.17 Hình điện di kết quả khảo sát các mẫu tôm thực địa bằng phương

pháp PCR với cặp mồi AP3 đã tối ưu

36

THÔNG TIN ĐỀ TÀI

1 Tên đề tài/dự án: Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật PCR điện di phát hiện tác nhân gây

hội chứng AHPND/EMS ở tôm

2 Chủ nhiệm đề tài/dự án: PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương, ThS Đoàn Thị Quỳnh

Hương

3 Cơ quan chủ trì: Trung tâm Nghiên cứu & Phát triển Nông nghiệp Công nghệ Cao

TP HCM

4 Thời gian thực hiện: 12 tháng,từ tháng 01/2015 đến tháng 12/2015

5 Kinh phí được duyệt: 108.933.000 đồng

6 Mục tiêu: Nghiên cứu xây dựng phương pháp PCR điện di phát hiện tác nhân gây hội

chứng AHPND/EMS ở tôm

7 Sản phẩm của đề tài /dự án:

- Bài báo khoa học

- Quy trình công nghệ đáp ứng được nhu cầu phát hiện chính xác và sớm tác nhân gây AHPND/EMS ở tôm

MỞ ĐẦU

Ngành thủy sản đã và đang chiếm vị trí đặc biệt quan trọng trong chiến lược phát triển kinh tế-xã hội của Việt Nam Tại Quyết định số 332/QĐ-TTg ngày 03/03/2011 của Thủ tướng Chính phủ phê duyệt Đề án phát triển nuôi trồng thủy sản đến năm 2020 đã đề

ra mục tiêu “phát triển nhanh nuôi trồng thủy sản theo hướng công nghiệp hóa, hiện đại hóa, có hiệu quả, sức cạnh tranh cao và phát triển bền vững; trở thành ngành sản xuất chủ lực cung cấp nguyên liệu cho chế biến xuất khẩu và tiêu dùng trong nước, đồng thời tạo nhiều việc làm, tăng thu nhập cho nông, ngư dân, đảm bảo an sinh xã hội, góp phần xóa đói giảm nghèo và bảo vệ an ninh quốc phòng vùng biển, đảo của Tổ quốc” Mục tiêu cụ thể tại Quyết định 332 gồm: Đến năm 2015 sản lượng nuôi trồng thủy sản đạt 3,60 triệu tấn, trên diện tích 1,10 triệu ha; giá trị kim ngạch xuất khẩu đạt 3,5 - 4,0 tỷ USD, giải quyết việc làm cho khoảng 3,0 triệu lao động; đến năm 2020 sản lượng nuôi trồng thủy sản đạt 4,5 triệu tấn, trên diện tích 1,2 triệu ha; giá trị kim ngạch xuất khẩu đạt 5,0 - 5,5 tỷ USD, giải quyết việc làm cho khoảng 3,5 triệu người

Tuy nhiên, ngành nuôi tôm và xuất khẩu tôm có nguy cơ bị đe dọa nghiêm trọng bởi các loại dịch bệnh và tình hình ô nhiễm môi trường vùng nuôi Cụ thể, một số bệnh nguy hiểm trên tôm bao gồm: bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm (AHPND), bệnh đốm trắng (WSD), bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan biểu mô (IHHND) đã và đang gây ra thiệt hại trầm trọng cho người sản xuất, nuôi tôm Theo báo cáo của các địa phương, tổng diện tích nuôi tôm bị các bệnh nêu trên có chiều hướng gia tăng giữa qua các, cụ thể: năm 2012 có 36.738 ha; năm 2013 19.014 ha; trong năm 2014 có hơn 28.126

ha có diện tích bị bệnh; diện tích bị thiệt hại do ô nhiễm môi trường cũng tăng qua các năm Hiện nay, công tác phòng chống dịch bệnh thủy sản đã và đang được thực hiện theo những quy định tại Pháp lệnh Thú y năm 2004, Nghị định số 33/2005/NĐ-CP ngày 15/03/2005 của Chính phủ, Thông tư số 17/2014/TT-BNNPTNT ngày 20/6/2014 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (NN&PTNT)

Hiện nay, các phương pháp chẩn đoán bệnh AHPND/EMS dựa vào hình thái và giải phẩu bệnh chỉ có thể giúp xác nhận tình trạng gan phát triển bất thường ở tôm Bên cạnh

đó, phương pháp phân lập chủng V parahaemolyticus từ dịch nuôi tôm cũng chỉ xác

nhận sự xuất hiện của chủng vi khuẩn này trong ao nuôi mà không phân biệt được đó là

chủng V parahaemolyticus có mang AHPND hay không Do đó, các phương pháp này

đều chưa thể giúp xác nhận được tác nhân gây AHPND/EMS ở tôm nuôi một cách chính xác Trong khi đó, công cụ hữu hiệu giúp chẩn đoán sớm và chính xác tác nhân gây AHPND/EMS ở tôm bằng kỹ thuật PCR với độ đặc hiệu và độ nhạy lâm sàng có thể áp dụng và triển khai sử dụng trong điều kiện Việt Nam, góp phần vào nhiệm vụ kiểm soát bệnh dịch và hạn chế các thiệt hại mà căn bệnh này gây ra cho ngành nuôi trồng thủy sản

và nền kinh tế quốc gia

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nuôi tôm tại Việt Nam

Theo Tổng cục Thủy sản, đến thời điểm 31/10/2014, cả nước đã thả nuôi 675.830 ha, trong đó diện tích nuôi tôm sú là 582.514 ha, tôm chân trắng là 93.316 Sản lượng thu hoạch 568.668 tấn, trong đó sản lượng tôm sú đạt 240.937 tấn, tôm chân trắng 327.731 tấn Năm

2013, theo báo cáo của Tổng cu ̣c Thủy sản, cả nước có khoảng 29 tỉnh/thành nuôi tôm nước

lợ, với tổng diện tích thả nuôi 652.612 ha, sản lượng đạt 475.854 tấn Diện tích nuôi chủ yếu

tâ ̣p trung ở khu vực đồng bằng Nam bô ̣ (chiếm 93% so với tổng diê ̣n tích cả nước) và đóng góp 84,4 % tổng sản lượng cả nước Về cơ cấu tỷ lê ̣ nuôi tôm, đã có sự di ̣ch chuyển lớn về diê ̣n tích nuôi tôm sú sang nuôi tôm chân trắng Về phương thức nuôi tôm nước lợ đã có xu thế tăng dần diê ̣n tích nuôi bán thâm canh và bán thâm canh giảm dần diê ̣n tích nuôi quảng

canh

Bảng 1.1 Tổng hợp diện tích nuôi của cả nước trong 10 tháng đầu năm 2014

(Số liệu do Tổng cục Thủy sản báo cáo tại Hội nghị tổng kết nuôi tôm nước lợ năm 2014 và xây dựng

kế hoạch năm 2015 được tổ chức tại tỉnh Bến Tre vào ngày 04/11/2014)

vị tính

Kế hoạch

Thực hiện

10 tháng

2014

Ước thực hiện năm

2014

So sánh

KH

2014 (%)

So sánh cùng

kỳ 2013 (Tỷ lệ % tăng, giảm)

Hình 1.1 Bản đồ thể hiện các tỉnh trọng điểm về nuôi tôm tại Việt Nam

Bảng 1.2 Các tỉnh trọng điểm về nuôi tôm tại Đồng bằng Sông Cửu Long năm 2014

Cà Mau Bạc Liêu Sóc Trăng Bến Tre Kiên Giang Diện tích nuôi Tôm

nước lợ (ha) 267.000 124.471 52.487 52.000 90.389 Sản lượng nuôi tôm

nước lợ (tấn) 116.000 95.700 67.312 35.953 51.430 1.2 Hội chứng tôm chết sớm - hoại tử gan tụy cấp (EMS/AHPND)

Tôm là một đối tượng dễ nuôi trồng nhưng mang lại giá trị kinh tế cao cho nông dân và các nhà sản xuất Tuy nhiên, tôm cũng là đối tượng rất dễ nhiễm bệnh và là nguyên nhân lây lan nguồn bệnh giữa các đầm tôm, đặc biệt là con tôm giống, một trong hai nguồn (môi trường

và con giống) lây nhiễm bệnh chủ yếu cần phải được kiểm soát Hội chứng tôm chết sớm

(Early Mortality Syndrome - EMS) cũng còn gọi là chứng hoại tử gan - tụy cấp (Acute

Hepatopancreatic Necrosis Disease – AHPND) là bệnh thiệt hại nghiêm trọng cho tôm nuôi

tại Việt Nam (cả tôm thẻ chân trắng lẩn tôm sú) dù là nuôi thâm canh hoặc bán thâm canh Bệnh được ghi nhận lần đầu tiên ở Trung Quốc năm 2009 Trong năm 2010, bệnh đã được phát hiện trong khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long của Việt Nam Trong năm 2011, phát hiện bệnh này tại Malaysia Ở miền đông Thái Lan bùng phát bệnh này vào năm 2012 [6] Năm

2010, Phòng nghiên cứu Bệnh học Thuỷ sản, Trường Đại học Arizona (Phòng nghiên cứu của

GS Donald Lightner - UAZ-AP) nghiên cứu và chỉ rõ nguyên nhân gây bệnh

Bệnh AHPND đã gây tổn thất nghiêm trọng đến ngành thủy sản do có tỉ lệ tôm bệnh chết có thể lên đến 100% tổng lượng tôm nuôi chỉ sau vài ngày các triệu chứng bệnh được ghi nhận [8], trực tiếp làm giảm sản lượng tôm ở các quốc gia có dịch, và gián tiếp gây ảnh hưởng xấu đến thị trường xuất nhập khẩu tôm trên khắp thế giới, trong đó có Việt Nam Ở Thái Lan, theo Hiệp hội Thực phẩm đông lạnh của Thái cho biết AHPND làm giảm sản lượng hàng năm của họ xuống một nửa trong năm 2013, nghĩa là giảm đi 300.000 tấn Bên cạnh đó, tập đoàn

CP báo cáo lợi nhuận quý 1 giảm đi 70% so với cùng kì năm trước do thiệt hại của bệnh AHPND gây ra, tương đương với mức giảm 109,9 triệu đô la Mỹ Ở Việt Nam, dịch bệnh hoại

tử gan tụy cấp tính diễn ra vào hầu hết các tháng trong năm, nhưng tập trung vào giai đoạn từ tháng 4 đến tháng 8, do đây là khoảng thời gian nuôi tôm chính vụ Dịch bệnh diễn ra ở hầu hết các vùng trọng điểm nuôi tôm, trong đó, các tỉnh nuôi tôm chủ yếu ở ĐBSCL bị thiệt hại nặng nề nhất

Hình 1.2 Bản đồ dịch bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm năm 2012, 2013 và 9 tháng đầu năm

2014 tại Việt Nam

EMS thường xuất hiện trong vòng 45 ngày sau khi thả tôm giống Tôm nhiễm bệnh có biểu hiện hôn mê (lờ đờ, bơi tấp bờ), bỏ ăn, tỷ lệ chết lên đến 100%, chết toàn bộ ao nuôi Giai đoạn cấp tính được thể hiện bằng sự thay đổi bất thường của các tế bào biểu mô ống lượn gan tuỵ, với sự bong tróc cấp tính các tế bào cấu thành ống lượn các tết bào B (tế bào tiết men tiêu hoá), tế bào R (tế bào dự trữ), và tế bào F (tế bào chuyển tiếp) có sự sụt giảm đáng kể về số lượng; tế bào E (tế bào phôi) có sự hư hại về chức năng, thể hiện qua mức độ phân bào bị suy giảm rõ rệt và nhân tế bào có thể bị trường phồng (karyomegaly)

Hiện nay có 2 nhóm phương pháp giúp chẩn đoán bệnh AHPND gồm phương pháp chẩn đoán bệnh dựa vào hình thái và giải phẫu tế bào gan cùng với phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) Quan sát hình thái có thể nhận biết các dấu hiệu bệnh AHPND/EMS trên tôm bằng cách kiểm tra màu sắc, kích thước gan tụy tôm ngay tại ao nuôi Phân tích mô học của các mẫu bệnh phẩm tôm bị nhiễm bệnh EMS cũng cho thấy cấu trúc bất thường của các tế bào mô gan, tụy và sự xuất hiện các ổ viêm tụ khu trú trong gan tụy Tôm bị nhiễm bệnh

có gan tụy sẫm màu, kích thước to lên, sau đó chuyển sang tái xanh và co lại Một số gan thì gan tụy trong nhìn thấy cả mô, tương tự như màu gelatin có dịch [8, 9] Tỷ lệ chết liên tục xảy

ra giai đoạn này, gan tụy bị hủy hoại mất hình dạng Tuy nhiên, một nhược điểm lớn của phương pháp tế bào học là chỉ có thể xác nhận được về hình thái tế bào học của gan tôm, chứ không thể xác nhận chính xác tác nhân gây nhiễm AHPDN/EMS là có hay không

Hình 1.3 Cấu trúc mô gan tụy của tôm khi phân tích bằng kỹ thuật mô bệnh học [8]

Hình 1.4 Dấu hiệu tôm thẻ chân trắng nhiễm bệnh Hoại tử gan tụy [8]

(A, B) tôm bị nhiễm bệnh, gan tụy (HP) teo, màu nhợt nhạt, dạ dày (ST) và ruột (MG) không có thức ăn; (C, D) tôm khỏe, HP có kích thước bình thường với màu da cam hơi tối,

dạ dày và ruột đầy thức ăn

1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu

Hiện nay, một vài quốc gia như Cộng Hòa Dominica, Ecuador, Mexico, Nicaragua, Philippines, Mỹ… đã hoãn hoặc cấm nhập khẩu tôm sống và/hoặc tất cả các sản phẩm từ tôm

từ những nước có AHPND Chính vì AHPND có thể gây tác động xấu đến sự phát triển của ngành nuôi tôm nói riêng và sự phát triển nền kinh tế của nhiều quốc gia nói chung, nên kể từ năm 2011, nhiều cơ quan và viện nghiên cứu đã nỗ lực trong việc tìm nguyên nhân và giải pháp góp phần giúp kiểm soát tốt bệnh dịch và hạn chế các thiệt hại mà căn bệnh này gây ra cho ngành nuôi trồng thủy sản và nền kinh tế quốc gia [1]

Trong năm 2012 và 2013, các nhóm nghiên cứu của D.Lightner đã tìm ra nguyên nhân gây bệnh AHPND chính là một loại vi khuẩn được tìm thấy trong dạ dày tôm bệnh chính là

chủng Vibrio parahaemolyticus Tuy nhiên, chủng V.parahaemolyticus lại là nhóm vi khuẩn

sống khá phổ biến trong đường ruột của nhiều loài sinh vật chủ trong môi trường nước lợ/mặn

và cả trên tôm; do đó, tôm bệnh hay không bệnh, đều có thể mang vi khuẩn này Cộng đồng

khoa học thế giới đã phân biệt có đến hàng trăm dòng Vibrio parahaemolyticus khác nhau

thuộc loài này, tuy nhiên chỉ có một thiểu số các dòng có mang độc lực để có thể gây bệnh (trên người) và dòng vi khuẩn gây bệnh EMS trên tôm [8] Điều này tương tự như việc vi khuẩn Escherichia coli là hết sức phổ biến trong đường ruột của người nhưng chỉ có thiểu số các dòng của loài vi khuẩn này gây được bệnh, ví dụ như Escherichia coli O157:H7 Có rất nhiều dòng vi khuẩn cùng loài sống hạnh phúc trong đường ruột của vật chủ nhưng không gây

bệnh được gọi là “commensal bacteria” Việc phát hiện vi khuẩn V parahaemolyticus một

cách chung chung không được coi là cách chẩn đoán phát hiện bệnh EMS Do đó, vấn đề cốt lõi trong chuẩn đoán bệnh Hoại tử gan tụy hiện nay là tìm được dòng vi khuẩn mang độc lực

Chủng V.parahaemolyticus gây ra bệnh AHPND cho tôm, là chủng V.parahaemolyticus đặc

biệt có khả năng tiết ra các protein độc chất làm rối loạn chức năng gan tụy, các protein độc tố này được mã hóa bởi các trình tự DNA, được dự đoán là có thể đang nằm trên các plasmid của

vi khuẩn V.parahaemolyticus gây ra [9] Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có hình dấu phẩy

hơi cong và ngắn, Gram - và có lông nên rất di động Chúng lên men D-mannitol, maltose, L.arabinose, không lên men saccharose, oxydase dương tính và kỵ khí tùy tiện

Từ 2013, D.V Lightner và cộng sự đã sử dụng phương pháp PCR điện di như là một công cụ hữu hiệu để phát hiện tác nhân gây AHPDN/EMS Theo các công bố của nhóm, phương pháp PCR này được xây dựng dựa vào trình tự DNA nằm ngoài nhân (extra-

chromosomal DNA) chỉ xuất hiện đặc hiệu ở vài chủng khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây

bệnh EMS trên tôm [6, 8, 4, 5] Tuy nhiên sau đó, phương pháp PCR này hiện đã được thương mại hóa bởi công ty Công nghệ sinh học GeneReach, Đài Loan, (bộ kit IQ 2000)

Cùng lúc đó đó ở Thái Lan, giáo sư T.W Flegel và cộng sự cũng đã thiết kế 2 cặp mồi lần lượt là AP1, AP2 sử dụng cho phương pháp PCR điện di khác để phát hiện các chủng vi

khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh AHPND với độ nhạy của cả 2 phương pháp chẩn đoán

của cả 2 phương pháp là 100%, tuy nhiên độ đặc hiệu chẩn đoán của phương pháp PCR với cặp mồi AP1 và AP2 là chưa cao (93% và 97,7%)[6] Đến tháng 6 năm 2014, giáo sư T.W Flegel tiếp tục công bố rộng rải một phương pháp PCR điện di mới với cặp mồi AP3 cải tiến, cho thấy cả độ nhạy và độ đặc hiệu chẩn đoán của phương pháp cải tiến này đều đạt 100% [2], [3]

Sau này, phó GS H Kondo và I Hirono ở Đại học KHKT Hải dương Tokyo (TUMSAT) cũng tuyên bố phương pháp PCR phát hiện tác nhân gây AHPND/EMS của họ phát triển có độ chính xác là 100%, tuy nhiên họ không công bố các trình tự mồi sử dụng trong phương pháp PCR này [5]

Nhiều nghiên cứu quốc tế gần đây cho thấy phương pháp PCR đang trở thành một công

cụ hiệu quả hơn phương pháp chẩn đoán bệnh dựa vào hình thái và giải phẫu tế bào gan, vì phương pháp PCR giúp phát hiện nhanh, nhạy và chính xác tác nhân gây bệnh AHPND/EMS

ở tôm trên thế giới, và đặc biệt là các phương pháp PCR này hoàn toàn có thể áp dụng được trong điều kiện của Việt Nam hiện nay

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung 1: Xây dựng qui trình PCR điện di phát hiện tác nhân gây hộichứng AHPND/EMS ở tôm

- Kiểm tra các các cặp mồi phát hiện EMS theo công trình của Tim Flegel

 Kiểm tra độ đặc hiệu in silico: trình tự các bộ mồi AP1, AP2 và AP3 sau được

kiểm tra thông số vật lý, khả năng tự bắt cặp, bắt cặp 2 mồi bằng công cụ Oligo analyzer của hãng IDT-Mỹ và kiểm tra độ đặc hiệu của mồi trên ngân hàng dữ liệu GenBank bằng công cụ BLAST

Bảng 2.1 Trình tự các cặp mồi phát hiện EMS theo công trình của Tim Flegel

Tên mồi – trình tự của mồi Kích thước mồi

(số nucleotide) AP1F

 Kiểm tra độ hoạt động thực tế của mồi: Sau khi mồi được tổng hợp, phản ứng

PCR điện di được thực hiện với các thành phần phản ứng cơ bản với các mẫu tôm bệnh được thu nhận từ các tỉnh Sóc Trăng, Cà Mau để xác nhận khả năng hoạt động thực tế của mồi

 Kiểm tra độ đặc hiệu của sản phẩm PCR: Các sản phẩm PCR của các cặp mồi

được giải trình tự, xác nhận trình tự nucleotide có phù hợp với các trình tự công bố hay không

- Thiết kế chứng nội (IC-internal control) cho hỗn hợp PCR điện di:

Bổ sung vào hỗn hợp PCR 1 cặp mồi mã hóa cho vùng 18S RNA 143F

5’-TTCAGNTTTGCAACCATACTTCCC-3’, có kích thước sản phẩm PCR 848bp đặc hiệu cho

bộ gen của nhóm sinh vật giáp xác do Tổ chức chăm sóc sức khỏe thú y quốc tế OIE (World Organisation for Animal Health - OIE) công bố Cặp mồi này có vai trò là cặp mồi chứng nội

để nhân bản trình tự chứng nội, giúp kiểm soát quá trình tách chiết DNA và quá trình PCR về sau

- Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR như sau:

 Nhiệt độ lai: khảo sát từ 50-55oC

TGTACAATCTATTACCAC

- Mẫu chứng dương chuẩn là đoạn amplicon nhân tạo do hãng IDT-Mỹ tổng hợp dài

333bp dựa theo trình tự do T.W.Flegel công bố năm 2014

Bảng 2.3 Thành phần và nồng đô ̣ hóa chất phản ứng PCR tối ưu hóa nhiệt độ lai

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR tối ưu hóa nhiệt độ lai Bước Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ

Bảng 2.6 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR tối ưu hóa nồng độ Mg2+

Bước Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ

H2O 14.55 14.45 14.35 14.25 14.15 14.05 13.95 13.85 13.75

Tổng 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl Dựa vào các kết quả, nồng độ IC được lựa chọn là 100nM và thí nghiệm khảo sát độ

nhạy, độ đặc hiệu giữa phản ứng có mồi IC

Bảng 2.8 Thành phần và nồng đô ̣ hóa chất phản ứng PCR so sánh độ nhạy của phản ứng AP3

Bảng 2.9 Thành phần và nồng đô ̣ hóa chất phản ứng PCR so sánh độ đặc hiệu của phản ứng

AP3 có cặp mồi chứng nội IC

2.2 Nội dung 2: Xác định các thông số kỹ thuật của qui trình PCR điện di phát hiện tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm

- Độ đặc hiệu kỹ thuật là khả năng phát hiện phân biệt dịch mẫu cần phân tích mục tiêu với các dịch mẫu không là mục tiêu, bao gồm cả các thành phần có trong chất nền Thực hiện phản ứng PCR đã tối ưu trên mẫu DNA các bộ gen của các loại vi khuẩn thường gặp trong ống tiêu hóa của tôm để kiểm tra khả năng bắt cặp đặc hiệu với tác nhân gây AHPND/EMS và khả năng không bắt cặp của các trình tự không đúng AHPND/EMS

- Độ nhạy kỹ thuật được đánh giá qua chỉ số LOD (limit of detection), là giới hạn lượng dịch mẫu phân tích ít nhất có trong chất nền đặc trưng có thể cho kết quả dương tính Sử dụng

ít nhất 5 mức nồng độ amplicon, trong đó nồng độ thấp nhất phải âm tính hoàn toàn, nồng độ cao nhất phải dương tính hoàn toàn Tổng hợp kết quả và sử dụng phép thống kê Kaber-Spearman để tính LOD50 theo công thức của FDA (FDA-Food and Drug Administration) công bố Thực hiện lặp lại 6 lần lặp lại cho mỗi nồng độ, thực hiên 2 đợt

- Độ lặp lại là mức độ tương đồng giữa các kết quả lặp lại (ít nhất 3 lần lặp ) của mẫu trong cùng đợt xét nghiệm khi sử dụng 1 phương pháp Độ lặp được đánh giá thông qua số lần xuất hiện dương tính của lô mẫu đã biết qua những lần lặp lại khác nhau Thực hiện ít nhất trên 3 bậc nồng độ trình tự đích pha loãng, thực hiện lặp lại ít nhất 3 lần, được thực hiện với ít nhất 3 chỉ tiêu Độ lặp lại của phương pháp do 1 người thực hiện

Độ lặp lại của phương pháp do 2 người thực hiện

 Độ lặp lại của phương pháp trên các dòng thiết bị PCR khác nhau

Mẫu sử dụng: Mẫu DNA tách chiết từ tôm bị bệnh AHPND (kí hiệu mẫu: ST-B3) và 2 mẫu được pha loãng 1/10 và 1/1000 từ mẫu này Các dòng máy được sử dụng trong kiểm tra

độ lặp lại của phương pháp là Stratagene, ABI (2007), LifeECO

Bảng 2.9 Các mẫu dùng trong kiểm tra độ đặc hiệu

* Phương pháp ly trích DNA tổng số bằng Kit Wizard® Genomic DNA Purification từ

Promega – Mỹ

DNA từ dạ dày hoặc mô gan tụy tôm, từ phân của tôm bố mẹ hay tôm post, hoặc từ tôm post (nguyên con) hoặc cua còng, giáp xác trong ao (vật lan truyền hoặc có thể mang mầm bệnh) hoặc bùn đáy ao,… được khuyến cáo thực hiện thêm một bước là “làm giàu sơ bộ” nhằm gia tăng mật số vi khuẩn bằng cách nghiền và ủ các mẫu phân tích với môi trường TSB (tryptic soy broth) có chứa 1,5% muối NaCl trong 4 giờ ở nhiệt độ 30oC với máy lắc Sau đó

để cho hỗn hợp dung dịch lắng xuống, ly tâm và loại bỏ phần dung dịch phía trên, giữ lại phần kết tủa bên dưới DNA được ly trích từ phần mẫu kết tủa dưới đáy ống nghiệm sau khi ly tâm

Đối với mẫu vi khuẩn, có thể lấy trực tiếp khuẩn lạc để ly trích DNA

 Cho mẫu vào trong các ống eppendorf 1,5ml không có RNase Nghiền sinh khối với cho đến khi mẫu thành bột

Thêm vào mỗi ống eppendorf 600µl Nuclei Lysis Solution Ủ các ống ở 65oC trong 5 phút

Thêm tiếp vào mỗi ống eppendorf 3µl RNase Solution Ủ ở 37oC trong 15 phút Sau

đó làm mát mẫu ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

Thêm vào mỗi ống eppendorf 200µl Protein Precipitation Solution Vortex

Ly tâm ở 14000 vòng/ phút trong 3 phút

 Chuyển phần dịch trong bên trên sang ống eppendorf mới đã chứa sẵn 600µl isopropanol ở nhiệt độ phòng

Đảo nhẹ ống eppendorf rồi ly tâm ở 14000 vòng/phút trong 1 phút

 Loại bỏ dịch nổi và thêm 600µl ethanol 70% ở nhiệt độ phòng

 Tiếp tục ly tâm ở 14000 vòng/phút trong 1 phút

 Để bay hơi hết ethanol và làm khô DNA

 Thêm 100 µl DNA Rehydration Solution Ủ ở 65oC trong 1 giờ hoặc ở 4oC qua đêm

* Phương pháp định lượng DNA

Hàm lượng DNA trong mẫu được xác định bằng cách đo mật độ quang (OD - Optical Density) bằng máy đo độ hấp thu ánh sáng Eppendorf®BioPhotometer plus – Đức ở hai bước sóng 260 nm và 280 nm Thông thường tỉ số giá trị OD260/OD280 lớn hơn giá trị 1,8 thì sản phẩm DNA được cho là sạch, không bị lẫn proteinvà các tạp chất khác

Bước 1 Cân 2g agarose cho vào 100ml dung dịch đệm TAE 1X (Tris-acetate-EDTA) ở

nhiệt độ phòng, khuấy đều và để yên 1 phút Đun sôi khoảng trong lò vi sóng (làm nóng chảy gel và không tạo bọt)

Bước 2 Làm nguội gel xuống 50 – 55oC, đổ gel vào khuôn gel và lắp lược, không để bọt khí trên gel

Bước 3 Khi gel nguội, tháo lược, đặt khuôn gel vào buồng điện di và đổ dung dịch đệm

TAE chạy vào khay gel sao cho dung dịch đệm cao hơn mặt gel khoảng 2 – 5 mm

Bước 4.Trộn 5 l sản phẩm PCR với 1 l loading dye 3X trên mặt giấy parafin Cho hỗn hợp và DNA chuẩn vào giếng của gel, đậy nắp và cắm điện cực

Bước 5.Điện di ở 100V trong 60 phút

Bước 6 Chụp hình ảnh gel

* Phương pháp mô bệnh học (Lightner, 1996)

- Gan tụy tôm được tách ra khỏi phần đầu ngực và cố định trong dung dịch Davidson (330 ml cồn Ethanol 95%, 220 ml 37% formaldehyde, 115 ml HCl 50%, 335 ml nước cất) trong 24-72 giờ

- Sau đó được bảo quản trong dung dịch cồn 70%

- Mẫu được làm mất nước lần lượt qua các dung dịch cồn 95% và cồn tuyệt đối, mỗi nồng độ trong 4 giờ, làm trong và làm mềm bằng dung dịch methylsalicilate trong 12-24 giờ

- Ngâm mẫu trong dung dịch paraffin nóng chảy ở nhiệt độ 650C trong 6 giờ rồi đúc mẫu

- Các mẫu sau khi đúc sẽ được cắt thành lát 5μm

- Nhuộm mẫu bằng dung dịch Hematocyline và Eosin, và quan sát tiêu bản trên kính hiển vi quang học

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nội dung 1: Xây dựng quy trình PCR điện di phát hiện tác nhân gây hội chứng EMS/AHPND ở tôm

3.1.1 Kiểm tra các cặp mồi phát hiện EMS theo công trình của Tim Flegel

 Kiểm tra độ đặc hiệu in silico:

Trình tự các cặp mồi AP1, AP2 và AP3 được kiểm tra thông số vật lý, khả năng tự bắt cặp, bắt cặp giữa 2 mồi bằng công cụ Oligo analyzer của IDT và kiểm tra độ đặc hiệu của mồi trên ngân hàng dữ liệu GenBank bằng công cụ BLAST Kết quả kiểm tra in silico tại Bảng 3.1 cho thấy cả 3 cặp mồi đều có các thông số vật lý phù hợp; khả năng hình thành các cấu trúc heterodime, self-dimer ở mức cho phép; tỉ lệ % G-C phù hợp; kết quả BLAST trùng khớp với trình tự gen mục tiêu và phù hợp để tiến hành thực hiện phản ứng PCR (Hình 3.1, 3.2 và 3.3)

Bảng 3.1 Thông số trên lý thuyết của 3 cặp mồi AP1R – AP1F, AP2R – AP2F, AP3R – AP3F

Tên mồi – trình tự của mồi

Kích thước mồi

%GC Tm

( 0 C)

Kích thước sản phẩm PCR (bp) AP1F