TỔNG QUAN Y VĂN
Tổng quan về bệnh nám da và điều trị
Nám da là một rối loạn tăng sắc tố phổ biến, ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống và sự tự tin của người bệnh Tình trạng này gây ra lắng đọng melanin mạn tính trong lớp thượng bì, với các vết màu nâu không đều trên các khu vực tiếp xúc với ánh nắng, đặc biệt là trên mặt Nguyên nhân chính của nám da bao gồm di truyền, tiếp xúc lâu dài với tia UV và hormone nữ Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng viêm có thể đóng vai trò trong sự phát triển của nám Mỗi yếu tố gây ra tình trạng tăng sắc tố riêng biệt, như tăng sắc tố do UV (photoaging), do thuốc (thuốc tránh thai) và tăng sắc tố sau viêm (PIH).
Sơ đồ quá trình hình thành melanin được trình bày trong hình 1.1
Hình 1.1 Sơ đồ quá trình hình thành melanin
Nám da liên quan đến các gen mã hóa tyrosinase, enzym quan trọng trong quá trình tổng hợp melanin ở tế bào sắc tố, cùng với các protein liên quan như TRP-1 và TRP-2, bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố nội sinh và ngoại sinh Quan sát vi phẫu cho thấy tình trạng rối loạn sắc tố trong nám thể hiện qua sự tích tụ melanin trong tế bào sừng hoặc đại thực bào Melanin có hai dạng chính là eumelanin và pheomelanin, tạo ra các hạt melanin với hình thái và màu sắc khác nhau Dựa trên cơ chế bệnh sinh của nám, nhiều loại thuốc điều trị đã được nghiên cứu và một số đã được FDA chấp thuận, như hydroquinone, acid azelaic, và phối hợp hydroquinone 4%, tretinoin 0,05% và fluocinolone acetonide 0,01% trong dạng thuốc mỡ Tri-Luma.
Bảng 1.1: Thuốc điều trị nám da theo cơ chế bệnh sinh [9]
Hoạt động Cơ chế bệnh sinh Điều trị
Kích hoạt tyrosinnase Tăng tổng hợp melanin Hydroquinone
Acid azelaic Acid glycolic Kem bôi phối hợp giữa retinoid và steroid Ức chế bơm proton
Kích thích các tế bào sừng do UVB
Kích thích sản xuất tế bào sắc tố
Yếu tố tăng trưởng gây ra sự hình thành mạch
Tích luỹ cAMP và phosphoryl hoá CREB
Kiểm soát con đường tổng hợp melanin
Metformin Ảnh hưởng của nội tiết tố
Liên kết estrogen kích hoạt con đường tổng hợp melanin
Theo hướng dẫn chẩn đoán và điều trị bệnh da liễu của Bộ Y Tế năm 2015, các thuốc điều trị nám da bao gồm: [11]
- Thuốc làm giảm sắc tố da: hydroquinone, acid azelaic, leucodinin, vitamin
- Kem chống nắng hoặc corticoid
- Uống cloroquin, plaquinil, camoquil (mỗi ngày 1 viên, có thể dùng từ một đến ba tháng)
- Uống thêm các thuốc vitamin C, B, PP, L- cystin liều cao, kéo dài
Các loại thuốc có thể được sử dụng đơn lẻ hoặc kết hợp từ một đến hai loại, tùy thuộc vào từng trường hợp cụ thể và theo chỉ định của bác sĩ.
Tổng quan về mô hình gây tăng sắc tố da trên động vật thử nghiệm
Nghiên cứu của Serra và cộng sự vào năm 1970 đã tiến hành trên hai nhóm thỏ giống Black Giant Flemish và New Zealand, cho uống Chlorpromazine với liều lượng 20-30 mg/kg/ngày trong thời gian 3-6 tháng, kết hợp với 30 phút chiếu xạ UV lên vùng da đã cạo lông mỗi ngày Sau khoảng 3 tuần, vùng da cạo lông xuất hiện các khu vực tăng sắc tố riêng biệt, trong khi da thỏ New Zealand và những vùng da trắng của thỏ Black Giant Flemish chỉ có biểu hiện ban đỏ nhẹ Đặc biệt, các vùng da màu của thỏ Black Giant Flemish cho thấy sự tăng sắc tố đáng kể ở cả lớp biểu bì và hạ bì.
Nghiên cứu của Flesch và cộng sự, 1949 thực hiện chiếu tia UV trong vòng
Nghiên cứu cho thấy, sau 15 phút tiếp xúc với ánh sáng UV, lượng SH trong dịch chiết từ biểu bì da của thỏ màu giảm đáng kể so với thỏ trắng Nguyên nhân là do sự gia tăng melanin trong lớp biểu bì da của thỏ màu, giúp ngăn chặn sự hấp thụ tia UV và làm giảm lượng SH trong melanocyte Ngược lại, tia UV có thể xuyên qua lớp biểu bì da của thỏ trắng, dẫn đến lượng SH trong melanocyte không bị ảnh hưởng.
Nghiên cứu của Abbas S và cộng sự (2019) trên chuột không lông SKH-1 cho thấy việc tiếp xúc với benzanthrone ở liều 25 và 50 mg/kg, kết hợp với tia UVB (50 mJ/cm2) trong 24 giờ, đã làm tăng tình trạng viêm da Sự gia tăng này có thể thông qua trung gian oxy hóa của tín hiệu MAPKs-NF-κB/AP-1, dẫn đến tăng cường biểu hiện của COX-2 và iNOS, từ đó gây ra viêm da.
1.2.2 Mô hình gây tăng sắc tố bằng hormon
Nghiên cứu của Laugier P (1979) đã kiểm tra tác động của thuốc tránh thai trên núm vú lợn đực bằng cách thoa dung dịch 0,5 mg ethinyloestradiol mỗi ngày Sau 3 tuần, phân tích hình thái tế bào biểu bì cho thấy tình trạng tăng gai (acanthosis) và tăng sắc tố mạnh Trong khi đó, thuốc chứa mestranol và các chất proestogen tinh khiết không ghi nhận tác động này.
Nghiên cứu của Jadassohn W (1970) đã tiến hành trên các nhóm chuột để đánh giá tác động của hormon Nhóm đối chứng được cho uống 0,05 mcg hormon p, p-dioxydiphenylhexane, trong khi các nhóm chuột khác nhận Noracyclin, Anovlar, Eugynon, Provera và progesteron với liều lượng 0,025 mcg hoặc 0,25 mcg estrogen mỗi ngày.
Trong nghiên cứu kéo dài 21 ngày, tất cả các nhóm chứa estrogen đều cho thấy sự gia tăng gai (acanthosis) và tăng sắc tố mạnh mẽ ở cả hai liều, với hormon có tác dụng mạnh nhất Phì đại tuyến bã nhờn phát triển ở các nhóm hormon như Noracyclin, Provera và progesterone, Eugynon chỉ với liều 0,025 mcg, trong khi không quan sát thấy phì đại ở liều 0,25 mcg Đối với Anovlar, không có phì đại tuyến bã nhờn ở cả hai liều Kết quả về sắc tố được xem là có ý nghĩa lâm sàng trong việc điều trị nám.
Nghiên cứu của ZHOU Kai-yi và các cộng sự (2014) đã chỉ ra rằng việc gây nám có thể xảy ra khi sử dụng progesteron liều 12 mg/kg kết hợp với chiếu tia UV một giờ mỗi ngày trong 36 ngày Trong nghiên cứu, chuột ICR giống cái được phân chia ngẫu nhiên thành các nhóm: nhóm sinh lý, nhóm chứng, nhóm dùng thuốc đối chứng Baixiao dan với liều 3 g/kg, và nhóm Xiaozheng Wan với các liều thấp (1 g/kg), trung bình (2 g/kg), và cao (4 g/kg) Kết quả của nghiên cứu đã cung cấp những thông tin quan trọng về ảnh hưởng của các loại thuốc này đối với tình trạng nám.
7 thấy nhóm điều trị làm giảm đáng kể hàm lượng tyrosinase của gan và da so với nhóm chứng [17]
1.2.3 Mô hình gây tăng sắc tố do thuốc
In 1970, William and colleagues developed a model combining the stimulant DOPAJ4C with melanoma tumors using chlorpromazine and reserpine This model utilized male Swiss-Webster white mice weighing between 18 grams.
22 g đã cấy khối u melanoma Chuột được tiêm phúc mô chlorpromazine liều
5 mg/kg/ngày, trong 7 ngày Vào ngày thứ 5, tiêm phúc mô DOPAJ4C (3,93 mCi/mM) Sau ngày thứ 7, chuột có biểu hiện tăng sắc tố da [18]
Mô hình khảo sát cơ sở hóa lý của Clofazimin, do Rosania và cộng sự thực hiện vào năm 2017, sử dụng chuột Balb/c và C57B/6 từ 4-5 tuần tuổi với liều uống 10 mg/kg/ngày Sau 3-4 tuần điều trị, nghiên cứu cho thấy Clofazimin tích lũy trong các đại thực bào, chủ yếu ở gan và lá lách, đồng thời gây ra sự tăng sắc tố da đáng kể mà không hình thành kết tủa trên da.
Mô hình gây nám da của ZHOU Kai-yi và cộng sự đã được ứng dụng rộng rãi để nghiên cứu tác động của các thành phần trong điều trị nám da Dựa trên cơ sở khoa học này, nhóm nghiên cứu đã áp dụng mô hình gây nám da bằng cách chiếu tia UV và tiêm progesteron của LV Gao-Hong, với một số điều chỉnh để phù hợp với điều kiện thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Dược Lý, Khoa Dược, ĐH Y Dược TP HCM.
Tổng quan về dược liệu cao Tía tô
Tía tô đã được chứng minh có nhiều tác dụng dược lý qua các nghiên cứu toàn cầu, bao gồm khả năng kháng ung thư in vitro trên nhiều dòng tế bào như ung thư da, bạch cầu, gan, phổi không tế bào nhỏ và đại tràng Ngoài ra, nó còn thể hiện tác dụng kháng viêm và kháng dị ứng in vivo, cùng với khả năng làm giảm protein niệu và ức chế sự tăng sinh tế bào giang mạch trong các mô hình nghiên cứu.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Động vật thí nghiệm
Thỏ cái giống Britist giant, với trọng lượng từ 2-2,5 kg, khỏe mạnh và không có biểu hiện bất thường, được nuôi riêng từng con Trước khi tiến hành thử nghiệm, thỏ được chăm sóc trong điều kiện thí nghiệm ít nhất 5 ngày.
Thỏ được cung cấp chế độ ăn đầy đủ với cám viên từ Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế Nha Trang, kèm theo cà rốt và nước uống hàng ngày Trước khi tiến hành thử nghiệm, lông thỏ được cạo ở hai bên sống lưng một ngày, với diện tích thử nghiệm là 5 x 7,5 cm.
Dược liệu và phương pháp chiết xuất
Tía tô được thu hái tại Hà Nội, sau đó lá được nhặt, rửa sạch và phơi âm can cho đến khi khô Tiếp theo, dược liệu được xay thô đến kích thước khoảng 4 mm để tiến hành chiết xuất và điều chế thành cao.
Hình 2.1 Dược liệu Tía tô thu hái tại Hà Nội
Bột lá tía tô được chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi ethanol 50% Quy trình bắt đầu bằng cách làm ẩm 1900 gam bột dược liệu trong 20 phút Sau đó, rửa sạch, tráng cồn và lót bông gòn ở đáy bình chiết Dược liệu đã được làm ẩm được cho vào thành từng lớp với lực nén vừa phải, dung môi ngập mặt dược liệu khoảng 3 cm và ngâm lạnh trong 24 giờ trước khi rút dịch chiết.
Dịch chiết được thu hồi bằng cách ép bã và sử dụng máy cô quay chân không ở 55°C, với tốc độ khoảng 100 giọt/phút cho đến khi không còn phản ứng với thuốc thử FeCl3 5% trong ethanol Sau khi cô quay, dịch được lắc phân bố với ethylacetat cho đến khi không còn phản ứng với FeCl3, sau đó tiếp tục cô thu hồi dung môi đến khi đạt thể chất cao đặc trên bếp cách thủy ở 95 °C Cuối cùng, cao đặc được bảo quản ở nhiệt độ 2-8 °C.
2.2.3 Xác định độ ẩm của bột dược liệu và cao chiết EA
Thực hiện theo phương pháp Xác định mất khối lượng do làm khô bằng cách dùng cân sấy ẩm hồng ngoại theo Phụ lục 9.6 DĐVN V
Để thực hiện quy trình, cân khoảng 0,50 g cao hoặc 1,0 g bột dược liệu lên miếng giấy nhôm kích thước 4 × 4 cm, sau đó dàn mỏng cao đều trên bề mặt giấy Tiếp theo, đặt miếng giấy vào cân hồng ngoại để đo và ghi nhận kết quả Đánh giá kết quả bằng cách thực hiện 3 lần và lấy giá trị trung bình.
Xác định hiệu suất chiết
Trước khi tiến hành chiết và tạo cao, cần cân khối lượng bột dược liệu và xác định độ ẩm Sau đó, hiệu suất chiết cao toàn phần sẽ được xác định trong cồn 50° cùng với các cao phân đoạn dựa trên công thức đã được quy định.
Hiệu suất chiết = mcao x (100-a)/ mdl x (100-b) mcao: khối lượng cao (g) mdl: khối lượng bột dược liệu trước khi chiết (g) a: độ ẩm cao (%) b: độ ẩm bột dược liệu (%)
Hoá chất và thuốc thử
Bảng 2.1 Danh mục hoá chất và thuốc thử
STT Hoá chất Hãng cung cấp Nước sản xuất
3 BSA (Bovin serum albumin) Sigma-Aldrich Mỹ
4 Progesteron 25 mg/ml Rotexmedica Đức
8 Penicillin/streptomycin Invitrogen Corp Mỹ
11 Dimethyl sulfoxide Xilong Trung Quốc
12 NH4OH Guangdong Trung Quốc
15 Dimethyl sulfoxide Xilong Trung Quốc
17 Na2HPO4 Guangdong Trung Quốc
18 NaH2PO4 Guangdong Trung Quốc
Dụng cụ và trang thiết bị
Bảng 2.2 Danh mục thiết bị
STT Hoá chất Hãng cung cấp Nước sản xuất
1 Bể siêu âm Elma Đức
2 Bếp cách thuỷ WB-14 Memmert Đức
3 Cân kỹ thuật Kem Đức
4 Cân phân tích Kem Đức
5 Cân phân tích độ ẩm MB45 Sartorius Đức
6 Đèn UVA ZW36D17Y-H386 Cnlight Trung Quốc
7 Máy cô quay Heidolph Đức
8 Máy đo pH Orion Thermo
10 Máy ly tâm lạnh CT15E Hitachi Nhật Bản
11 Máy nghiền đồng thể cơ học
12 Máy vortex Genius 3 Ika Đức
13 Các dụng cụ: falcon 15, eppendorf 2 mL, micropipet, multimicropipet, đĩa 96 giếng đáy phẳng, flask, bình định mức, cuvet.
Đánh giá tác động của cao EA trên mô hình thỏ gây nám da bằng tia
Thỏ giống British Giant được chia thành các lô (mỗi lô ít nhất 4 thỏ) như sau:
Lô sinh lý: Thỏ được cạo sạch lông ở vùng da lưng, không chiếu UV và cho uống nước cất trong suốt quá trình thử nghiệm
Lô chứng bệnh: Thỏ được cạo sạch lông ở vùng da lưng, chiếu tia UV 30
13 phút mỗi ngày và tiêm progesteron cách ngày liều 5mg/kg trong 28 ngày
Thỏ được chuẩn bị bằng cách cạo sạch lông ở vùng lưng và chiếu tia UV trong 30 phút mỗi ngày Trong suốt 28 ngày, tiêm progesteron với liều 5 mg/kg cách ngày Khi xuất hiện vùng da tăng sắc tố vào ngày đầu tiên, bôi kem HQ 4% lên vùng da này mỗi ngày cho đến ngày thứ 28.
Để điều trị, thỏ cần được cạo lông ở vùng da lưng và chiếu tia UV 30 phút mỗi ngày Tiêm progesteron với liều 5 mg/kg cách ngày trong 28 ngày Khi xuất hiện vùng da tăng sắc tố vào ngày đầu tiên, bôi cao tía tô 5% lên vùng da này một lần mỗi ngày cho đến ngày thứ 28.
Nghiên cứu gây nám da trên thỏ được thực hiện bằng cách cạo sạch lông ở vùng da lưng của thỏ Trong quá trình thử nghiệm, thỏ được cố định trong hộp và chiếu tia UV lên phần da lưng trong 30 phút mỗi ngày Progesteron được tiêm với liều 5 mg/kg, cách ngày.
Để bôi cao Tía tô cho chuột, sử dụng que nhựa để trải đều kem lên da đã cạo lông cho đến khi toàn bộ bề mặt được phủ một lớp mỏng Sau khi bôi, hãy chờ cho kem khô hoàn toàn trước khi đưa chuột trở lại lồng nuôi.
Đánh giá kết quả
Mỗi tuần, hãy quan sát và chụp hình vùng da đã cạo lông, giữ khoảng cách 15 cm từ máy chụp hình đến vùng da nám Đánh giá cảm quan về tỷ lệ phần trăm nám sẽ được thực hiện thông qua phần mềm MATLAB, sử dụng ứng dụng color Thresholder để thiết lập ngưỡng phân chia màu sắc trên nhiều không gian màu khác nhau Hình ảnh của vùng da nám sẽ được chuyển đổi thành hình trắng/đen, trong đó màu trắng biểu thị da chưa nám và màu đen là da nám Cuối cùng, sử dụng hàm regionprops để tính diện tích vùng nám theo đơn vị pixel.
Tỷ lệ % nám = số đơn vị pixel bị nám/tổng số đơn vị pixel vủa vùng gây nám
Cố định thỏ trên mâm và tiêm bắp gentamicin với liều 12 mg/kg Sử dụng thuốc tê Lidocain 2,5% thoa đều lên vùng cần gây tê và để tiếp xúc trong 10-15 phút cho đến khi thấm hoàn toàn, sau đó lau sạch bằng dung dịch NaCl 0,9% Tiến hành cắt da với diện tích 2 cm x 2 cm, rửa sạch bằng dung dịch NaCl 0,9% và lau khô bằng giấy lọc Chia vùng cắt thành 2 phần.
- Lấy ẳ phần da ngõm vào formol 10% để nhuộm HE
- Lấy ắ da cũn lại ngõm vào formol 10% trong 10 – 15 phỳt, cạo loại bỏ mô mỡ, rửa sạch bằng dung dịch NaCl 0,9%
- Lau khô mẫu da, cân mảnh mô và tiến hành định lượng melanin
Cuối thử nghiệm, sử dụng dụng cụ bấm da để lấy mẫu da lưng (2 x 2 cm) đối xứng qua xương sống, sau đó tách mỡ, mô liên kết và cơ bám trên da, rửa bằng NaCl 0,9% lạnh Mẫu được chia thành hai phần để tiến hành phân tích hình thái tế bào và định lượng melanin.
Mẫu da được bảo quản trong dung dịch formol 10% và cắt thành tiêu bản dày 2-3 mm Sau đó, mẫu được xử lý và nhuộm bằng hematoxylin – eosin (HE) để thực hiện phân tích vi thể tại khoa giải phẫu bệnh, bệnh viện Nhi Đồng 1, TP Hồ Chí Minh.
Dựa theo phương pháp định lượng của Watts KP và cộng sự [34]
2.7.3.1 Xây dựng đường chuẩn melanin
Để chuẩn bị dung dịch melanin 0,5 mg/ml, cân chính xác 5 mg melanin và cho vào bình định mức 10 ml Thêm NH4OH 1N vừa đủ đến vạch, sau đó lắc đều và vortex cho đến khi tan hoàn toàn thành dung dịch đồng nhất Dung dịch cần được bảo quản ở nhiệt độ 2 - 8 độ C và sử dụng trong ngày.
Để xây dựng đường chuẩn melanin, cần pha loãng dung dịch melanin chuẩn đến nồng độ từ 0 đến 14 µg/ml bằng NaOH 0,1N và nước cất Sau đó, đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 405 nm bằng máy UV-vis.
Chuẩn bị các thành phần phản ứng
Dung dịch MgCl2 5mM trong NaCl 0,5M được chuẩn bị bằng cách cân 2,96g NaCl, hòa tan trong 500 mL nước cất và thêm 0,23g MgCl2 để tạo thành dung dịch đồng nhất Để tạo đệm Tris HCl 0,05M pH 8, cân 606 mg Tris HCl và 2,922g NaCl, hòa tan trong 95 mL nước cất và điều chỉnh pH bằng HCl Sau đó, chuyển vào bình định mức 100 mL và thêm nước cất đến vạch Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ 2 – 8 độ C.
Dung dịch pronase 2 mg/ml được chuẩn bị bằng cách cân chính xác 200mg pronase vào bình định mức 10 ml, sau đó thêm nước cất đến vạch và vortex cho đến khi tan hoàn toàn Dung dịch này cần được bảo quản ở nhiệt độ 2-8°C và sử dụng trong vòng 2 tuần Để chuẩn bị dung dịch pronase 20 mg/ml, hút chính xác dung dịch pronase vào bình định mức 10 ml, thêm Tris HCl 0,05M pH 8 đến vạch và vortex cho đến khi tan hoàn toàn, nên pha chế khi sử dụng.
Nghiền đồng thể mảnh mô với 5 ml nước cất, tráng dụng cụ nghiền với 1 ml nước cất Chia đều dịch vào eppendorf, tráng cốc với 1 ml nước cất
Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 15 phút, lấy tủa
Thêm 5 ml đệm NaPi 0,1 M pH 6,8 lắc đều và ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 15 phút, lấy tủa
Kết tủa được ngâm với chloroform: methanol (2:1) trong 1 phút, hút bỏ dịch Sau đó, kết tử được ngâm với ethanol: ether (3:1) trong 2 phút, hút bỏ dịch để loại lipid
Thêm 7 ml dung dịch MgCl2 5mM trong NaCl 0,15M, lắc đều, ly tâm với tốc độ 13000 vòng/15 phút, lấy tủa
Cho dung dịch Pronase 2 mg/ml vào đệm Tris HCl 0,05 M pH 8 và ủ ở 30°C trong 48 giờ Sau đó, ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 15 phút để thu được tủa Tiếp theo, thêm 5 ml nước cất, lắc đều và ly tâm lại với tốc độ 13.000 vòng/phút.
Cho vào tủa 0,5 ml nước cất và 1 ml NaOH 0,1 N, đun cách thuỷ hỗn hợp ở
90 0 C trong 90 phút Để nguội, ly tâm lấy dịch trong Đo độ hấp thu ở bước sóng 405 nm Hàm lượng melanin được tính dưạ vào đường chuẩn với nồng độ 0 – 14 àg.
Xử lý số liệu
Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm SPSS 20.0, với các giá trị được trình bày dưới dạng trung bình ± SEM (Sai số chuẩn của trung bình) Sự khác biệt giữa các cặp trong lô và giữa các lô được xác định thông qua phép kiểm T test và Mann Whitney Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p nhỏ hơn 0,05.
KẾT QUẢ
Chiết xuất cao
Từ 1900 g bột dược liệu lá Tía tô chiết với ethanol 50 0 thu được khối lượng cao toàn phần là 206 gram đạt hiệu suất chiết 12,10%
3.1.2 Cao chiết phân đoạn ethyl acetat từ lá Tía tô
Sau khi thu được Cao toàn phần từ lá Tía tô với hiệu suất chiết 12,10%, tiến hành lắc phân bố với dung môi ethylacetat, đã thu được cao chiết phân đoạn ethyl acetat từ lá Tía tô với khối lượng 35,5 gram và đạt hiệu suất 2,24% Kết quả xác định phần trăm mất khối lượng do làm khô bột dược liệu và cao được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1 Mất khối lượng do làm khô bột dược liệu và cao chiết
Chỉ tiêu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Độ ẩm (%)
Kết quả độ ẩm trung bình sau 3 lần thực hiện phương pháp mất khối lượng do làm khô dược liệu đạt 11%, phù hợp với tiêu chuẩn DĐVN V cho lá tía tô, không vượt quá 13% Đồng thời, độ ẩm trung bình của cao toàn phần và cao EA cũng không vượt quá 20%, đáp ứng tiêu chuẩn DĐVN V.
Tác động điều trị nám da của cao Tía tô
3.2.1 Thu được các lô thỏ trong mô hình
3.2.1.1 Khảo sát mô hình thỏ gây nám da bằng tia UV và progesteron
Trong nghiên cứu về các dấu hiệu cảm quan trên da thỏ giống British Giant, sau 42 ngày điều trị bằng cách chiếu tia UV 30 phút mỗi ngày kết hợp với tiêm progesteron liều 5mg/kg cách ngày, các kết quả đã được tổng hợp và trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 Dấu hiệu cảm quan của thỏ gây nám da bằng tia UV và progesteron
Ngày Dấu hiệu cảm quan
8 Da đỏ, lớp biểu bì bong tróc
12 Xuất hiện vùng nám ở lớp biểu bì
14 Vùng nám đậm, lan rộng
16 Vùng nám đậm tiếp tục lan rộng, kèm lông mọc thưa
20-28 Vùng nám đậm, lan rộng, kèm lông mọc dày
32 Vùng nám bắt đầu nhạt do sắc tố đẩy lên lông
36-40 Vùng nám tiếp tục nhạt dần do sắc tố đẩy lên lông
42 Da dày, lớp biểu bì không sắc tố
Kết quả nghiên cứu cho thấy vùng nám bắt đầu xuất hiện sau 12 ngày thử nghiệm, đạt đỉnh điểm vào ngày thứ 14 và tiếp tục tăng cho đến ngày 28, sau đó nhạt dần Dựa trên kết quả này, nhóm nghiên cứu đã chia thỏ thành các lô để khảo sát tác động điều trị nám da của cao Tía tô.
Lô sinh lý: Không chiếu UV và cho uống nước cất trong suốt quá trình thử nghiệm
Lô chứng bệnh: Chiếu tia UV 30 phút mỗi ngày và tiêm progesteron cách ngày liều 5mg/kg trong 28 ngày
Lô thuốc chứng bao gồm việc chiếu tia UV trong 30 phút mỗi ngày và tiêm progesteron với liều 5 mg/kg cách ngày trong 28 ngày Vào ngày đầu tiên khi xuất hiện vùng da tăng sắc tố, cần bôi kem HQ 4% lên vùng da đó với lượng phù hợp mỗi ngày cho đến ngày thứ 28.
Lô điều trị bao gồm việc chiếu tia UV trong 30 phút mỗi ngày và tiêm progesteron với liều 5 mg/kg cách ngày trong 28 ngày Khi xuất hiện vùng da tăng sắc tố vào ngày đầu tiên, cần bôi cao tía tô 5% lên vùng da đó một lần mỗi ngày cho đến ngày thứ 28.
3.2.2 Đánh giá kết quả điều trị nám da của cao Tía tô
3.2.2.1 Tỷ lệ phần trăm diện tích vết nám
Kết quả tỷ lệ phần trăm nám của các nhóm thử nghiệm được trình bày trong bảng 3.3
Bảng 3.3 Tỷ lệ % nám khảo sát tác động điều trị của cao EA 5%
( * ) p < 0,05, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô sinh lý
( # ) p < 0,05, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh
Vào ngày thứ 7, vùng da thỏ tiếp xúc với tia UV trở nên ửng đỏ và lớp biểu bì bong tróc, trong khi da thỏ ở lô sinh lý không bị chiếu tia UV vẫn giữ được trạng thái bình thường Quá trình thử nghiệm này cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa hai vùng da Để điều trị vùng nám da trên thỏ, các phương pháp sử dụng cao đã được tiến hành.
Vào ngày thứ 12 của thử nghiệm, các đốm sắc tố bắt đầu xuất hiện với tỷ lệ 5% EA và 4% kem HQ Đến ngày 14, vùng nám ở cả ba lô (EA 5%, HQ, và chứng bệnh) đều mở rộng và đạt diện tích tối đa mà không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Từ ngày 21, vùng nám ở các lô điều trị giảm rõ rệt, đặc biệt vào ngày thứ 28, với tỷ lệ phần trăm giảm lần lượt là 59,5% cho lô EA 5% và 44,2% cho lô kem HQ 4% so với ngày thứ 14, cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh Tuy nhiên, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa lô EA 5% và lô kem HQ 4%.
HQ 4% tại các thời điểm khác nhau của thử nghiệm
Hình 3.1 Quy trình xử lý ảnh dựa trên ứng dụng MATLAB
Hình 3.1 trình bày hình ảnh da thỏ được xử lý qua ứng dụng MATLAB, bao gồm (a) ảnh thô của da lưng thỏ, (b) hình ảnh không bị xóa hiệu ứng "bird eye", (c) ảnh phóng to với độ phân giải 0,1 mm/pixel, và (d) vùng ảnh sau khi phân chia ngưỡng màu, trong đó màu trắng thể hiện vùng không chứa sắc tố và màu đen thể hiện vùng có sắc tố.
Đánh giá vi thể
Trong điều kiện bình thường, hạt melanin phân bố rải rác ở lớp hạ bì da thỏ, nhưng sau khi tiếp xúc với tia UV và progesteron, số lượng hạt melanin tăng lên và bắt đầu co cụm thành từng đám Phân tích vi thể vào ngày thứ 14 cho thấy sự phân bố hạt melanin dày đặc ở vùng da tiếp xúc với tia UV, đạt mức B và C, trong khi ở lô sinh lý chỉ quan sát thấy vài hạt melanin rải rác Đến ngày 28, mật độ hạt melanin giảm đáng kể.
Trong nghiên cứu, nhóm điều trị bằng cao EA 5% và HQ 4% cho thấy sự phân bố thưa thớt của 20 hạt melanin trong lớp hạ bì của vùng da thỏ Mật độ các hạt melanin trong nhóm điều trị tương đương nhau và thấp hơn so với nhóm chứng, đạt ý nghĩa thống kê.
Hình 3.2 Sự phân bố melanin trong nang lông ở lớp hạ bì da thỏ
(A) Cấp độ 1; (B) Cấp độ 2; (C) Cấp độ 3
Bảng 3.4 Mật độ các hạt melanin trong lớp hạ bì da thỏ
( * ) p < 0,05, so với lô chứng bệnh
Định lượng melanin
Phương trình tuyến tính mô tả mối quan hệ giữa nồng độ melanin chuẩn và độ hấp thu là y = 0,0564x + 0,0033, với giá trị R² = 0,993 (Hình 3.3) Nồng độ melanin được chiết xuất từ các mẫu da của các nhóm thí nghiệm khác nhau được thể hiện trong Bảng 3.5.
Vào ngày 14, hàm lượng melanin ở vùng da tiếp xúc với tia UV tăng lên rõ rệt, không có sự khác biệt đáng kể giữa lô chứng bệnh và hai lô điều trị Việc bôi EA 5% hoặc kem HQ 4% đã làm giảm nồng độ melanin lần lượt là 39,9% và 43,2% so với lô chứng bệnh Hơn nữa, nồng độ melanin của hai lô điều trị này không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô sinh lý.
Bảng 3.5 Nồng độ melanin của lô điều trị
Ngày EA 5% HQ 4% Chứng bệnh Sinh lý
* p < 0,05, so với lô chứng bệnh
BÀN LUẬN
Quá trình tổng hợp melanin bắt đầu bằng việc hydroxyl hóa L-tyrosine thành DOPA, sau đó chuyển đổi thành DOPA-quinone, được xúc tác bởi enzym tyrosinase Sự ức chế hoạt động của tyrosinase sẽ dẫn đến việc giảm tổng hợp melanin Nghiên cứu của Hwang và cộng sự đã khảo sát tác động ức chế tyrosinase và sinh tổng hợp melanin của 101 chất chiết xuất trên tế bào B16, cho thấy lá Tía tô có tác dụng tích cực trong điều trị nám da Do đó, Tía tô được xem là nguồn dược liệu tiềm năng cho việc sản xuất dược mỹ phẩm có công dụng làm sáng da, đặc biệt cho làn da nhạy cảm với tia.
Nghiên cứu in vitro cho thấy EA5% có khả năng ức chế tyrosinase tương đương với acid kojic, với giá trị IC50 gần giống nhau Bên cạnh đó, các nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng cao chiết toàn phần từ lá Tía tô có hiệu quả trong việc chống oxy hóa, chống viêm và ức chế khối u.
Nghiên cứu này sử dụng mô hình thỏ để tăng sắc tố da thông qua việc tiếp xúc với tia UV và tiêm progesteron Tia UV kích thích hoạt động của tế bào sắc tố, trong khi progesteron làm tăng cường hiệu ứng của bức xạ này.
UV để làm tăng số lượng tế bào sắc tố thông qua một số thụ thể hormon
Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá tác động của steroid sinh dục ở lớp hạ bì và biểu bì, đặc biệt là ở lớp hạ bì của thỏ British Giant khi tiếp xúc với tia UV, dẫn đến sự gia tăng hàm lượng melanin trong da Sử dụng phần mềm MATLAB, nghiên cứu đã định lượng hàm lượng melanin để đánh giá hiệu quả của các sản phẩm làm sáng da và điều trị rối loạn sắc tố Nồng độ melanin ở nhóm điều trị bằng EA 5% được so sánh với nhóm điều trị bằng HQ 4%, chất ức chế tyrosinase nổi tiếng, với kem HQ 4% được chọn làm chất đối chứng Phân tích mô bệnh học cho thấy sự phân bố của các tế bào sắc tố và sự hiện diện đáng kể của hạt melanin trong lớp hạ bì, tương tự như kết quả của Forrest và cộng sự.
Nghiên cứu của chúng tôi đã chỉ ra kết quả hứa hẹn của cao chiết EA 5% trong điều trị rối loạn sắc tố Cần tiến hành các thí nghiệm sâu hơn về dược phẩm và mỹ phẩm chứa cao EA 5% để phát triển các sản phẩm mới an toàn và hiệu quả, đặc biệt trong việc điều trị nám da lâu dài.
