Khảo sát đột biến gen brca1 brca2 kiểu dòng tế bào mầm và tế bào sinh dưỡng germline and somatic mutation trong ung thư buồng trứng bằng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới next generation sequencing ngs

HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NHIỆM VỤ Khảo sát đột biến gen BRCA1/BRCA2 kiểu dòng tế bào mầm và tế bào s

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM BỘ Y TẾ

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NHIỆM VỤ

Khảo sát đột biến gen BRCA1/BRCA2 kiểu dòng tế bào mầm

và tế bào sinh dưỡng (germline and somatic mutation) trong ung thư buồng trứng bằng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới

(Next Generation Sequencing-NGS)

Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

Chủ nhiệm nhiệm vụ: PGS.TS.BS Hoàng Anh Vũ

TS Nguyễn Trọng Bình

Thành phố Hồ Chí Minh - 2020

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM BỘ Y TẾ

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NHIỆM VỤ

Khảo sát đột biến gen BRCA1/BRCA2 kiểu dòng tế bào mầm

và tế bào sinh dưỡng (germline and somatic mutation) trong ung thư buồng trứng bằng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới

(Next Generation Sequencing-NGS)

(Đã chỉnh sửa theo kết luận của Hội đồng nghiệm thu ngày 27/5/2020)

Chủ nhiệm nhiệm vụ:

Hoàng Anh Vũ Nguyễn Trọng Bình

Cơ quan chủ trì nhiệm vụ:

Thành phố Hồ Chí Minh - 2020

I THÔNG TIN CHUNG

1 Tên nhiệm vụ: Khảo sát đột biến gen BRCA1/BRCA2 kiểu dòng tế bào mầm và tế

bào sinh dưỡng (germline and somatic mutation) trong ung thư buồng trứng bằng kỹ

thuật giải trình tự gen thế hệ mới (Next Generation Sequencing-NGS)

Thuộc: Chương trình/lĩnh vực (tên chương trình/lĩnh vực): Y tế

2 Chủ nhiệm nhiệm vụ:

2.1 Chủ nhiệm:

Họ và tên: HOÀNG ANH VŨ

Ngày, tháng, năm sinh: 27/01/1973 Nam/ Nữ: Nam

Học hàm, học vị: Phó giáo sư, Tiến sĩ

Chức danh khoa học: Giảng viên cao cấp

Chức vụ: Giám đốc Trung tâm Y sinh học phân tử

Điện thoại: Tổ chức: 028 38558411; Mobile: 077-2993537

Fax: E-mail: hoanganhvu@ump.edu.vn

Tên tổ chức đang công tác: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

2

Điện thoại: Tổ chức: 08.37153792 Mobile: 0935255352

Fax: 08.38916997 E-mail: ntbinh.snn@tphcm.gov.vn Tên tổ chức đang công tác: Trung tâm Công nghệ Sinh học TPHCM

Địa chỉ tổ chức: 2374 Quốc lộ 1, Phường Trung Mỹ Tây, Quận 12

Địa chỉ nhà riêng: 22/20/1 Đường 990, Phường Phú Hữu, Quận 9, TP.HCM

3 Tổ chức chủ trì nhiệm vụ:

Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Điện thoại: 028 38558411 Fax: E-mail: yds@ump.edu.vn

Website: yds.edu.vn

Địa chỉ: 217 Hồng Bàng, quận 5, TPHCM

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: PGS TS Trần Diệp Tuấn

Số tài khoản: 3713.0.1057277.00000

Kho bạc: Kho bạc nhà nước Quận 5, Tp.HCM

Tên cơ quan chủ quản đề tài: Sở Khoa học Công nghệ TPHCM

Thời gian

(Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ) (Tháng, năm) Thời gian

Kinh phí (Tr.đ)

3

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:

Đối với đề tài:

5 Chi khác liên quan

hoạt động nghiên cứu

- Lý do thay đổi (nếu có):

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án:

(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xét duyệt, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện nếu có); văn bản của tổ chức chủ trì nhiệm vụ (đơn, kiến nghị điều chỉnh nếu có)

Số

TT

Số, thời gian ban

23/11/2017

Quyết định về việc phê duyệt nhiệm vụ nghiên cứu khoa học và công nghệ

31/7/2017

Chấp thuận của hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

223/2017/HĐ-SKHCN,

23/11/2017

Hợp đồng thực hiện nhiệm vụ khoa học và công nghệ

10/01/2018

Quyết định về việc đồng ý cho phép tiến hành thu nhận số liệu nghiên cứu tại Bệnh viện Từ Dũ

Hợp đồng giao khoán chuyên môn

chọn nhà thầu các gói thầu phục

TS Nguyễn Duy Sinh

Công văn về việc xin bổ sung cán

bộ thực hiện nhiệm vụ khoa học công nghệ

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

Giải trình tự mẫu trên hệ thống Ion Torrent PGM

Quy trình giải trình tự gen thế hệ mới cho gen BRCA1/2

- Lý do thay đổi (nếu có):

5 Cá nhân tham gia thực hiện nhiệm vụ:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người kể cả chủ nhiệm)

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1 Nguyễn Duy Sinh Hoàng Anh Vũ Điều hành chung;

phân tích dữ liệu NGS; xác nhận lại các đột biến BRCA/2 bằng Sanger; viết bài báo khoa học;

viết báo cáo tổng kết đề tài

Hoàn thành nghiên cứu đúng thời hạn;

đăng 2 bài báo khoa học trong nước; hoàn thành 01 bản thảo bài báo quốc tế; hoàn thành báo cáo tổng hợp, phụ lục sản phẩm

và tóm tắt

Thay chủ nhiệm đề tài do Nguyễn Duy Sinh chuyển công tác

2 Nguyễn Trọng

Bình

Nguyễn Trọng Bình

Hoàn thiện đề cương nghiên cứu; xây dựng quy trình NGS trên Ion Torrent PGM; hướng dẫn học viên cao học;

viết bài báo khoa học; viết báo cáo tổng kết đề tài

Đề cương được phê duyệt ; sản phẩm quy trình hoàn chỉnh trên

hệ thống Ion Torrent PGM;

đăng 2 bài báo khoa học trong nước; tham gia hoàn thành báo cáo tổng hợp

và phụ lục sản phẩm

3 Hoàng Thành Chí Hoàng Thành Chí Tham gia viết đề

cương; xây dựng quy trình và chạy mẫu nghiên cứu trên hệ thống Ion Torrent PGM

Viết tổng quan

và phương pháp nghiên cứu; viêt một phần kết quả phân tích NGS

4 Lê Quang Thanh Lê Quang Thanh Tham gia viết đề

cương; chọn mẫu ung thư buồng trứng cho nghiên cứu

Quy định tiêu chuẩn chọn mẫu; chọn đủ mẫu cho nghiên cứu

5 Bùi Thị Hồng Nhu Bùi Thị Hồng

Nhu

Soạn mẫu giấy đồng ý tham gia nghiên cứu; tư vấn và chọn mẫu ung thư buồng trứng cho nghiên cứu

Chọn đủ mẫu cho nghiên cứu

7

6 Võ Thanh Nhân Võ Thanh Nhân Soạn mẫu giấy

đồng ý tham gia nghiên cứu; tư vấn và chọn mẫu ung thư buồng trứng cho nghiên cứu

Chọn đủ mẫu cho nghiên cứu

- Lý do thay đổi ( nếu có):

Do Nguyễn Duy Sinh chuyển công tác từ Đại học Y Dược TPHCM qua Bệnh viện Quốc tế VinMec không còn tham gia nghiên cứu, chủ nhiệm đề tài được thay thế bằng Hoàng Anh Vũ

6 Tình hình hợp tác quốc tế:

Số

TT

Theo kế hoạch

(Nội dung, thời gian, kinh phí,

địa điểm, tên tổ chức hợp tác,

số đoàn, số lượng người tham

1

- Lý do thay đổi (nếu có):

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

(Nội dung, thời gian,

kinh phí, địa điểm )

Ghi chú*

1

- Lý do thay đổi (nếu có):

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

Số

TT

Các nội dung, công việc

chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu)

Theo kế hoạch Thực tế đạt được

1 Nội dung 1: Thu thập mẫu bệnh và

kiểm chứng bằng Bác sĩ giải phẫu

bệnh độc lập (20% tổng số mẫu)

11/2017 – 8/2018

1/2019 – 3/2020

Hoàng Anh Vũ,

Lê Quang Thanh, Bùi Thị Hồng Nhu, Võ Thanh Nhân

2 Nội dung 2: Thu nhận DNA 3/2018 –

12/2018

1/2019 – 3/2020

Hoàng Anh Vũ, Nguyễn Trọng Bình, Hoàng

Nguyễn Trọng Bình, Hoàng Thành Chí

4

Nội dung 4: Tạo DNA khuôn mẫu

bằng phản ứng PCR trong nhũ tương

5/2018 – 2/2019

2/2019 – 4/2020

Nguyễn Trọng Bình, Hoàng Thành Chí

5

Nội dung 5: Giải trình tự Ion Torrent

PGM

5/2018 – 2/2019

2/2019 – 4/2020

Nguyễn Trọng Bình, Hoàng Thành Chí

6

Nội dung 6: Phân tích dữ liệu 3/2019 –

7/2019

3/2019 – 4/2020

Hoàng Anh Vũ, Nguyễn Trọng Bình, Hoàng Thành Chí

7

Nội dung 7: Giải trình tự Sanger 7/2019 –

9/2019

4/2019 – 4/2020

Hoàng Anh Vũ, Hoàng Thành Chí

8 Nội dung 8: Gửi 20% số mẫu dương

tính để ngoại kiểm ở công ty Amgen

(Hoa Kỳ)

7/2019 – 9/2019

12/2019 – 4/2020

Hoàng Anh Vũ, Nguyễn Trọng Bình

9 Nội dung 9: Xử lý số liệu và viết báo

cáo nghiệm thu đề tài

10/2019 – 11/2019

3/2020 – 4/2020

Hoàng Anh Vũ, Nguyễn Trọng Bình,

- Lý do thay đổi (nếu có): Giai đoạn 1 hoạt động nghiên cứu vị chậm trễ do chủ nhiệm

đề tài là Nguyễn Duy Sinh chuyển công tác khỏi Đại học Y Dược TPHCM Đề tài được chuyển chủ nhiệm cho Hoàng Anh Vũ và được gia hạn 6 tháng sau khi giám định giữa kỳ (đến tháng 5/2020)

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA NHIỆM VỤ

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

Thực tế đạt được

hiện chính xác các biến thể gen BRCA1/2 từ các mẫu chứng BRCA Germline

và BRCA Somatic Multiplex

được 2 chuyên gia độc lập đánh giá đạt

- Lý do thay đổi (nếu có):

Tạp chí (2 đã đăng trong nước

và 1 gửi tạp chí quốc tế)

+ 1 bài đăng trên Tạp chí Khoa học Đại học Huế + 1 bài đăng trên Tạp chí Y học TPHCM + 1 bản thảo gửi Asian Pacific Journal

of Cancer Prevention

- Lý do thay đổi (nếu có):

Thêm 1 bài báo khoa học đăng trên tạp chí trong nước Bài báo quốc tế trong giai đoạn chờ bình duyệt

d) Kết quả đào tạo:

Theo kế hoạch Thực tế đạt

được

cương cao học

- Lý do thay đổi (nếu có): Do đại dich COVID-19, các Trường đại học đóng cửa cho

đến hết tháng 4/2020 nên ảnh hưởng đến kế hoạch tốt nghiệp của các học viên sau đại học

Theo

kế hoạch

Thực tế đạt được

- Lý do thay đổi (nếu có):

e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế

Kết quả

sơ bộ

1

2

2 Đánh giá về hiệu quả do nhiệm vụ mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

Kết quả nghiên cứu sẽ được công bố trên tạp chí quốc tế, đóng góp số liệu của Việt Nam vào ngân hàng dữ liệu chung của thế giới về đột biến gen trong ung thư buồng trứng Đề tài cũng có sự tham gia của học viên cao học, giúp nâng cao năng lực nghiên cứu thực nghiệm cho các học viên này

Kết quả nghiên cứu chứng minh được tính khả thi của khảo sát đột biến gen

BRCA1/2 từ mẫu mô u và mô vùi nến của ung thư buồng trứng, có khả năng áp dụng

vào thực hành lâm sàng Tình trạng đột biến gen cho phép tư vấn di truyền và lựa chọn thuốc đặc hiệu nhóm ức chế PARP cho bệnh nhân Việt Nam

Dưới sự cho phép của Sở KH&CN TPHCM, quy trình kỹ thuật áp dụng trong nghiên cứu này sẽ được chuyển giao trọn gói hay chuyển giao công nghệ có đào tạo

cho các đơn vị trong nước có nhu cầu thực hiện khảo sát đột biến BRCA1/2 trong ung

thư buồng trứng

Kết quả nghiên cứu sẽ được ứng dụng phục vụ cho các đơn vị y khoa có nhu cầu

khảo sát đột biến dòng mầm cũng như sinh dưỡng của BRCA1/2: Các bệnh viện ung

bướu, các bệnh viện có khoa ung bướu phụ khoa, các trung tâm ung bướu, các trung tâm tư vấn di truyền

Làm chủ công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới sẽ cho phép nhóm nghiên cứu triển khai thêm các ứng dụng rộng hơn, bên cạnh các bệnh lý ung bướu còn có thể ứng dụng cho các bệnh di truyền, chuyển hóa liên quan đến đột biến gen

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

11

Y học cá thể hóa là xu hướng tất yếu của y khoa hiện đại, trong đó xác định các đột biến gen cho mỗi bệnh nhân là một yêu cầu tối quan trọng Trong ung thư buồng

trứng, việc ứng dụng được công nghệ NGS để khảo sát đột biến BRCA1/2 tại Việt Nam

giúp thuận lợi cho công tác điều trị, bệnh nhân không phải gửi mẫu ra nước ngoài để chẩn đoán sẽ tiết kiệm được chi phí, giảm bớt các thủ tục và rút ngắn thời gian chờ đợi kết quả

Đối với các cơ sở ứng dụng kết quả nghiên cứu, đề tài cung cấp một công cụ

chính xác, hiệu quả trong việc xác định đột biến BRCA1/2 phục vụ cho cả tư vấn di

truyền phát hiện sớm ung thư cũng như điều trị nhắm trúng đích phân tử hiệu quả

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của nhiệm vụ:

I Báo cáo tiến độ

II Báo cáo giám định

Kết quả: Đạt, được cấp tiếp kinh phí để thực hiện nhiệm vụ, gia hạn 6 tháng III Nghiệm thu cơ sở

Kết quả: Đạt, cần chỉnh sửa

để có thể bảo vệ Hội đồng cấp Sở KHCN

PHỤ LỤC 1: CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG ĐẠO ĐỨC

PHỤ LỤC 7: QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN ĐÔT BIẾN GEN

BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI ION

TORRENT PGM

I

TÓM TẮT NGHIÊN CỨU

Các thuốc ức chế enzyme poly ADP-ribose polymerase (PARPi) như olaparib

và rucaparib có tác dụng hiệu quả đối với ung thư biểu mô buồng trứng mang đột biến

dòng mầm hoặc dòng sinh dưỡng ở gen BRCA1 hoặc BRCA2 Chúng tôi nghiên cứu

tính khả thi của kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới trong việc phát hiện đột biến gen

BRCA1 hoặc BRCA2 từ mô u của ung thư biểu mô buồng trứng

Ứng dụng bộ sản phẩm Oncomine BRCA Research Assay trên hệ thống Ion Torrent PGM, chúng tôi khảo sát 101 bệnh phẩm mô u từ bệnh nhân ung thư biểu mô buồng trứng thuộc các dạng carcinôm tuyến bọc dịch trong, carcinôm tuyến bọc dịch nhầy, carcinôm tuyến dạng nội mạc tử cung và carcinôm tế bào sáng Kết quả không có

đột biến nào của gen BRCA2 được phát hiện trong nghiên cứu Chúng tôi phát hiện 8 bệnh nhân mang đột biến gây bệnh trên gen BRCA1, bao gồm 1 trường hợp đột biến sinh dưỡng và 7 đột biến dòng mầm Đột biến c.5251C>T trên exon 11 của gen BRCA1

gặp trên 4 bệnh nhân, gợi ý đây là một trong những đột biến tổ tiên của bệnh nhân Việt Nam

II

SUMMARY OF RESEARCH CONTENT

Poly (ADP-Ribose) polymerase (PARP) Inhibitors such as olaparib and rucaparib are effective against ovarian carcinoma with a germline or somatic mutation

in either BRCA1 or BRCA2 gene We asked if new generation sequencing technique was capable of detecting BRCA1 or BRCA2 mutations from tumor tissues of ovarian

carcinoma

We used the Oncomine BRCA Research Assay product on an Ion Torrent PGM platform to investigate 101 tumor samples from ovarian carcinoma patients, including serous carcinoma, endometrioid carcinoma, mucinous carcinoma, and clear

cell carcinoma No mutation of the BRCA2 gene was detected in this study We found 8 patients harboring pathogenic mutations on the BRCA1 gene, with only 1 was somatic mutation and 7 were germline mutations The c.5251C>T mutation on BRCA1 exon 11

was found in 4 patients, suggesting that this is one of the founder mutations in Vietnamese patients

III

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

VIẾT TẮT GỐC TỪ

BRCA1/2 Breast cancer 1/2 gene

CNV Copy number variation

FFPE Formalin-fixed paraffin-embedded

MLPA Multiplex ligation-dependent probe amplification

NGS Next generation sequencing

PCR Polymerase chain reaction (phản ứng khuếch đại chuỗi)

PGM Personal Genome Machine

SNV Single nucleotide variation

IV

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.3 Mẫu đối chứng đại diện cho biến thể sinh dưỡng 25 Bảng 3.4 Các biến thể nhầm nghĩa lành tính của gen BRCA1/2 phát

hiện trong 9 mẫu không phải ung thư buồng trứng

26

Bảng 3.5 Các thông số quan trọng cho từng mẫu chạy NGS 28

Bảng 3.7 Các đoạn mồi để xác nhận đột biến bằng kỹ thuật Sanger 35 Bảng 3.8 Những trường hợp đã được xác nhận bằng kỹ thuật Sanger 36 Bảng 3.9 Các bất thường số lượng bản sao phát hiện 37

V

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cơ chế tác động của thuốc ức chế đặc hiệu PARP 4

Hình 3.1 Đánh giá sau quá trình chạy PCR trong nhũ tương 23

Hình 3.2 Tính chính xác trong phát hiện đột biến BRCA1/2 27

VI

PHẦN ĐỐI CHIẾU KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

1 Tên đề tài: “Khảo sát đột biến gen BRCA1/BRCA2 kiểu dòng tế bào mầm và tế

bào sinh dưỡng (germline and somatic mutation) trong ung thư buồng trứng bằng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (Next Generation Squencing-NGS)” Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS.BS Hoàng Anh Vũ

TS Nguyễn Trọng Bình

Cơ quan chủ trì: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

Thời gian thực hiện: Từ tháng 11/2017 đến tháng 05/2020

Kinh phí được duyệt: 3.072.000.000 đồng

2 Mục tiêu:

2.1 Mục tiêu tổng quát: Xác định tỷ lệ đột biến gen BRCA1 và BRCA2 dòng

mầm và sinh dưỡng trên bệnh nhân ung thư buồng trứng người Việt Nam 2.2 Mục tiêu cụ thể:

+ Khảo sát tỷ lệ đột biến dòng mầm BRCA1/BRCA2 trong ung thư buồng trứng; + Khảo sát tỷ lệ đột biến dòng sinh dưỡng BRCA1/2 trong ung thư buồng trứng; + Xây dựng qui trình xác định đột biến BRCA1/2 bằng kỹ thuật giải trình tự gen

thế hệ mới có độ nhạy và độ đặc hiệu trên 95%

3 Nội dung thực hiện (đối chiếu với hợp đồng và phụ lục hợp đồng đã ký):

TT Các nội dung, công việc

dự kiến

Các nội dung, công việc

đã thực hiện

mô vùi nến và ≤ 100 mẫu máu

tương ứng với mẫu mô có đột biến

+ 115 bệnh phẩm phẫu thuật, bao gồm 66 mẫu mô vùi nến có tế bào u và 55 mẫu mô tươi

+ 55 mẫu máu và 4 mẫu mô vùi nến không chứa tế

VII

bào u

2 &

3

Thu nhận DNA và tạo thư viện

DNA từ 100 mẫu mô vùi nến

Tách 115 mẫu DNA từ tế bào u và xử lý bằng Uracil-N-Glycosylate Sau bước tạo thư viện có

110 mẫu đạt chất lượng và số lượng cho bước giải trình tự thế hệ mới Ion Torrent PGM

ứng PCR trong nhũ tương

Tổng cộng có 18 lần chạy trên chip 318 (7 mẫu cho 1 lần chạy) để có kết quả cho 110 mẫu nghiên cứu và các mẫu đối chứng mang đột biến dòng mầm và đột biến sinh dưỡng

Khẳng định được 8 đột biến gây bệnh đều của gen

BRCA1, trong đó có 7 đột biến dòng mầm và 1 đột

biến sinh dưỡng

ngoại kiểm

Ngoại kiểm từ GENEWIZ cho kết quả đột biến của mẫu OC-Y16T và OC-Y33T giống trong nghiên cứu (c.1360_1361delAG và c.1621C>T)

9 Xử lý số liệu và viết báo cáo nghiệm

4 Sản phẩm của đề tài (đối chiếu với hợp đồng đã ký):

Sản phẩm dạng kết quả I, II

kỹ thuật

Kết quả đạt được

1 Qui trình chẩn đoán đột biến

gen bằng phương pháp giải

trình tự thế hệ mới Ion Torrent

PGM

Quy trình hoàn chỉnh, độ nhạy và độ đặc hiệu trên 95%

Phụ lục 7: quy trình chẩn đoán đột biến gen bằng phương pháp giải trình

tự thế hệ mới Ion Torrent PGM

VIII

quốc tế) + 1 bài đăng trên Tạp chí Y học TPHCM

+ 1 bản thảo gửi Asian Pacific Journal of Cancer Prevention

2 Đào tạo sau đại

học

02 thạc sĩ + 1 học viên cao học của Trường Đại học

Khoa học Tự nhiên tham gia nghiên cứu, chờ trình luận văn (Ngô Đại Phú)

+ 1 học viên cao học của Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm tham gia nghiên cứu, chờ trình luận văn (Phạm Thị Thu Giang)

1

CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU 1.1 Tổng quan vấn đề nghiên cứu:

Ung thư buồng trứng là một trong những ung thư thường gặp ở phụ nữ với 238.700 trường hợp mới chẩn đoán hàng năm và số ca tử vong là 159.000 trên toàn thế giới [5]

BRCA1/BRCA2 là hai gen ức chế bướu có vai trò sửa chữa tổn thương DNA,

thường bị đột biến trong ung thư vú và buồng trứng di truyền Bên cạnh việc có nguy

cơ suốt đời mắc ung thư buồng trứng với 55% và 25% tương ứng cho đột biến BRCA1

và BRCA2 [6,7,8], những người mang đột biến gen BRCA1/BRCA2 cũng có 80% nguy

cơ mắc ung thư vú [7,8] Ngoài ra nam giới mang gen BRCA2 đột biến cũng tăng nguy

cơ ung thư tiền liệt tuyến và ung thư tụy

Mặc dù tỉ lệ đột biến gen này trong dân số bình thường là tương đối thấp 1/400) nhưng đáng lưu tâm là trong dân số bệnh nhân ung thư buồng trứng thì tỉ lệ lại khá cao (15-20%) [9] Gần đây thuốc ức chế poly ADP ribose polymerase ( PARP inhibitors) đã được chứng minh là hiệu quả giúp đưa các tế bào bị đột biến BRCA1/BRCA2 mà không thể sửa chữa được đi vào chương trình chết tế bào theo lập trình apoptosis và giúp cải thiện tiên lượng bệnh hơn nữa [11,12] Bên cạnh việc đột

(1/800-biến BRCA1/BRCA2 kiểu mầm (germline mutation), một số nghiên cứu gần đây cũng cho thấy có tỷ lệ đột biến BRCA1/BRCA2 đáng kể kiểu sinh dưỡng (somatic mutation)

[13,14]

Vào tháng 12, 2014, thuốc Olaparib, tên thương mại là Lynparza, là một loại thuốc

ức chế PARP đã được chấp thuận dùng cho bệnh nhân ung thư buồng trứng đột biến dòng mầm BRCA1/BRCA2 bởi Food and Drug Administration-FDA (Hoa Kỳ) và European Medicines Agency-EMA (Châu Âu) [9,15] Gần đây hơn, vào đầu tháng 1/2017, FDA Hoa Kỳ cũng đã chấp thuận cho dùng thuốc Rucaparib (Rubraca), là thuốc ức chế PARP thế hệ thứ hai để điều trị ung thư buồng trứng có mang đột biến

dòng mầm BRCA1/BRCA2[16] Đáng lưu ý là cả hai kiểu đột biến dòng tế bào mầm và

2

tế bào sinh dưỡng trong ung thư buồng trứng đều có lợi ích về sống còn nếu điều trị bằng thuốc ức chế PARP [2] nên khuyến cáo của EMA có thể áp dụng cả hai loại đột biến

1.1.1 Cơ chế sửa chữa DNA

DNA liên tục bị tổn thương bởi nguyên nhân từ môi trường hay nội sinh, bao gồm

cả do quá trình nhân đôi của nó, tạo ra nhiều gốc tự do và tiếp xúc với tác nhân làm tổn hại DNA Để duy trì tính nguyên vẹn của bộ gen, tế bào dùng một mạng lưới phức tạp của các tín hiệu phân tử để sửa chữa nhiều kiểu tổn thương DNA, ví dụ như bị thay đổi một nucleotide, gãy, đứt 1 chuỗi DNA, đứt 2 chuỗi DNA và bắt chéo giữa 2 chuỗi DNA [17]

Những con đường tín hiệu chính liên quan đến sửa chữa DNA là tái tổ hợp tương đồng (Homologous Recombination-HR) và tái tổ hợp không tương đồng (Non-Homologous End Joining-NHEJ) Con đường HR chủ yếu hoạt động trong giai đoạn S/G2 của chu kỳ tế bào và có sự tham gia phối hợp của nhiều protein bao gồm BRCA1/BRCA2 [18]

Bên cạnh vai trò trong sửa chữa DNA HR, BRCA1 cũng là yếu tố điều hòa sao mã

và điều hòa tái cấu trúc DNA Con đường sửa chữa DNA được điều hòa để duy trì tính

ổn định của DNA, là yếu tố chính cho sự sống còn của tế bào

Ở những tế bào có đột biến BRCA1/ BRCA2, sự sửa chữa DNA theo con đường HR

bị suy yếu, thay vào đó là con đường NHEJ Điều này có thể dẫn đến sự mất ổn định của bộ gen và làm tăng nguy cơ chuyển dạng ác tính [19]

1.1.2 Đột biến BRCA1/BRCA2 trong ung thư buồng trứng

Đột biến BRCA1/BRCA2 hiện tại được xem như là yếu tố quan trọng nhất gây mất

ổn định di truyền nhưng lại là yếu tố duy nhất điều trị được trong ung thư buồng trứng

dạng biểu mô Tỉ lệ đột biến BRCA1/BRCA2 kiểu mầm (germline mutation) cao nhất

trong ung thư buồng trứng dạng biểu mô tiết dịch thanh (8-18%), tuy nhiên cũng có

3

một tỉ lệ đáng kể trong ung thư buồng trứng dạng nội mac, tế bào sáng (5-15%) nhưng hiếm gặp trong thể carcinosarcoma [20]

Đột biến BRCA1/BRCA2 trong ung thư buồng trứng có những đặc điểm lâm

sàng đặc trưng như khởi bệnh sớm, sống còn tốt hơn, đáp ứng cao hơn nếu phác đồ hoá trị có platinum và quan trọng là đáp ứng với điều trị bằng thuốc chống PARP [20] Theo một nghiên cứu của The Cancer Genome Atlas Research Network khảo sát trên

316 trường hợp ung thư buồng trứng dạng biểu mô tiết dịch thanh giai đoạn II-IV, tỷ lệ

đột biến kiểu tế bào mầm là 8% và 9% cho BRCA1 và BRCA2 (tổng cộng là 17%) và

đột biến kiểu tế bào sinh dưỡng là 3% [13]

Một nghiên cứu khác của Hennessy cho thấy đột biến BRCA1/BRCA2 kiểu mầm

là 19%, đáng ngạc nhiên là trong số bệnh nhân có đột biến này, 39% có kèm theo đột biến kiểu sinh dưỡng Tỉ lệ đột biến kiểu sinh dưỡng tính chung khoảng 5-7% Có thể nói tổng quát là có bốn hoặc năm trường hợp bệnh nhân ung thư buồng trứng có đột

biến BRCA1/BRCA2 kiểu mầm thì sẽ có một người đột biến kiểu sinh dưỡng [14]

1.1.3 Vai trò của thuốc ức chế poly ADP ribose polymerase inhibitors

(PARP inhibitors) trong điều trị ung thư buồng trứng có đột biến BRCA1/BRCA2

DNA của tế bào liên tục bị tổn thương do nhiều tác động và trong cơ thể luôn luôn duy trì cơ chế sữa chữa để duy trì tính ổn định của bộ gen cũng như sự sống còn của tế bào

Poly ADP ribose polymerase (PARP) là một nhóm lớn các enzym nhiều chức năng, trong đó quan trọng nhất là PARP1, đóng vai trò sửa chữa chuỗi đơn DNA bằng cách cắt đứt base tổn thương Việc ức chế PARP sẽ đưa đến gãy chuỗi đôi DNA ngay tại ngã ba sao chép và đưa qua con đường sửa chữa kiểu HR phụ thuộc

BRCA1/BRCA2 Trong trường hợp đột biến BRCA1/BRCA2, rõ ràng là tế bào bị mất cơ

chế sửa chữa DNA theo kiểu HR (sữa chữa chuỗi đôi), mà việc dùng thuốc PARP inhibitor làm tế bào sẽ không thể sửa chữa chuỗi đơn được, làm tế bào bướu bị tổn thương trầm trọng đáng kể so với tế bào lành và sẽ bị cơ thể đưa vào chương trình chết theo lập trình (Hình 1.1) [21] Lợi ích lớn nhất của việc dùng thuốc ức chế PARP trong

4

ung thư buồng trứng là tăng thời gian sống còn không bệnh của nhóm bệnh nhân ung

thư buồng trứng tiết dịch thanh grade cao có đột biến BRCA1/BRCA2 dòng tế bào

mầm ở cả mô thức điều trị duy nhất hay điều trị hỗ trợ sau hoá trị [22]

Ngoài ra, các thử nghiệm lâm sàng tiếp theo với các đột biến ở cả dòng tế bào sinh dưỡng cũng cho thấy tỷ lệ đáp ứng với hoá trị cao đáng kể giữa nhóm có đột biến

so với không có đột biến [24]

1.1.4 Đại cương về giải trình tự gen và kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới

Hình 1.1: Cơ chế tác động của thuốc ức chế đặc hiệu PARP Trong tế bào thường, 2 cơ chế chính sửa

sai DNA có sự tham gia của PARP và BRCA1/2 Khi sử dụng chất ức chế đặc hiệu hoạt động của PARP, ở

tế bào thường, DNA được sửa chữa qua trung gian BRCA1/2 Trong khi đó, tế bào ung thư bị đột biến mất chức năng của BRCA1/2 sẽ không thể sửa sai DNA khi chất ức chế PARP được sử dụng và tế bào sẽ chết theo chương trình

5

Thông tin di truyền của mọi cơ thể sinh vật được chứa đựng trong phân tử có tên

là DNA, đó là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn được tạo thành từ bốn loại nucleotide gồm: A (adenine), C (cytosine), G (guanine) và T (thymine) Các nucleotide này sắp xếp nối tiếp nhau theo một trình tự xác định, và trình tự này không những đặc trưng ở từng loài mà còn khác nhau ở từng các thể trong cùng một loài Giải trình tự DNA là kỹ thuật giúp xác định sự sắp xếp của bốn loại nucleotide A, T, C, G trên phân

tử DNA, nhờ đó nghiên cứu được đặc điểm di truyền ở mức độ sinh học phân tử

Trong giai đoạn đầu của giải trình tự gen, các nhà khoa học sử dụng phương pháp giải trình tự của Maxam và Gilber [27] và phương pháp giải trình tự của Sanger [27] Trong hai phương pháp giải trình tự DNA, phương pháp của Sanger được sử dụng rộng rãi hơn và hiện nay còn được sử dụng trong một số ứng dụng nhất định như giải trình tự những đoạn gen ngắn phục vụ nghiên cứu Việc giải trình tự được thực hiện dễ dàng nhờ có sự hỗ trợ của máy giải trình tự tự động Máy giải trình tự hoạt động dựa theo nguyên lý của phương pháp Sanger có cải biến Trong đó các ddNTP không được đánh dấu phóng xạ mà được đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau cho mỗi loại ddNTP Máy giải trình tự tự động bao gồm các thành phần chính như: hệ mao quản, hệ chiếu sáng laser, hệ nhận và xử lý tín hiệu Các vạch điện di trong mao quản

sẽ được phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser Hệ thống nhận diện tín hiệu màu

sẽ ghi lại và mã hóa thành các nucleotide A, T, C, G

Nhìn chung, hai phương pháp truyền thống này ít được sử dụng trong điều kiện ngày nay do nhu cầu ngày càng cao của kỹ thuật giải trình tự DNA (yêu cầu lượng thông tin DNA được giải trình tự nhiều hơn, thời gian giải trình tự nhanh hơn…) Để đáp ứng nhu cầu trên, phương pháp mới đã ra đời và thay thế phương pháp giải trình tự truyền thống Hiện nay máy giải trình tự thế hệ mới chẳng hạn như Ion Torrent, illumina v.v đã ra đời và giải quyết các nhược điểm của máy giải trình tự thế hệ trước kia Tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà chúng ta nên sử dụng loại nào cho phù hợp Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng giải trình tự gen thế hệ mới Ion Torrent

6

Công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới hiện này đã đưa vào sử dụng với một vài nền tảng giải trình tự có sẵn trên thị trường, như Genome Squencer (Roche-454 Life Sciences, Mỹ), Genome Analyzer/HiSep/MiSep (Illumina-Solexa, Mỹ), Ion Torrent PGM, and Ion Proton sequencer (Thermo Fisher Scientific, Mỹ) và HeliScope từ Helicos BioSciences (Cambridge, Mỹ) Sự khác biệt chính giữa chúng là hiệu suất, chất lượng dữ liệu, và thông lượng MiSep có thông lượng cao nhất mỗi lần chạy (1,6 Gb/run, 60 Mb/h) và tỉ lệ lỗi thấp nhất, 454 GS Junior tạo được những read dài nhất (lên đến 600 base) nhưng có thông lượng thấp nhất (10 Mb/run, 9 Mb/h), trong khi Ion Torrent PGM có thông lượng cao nhất (10-100 Mb/h) Ion Torrent là nền tảng giải trình tự tổng hợp dựa vào đo tín hiệu pH thay đổi mỗi lần ion H+ được tiết ra khi enzyme DNA polymersase gắn một nucleotide vào Chính nhờ sử dụng những nucleotide tự nhiên, điều này giúp giảm giá thành và gia tăng tốc độ xử lý do không phải trải qua các bước phân tích hình ảnh Hiện nay, hai nền tảng giải trình tự phổ biến

và được ưa chuộng nhất trên thị trường là Ion Torrent và Illumina Có vài nghiên cứu

đã tiến hành kiểm tra hiệu suất của cả hai nền tảng qua nhiều ứng dụng khác nhau và cho thấy chúng xuất ra kết quả tương tự Gần đây, một đánh giá giữa Illumina MiSeq

và Ion Proton trong việc phát hiện các biến thể dòng sinh dưỡng trong ung thư xác định rằng cả hai nền tảng này cho hiệu suất tương đương trong phát hiện biến thể dòng mầm với DNA có nguồn gốc từ mẫu mô đúc nến khi sử dụng bộ kit thương mại dựa trên chiến lược PCR đa mồi để tạo thư viện DNA

Ion Torrent PGM cung cấp ba loại chip giải trình tự với ba mức giá khác nhau, cho ra một sự linh hoạt trong thiết kế thí nghiệm khi lựa chọn được đưa ra dựa trên thông lượng được yêu cầu Ion Torrent sử dụng nền tảng công nghệ giải trình tự bán dẫn trước đây thường được biết đến với những lỗi điển hình nằm trong khu vực homopolymer, khu vực mà các nucleotide giống nhau lặp lại liên tục (k-mer ≥ 3 nucleotide) Tuy nhiên, với nhiều nỗ lực tối ưu hóa trong quy trình tin sinh và tăng cường độ phủ cũng như độ đồng nhất trong bộ kit Oncomine BRCA1/2 panel, đây hiện không còn là lỗi đáng lo ngại cho mục tiêu nghiên cứu Ngoài ra, với dung lượng vừa

Nguyên tắc hoạt động: Máy giải trình tự Personal Genome Machine (PGM) là

thiết bị giải trình tự sử dụng công nghệ thế hệ mới là công nghệ bán dẫn Hệ thống PGM sử dụng chip bán dẫn đếm proton H+ Ion chip bán dẫn sử dụng rất nhiều mạng đầu dò bán dẫn song song để thực hiện việc đo trực tiếp theo thời gian thực lượng ion

H+ trong suốt quá trình nhân lên tự nhiên của DNA Mật độ các giếng trên chip bán dẫn cho phép hàng triệu phản ứng diễn ra độc lập trong khi dòng chất lỏng tích hợp cho phép các hóa chất chảy trên mạng bán dẫn Điều này cho phép chuyển trực tiếp thông

tin di truyền (DNA) thành thông tin kỹ thuật số (trình tự DNA)

Ưu điểm của Ion Torrent

+ Công nghệ giải trình tự bằng chip bán dẫn dựa trên việc đo ion H+, với công nghệ này không cần thay đổi các nucleiotide hoặc gắn reporter huỳnh quang/hóa học và cũng không cần thiết gắn hệ quang học và camera tốn kém và phức tạp

+ Máy giải trình tự Ion PGM cho kết quả nhanh nhất trong các máy giải trình tự thế hệ mới hiện nay, đưa ra quy trình làm việc từ bước có DNA tinh sạch đến bước đọc kết quả cuối cùng chỉ trong khoảng 8 giờ cho hầu hết các ứng dụng

+ Hệ thống AB Library Builder và Ion OneTouch hỗ trợ máy giải trình tự Ion PGM, cho phép đơn giản hóa và tự động hóa việc chuẩn bị các thư viện các đoạn và chuẩn bị mẫu, hơn nữa còn làm thiết bị dễ sử dụng hơn

+ Giải pháp phần mềm, từ cả Ion Torrent và các nhà cung cấp khác, cho phép việc phân tích dữ liệu được đơn giản và hiệu quả hơn

+ Việc thiết kế mô đun của hệ thống Ion PGM nghĩa là việc chuẩn bị thư viện, chuẩn bị mẫu và giải trình tự tất cả có thể thực hiện song song Thời gian chạy ngắn, kết hợp với khả năng chuẩn bị thư viện và mẫu tiến bộ, cho phép người dùng có thể tối

+ Lượng mẫu ban đầu cực kỳ ít, rất phù hợp với những mẫu quý hiếm (chỉ cần

10 ng FFPE DNA hoặc gDNA với Ion AmpliSeqT Cancer Panel, 50-500 ng DNA cho giải trình tự DNA bộ gene, 200 ng RNA tổng số cho giải trình tự tất cả các đoạn RNA phiên mã, 5 ng RNA làm nền cho giải trình tự các RNA mô

+ Dữ liệu đầu ra dạng tiêu chuẩn FASTQ đã được tiêu chuẩn hóa cho các phân tích tiếp theo và dùng để hiển thị thông tin bằng phần mềm của các hãng tin sinh học, như Partek

+ Phân tích kết quả chỉ trong vài phút, không phải hàng giờ Hệ thống hoàn chỉnh cho phép phân tích cả sơ cấp và thứ cấp: máy Ion PGM kết hợp với Torrent Server/Torrent Suite mang lại một giải pháp toàn diện duy nhất cho các nhà nghiên cứu, cung cấp dữ liệu bộ gene sau khi phân tích sơ cấp và thứ cấp

+ Ion bán dẫn cung cấp sự linh hoạt cao cho các dự án và các mức chi phí khác nhau Khả năng chạy đồng thời lên đến 32 mẫu trên các kit có sẵn (hoặc nhiều hơn 384 mẫu khi sử dụng mã vạch) làm tăng khả năng linh hoạt của hệ thống hơn nữa

+ Công nghệ này hỗ trợ đọc chiều dài đoạn từ 35 đến 400 base, các quy trình (protocol) đã có sẵn cho single-end sequencing (SES), paired-end sequencing (PES) và mate-pair sequencing (MPS)

+ Dòng nucleotide chảy qua một cách tuần tự cho phép linh động chiều dài đoạn đọc trong mỗi lần chạy

+ Giải trình tự các đoạn khuếch đại với chiều dài khác nhau mở rộng lên đến hàng trăm đến hàng ngàn cặp base

Vai trò của kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới trong việc phát hiện các đột biến di truyền trong ung thư

9

Ước tính có khoảng 10-15% ung thư có tính di truyền, và có khoảng 35 hội chứng ung thư di truyền, trong số đó có nhiều trùng lắp về biểu hiện kiểu hình Ví dụ như đột biến gen p53 có thể biểu hiện trong hội chứng Li-Fraumeni, hội chứng ung thư

vú và buồng trứng di truyền [24]

Rõ ràng là các phương pháp giải trình tự gen thế hệ đầu như phương pháp Sanger khảo sát trên từng exon của gen sẽ có hạn chế lớn trong việc thể hiện cái nhìn toàn diện về tất cả các gen có thể bị đột biến trong từng hội chứng Ngoài ra giá thành khảo sát nhiều gen là trở ngại lớn của phương pháp này

Trong trường hợp cụ thể là tìm đột biến BRCA1/BRCA2, phần lớn các trường

hợp lâm sàng được chẩn đoán ung thư buồng trứng dựa trên bệnh phẩm là mẫu mô vùi

nến Để chẩn đoán đột biến BRCA1/BRCA2 thì phải ly trích DNA từ mẫu mô này để

giải trình tự gen Tuy nhiên đa phần các mẩu mô này rất nhỏ và DNA thu được chất

lượng kém Đáng lưu tâm là đột biến gen BRCA1/BRCA2 không giống như KRAS hay EGFR mà các vị trí đột biến thường xảy ra trong 1 số exon cố định mà ngược lại các kiểu đốt biến lại đa dạng, xảy ra trên nhiều exon khác nhau Ngoài ra BRCA1/BRCA2

còn có các kiểu đột biến mất đoạn, đảo đoạn hay chuyển đoạn bên cạnh kiểu đột biến điểm [25] Điều này cho thấy phương pháp giải trình tự Sanger không thích hợp để tìm

đột biến gen BRCA1/ BRCA2 vì các lý do sau:

- Phương pháp Sanger đòi hỏi lượng DNA thu được phải khá cao và có chất lượng tốt

- BRCA1 có 23 exon, BRCA2 có 27 exon, việc tìm đột biến đòi hỏi phải khuếch đại tất

cả các exon này, dẫn đến là giá thành sẽ cao đáng kể

- Không tìm được đột biến bằng Sanger không có nghĩa là không có đột biến vì phương pháp này chỉ tìm ra đột biến điểm Những đột biến mất đoạn lớn của gen có thể bị bỏ sót bởi kỹ thuật Sanger

Tuy nhiên kỹ thuật Sanger vẫn được xem như tiêu chuẩn vàng để kiểm chứng các đột biến nhỏ trên mỗi gen cụ thể, nhờ tính đặc hiệu của các cặp mồi được thiết kế cho PCR trước khi giải trình tự

10

Ngoài ra đột biến gen BRCA1/BRCA2 thuộc nhóm gen sửa chữa DNA nên các

nghiên cứu cho thấy bệnh nhân thường kèm theo một số gen khác bị đột biến như

CDH1, PTEN, STK11, TP53, RAD51 Các đột biến kèm theo này có thể làm thay đổi

tiên lượng bệnh cũng như các phương pháp khảo sát và theo dõi cho bản thân bệnh nhân và các thành viên trong gia đình [26]

Phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới có thể khảo sát một lượng lớn gen trên một mẫu DNA nhỏ mà giá thành không tăng lên nên tạo ra một cơ hội lớn để chúng ta

có thể chẩn đoán được tất cả các hội chứng di truyền mà bệnh nhân và người nhà bệnh nhân có thể mắc phải, cũng như việc thấy tập hợp một số đột biến như thế sẽ làm rõ bệnh sử tự nhiên của bệnh, việc tích lũy các đột biến như thế nào và tiên lương của bệnh ra sao

1.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Tại Việt Nam, theo ghi nhận ung thư quần thể 2004, ung thư buồng trứng đứng hàng thứ 8 trong các ung thư ở nữ giới [1]

Hiện tại có một số cơ sở nghiên cứu đã khảo sát đột biến BRCA1/BRCA2 trong ung

thư vú bằng phương pháp giải trình tự Sanger [14, 3,4], vốn có nhiều hạn chế do giá thành cao đối với 2 gen có kích thước khá lớn này Ngoài ra việc chủ yếu chỉ phát hiện

đột biến điểm là hạn chế lớn của phương pháp Sanger vì đột biến BRCA rất đa dạng

Do đó hiện chưa có dữ liệu nào đáng tin cậy tại Việt Nam về đột biến BRCA1/BRCA2 trong ung thư buồng trứng để giúp hướng dẫn điều trị bằng thuốc ức chế PARP Ngoài

ra các nghiên cứu chỉ dùng mẫu máu của bệnh nhân để xét nghiệm chỉ ghi nhận được tỉ

lệ đột biến dòng tế bào mầm mà bỏ sót một tỉ lệ đáng kể đột biến sinh dưỡng

Phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới được xem là cuộc cánh mạng trong y sinh học vì có đóng góp to lớn trong việc giải trình tự bộ gen của loài người Phương pháp này dựa trên cơ sở khuếch đại từng đoạn gen mạnh mẽ hơn nên không cần lượng DNA nhiều, đọc trình tự đoạn gen nhiều lần nên hạn chế sai sót tối đa và tổng hợp thông tin

11

tốt hơn, phức tạp hơn trên cơ sở có sự hỗ trợ của máy tính thế hệ mới Ngoài ra do sự cải tiến về kỹ thuật nên việc giải trình tự nhiều gen cũng không làm tăng giá thành chẩn đoán đáng kể so với giải trình tự một gen

Xuất phát từ thực tế lâm sàng cần có một xét nghiệm tin cậy để phát hiện đột biến

của 2 gen BRCA1/BRCA2 trong ung thư buồng trứng, cung cấp một cơ sở khoa học để

điều trị bằng thuốc ức chế PARP, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu khảo sát đột

biến gen BRCA1/BRCA2 kiểu dòng tế bào mầm và tế bào sinh dưỡng trong ung thư

buồng trứng bằng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (Next Generation NGS)

Sequencing-1.3 Mục tiêu của nhiệm vụ

a Mục tiêu tổng quát: Xác định tỷ lệ đột biến gen BRCA1 và BRCA2 dòng mầm và

sinh dưỡng trên bệnh nhân ung thư buồng trứng người Việt Nam

b Mục tiêu cụ thể:

- Khảo sát tỷ lệ đột biến dòng mầm BRCA1/BRCA2 trong ung thư buồng trứng

- Khảo sát tỷ lệ đột biến dòng sinh dưỡng BRCA1/BRCA2 trong ung thư buồng trứng

- Xây dựng qui trình xác định đột biến BRCA1/BRCA2 bằng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới có độ nhạy và độ đặc hiệu trên 95%

12

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Các phương tiện và hoá chất chính dùng trong nghiên cứu:

 Máy ủ nhiệt rung tự động Thermo Mixer F1.5 (Eppendorf) cho ống 1.5 ml

 Máy chộn dung dịch Vortex Mixer (Cleaver Scientific)

 Máy li tâm mini D1008 (DLAB)

 Máy ly tâm Eppendorf 5415R Centrifuge (Eppendorf)

 Máy đo quang phổ NanoDrop™ One Microvolume UV-Vis Spectrophotometers (Thermo Fisher Scientific)

 Máy đo huỳnh quang Qubit 4.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific)

 Bộ Pipette Eppendorf P2.5 (0.1–2.5μL) , P20 (2–20μL), P200 (20–200μL), và P1000 (100–1000μL) cùng với các đầu tip tương ứng

 Ống Eppendorf™ DNA LoBind™ (Fisher Scientific) và Eppendorf Tubes® 3810X (Eppendorf)

 Các giá đỡ eppendorf

 Thanh nam châm DynaMag-2 (Thermo Fisher Scientific)

 Máy Ion OneTouch™ 2 Instrument (Thermo Fisher Scientific)

 Máy Ion OneTouch™ ES Instrument (Thermo Fisher Scientific)

 Máy giải trình tự Ion PGM™ và Ion 318 Chip Kit V2 BC (Thermo Fisher Scientific)

 Máy luân nhiệt Mastercycler nexus X2 (Eppendorf) và máy LightCycler® 96 (Roche) dùng cho phản ứng PCR

13

 Hệ thống máy lọc nước Milli-Q® systems (Merck)

 Máy Genetic Analyzer ABI 3500 (Applied Biosystems)

 Cân điện tử Analytical Balance MS204TS/00 (Mettler Toledo)

 Nước không nuclease, nước mini Q

 Cồn 99% Ethanol absolute for analysis, EMSURE® (Merck), NaOH Sodium hydroxide, pellets, ExpertQ® (Scharlab)

 Bộ Kit do nồng độ DNA Qubit dsDNA HS Assay kit (Thermo Fisher Scientific)

 Bộ kit tách DNA cho mẫu mô đúc nến GeneRead DNA FFPE Kit (Thermo Fisher Scientific)

 Bộ kit khuếch đại đa mồi cho hai gen BRCA Oncomine™ BRCA Research Assay (Thermo Fisher Scientific)

 Ion AmpliSeq™ Library Kit Plus (Thermo Fisher Scientific)

 Bộ kit Ion Xpress™ Barcode Adapters 1-16 và Ion Xpress™ Barcode Adapters 17-32 Kit (Thermo Fisher Scientific)

 The Ion PGM™ Hi-Q™ View OT2 Kit (Thermo Fisher Scientific)

 The Ion PGM™ Hi-Q™ View Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific)

 Bộ TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (Takara, Nhật Bản) và các mồi đặc hiệu dùng trong PCR trong kỹ thuật Sanger

 Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR cho giải trình tự Sanger ExoSAP-IT® PCR Product Cleanup (Thermo Scientific)

 Nucleotide huỳnh quang BigDye® Terminator v3.1 (Life Technologies)

14

2.1 Phương pháp thu nhận mẫu:

+ Nghiên cứu đã được chấp thuận bởi Hội đồng Đạo đức trong nghiên cứu y sinh học của Đại học Y Dược TPHCM (số 247/ĐHYD-HĐ ngày 31/07/2017) và Ban Giám đốc Bệnh viện Từ Dũ

+ Đây là một nghiên cứu mô tả cắt ngang Toàn bộ mẫu trong nghiên cứu này được thu thập từ Bệnh viện Từ Dũ Trước tiên chúng tôi tiến hành tư vấn người tình nguyện tham gia nghiên cứu và hướng dẫn điền phiếu đồng thuận và thu thập các thông tin cơ bản Những trường hợp đã đồng ý và đáp ứng đúng tiêu chuẩn của nghiên cứu sẽ được thu nhận bệnh phẩm là mô u phẫu thuật và 2 mL máu tĩnh mạch Các trường hợp không thu nhận mẫu máu thì thu nhận thêm các block bệnh phẩm không chứa mô u để kiểm tra đột biến là dạng sinh dưỡng hay dòng mầm ở giai đoạn sau của nghiên cứu 20% các bệnh phẩm này được kiểm chứng bởi một bác sĩ giải phẫu bệnh độc lập

+ Tiêu chuẩn chọn mẫu nghiên cứu: Ung thư buồng trứng dạng biểu mô (không phân biệt grade)

2.2 Tách chiết và xử lý DNA từ mẫu mô vùi nến và từ mẫu máu

Các mẫu mô tươi phẫu thuật được trữ ở -700C tại Trung tâm Y sinh học phân tử, Đại học Y Dược TPHCM cho đến khi tiến hành tách DNA DNA bộ gen được ly trích

từ mẫu mô vùi nến (formalin-fixed paraffin-embedded - FFPE) và mô tươi bằng kit GeneRead DNA FFPE (QIAGEN) Quy trình chi tiết như trong Phụ lục 7 Tóm tắt lại, những lát cắt từ mẫu mô vùi nến sẽ được loại bỏ paraffin bằng cách đưa lên nhiệt độ cao (56oC), sau đó được ủ với proteinase K để ly giải DNA bộ gen ra khỏi tế bào DNA tiết ra được phá vỡ liên kết chéo (DNA với DNA, DNA với protein, DNA với paraffin) bằng cách ủ ở nhiệt độ cao (90oC) Dịch chiết DNA này sẽ được xử lý với Uracil-N-Glycosylase (UNG) để loại bỏ những đột biến dương tính giả gây ra do hiện tượng khử amin ở cytosine thành uracil Sau đó các thành phần không mong muốn sẽ được loại bỏ

ở bước rửa, DNA bộ gen còn lại trên cột sẽ được thu nhận bằng dung dịch rửa giải

2.3 Chuẩn bị thư viện DNA

DNA tinh sạch được pha loãng về 2 ng/µl và tiến hành multiplex PCR cùng với

2 mẫu đối chứng bằng Oncomine BRCA Research Assay (Thermo Fisher Scientific) Mẫu đối chứng BRCA Somatic Multiplex I và BRCA Germline I được cung cấp bởi công ty Horizon (Cambrige, Anh) có mang biến thể đã biết trước Quy trình chi tiết như trong Phụ lục 7 Tóm tắt lại, có hai phản ứng multiplex PCR cho mỗi mẫu, sử dụng hai hỗn hợp mồi tách biệt (pool 1 và pool 2) Thành phần phản ứng multiplex PCR của mỗi pool gồm: 2 µl 5X Ion AmpliSeq HiFi Mix, 5 µl DNA bộ gen, 1 µl nước và 2 µl Oncomine BRCA pool 1 hoặc pool 2 Chương trình luân nhiệt cho phản ứng multiplex PCR: 990C trong 2 phút, theo sau là 18 chu kỳ với 990C trong 15 giây và 600C trong 4 phút, sau cùng mẫu được giữ ở nhiệt độ 100C Các amplicon thu được từ phản ứng multiplex được xử lý với FuPa reagent để cắt bỏ đi một phần trình tự mồi (primer) và phosphoryl hóa amplicon khi ủ ở 500C trong 10 phút, tiếp đến là 550C trong 10 phút, và sau cùng là 600C trong 20 phút Để giải trình tự cùng lúc nhiều mẫu trên cùng một chip, thư viện DNA của mỗi mẫu sẽ được gắn với một trình tự nhận biết (barcode) được cung cấp trong IonXpress Barcode Adapter 1 to 32 Kit (Thermo Fisher Scientific) Amplicon nối P1 Adapter và IonXpress Barcode theo chương trình nhiệt là

220C trong 30 phút, 680C trong 5 phút và 720C trong 5 phút Thư viện amplicon sau khi nối adapter/barcode được tinh sạch bằng AMPure XP Reagent (Thermo Fisher Scientific) Thư viện tinh sạch được định lượng bằng qPCR sử dụng Ion Library TaqMan Quantitation Kit (Thermo Fisher Scientific), sau đó pha loãng về 100 pmol/µl

và kết hợp thư viện theo tỉ lệ tương đương cho mỗi mẫu

16

2.4 Chuẩn bị DNA khuôn mẫu bằng phản ứng PCR trong nhũ tương

Tiếp theo, mẫu được tiến hành PCR hệ phân tán (emulsion PCR) với máy Ion OneTouch 2 và bộ Ion PGM™ Hi-Q™ View OT2 Kit (Thermo Fisher Scientific), máy được vận hành như sự chỉ dẫn của hãng Hạt ISP dương tính (Template-positive Ion Sphere Particles) từ PCR phân tán được làm giàu bằng hạt Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads nhờ máy OneTouch ES (Thermo Fisher Scientific) Quy trình chi tiết được trình bày trong Phụ lục 7

2.5 Giải trình tự Ion Torrent PGM

Hạt ISP sau khi làm giàu được đưa lên chip 318 để giải trình tự ) Quy trình chi tiết được trình bày trong Phụ lục 7 Giải trình tự gen được tiến hành trên máy giải Personal Genome Machine (PGM) sử dụng Ion PGM™ Hi-Q™ Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific) theo như hướng dẫn của nhà sản xuất, sử dụng dòng chảy

500 lần (500-flow runs)

2.6 Phân tích dữ liệu

Dữ liệu trình tự được xử lý bằng phần mềm Ion Torrent Software vận hành trên Ion Torrent Server (Thermo Fisher Scientific) Sơ đồ vận hành gồm xử lý tín hiệu, phát hiện base (base calling), ấn định chỉ số chất lượng, cắt adapter, sắp gióng cột các trình

tự (read) thu được đến bộ gen tham khảo H19 (human genome 19 reference), kiểm soát chất lượng sắp gióng cột, phân tích độ phủ và phát hiện biến thể (variant calling) Phân tích độ phủ, và phát hiện biến thể được thực hiện bằng phần mềm Torrent Variant Caller plugin software phiên bản 5.10.0 (Thermo Fisher Scientific) Thông số được thiết lập cho phần mềm Variant Caller với mức độ nghiêm ngặt cao cho phát hiện đột biến dòng sinh dưỡng Phần phân tích biến thể tiếp tục được thực hiện bằng phần mềm Ion Reporter software phiên bản 5.10.12.3.0 (Thermo Fisher Scientific), phần mềm này

sẽ phân loại biến thể thành những loại: thay thế một nucleotide (single nucleotide variation – SNV), thay thế đồng thời nhiều nucleotide kế cận nhau (multiple nucleotide polymorphism – MNP), thêm hoặc mất đoạn nhỏ (insertions hoặc deletions – Indels),

17

thêm hoặc mất đoạn lớn với ít nhất 1 exon trở lên (copy number variation – CNV), hoặc không đột biến (No calls) Kết quả giải trình tự gen sẽ được kiểm tra trực quan lại nhờ công cụ Integrative Genomics Views – IGV (Broad Institute) Biến thể được chú thích theo như danh pháp được sử dụng bởi Human Genome Variation Society (HGVS), và được xem là biến thể có hại (deleterious) nếu chúng được ghi nhận là gây bệnh (pathogenic) hoặc rất có thể gây bệnh (likely pathogenic) như trong cơ sở dữ liệu ClinVar (đối với đột biến dòng mầm) và cơ sở dữ liệu COSMIC (đối với đột biến dòng sinh dưỡng)

2.7 Giải trình tự Sanger

Những trường hợp đột biến BRCA1/BRCA2 đã phát hiện bằng giải trình tự Ion

Torrent PGM sẽ được xác nhận lại bằng giải trình tự trực tiếp theo phương pháp Sanger Vùng gen mang đột biến sẽ được khuếch đại bằng PCR Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên thạch agarose 1,5% có nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới hệ thống chụp ảnh điện di Geldoc-ItTM

(UVP, Mỹ) Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng ExoSAP-IT® PCR Product Cleanup (Affymetrix), theo hướng dẫn sử

dụng của nhà sản xuất Sản phẩm PCR đã được tinh sạch sẽ được thực hiện phản ứng cycle sequencing với BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied

Biosystems, Mỹ) theo hai chiều xuôi và ngược Sản phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol, hòa tan trong Hi-Di formanide, biến tính ở 95C trước khi làm lạnh đột ngột Trình tự DNA được đọc bằng máy ABI 3500 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer và capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ) Kết quả giải trình tự sẽ được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench

Các trình tự tham chiếu của gen BRCA1 là NG_005905.2 và NM_007294.3; của gen BRCA2 là NG_012772.3 và NM_000059.3

18

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Nội dung 1: Thu thập mẫu bệnh phẩm

Tổng cộng có 115 bệnh nhân tại Bệnh viện Từ Dũ tham gia nghiên cứu này (Phụ lục 2) Trong số đó có 60 trường hợp chúng tôi chọn bệnh phẩm là block mô u và block không chứa mô u của cùng bệnh nhân, từ Khoa Giải phẫu bệnh (chẩn đoán trong thời gian từ 2014 – 2020) Các trường hợp còn lại (55 bệnh nhân) có bệnh phẩm là mô

u phẫu thuật và máu tĩnh mạch, thu thập từ Khoa Ung bướu phụ khoa (được chẩn đoán

và phẫu thuật điều trị trong năm 2019 - 2020) Việc thu nhận 2 nguồn bệnh phẩm được thực hiện từ giai đoạn giám định đề tài giữa kỳ, sau khi Hội đồng chuyên môn đồng ý cho phép lấy mẫu nghiên cứu là ung thư buồng trứng dạng biểu mô mà không cần phải

là nhóm grade cao Về mặt lý thuyết, mô tươi phẫu thuật có thể dùng cho phân tích đột biến gen với điều kiện phải có xác nhận chẩn đoán giải phẫu bệnh Trong một nghiên cứu trước đây trên bệnh nhân u nguyên bào võng mạc, chúng tôi đã từng sử dụng bệnh phẩm là mô tươi phẫu thuật từ bệnh nhi của Bệnh viện Mắt Thành phố Hồ Chí Minh (Kiet NC, Mol Vis 2019 Apr 4;25:215-221)

Kết quả kiểm tra giải phẫu bệnh cho thấy có 9 trường hợp không phù hợp với chẩn đoán ung thư buồng trứng dạng biểu mô trong số 55 mẫu mô tươi phẫu thuật (bao gồm các chẩn đoán sarcôm cơ trơn, u mạch máu lành, u quái giáp lành, u tế bào hạt thể người lớn, u tế bào Sertoli - Leydig biệt hóa kém) Trong các phân tích sau đây, chúng tôi sẽ làm rõ hơn về các mẫu này Các mẫu này vẫn được tiến hành giải trình tự thế hệ mới và được xem như nhóm chứng âm cho quy trình

Trong phần trình bày tiếp theo cho thấy có thêm 5 mẫu không đạt lượng thư

viện DNA cho chạy NGS Tổng hợp lại, trong nghiên cứu này có 101 trường hợp ung

thư buồng trứng dạng biểu mô đã được giải trình tự thành công cho hai gen BRCA1 và BRCA2 trên hệ thống Ion Torrent PGM