Khảo sát các đặc điểm đặc trưng về di truyền và sinh hóa của tác nhân gây bệnh đuôi tôm đỏ hoại tử ở tôm sú penaeus monodon

Virus RNA có hai cách nhân bản: - Khi lõi của virion vào tế bào chất pha che khuất “eclypse”, các phân tử RNA virus có thể tự nhân ñôi thành các phân tử RNA virus mới dưới tác ñộng của e

ỦY BAN NHÂN DÂN TP HỒ CHÍ MINH

SỞ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ

MỤC LỤC

4 I.1.1 Virus là vật ký sinh nội bào bắt buộc 2

6 I.1.3 Phiên mã, dịch mã và sao chép genome virus 5

11 I.2.4 Khảo sát hình dạng và cấu trúc của virus 9

13 I.2.6 ðịnh lượng virus trong tế bào nuôi cấy 10

18 I.3.1 Tác nhân virus gây bệnh ở tôm 16

19 I.3.2 Khả năng lây lan dịch bệnh virus ở tôm 17

20 I.3.3 Khả năng biến ñổi di truyền và sự xuất hiện các

chủng virus mới

18

25 II.3 Chuẩn ñộ virus theo phương pháp pha loãng nồng ñộ 24

26 II.4 Phân lập và tinh sạch virus theo phương pháp Plaque 24

28 II.6 Thu nhận virus từ tế bào Sf9 cảm nhiễm 26

30 II.8 Siêu ly tâm gradient sucrose và CsCl 28

31 II.9 Tinh sạch virus bằng ly tâm gradient sucrose 28

32 II.10 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp 29

33 II.11 Phương pháp hiển vi ñiện tử xác ñịnh kích thước và

hình dạng virus

31

36 II.14 Phương pháp ñiện di hai chiều (2 D) và phân tích 35

39 II.17 Ly trích DNA bằng Kit QIAamp MinElute Virus Spin 43

40 II.18 Phương pháp ly trích DNA từ gel agarose 44

41 II.19 Phương pháp ñiện di DNA trên gel agarose 45

42 II.20 Phương pháp xác ñịnh bản chất acid nucleic bằng các

enzyme nuclease

47

43 II.21 Cắt DNA genome virus bởi một số enzyme cắt giới hạn 49

44 II.22 Phương pháp RDVD giải trình tự nhanh virus 50

46 II.24 Khảo sát các phân ñoạn DNA trong genome virus 54

47 II.25 Chỉ thị RTV trên mẫu tế bào Sf9 nhiễm WSSV với cặp mồi P4

54

48 II.26 Phân tích trình tự DNA và Protein 54

49 II.27 Phương pháp gây nhiễm thực nghiệm cho tôm sú với

RTV từ tế bào nuôi cấy

56

50 II.28 Phương pháp ñiều tra tình hình bệnh (PL.4) 56

53 III.2 Kết quả nghiên cứu hiển vi ñiện tử 57

54 III.3 Kết quả xác ñịnh miễn dịch huỳnh quang tế bào côn

56 III.5 Kết quả thu nhận virus ñậm ñặc từ dịch tế bào nuôi cấy 63

57 III.5.1 ðậm ñặc dịch virus bằng phương pháp ñông khô 63

58 III.5.2 Kết quả thu nhận virus bằng phương pháp SLT 63

59 III.6 Kết quả xác ñịnh mật ñộ nổi của RTV trong sucrose 65

60 III.7 Kết quả xác ñịnh mật ñộ nổi của RTV trong CsCl 68

61 III.8 Kết quả phân tích nanoLC-ESI-MS/MS 69

62 III.8.1 Lấy mẫu trên bản gel sau ñiện di 69

63 III.8.2 Kết quả nhận diện protein 70

64 III.8.3 Kết quả xác ñịnh khối lượng phân tử của protein 70

65 III.8.4 Giải trình tự de novo các peptide 72

66 III.9 Kết quả ñiện di hai chiều (2D) xác ñịnh thành phần

protein của RTV

73

67 III.10 Kết quả xác ñịnh bản chất của genome RTV 77

68 III.11 Kết quả ước ñịnh kích thước genome của RTV 78

69 III.12 Kết quả thủy giải DNA genome RTV bởi một số 79

enzyme giới hạn

70 III.13 Kết quả phân tích genome RTV bằng phương pháp

RDVD

80

71 III.13.1 Trình tự các phân ñoạn thu ñược 80

72 III.13.2 Khảo sát PCR DNA của RTV tinh sạch với 4

74 III.14 Kết quả phân tích trình tự sản phẩm PCR của RTV 87

75 III.14.1 Thu sản phẩm PCR trên gel agarose 87

76 III.14.2 Giải trình tự sản phẩm PCRtrên mẫu RTV tinh

sạch với cặp mồi C4

87

77 III.14.3 Kết quả tìm kiếm trình tự tương ñồng của DNA1

và DNA2 trên Genbank

88

78 III.14.4 Kết quả tìm khung ñọc mở (Open Reading Frame-

ORF) từ 2 trình tự DNA1 và DNA2

90

79 III.15 Kết quả gây nhiễm thực nghiệm cho tôm với RTV từ

tế bào nuôi cấy

94

80 III.15.1 Kết quả gây nhiễm thực nghiệm cho tôm sú giống

với RTV từ tế bào nuôi cấy

94

81 III.15.2 Kết quả gây nhiễm thực nghiệm cho tôm sú trưởng thành với RTV từ tế bào nuôi cấy

97

82 III.15.3 KẾT LUẬN VÀ ðỀ XUẤT Ý KIẾN 101

83 III.16 Kết quả ñiều tra bệnh ñuôi ñỏ hoại tử ở tôm sú trên ñịa

bàn Khánh Hòa, Ninh Thuận và Bình Thuận

DANH MỤC HÌNH

5 Hình 5 Sự tách hạt virus trong gradient mật ñộ 8

8 Hình 8 Chỉ thị tế bào nhiễm virus bằng kháng thể ñặc hiệu ñánh

dấu huỳnh quang

9

9 Hình 10 Sơ ñồ chọn dòng gene dùng tế bào vi khuẩn và vector

plasmid

11

16 Hình 16 Các pha phân tách khi ly trích acid nucleic bằng phenol 42

17 Hình 17 Các cặp primers sử dụng ñể xác ñịnh trình tự RNA virus 51

28 Hình 28 Ảnh chụp Plaque RTV dưới kính hiển vi soi ngược 62

31 Hình 31 Giá trị OD của các phân ñoạn sau SLT gradient

sucrose

65

35 Hình 35 ðường cong giá trị OD của các phân ñoạn sau SLT CsCl 68

36 Hình 36 Bảng gel ñiện di protein RTV và vị trí band cắt cho phân

tích nanoprotein

69

42 Hình 42 Kết quả phân tích trên gel chỉ ra các spot khác biệt ở mức

thống kê 99% từ mẫu RTV-LA và mẫu ñối chứng

74

44 Hình 44 Kết quả tính kích thước genome của RTV trên gel agarose 78

46 Hình 46 Kết quả ñiện di agarose sản phẩm thủy giải genome RTV 80

56 Hình (6) Dấu hiệu bệnh thể hiện ở một số tôm yếu và chết ở các

nghiệm thức cho ăn virus

100

57 Hình (7) Hình chụp mẫu tôm thu ngẫu nhiên trong nghiệm thức

cho tôm dùng loại thức ăn ñã ñược bổ sung virus, ở ñộ mặn 10%o

100

58 Hình (8) Dấu hiệu ñỏ ñuôi xuất hiện ở các con tôm yếu và chết

trong các nghiệm thức tiêm virus RTV

100

59 Hình (1) Tỉ lệ ñìa nuôi tôm sú ở ba Tỉnh: Khánh Hòa, Bình Thuận,

Ninh Thuận xuất hiện bệnh ñỏ ñuôi (n=128)

DANH MỤC BẢNG

1 Bảng 1 Nơi xảy ra quá trình sao chép genome virus trong tế bào 5

10 Bảng 10 Giá trị OD 254 nm của các dung dịch trước SLT và các

phân ñoạn sau SLT

16 Bảng 16 Khối lượng phân tử của các protein chủ yếu của RTV

trong ñiện di 2D

74

17 Bảng 17 So sánh kết quả ñiện di 1 chiều và 2 chiều mẫu RTV-LA 76

18 Bảng 18 Trình tự các phân ñoạn DNA của RTV thu ñược bằng

phương pháp RDVD

81

20 Bảng 20 Tổng hợp các trình tự tương ñồng của kết quả Blast

DNA1 (blastn,blastx, Tblastx)

89

21 Bảng 21 Tổng hợp các trình tự tương ñồng của kết quả Blast

DNA2 (blastn,blastx, Tblastx)

25 Bảng (6): Những dấu hiệu bất thường về môi trường ñìa nuôi

trước khi xảy ra bệnh ñỏ ñuôi

104

MỞ đẦU

Với quy mô phát triển và kỹ thuật ngày càng cao, nghề nuôi trồng thủy sản ựã trở thành một ngành công nghiệp mang lại nhiều thành tựu ựáng kể cả về kinh tế và xã hội cho các nước ở khu vực ven biển đông Nam Châu Á, ựặc biệt ở Việt Nam Tuy vậy, cũng như nhiều ngành chăn nuôi khác, nghề nuôi trồng thủy sản ở quy mô công nghiệp tất yếu dẫn ựến dịch bệnh phát sinh nghiêm trọng

Do ựặc thù về cơ chế miễn dịch và môi trường sống của tôm, một khi dịch bệnh bùng phát, người nuôi hoàn toàn bị ựộng vì không có thuốc trị bệnh ựặc hiệu, nên thiệt hại không thể tránh khỏi Sự rủi ro trong sản xuất tất yếu dẫn ựến sự không ổn

ựịnh cả ở lĩnh vực chế biến xuất khẩu và tạo ra hệ lụy dây chuyền trong ựời sống

kinh tế - xã hội của cả cộng ựồng

Tình hình dịch bệnh do virus gây ra ở tôm càng ngày càng phức tạp Hầu hết các bệnh virus ựược công bố trên thế giới ựều ựã có mặt ở Việt Nam Sự ựồng nhiễm nhiều loại virus trong một cá thể làm dịch bệnh bùng phát rất nhanh chóng Những chứng bệnh lạ thường xuyên xuất hiện làm người sản xuất thông thể ứng phó kịp Chắnh vì vậy, nghiên cứu về tác nhân bệnh virus ựể ựưa ra những giải pháp kiểm soát bệnh hiệu quả là yêu cầu cấp thiết nhất trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản bền vững hiện nay

Tổ chức FAO ựã hết sức nỗ lực trong việc tạo lập các tổ chức quốc tế nhằm thống nhất mục tiêu nghiên cứu ựể tìm kiếm, phát hiện sớm tác nhân bệnh và phối hợp các giải pháp kiểm soát bệnh ở quy mô toàn cầu Với những nỗ lực ựó, danh sách tác nhân bệnh virus phát hiện ựược ngày càng nhiều Tuy vậy, số những virus ựã ựược phát hiện cũng chưa phản ánh hết sự hiện diện của các loại virus vẫn ựang tồn tại trong thực tế Vì vậy, việc tìm kiếm phát hiện dấu hiệu bệnh mới thực sự cần thiết

ựể sớm nhận diện nguy cơ tiềm ẩn và tìm giải pháp nhằm kiểm soát và hạn chế sự

lây lan tác nhân bệnh

Ở giai ựoạn I của ựề tài (2003 Ờ 2006), chúng tôi ựã phát hiện và khẳng ựịnh ựược

tác nhân virus gây ra bệnh ựuôi ựỏ hoại tử ở tôm sú Nhiệm vụ tiếp theo của ựề tài (2007 Ờ 2010) là xác ựịnh các ựặc trưng cơ bản về sinh lý, sinh hóa và phân tử của virus làm cơ sở ựể xác ựịnh nguồn gốc phát sinh loài của tác nhân bệnh này Ngoài

ra, ựề tài cũng phối hợp với các ựơn vị chuyên ngành bước ựầu ựiều tra tình hình bệnh ựuôi ựỏ hoại tử ở khu vực miền trung Chúng tôi hy vọng sẽ có những thông tin cần thiết cung cấp cho người nuôi tôm ựể nhận diện, ựề phòng và kiểm soát tác nhân bệnh Bên cạnh ựó chúng tôi cũng mong muốn xây dựng ựược hệ phương pháp hoàn chỉnh và hiệu quả phục vụ cho các nghiên cứu cơ bản nhằm tìm kiếm phát hiện virus gây bệnh mới và triển khai ựược phương pháp phát hiện bệnh hiệu quả trong thực tế

PHẦN I TỔNG QUAN I.1 ðẶC ðIỂM CƠ BẢN CHUNG CỦA VIRUS

I.1.1 Virus là vật ký sinh nội bào bắt buộc (Obligate Intracellular Parasite)

Virus khác với tế bào ở cách nhân lên Một tế bào mới luôn luôn ñược hình thành trực tiếp từ một tế bào trước ñó, nhưng một virion mới ñược hình thành bởi quá trình sao chép bên trong tế bào chủ và kéo theo sự tổng hợp các thành phần cấu tạo

và tập hợp chúng thành virion Virus do ñó là vật ký sinh tế bào và phụ thuộc vào tế bào chủ của chúng cho tất cả các yêu cầu bao gồm:

- Xây dựng các thành phần như các amino acid và nucleoside;

- Bộ máy tổng hợp protein (các ribosome);

- Năng lượng dưới dạng adenosine triphosphate (ATP)

Virus thay ñổi môi trường nội bào của tế bào chủ ñể gia tăng hiệu suất của quá trình tái tạo Sự biến ñổi có thể bao gồm việc tạo các cấu trúc màng mới, làm giảm biểu hiện gene của tế bào hay làm gia tăng các quá trình tế bào từ ñó có thể làm tăng số lượng virus từ tế bào(John, 2007)

I.1.2 Cấu trúc của virus

Virus chỉ có một loại nucleic acid (DNA hoặc RNA), không có hệ thống sinh tổng hợp protein riêng (không có ribosome), không có hệ thống biến dưỡng riêng, không tạo màng lipid riêng, không có khung sườn tế bào và không tăng trưởng (Phạm

Thành Hổ, 2001)

hoặc + =

+

Hình 1 Sơ ñồ cấu trúc cơ bản của virus

Bên ngoài tế bào chủ, virus tồn tại như là hạt virus hay còn gọi là virion Virion là

hệ thống chuyển tải gene Virion chứa genome virus và chức năng của nó là bảo vệ genome và trợ giúp ñưa genome vào tế bào chủ Genome ñược gói trong một cấu trúc protein gọi là capsid

DNA

RNA

Vỏ protein capsid Nucleocapsid Virus trần

Nucleocapsid Màng lipid có các

glycoprotein

Virus có màng bao

Nhiều virus cũng có một thành phần cấu tạo là lipid, thường có ở bề mặt virion ñể hình thành vỏ màng (envelope) Envelope cũng chứa các protein với vai trò trợ giúp

sự xâm nhập virus vào tế bào chủ Một số virus hình thành thể vùi protein (occlusion body) bảo vệ virion bên trong

I.1.2.1 Genome virus

Khác với các cơ thể sống khác, virus chỉ có chứa một loại acid nucleic DNA hoặc RNA Genome của các cơ thể bậc cao, ở cả ñộng vật và thực vật bao giờ cũng là DNA mạch kép, trong khi genome của virus có thể là RNA hoặc DNA ở dạng mạch

ñơn hoặc mạch kép, dạng thẳng hoặc dạng vòng Nói chung, genome virus nhỏ hơn

rất nhiều so với genome của tế bào Genome virus có một dải rộng kích thước từ 1.7

ñến 1000 kilobase (kb), ñược sao chép theo ba con ñường khác nhau:

DNA → DNA

RNA → RNA

RNA → cDNA → RNA

Các enzyme, chất dinh dưỡng, ribosome và các nguồn khác của tế bào chủ ñược sử dụng ñể tạo ra nhiều bản sao của bộ gene và các protein của các cấu phần khác Khi các phần riêng lẻ ñã tích ñủ, chúng tự ráp (self – assembly) với nhau thành số lượng lớn các virion rồi phá vỡ tế bào ñể tìm các tế bào chủ mới Các cấu phần ñược gắn với nhau bằng liên kết yếu nên không cần enzyme

* Nhóm lõi DNA: tất cả các virus biến ñổi tế bào qua việc gắn nucleic acid của

virus vào DNA của tế bào chủ Sự gắn này ổn ñịnh và ñược sao chép với bộ gene trong mỗi thế hệ Một số virus ở Eukaryotae giống về cấu trúc và chức năng so với một số gene của tế bào chủ hơn virus của vi khuẩn

* Nhóm lõi RNA: khi sáp nhập vào tế bào chủ, vỏ virion virus nhờ có cùng bản

chất sinh hóa mà dung giải liên tục, lẫn vào màng tế bào chủ, phần lõi còn lại giải phóng vào tế bào chất của tế bào chủ nhưng virion không bị phá hủy mà tế bào chủ

sẽ chọn lọc ñược các hợp phần virus cần thiết cho quá trình nhân bản virus Virus RNA có hai cách nhân bản:

- Khi lõi của virion vào tế bào chất (pha che khuất “eclypse”, các phân tử RNA virus có thể tự nhân ñôi thành các phân tử RNA virus mới dưới tác ñộng của enzyme tế bào chủ, hoặc một số virus RNA ñược xác ñịnh có loại enzyme sao chép ngược (inverse transcriptase) có thể sao một bản trên một phân tử DNA, xử lý ngược lại quá trình nhả xoắn thông thường khi sinh tổng hợp protein

- Nhân bản virus phụ thuộc vào hoạt ñộng sống của tế bào chủ vì chúng không có enzyme và các tiền trao ñổi chất cơ bản cần thiết ñể tự nhân ñôi nên phải dùng của vật chủ Sau khi lọt vào tế bào chủ, virus nhân bản ngay, tổng hợp riêng biệt loại lõi

và vỏ virus rồi ghép lại thành các virus mới Vỏ virus ñể lại ngoài màng tế bào chủ, lõi RNA hay DNA virus ñi vào tiếp xúc với ribosome (là cơ quan tổng hợp protein trong tế bào chủ) Tại ñây nhờ các enzyme và các nucleotid của tế bào chủ, RNA hay DNA virus ñiều khiển tổng hợp các protein và các phân ñơn vị protein chuyên

hóa hợp thành vỏ virus, còn các acid nucleic cũng tự nhân bản, sau ñó hai phần hợp lại thành một virus mới

Các virus RNA là các hệ nhân bản ñộc ñáo trong ñó RNA có thể tự nhân bản ñộc lập với DNA tế bào chủ Trong một số trường hợp RNA virus có chức năng như RNA thông tin: tự nhân ñôi gián tiếp bằng sử dụng các hệ tiền chất trao ñổi cơ bản

và ribosome của tế bào Vấn ñề ñặt ra là làm sao virus có thể mã hóa tất cả các nhu cầu của nó trong một genome nhỏ Thực nghiệm ñã chứng minh virus thực hiện

ñiều này bằng một số cách như sau:

1) Sử dụng protein của tế bào chủ Genome của các virus lớn sao chép một số chức

năng của tế bào chủ, nhưng các virus rất nhỏ dựa chủ yếu vào chức năng của tế bào chủ Tuy nhiên chức năng mã hóa RNA là bắt buộc với tất cả các loại virus Chức năng này là nhờ RNA polymerase vì tế bào không mã hóa enzyme ñể sao chép RNA virus Một phần ñáng kể của genome RNA virus là ñể mã hoá polymerase

2) Mã hoá rất hiệu quả Có thể có sự trùng lặp (overlapping) các gene và các gene

ñược mã hóa bên trong gene

3) Nhiều protein virus là ña chức năng Một protein virus có thể có một vài hoạt

tính enzyme

ða số genome virus chứa một phân tử ñơn acid nucleic, nhưng các gene của một vài

virus lại ñược mã hóa thành hai hay nhiều phân tử acid nucleic Những genome phân ñoạn này phổ biến ở RNA virus hơn DNA virus Quá trình của một genome phân ñoạn tạo ra cho virus khả năng kết hợp gene mới và do ñó tạo khả năng tiến hóa nhanh hơn

I.1.2.2 Protein virus

Khi kích thước genome virus tăng thì số lượng protein cũng có khuynh hướng tăng

Vỏ protein bọc bộ gene gọi là capsid, thường có dạng que, ống, xoắn, ña diện hay phức tạp Các capsid thường ñược tạo nên bởi một số lớn tổ hợp các phân tử protein gồm ít loại, ñược gọi là capsome Một vài virus có cấu trúc phụ hỗ trợ ñể chúng

nhiễm vào tế bào chủ Capsid virus là yếu tố xác ñịnh quan trọng của giải vật chủ

và chúng là ñích của tính miễn dịch bảo vệ của vật chủ (Alan, 2002)

Nhiều virus ñộng vật có màng bao (envelope) có nguồn gốc từ màng tế bào chủ, nhưng ngoài phospholipid và protein của tế bào chủ, chúng còn có thêm các protein

và glycoprotein nguồn gốc virus Những protein là thành phần của virion ñược gọi

là protein cấu trúc (Virus VP) Chúng thực hiện các chức năng bảo vệ genome virus, gắn virion vào tế bào chủ, dung giải màng virion vào màng tế bào Một số protein ñược tổng hợp bởi virus trong tế bào chủ nhưng không phải là thành phần của virion (non- structural protein – NS) bao gồm: các enzyme (protease, reverse transcriptase), các yếu tố phiên mã (transcription factor), primer cho sự sao chép acid nucleic và tương tác với ñáp ứng miễn dịch của tế bào chủ

Hình 2 Cấu trúc của vỏ capsid

Virus hình cầu với cấu trúc ña diện 20 mặt (a), Virus hình que với cấu trúc ñối xứng xoắn (b) (John, 2007)

I.1.3 Sự phiên mã, dịch mã và sao chép genome trong tế bào

Tùy loại virus mà quá trình tổng hợp các thành phần của chúng và nơi xảy ra các quá trình này rất khác nhau ðiều này trước hết phụ thuộc vào genome của virus là DNA hay RNA, mạch ñơn hay mạch kép, dạng thẳng hay khép vòng

ðối với các virus có genome là RNA: hầu hết các virus này có quá trình phiên mã,

sao chép và tổng hợp protein trong nguyên sinh chất Chỉ có một số là virus RNA nhưng lại sao chép trong nhân Chúng phiên mã ngược genome của chúng thành DNA trong nguyên sinh chất và ñợi cho tới khi quá trình phân bào bắt ñầu, DNA của virus (kết hợp với protein) có thể vào trong nhân Vì thế các virus này chỉ có thể

sao chép ở trong các tế bào ñang phân chia

ðối với các virus có genome là DNA: ña số virus ñộng vật chứa DNA mạch kép

Quá trình phiên mã và sao chép xảy ra trong nhân, protein ñược tổng hợp ở tế bào chất Các protein cấu trúc của các virus này có các trình tự cho phép chúng gắn vào

vi ống ñể vận chuyển vào nhân tế bào ñể lắp ráp Chỉ có nhóm poxvirus là virus

DNA, nhưng quá trình sao chép và tổng hợp protein ñều diễn ra trong tế bào chất

của tế bào nhân chuẩn (Nguyễn Xuân Thành, 2004)

Bảng 1 Nơi xảy ra quá trình sao chép genome virus trong tế bào eukaryote

I.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHỔ BIẾN TRONG NGHIÊN CỨU VIRUS

Nhiều năm qua, sự di trú toàn cầu dẫn tới nảy sinh bệnh dịch gây nguy hiểm lớn ñối với kinh tế và sức khỏe cộng ñồng ðể hạn chế sự bùng nổ dịch bệnh, sự phát hiện sớm tác nhân bệnh truyền nhiễm là hết sức cần thiết Trong thực tế, sự bùng nổ hội chứng hô hấp cấp nguy hiểm (SARS) cho ta một bài học quan trọng là một virus mới xuất hiện cần phải ñược phát hiện nhanh như thế nào Do ñó, một hệ thống tiêu chuẩn và hiệu quả là yêu cầu quan trọng ñể phát hiện sớm các virus mới xuất hiện (Per Andersson, 2005)

Virus học là một lĩnh vực rộng, sử dụng nhiều phương pháp nghiên cứu phổ biến trong lĩnh vực sinh học tế bào và sinh học phân tử (John, 2007) Các phương pháp

ñược dùng trong nghiên cứu virus nhằm ñưa ra sự ñánh giá chính xác bản chất của

virus và các kỹ thuật ñược sử dụng ñể ñạt ñược kiến thức và sự hiểu biết về virus

I.2.1 Nuôi cấy virus (Cultivation of viruses)

Virus ñộng vật khởi sự quá trình nhiễm vào tế bào bằng việc gắn thụ ñộng vào các receptor bề mặt tế bào, sau ñó genome virus ñược tháo khỏi vỏ, ñi vào nguyên sinh chất và tiếp tục dịch mã ñể tạo ra các protein cần thiết cho quá trình sao chép của virus và các protein cấu trúc của virus Ở giai ñoạn nhiễm muộn, các virion tập hợp lại và phóng thích khỏi tế bào Quy trình nhiễm kết thúc bởi sự phá hủy cấu trúc của

tế bào bị nhiễm, tế bào bị biến dạng về hình thái hay bị chết (Hình 3B) (Nguồn: John, 2007)

3A 3B

Hình 3 Tế bào Vero

3A: tế bào bình thường 3B: tế bào nhiễm virus Polio

Hàng loạt quy trình nuôi cấy virus ñược phát triển ñể phục vụ cho nghiên cứu Một

số kỹ thuật ñã ñược phát triển ñể nuôi cấy virus trong hệ thống không có tế bào, nhưng ña số trường hợp cần phải có dòng tế bào tương thích cho virus phát triển Virus ñộng vật có thể ñược ñưa vào cơ thể sống như chuột, phôi trứng hay sâu non Tuy vậy, ña số trường hợp virus ñộng vật ñược phát triển trong tế bào ñộng vật nuôi

cấy in vitro

Không phải mọi virion ñều có khả năng tái tạo trong tế bào vật chủ Những virion

có khả năng này ñược gọi là lây nhiễm (infective) và thuật ngữ “tính gây nhiễm” (infectivity) ñược dùng ñể biểu thị khả năng tái tạo của virus Các virion có thể không lây nhiễm vì chúng thiếu một phần genome hay vì chúng bị tổn thương ðể xác ñịnh trong mẫu có virus lây nhiễm hay không chúng cần ñược ủ với tế bào nuôi cấy hay cơ thể vật chủ Sự thay ñổi hình thái tế bào sau ñó ñược kiểm tra và quan

sát dưới kính hiển vi Sự thay ñổi hình thái tế bào do virus ñược gọi là hiệu ứng tế bào (cytopathic effect – CPE)

I.2.2 Phân lập virus (Isolation of viruses)

Nhiều virus có thể ñược phân lập là kết quả của việc hình thành vùng riêng biệt nhìn thấy ñược (plaque) Trong nuôi cấy tế bào, nếu một lớp tế bào ñược ủ với virus

ở nồng ñộ pha loãng sao cho chỉ rất ít tế bào bị nhiễm bởi virus ban ñầu Sau ñó các

plaque hình thành ở vị trí tế bào bị chết hay thay ñổi bởi sự nhiễm virus Mỗi plaque hình thành khi sự nhiễm lan rộng ra xung quanh từ tế bào bị nhiễm ban ñầu và ñược

cố ñịnh bởi lớp agarose phủ lên trên ñể bảo ñảm các hạt virus không bị khuếch tán (hình 4)

Virus ñầu tiên ñược phân lập có thể sao chép kém trong tế bào in vitro Nhưng sau

khi trải qua một số chu kỳ tái tạo chúng có thể tái tạo một cách rất hiệu quả Mỗi lần virus ñược cấy chuyền (sub-cultured) gọi là passage Sau một số lần passage virus

có thể có khác biệt về di truyền với chủng hoang dại ban ñầu Trong trường hợp này

nó trở thành chủng virus phòng thí nghiệm

I.2.3 Tinh sạch virus

Virus có thể ñược tinh sạch từ nhiều nguồn khác nhau: từ tế bào nuôi cấy, từ mô cơ quan hay vật chủ nguyên vẹn Quy trình tinh sạch các loại virus khác nhau ñược xem là virion có tính bền lớn hơn tất cả các hạt và các ñại phân tử của tế bào Hơn nữa, virion nói chung khác với các hạt và ñại phân tử của tế bào về mặt vật lý

Virus sau khi ñược nhân lên trong tế bào thường ñược loại bỏ cặn tế bào và những tạp chất khác trước khi mẫu virus ñược sử dụng cho các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm Nhiều quy trình tinh sạch virus liên quan ñến siêu ly tâm Sự tinh sạch virion thường bắt ñầu bằng việc ñồng nhất (homogenization) mẫu bằng cách nghiền

tế bào hay mô bị nhiễm trong dung dịch ñệm có ñộ pH và nồng ñộ muối thích hợp Quá trình ñồng nhất mẫu virus cần thực hiện ở nhiệt ñộ thấp Cặn thô của tế bào và

mô ñược lọc qua vải hay các vật liệu tương tự

Phần lớn các virus không bị bất hoạt ở nhiệt ñộ thấp, bền với acid và nồng ñộ muối cao Tuy vậy cũng có ngoại lệ, mô nhiễm virus hay virus ñã tinh sạch có thể bị suy giảm trong những ñiều kiện khác nhau Vì vậy không có quy trình chung ñược áp dụng cho mọi loại virus Thậm chí một quy trình chung nhất ñể cô ñặc virus là siêu

ly tâm cũng làm ảnh hưởng ñến cấu trúc của virion nhất ñịnh vì lực khép kín

Có khả năng một plaque bị nhiễm bởi hai hay nhiều virus, do ñó, ñể ñảm bảo rằng chủng thu ñược là thuần nhất về di truyền thì virus thu ñược từ 1 plaque cần lặp lại quá trình trên một hoặc hai lần ðây ñược xem là nguồn virus ñã ñược tinh sạch

Hình 4 Các plaque virus ñộng vật trong nuôi cấy tế bào

(Nguồn: John, 2007)

khoảng 100.000xg ñược áp vào ñáy của ống ly tâm Các virion ñó có thể ñược tách

ra thành công bằng cách lắng chúng vào ñệm sucrose ñậm ñặc hay dung dịch

glycerol, hay bằng cách sử dụng siêu lọc hoặc tác nhân kết tủa nhẹ ñể tránh ly tâm

tốc ñộ cao Virion cũng có thể kết tủa bằng amonium sulfate hay PEG

Tinh sạch từng phần (partial purification) có thể ñạt ñược bởi ly tâm lắng

(differential centrifugation) Mức ñộ tinh sạch cao hơn có thể ñạt ñược bởi một

vài dạng ly tâm gradien mật ñộ (Density gradient centrifugation)

Ly tâm lắng (Differential centrifugation)

Ly tâm lắng liên quan ñến các chu kỳ ly tâm thay ñổi, từ

ly tâm tốc ñộ thấp (khoảng 10 000 xg/20 phút) Sau quá trình này toàn bộ virus còn ở trong phần dịch nổi, Tiếp theo là chu kỳ ly tâm tốc ñộ cao (khoảng 100 000 xg/2 giờ) Sau quá trình này virus tập trung ở trong phần lắng cặn (hình 6)

Ly tâm gradien mật ñộ (Density gradient centrifugation)

Ly tâm gradien mật ñộ liên quan ñến sự ly tâm các hạt (virus) hay các phân tử (như là nucleic acid) trong một dung dịch có nồng ñộ tăng dần Chất tan ñược sử dụng phổ biến là sucrose có tính hòa tan cao Có hai cách chủ yếu trong ly tâm grarien mật ñộ là ly tâm vùng (rate zonal) và ly tâm ñẳng tỷ trọng (isopycnic) (hình 7)

Hình 6 Mô hình ly tâm lắng

Trong ly tâm vùng, hạt di chuyển qua gradient ở tốc ñộ ñược xác ñịnh bởi hệ số

lắng liên quan ñến kích thước hạt Các hạt ñồng nhất như các hạt virus giống nhau

sẽ di chuyển tạo thành một vạch nhìn thấy rõ và có thể thu nhận hạt virus sau khi các vạch di chuyển qua gradient (hình 7)

Trong ly tâm ñẳng tỷ trọng, một nồng ñộ chất tan ñược chọn ñể bảo ñảm rằng mật

ñộ ở ñáy của gradient lớn hơn các hạt hay các phân tử cần ñược tinh sạch Các hạt

sẽ di chuyển ñến vị trí mà ở ñó mật ñộ gradient bằng với mật ñộ của nó Kỹ thuật này cho phép xác ñịnh mật ñộ nổi (Buoyant density) của acid nucleic và virion Buoyant density của virion ñược xác ñịnh trong gradient của caesium chloride (CsCl), ñược sử dụng như là tiêu chuẩn trong xác ñịnh ñặc trưng của virus (hình 5)

I.2.4 Khảo sát hình dạng và cấu trúc của virus

I.2.4.1 Sử dụng kính hiển vi thường

Kích thước của tất cả các virion không thể ghi nhận ñược bằng kính hiển vi ánh sáng thường, nhưng kính hiển vi ánh sáng thường ñược áp dụng ñể chỉ thị tế bào bị nhiễm virus Thí dụ, bằng sự quan sát hiệu ứng hủy hoại tế bào (cytopatic effect) hay soi kính huỳnh quang (fluorescent microscope) tế bào nhiễm virus ñược chỉ thị bằng cách sử dụng kháng thể kháng ñặc hiệu virus ñược ñánh dấu trực tiếp với thuốc

nhuộm fluorescent (hình 8)

Hình 8 Chỉ thị tế bào nhiễm virus bằng kháng thể ñặc hiệu ñánh dấu huỳnh quang

(Nguồn: John, 2007)

I.2.4.2 Sử dụng kính hiển vi ñiện tử

Phần lớn nghiên cứu cấu trúc virion sử dụng kính hiển vi ñiện tử ðộ phóng ñại lớn

có thể ñạt ñược với kính hiển vi ñiện tử quét trong ñó virus trong dung dịch hay trong lớp cắt mỏng của tế bào nhiễm virus ñược xử lý sao cho các chi tiết cấu trúc, kích thước và vị trí sao chép của chúng có thể quan sát và ghi nhận ñược

I.2.5 Kỹ thuật ñiện di

Hỗn hợp protein hay acid nucleic có thể tách ra trong gel polyacrilamide hay gel agarose tương ứng Trong tất cả các kỹ thuật ñiện di, mỗi protein hay acid nucleic hình thành một band trong gel ðiện di có thể thực hiện trong các ñiều kiện mà ở ñó tốc ñộ di chuyển qua gel dựa vào trọng lượng phân tử Khối lượng phân tử của

Hình 7 Mô hình ly tâm gradient mật ñộ

Ly tâm vùng Ly tâm ñẳng tỷ trọng dịch chứa

virus

protein hay kích thước acid nucleic có thể ước chừng ñược khi so sánh với các vị trí tương ñương của band ñã biết sẵn (marker) Kỹ thuật ñể ước lượng khối lượng phân

tử của protein là ñiện di gel với sự có mặt của chất tẩy sodium dodecyl sulphate (SDS-PAGE)

I.2.6 ðịnh lượng virus trong tế bào nuôi cấy

ðịnh lượng hạt gây nhiễm trong mẫu chứa virus là công cụ quan trọng trong nghiên

cứu virus học Chuẩn ñộ virus chủ yếu ñược xác ñịnh bằng phương pháp cảm nhiễm virus cho ñộng vật chủ (bioassay), phương pháp tế bào xác ñịnh khuẩn lạc (plaque assay) hay phương pháp pha loãng nồng ñộ (endpoint titration assay) hoặc một số phương pháp khác tùy thuộc vào tính chất của loại virus

I.2.6.1 Phương pháp xác ñịnh khuẩn lạc

Phương pháp xác ñịnh khuẩn lạc có thể tiến hành với bất kỳ virus nào có khả năng hình thành khuẩn lạc ðây là phương pháp ñược tiến hành dựa vào việc pha loãng nồng ñộ virus sao cho các khuẩn lạc (một vùng tế bào bị nhiễm virus) ñược hình thành từ một hạt virus ban ñầu và tách biệt so với các khuẩn lạc khác Giá trị chuẩn

ñộ ñược thể hiện với phương pháp này là ñơn vị hình thành khuẩn lạc (Plaque

forming Unit – PFU) Số lượng khuẩn lạc hình thành phản ánh số lượng hạt gây nhiễm trong dung dịch

I.2.6.2 Phương pháp pha loãng nồng ñộ

Giá trị chuẩn ñộ ñược thể hiện với phương pháp này là liều gây nhiễm 50% mô nuôi cấy (Tissue culture infectious dose) (TCID50/ml) Dịch virus ñược pha loãng hệ số

10 Mỗi nồng ñộ virus ñược ủ với 1 hàng tế bào nuôi cấy trong ñĩa chuẩn ñộ 96 giếng Sau một thời gian ủ nhất ñịnh, tế bào trong các giếng ñược ghi nhận dương tính (+) hoặc âm tính (-) dựa vào CPE quan sát ñược Sử dụng phương pháp Reed-Muench ñể xác ñịnh giá trị TCID50 theo công thức:

Lg TCID50 = Lg B+ (b -50) / (b - a) x d

Trong ñó:

B: liều virus gây nhiễm mà ở ñó nhận ñược hiệu quả nhiễm >50 %

b: số % nhiễm lớn hơn và gần sát 50%

a: số % nhiễm nhỏ hơn ngay sau 50%

d: logarit của hệ số pha loãng

ðơn vị mật ñộ virus là TCID50 / ml

Có thể chuyển ñổi ñơn vị TCID50 / ml thành ñơn vị pfu / ml bằng cách nhân giá trị TCID50 với 0.69

I.2.6.3 ðịnh lượng nhanh virus bằng MTT

(3-(4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyl-tetrazolium-bromide) (Per Andersson, 2005)

Mặc dù ñược sử dụng rất phổ biến nhưng phương pháp xác ñịnh khuẩn lạc và phương pháp pha loãng nồng ñộ có nhược ñiểm là tốn thời gian và yêu cầu theo dõi

hàng ngày từ 5-10 ngày Trong nhiều trường hợp, một số virus không gây ra hiệu

ứng hủy hoại tế bào, vì vậy không thể áp dụng ñược phương pháp xác ñịnh khuẩn

lạc và phương pháp pha loãng nồng ñộ ñể chuẩn ñộ hạt virus gây nhiễm

Phương pháp ñịnh lượng nhanh virus bằng MTT dựa trên nguyên tắc MTT sẽ bị khử thành formazane với sự có mặt của enzyme succinate dehydrogenase của ty thể của tế bào cũng như một vài enzyme dehydrogenase khác của tế bào Nghiên cứu với Polio virus chỉ ra rằng polio virus gây ra sự ức chế sớm hoạt tính của succinate dehydrogenase dẫn ñến ức chế quá trình hô hấp của tế bào Hiện tượng này quan sát

ñược trước khi hiệu ứng hủy hoại tế bào ghi nhận ñược Kết quả này có thể suy ra

rằng tế bào không bị nhiễm có thể khử MTT ñể hình thành formazane có mức ñộ lớn hơn tế bào bị nhiễm

Thuốc nhuộm MTT ñã ñược sử dụng ñể khảo sát tính ñộc ñối với tế bào của một số chất như xử lý với homon sinh trưởng người hay thuốc dùng cho bệnh nhân bị Alzheimer MTT cũng ñươc sử dụng ñể nghiên cứu các khía cạnh khác nhau của hiệu ứng virus ñối với tế bào

Cloning phân tử là kỹ thuật cho phép lập bản ñồ phân tử DNA, phân lập chọn lọc và khuếch ñại các phân ñoạn ñặc hiệu của DNA cũng như biểu hiện của các gene vào

tế bào vật chủ mới (hình 9)

1.2.7 Nhân dòng gene

I.2.7.1 Nhân dòng gene thông qua hệ thống tế bào vi khuẩn và vector plasmid

Thu nhận virus tinh sạch

Tách chiết RNA/DNA tổng số

Thu nhận gene (tách các ñoạn DNA từ bộ gene)

Tạo plasmide tái tổ hợp mang gene cần

Biến nạp DNA tái tổ hợp và tế bào

Chọn lọc, tạo dòng gene

Phân tích trình tự gene và xác ñịnh nguồn gốc phát sinh loài

Hình 9 Sơ ñồ chọn dòng gene dùng tế bào vi khuẩn và vector plasmid

I.2.7.2 Phương pháp xác ñịnh nhanh trình tự RNA virus mới (Rapid determination of viral RNA – RDV) (Tetsuya, 2007)

Do các enzyme giới hạn chỉ nhận biết và cắt chuỗi DNA ở những vị trí xác ñịnh nên việc xác ñịnh trình tự của RNA virus khó khăn hơn rất nhiều Hiện nay phương pháp mới ñể xác ñịnh các RNA virus ñã ñược phát triển bởi nhóm các nhà nghiên cứu ở Viện Nghiên cứu Bệnh Truyền nhiễm Quốc gia của Nhật và ñược ứng dụng thành công trong nghiên cứu xác ñịnh nhanh các virus RNA trong mẫu dịch nổi tế bào nuôi cấy nhiễm virus

Phương pháp này dựa trên cơ sở phân tích sự khác biệt giữa các cDNA ñại diện (Representatial Difference Analysis – RDA) bằng cách sử dụng 96 hexanucleotides (các ñoạn 6 nucleotide) không thích hợp cho việc bắt cặp RNA ribosome, nhưng lại bắt cặp bình thường tất cả các genome của RNA virus như là các mồi cho phiên mã ngược từ RNA sang cDNA (Mizutani, T., 2007) ðây là một phương pháp nhanh ñể xác ñịnh trực tiếp các trình tự RNA virus mà không sử dụng bước tạo dòng cDNA Phương pháp này có thể phát hiện ñồng thời các phân ñoạn cDNA của nhiều virus khác nhau mà không sử dụng mồi ñặc hiệu, bao gồm cả một số virus không thể phát hiện bằng phương pháp RT-PCR thông thường như virus Yokose (YOKV) - một flavirus, hay enterovirus và có thể phát hiện cả virus chưa biết một cách nhanh chóng Hạn chế của phương pháp này là phải nuôi cấy virus trong tế bào và phải qua nhiều bước Phương pháp RDV gồm 6 công ñoạn:

1 Bán tinh sạch các hạt virus bằng cách phá hủy cấu trúc RNA và DNA của tế bào

2 Hạn chế các phân ñoạn DNA bằng việc sử dụng hệ thống cột tiền lọc và và tách rửa một lượng nhỏ RNA

3 Tổng hợp sợi cDNA ñơn và sợi kép (first and second – strand cDNA)

4 Cấu trúc và khuếch ñại thư viện cDNA

5 Cấu trúc thư viện cDNA sợi kép

6 Giải trình tự trực tiếp bằng cách sử dụng các primer ngẫu nhiên (hình 17) Với cải biến nhỏ trong phương pháp này, nhóm tác giả ñã phát triển thêm một hệ thống ñể xác ñịnh nhanh các trình tự DNA virus (Rapid determination of viral DNA sequences – RDVD) Nhờ vậy không chỉ các virus RNA ñược phát hiện nhanh mà

cả virus DNA cũng ñược phát hiện nhanh bằng hệ thống RDV (Maeda, K., 2008)

I.2.8 Học thuyết trung tâm – cơ sở cho nghiên cứu trình tự DNA và protein

Năm 1953, Crick nêu giả thiết, rằng DNA xác ñịnh trình tự aminoacid trong mạch polypeptide Cơ sở cho mối quan hệ này là cả gene và mạch polypeptide ñều có cấu trúc thẳng: một bên là trình tự các nucleotide, một bên là trình tự các amino acid Nhiều thực nghiệm sau ñó ñã chứng minh giả thiết này là hoàn toàn ñúng Như vậy, thứ tự theo ñường thẳng của các nucleotide sẽ xác ñịnh trình tự amino acid ñặc trưng và những thay ñổi ñột biến trong thứ tự nucleotide sẽ gây nên biến ñổi ở vị trí

tương ứng của trình tự amino acid ðây chính là cơ sở của học thuyết trung tâm của sinh học phân tử ñược Crick nêu ra từ năm 1958

Học thuyết trung tâm thể hiện mối quan hệ giữa DNA và protein như sau:

Mã di truyền cũng có tính suy thoái (degeneration), tức là 1 amino acid có nhiều codon mã hóa, trừ Methionine và Tryptophane chỉ có một codon mã hóa Codon mã hóa cho Methionine AUG là codon mở ñầu khung ñọc mở ORF (Phạm Thành hổ, 2001)

I.2.9 ðịnh danh virus

I.2.9.1 ðặt tên virus

Không có một phương pháp ñơn lẻ nào ñể ñặt tên các nhóm virus Tên của các virus riêng ñược sử dụng khá tự do (John, 2007):

- Tên của một số virus dựa vào vật chủ Ví dụ tên của các virus gây bệnh côn trùng thường ñược ñặt trùng với tên La tinh của côn trùng ñó

- Các virus của vi khuẩn có ký hiệu ñơn giản như T1, T2…ñược gọi là phage

- Virus của người và các ñộng vật có xương sống khác thường ñược ñặt tên theo bệnh mà chúng gây ra như virus sởi, virus lở mồm long móng v.v…

- Tên của virus ñược ñặt theo ñịa danh mà virus ñược phát hiện

- Các virus ñộng vật có DNA sợi ñơn, ñối xứng lập phương, nhỏ ñược gọi là

Parvovirus (từ La tinh Parvus là nhỏ)

- Các virus thực vật ña diện ñược gọi là nepovirus

I.2.9.2 Phân loại virus

ðối với một virus chưa biết, việc khảo sát và nghiên cứu các ñặc ñiểm lý, hóa và

sinh học của virus là những nội dung cơ bản Các ñặc ñiểm này sẽ ñược sử dụng ñể nhận diện và phân loại virus Tùy thuộc vào số lượng, ñặc ñiểm phân tích ñược mà virus có thể ñược phân loại ở các mức ñộ khác nhau (bộ, họ, chi hay loài…) dựa vào các chỉ tiêu phân loại

Sao chép

- Tiêu chuẩn phân loại của ICTV (International Committee of Taxonomy of

Viruses) ICTV xây dựng các luật cho danh pháp và phân loại virus và cân nhắc ñề

nghị cho nhóm phân loại và tên virus mới

phân loại virus dựa trên nhiều ñặc ñiểm cấu trúc và sinh học cơ bản ðể xác ñịnh chính xác một loại virus mới người ta ước tính rằng cần phải có tới khoảng 500 ñặc

ñiểm Tuy vậy một số tính chất genome virus ñược ICTV sử dụng trong phân loại ñến mức ñộ loài bao gồm:

- Loại acid nucleic (DNA hay RNA)

- Kích thước genome, tính theo kp hoặc kbp

- Acid nucleic mạch ñơn (ss) hay mạch kép (ds)

- Mạch thẳng hay khép kín, phân cực (dương (+), âm (-) hay lưỡng cực

- Số lượng và kích thước các ñoạn (segment)

- Trình tự nucleotide, có hay không các trình tự lặp lại, các ñồng phân

- Tỷ lệ G+C

- Có hay không mũ ở ñầu 5’, có hay không protein liên kết ở ñầu 5’, có hay không

có ñuôi poly (A) ở ñầu 3’

- Theo hệ thống phân loại Baltimore:

Năm 1971, David Baltimore ñưa ra hệ thống phân loại virus dựa trên mối quan hệ giữa genome virus và mRNA Dựa vào kiểu gen và phương thức phiên mã, sao chép

mà các virus ñược chia thành 7 lớp Ưu ñiểm của hệ thống phân loại Baltimore là sự phân biệt giữa các virus RNA mạch dương ở lớp 6 (thực hiện phiên mã ngược) với các virus RNA mạch dương ở lớp 5 (không thực hiện phiên mã ngược), giữa các virus DNA mạch kép ở lớp 7 (thực hiện phiên mã ngược) với các virus DNA mạch kép ở lớp 1 (không thực hiện phiên mã ngược) (Hình 10)

(+) RNA và (+) DNA có cùng trình tự như mRNA (ngoại trừ ở DNA thymine thay thế cho uracil) (-) RNA và (-) DNA có trình tự bổ sung với mRNA (ngoại trừ ở DNA thymine thay thế cho uracil) Các mạch (+) và (-) không dùng cho dsDNA của các virus lớp I vì genome của hầu hết các virus này có khung ñọc mở theo cả 2 chiều Các mạch (+) và (-) dùng cho các DNA mạch ñơn của các virus lớp II Hầu hết các virus này ñều có genome mạch (+) hoặc mạch (-)

Hình 10 Sự sao chép genome virus trong 7 nhóm theo phân loại Baltimore

- Phân loại và danh pháp virus dựa vào dữ liệu trình tự protein và genome

Hiện nay các kỹ thuật ñể xác ñịnh trình tự genome virus và cấu tạo genome ñã có sẵn Hướng hiện ñại ñể ñịnh danh virus dựa trên sự so sánh các chuỗi và cấu tạo genome Mức ñộ tương ñồng giữa các genome virus có thể khẳng ñịnh khi sử dụng các chương trình máy tính và có thể ñược thể hiện trong biểu ñồ cây phát sinh loài (phylogenetic tree) vì chúng chỉ ra sự tiến hóa (phylogeny) của virus Cây phát sinh loài có thể gồm các týp virus khác nhau (hình 11)

Hình 11 Cây phát sinh loài không có gốc

Ví dụ về cây phát sinh loài không gốc bắt nguồn từ các trình tự của protein VP1 của

virus trong họ Reoviridae Các nhóm tên là giống của họ Không có giả ñịnh về tồ

tiên của virus trong cây phát sinh loài

Các nhánh của cây phát sinh loài chỉ ra liên hệ giữa các chuỗi trình tự Các nhánh

có thể so sánh ñược hoặc không so sánh ñược Nếu chúng so sánh ñược thì chiều

dài của chúng thể hiện khoảng cách di truyền giữa các trình tự (John, 2007)

I 3 VIRUS GÂY BỆNH Ở TÔM

Do có tính ñặc thù về vật chủ, môi trường sống của vật chủ và ñặc tính miễn dịch của vật chủ, nên virus gây bệnh tôm có một số nét khác biệt so với virus gây bệnh ở

ñộng vật nói chung

I.3.1 Tác nhân virus gây bệnh ở tôm ñược phát hiện ngày càng nhiều

Theo báo cáo của Tổ chức Sức khỏe ðộng vật Thế giới (World Organization for Animal Health – OIE), năm 1989 có 6 loại virus ñược biết có ảnh hưởng ñến tôm he

(Penaeus), nhưng ñến năm 1997 ñã có hơn 20 virus ñược ñịnh danh có ảnh hưởng

ñến các chủng tôm hoang dại và sản xuất thương mại [3]

Năm 2003, OIE ñưa ra danh sách 7 virus ñược xem là rất nguy hiểm, có khả năng lây lan và ảnh hưởng quan trọng ñến kinh tế xã hội và sức khỏe cộng ñồng Trong danh sách này, virus gây bệnh hội chứng ñốm trắng (White Spot Syndrome Virus -

WSSV) ñứng ở vị trí ñầu tiên, sau ñến virus gây bệnh ñầu vàng (Yellow Head Virus

- YHV), virus gây bệnh hội chứng Taura (Taura Syndrome Virus - TSV), virus gây

Seadornavirus Phytoreovirus

Orbivirus Rotavirus

Mycoreovirus

Coltivirus

Orthoreovirus Oryzavirus

Aquareovirus

Cypoviru s Fijiviru s

chết ấu trùng (Spawn Mortality Virus - SMV), baculovirus tôm he (Baculovirus

Penae - BP), baculovirus thể cầu (Spherical Baculovirosis Penaeus monodon - type

baculovirus - SBV) và virus gây hoại tử dưới da và nhiễm trùng máu (Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus - IHHNV) đến nay, danh sách

các virus gây bệnh ựược phát hiện ựã tăng lên rất nhiều

Cũng trong năm 2003, một loại virus mới giống virus tạo không bào lymphoid

(Lymphoid Vacuolization Virus Ờ LOVV) ựã ựược phát hiện ở Thailand LOVV

ựược thu nhận từ tôm thẻ chân trắng bố mẹ ựánh bắt ựược ở biển Andaman

Thailand (Penaeus vannamei) (Flegel Tim, 2003)

Các nhà khoa học Mỹ cũng vừa tìm thấy một loại virus giống TSV (TSVỜ like

virus) ở tôm càng xanh nuôi nước ngọt (Macrobrachium) (Tim flegel, 2003) TSV

rất phổ biến ở tôm thẻ nhưng trước ựây không phát hiện ựược ở tôm càng xanh

điều này cho thấy khả năng lây nhiễm virus giữa các loài tôm là một vấn ựề thực tế

cần ựược nhìn nhận một cách khách quan khoa học

Năm 2002, lần ựầu tiên người nuôi tôm ở Brazil thông báo về một loại bệnh biểu hiện trắng ựục cơ phần ựuôi ở tôm thẻ chân trắng Bệnh tiến triển chậm với tỷ lệ chết thấp tồn tại trong suốt vụ nuôi Vào thời ựiểm thu hoạch, tỷ lệ tôm chết tắch lũy lên tới 70% Mẫu bệnh ựược cố ựịnh và gửi tới Phòng thắ nghiệm Bệnh học Thủy sản, Trường đại học Arizona Cuối năm 2005, tác nhân gây bệnh ựã ựược xác ựịnh

là virus và ựược ựặt tên là virus gây nhiễm trùng hoại tử cơ (Infectious Myonecrosis

Virus Ờ IMMV) (Bonnie, 2006)

I.3.2 Khả năng lây lan dịch bệnh virus ở tôm

Do ựặc trưng của tôm nuôi là sống ngoài tự nhiên trong nguồn nước lưu thông và nguồn tôm bố mẹ thường ựược ựánh bắt ngoài khơi nên dịch bệnh lây lan rất dễ dàng giữa các vùng Mặc dù cơ chế lan truyền virus vẫn chưa khẳng ựịnh ựược nhưng một số ựường lây lan dịch bệnh chắnh ựã ựược cảnh báo như sau:

I.3.2.1 Nhập nuôi và vận chuyển ựộng vật thủy sinh

Việc nhập nuôi và vận chuyển ựộng vật thủy sinh là nguyên nhân chắnh dẫn tới việc

mở ựường, thiết lập sự tồn tại và lây lan các loài gây bệnh (ký sinh trùng, virus, vi khuẩn và nấm Ầ) vào vùng ựịa lý và vật chủ mới Một khi ựã ựược thiết lập trong môi trường nước tự nhiên và vật chủ mới, các tác nhân gây bệnh này hoàn toàn không thể trừ tiệt ựược (Lightner DV, 1997)

Thực tế ựã chứng minh rằng việc nhập nuôi tôm thẻ chân trắng từ Châu Mỹ vào châu Á ựã dẫn tới việc ựưa TSV vào khu vực này Dịch bệnh làm chết hàng loạt tôm chân trắng nuôi ở đài Loan ựã ựược xác ựịnh là do sự bùng nổ hội chứng Taura (Yun-Shiang Chang, 2004) Người ta cho rằng TSV ựã ựược truyền vào đài Loan qua tôm giống bị nhiễm Sau ựó TSV ựược thông báo ựã có mặt ở Trung Quốc (1999 Ờ 2000), Thái Lan, Philipppines, Malaysia, Việt Nam (2005) [3]

Ngược lại, sự có mặt của WSSV ở Mỹ La Tinh ựược chứng minh có nguồn gốc từ châu Á ựã gây thiệt hại kinh tế ựáng kể ở khu vực này từ năm 1999 Chỉ riêng

Ecuador là nước sản xuất tôm lớn nhất châu Mỹ , trong vòng 5 năm kể từ khi WSSV xuất hiện ở vùng này ñã giảm 42% sức sản xuất (Lightner DV, 1997)

I.3.2.2 Sự lan truyền mầm bệnh qua tôm giống và tôm bố mẹ ñã bị nhiễm bệnh

Do phần lớn tôm bố mẹ phải ñánh bắt xa bờ nên nguồn tôm bố mẹ và tôm giống không ổn ñịnh, do ñó việc vận chuyển và lưu thông tôm bố mẹ và tôm giống cũng như chất lượng của chúng rất khó kiểm soát ñây là một ñiều kiện thuận lợi ñể virus

có thể phát triển lây lan giữa các vùng ñịa lý khác nhau Việc sử dụng nguồn nước chung cũng dẫn ñến tình trạng dịch bệnh dễ dàng lây lan rộng khắp (Lightner DV, 1996)

I.3.2.3 Lan truyền virus qua côn trùng và chim di cư

Người ta cho rằng cơ chế này còn nguy hiểm và phổ biến hơn con ñường truyền nhiễm qua tôm giống và tôm bố mẹ Ví dụ: TSV ñã ñược phát hiện thấy trong mô

của nhện nước (Trichocorixa reticulata), một côn trùng phổ biến ở các vùng cửa

sông trên toàn thế giới Chất chiết mang virus từ côn trùng này có thể gây nhiễm cho tôm thẻ chân trắng sạch bệnh trong ñiều kiện phòng thí nghiệm (Lightner,

1995) TSV cũng ñược tìm thấy trong phân của loài chim biển ăn thịt tôm (Larus atricilla) bắt ñược ở gần ao nuôi tôm bị nhiễm TSV ở Texas (Lightner, 1996b) Kết

quả thực nghiệm cũng chỉ ra rằng TSV và IHHNV còn duy trì ñược khả năng gây nhiễm sau khi ñược thải qua hệ thống tiêu hóa của chim mòng biển (Vanpatten, 2004)

I.3.2.4 Lưu thông thương mại tôm ñông lạnh

Nghiên cứu gây nhiễm thực nghiệm cho thấy các tác nhân WSSV, YHV, TSV trong tôm ñông lạnh nhập khẩu vẫn có khả năng gây nhiễm cho tôm nuôi Có khả năng IHHNV trong tôm ñông lạnh còn giữ ñược hoạt tính gây nhiễm hơn 5 năm trong ñiều kiện lưu giữ ở -20oC Vì vậy ñây là một yếu tố tiềm năng của sự lây lan virus giữa các vùng (Lighner, 1997)

I.3.3 Khả năng biến ñổi di truyền và sự xuất hiện các chủng virus mới

Virus luôn phải ñối mặt với sự biến ñổi liên tục của môi trường khi chúng chuyển từ vật chủ này sang vật chủ khác Vì vậy, biến ñổi thích nghi và né tránh cơ chế bảo vệ của vật chủ là khuynh hướng tồn tại của mọi virus Virus RNA có khả năng biến ñổi cao hơn vì RNA polymerase tái tạo genome virus không có chức năng ñọc các bản

in và sửa lỗi xảy ra trong DNA polymerase tế bào Kết quả là tỷ lệ lỗi hợp nhất nucleotide trong RNA - virus là khoảng 10-3 – 10-4, cao hơn ít nhất 1000 lần so với

vi khuẩn hay tế bào có nhân thật [5] Vì vậy các RNA- virus gây bệnh ở tôm như

TSV, YHV, GAV (Gill Associated Virus), LOV (Lymphoid Organ Virus) và RPS

(Rhadovirus of Penaeid Shrimp) thường xuyên thay ñổi và rất khó kiểm soát (Walker, 2000)

Thực tế cho thấy, ngay cả khi tôm nhập khẩu ñược kiểm tra kỹ thì số lượng tác nhân bệnh ñược giám sát vẫn còn hạn chế Tôm ñặc biệt nhậy cảm ñối với tác nhân bệnh virus Sự nhiễm virus có thể tồn tại dai dẳng trong suốt ñời sống của tôm mà không

có dấu hiệu lâm sàng bệnh rõ rệt hay bị chết Vì vậy việc chỉ thị và giám sát bệnh trong trường hợp này sẽ rất khó khăn

Mặt khác, tôm cũng có thể là vật chủ của ñồng thời nhiều virus, trong ñó một số virus có thể dung hợp với vật chủ này nhưng cũng có thể gây ra vấn ñề nghiêm trọng ở những vật chủ khác Chắc chắn rằng vẫn còn tồn tại những virus “ẩn” chưa

ñược biết và do ñó không có khả năng chỉ thị, vì thế số lượng virus chưa biết có ảnh

hưởng ñến tôm nuôi sẽ ngày càng nhiều Những thể ñột biến âm thầm phát triển, một khi ñã thích ứng ñược với vật chủ mới thì virus lây lan rất nhanh chóng Vì vậy, việc phát hiện sớm sự tồn tại của virus sẽ giúp hạn chế ñược nguy cơ bùng phát dịch bệnh mới ðiều này ñòi hỏi nỗ lực không chỉ của các nhà nghiên cứu mà còn của toàn xã hội, ñặc biệt là người trực tiếp sản xuất và các nhà quản lý OIE khuyến cáo

toàn bộ các nước thành viên của OIE bắt buộc phải báo cáo về sự xuất hiện những dấu hiệu bệnh mới nhằm giám sát và hạn chế sự lây lan thành dịch bệnh

I.4 NGHIÊN CỨU VIRUS TÔM Ở VIỆT NAM

Ở nước ta, nghiên cứu về virus gây bệnh ở tôm cũng ñược chú ý nhiều cùng với sự

phát triển của nghề này từ những năm ñầu thập niên 90 Kết quả nghiên cứu tình hình dịch bệnh trong thời gian qua cho thấy, ở Việt Nam cũng có mặt hầu hết tất cả các loại virus gây bệnh phổ biến cho tôm nuôi trên thế giới

Từ ñầu năm 2001, ñược sự chấp thuận của bộ Thủy sản, tôm thẻ chân trắng có nguồn gốc Nam Mỹ ñược nhiều công ty nhập nuôi thử nghiệm ở Bạc Liêu, Phú yên, Quảng Ninh, Hải Phòng, Thái Bình, Hà Tĩnh Nghệ An, Quảng Trị, ðồng Nai…

ðến năm 2003, bệnh hội chứng Taura ñã bùng phát ở tôm thẻ chân trắng, gây ảnh

hưởng nghiêm trọng tại nhiều vùng nuôi trên ñịa bàn cả nước [7] Khả năng lây lan TSV từ tôm thẻ chân trắng sang các loài tôm khác ở Việt Nam, ñặc biệt ñối với tôm

sú là một vấn ñề ñược chú ý ñặc biệt vì tôm sú là ñối tượng nuôi chính của nước ta Nhóm các nhà nghiên cứu Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam ñã khẳng ñịnh sự có mặt của TSV ở tôm thẻ chân trắng nuôi tại Quảng Ninh, Phú Yên, Bạc Liêu và từ sản phẩm tôm ñông lạnh tại Hà Nội bằng kỹ thuật PCR Các tác giả cũng khẳng ñịnh khả năng gây nhiễm thực nghiệm TSV từ tôm thẻ chân trắng sang tôm sú (Nguyễn Hoàng Uyên, 2003)

Nghiên cứu virus gây bệnh ở tôm cũng ñược tiến hành từ năm 1997 ở Viện Sinh học Nhiệt ñới TP Hồ Chí Minh Các nghiên cứu ñầu tiên tập trung vào việc cải tiến môi trường nuôi cấy và ñiều kiện nuôi giữ tế bào côn trùng Sf9 ñể có dòng tế bào biến ñổi mẫn cảm với virus gây bệnh ở tôm Hiện nay nhóm nghiên cứu ñã duy trì

ñược dòng tế bào ñã ñược thích ứng này làm công cụ ñể nghiên cứu virus gây bệnh

Vào năm 2000 chúng tôi ñã thu ñược mẫu tôm sú nuôi ở Long An với dấu hiệu ñuôi

ñỏ ñậm (Hình 12B) Khác với dấu hiệu ñỏ ñuôi ở tôm thẻ chân trắng, phần ñỏ hoại

tử bao gồm từ quạt ñuôi lên tới ñốt thân thứ hai Tôm còn sống nhưng vận ñộng và tiêu thụ thức ăn kém Phần mô ñỏ hoại tử ñược tách riêng, nghiền ñồng thể với môi trường nuôi cấy tế bào và ly tâm lấy dịch trên cặn Lọc qua màng 0.22 µm ñể loại trừ vi khuẩn, nấm

Dịch lọc thu ñược từ tôm bệnh sau ñó ñược ủ với tế bào côn trùng Sf9 cho hiệu ứng hủy hoại tế bào tương ñối rõ ở nhiều thế hệ nuôi cấy liên tục Dịch tế bào này cũng

ñược sử dụng ñể gây nhiễm cho tôm giống và quan sát thấy biểu hiện ñỏ ñuôi tương

tự như mẫu ban ñầu ở tôm gây nhiễm thực nghiệm Dịch lọc từ mô và dịch tế bào nuôi cấy ủ với dịch lọc này ñược gửi ñi Singapore ñể kiểm tra virus Chỉ thị PCR cho kết quả âm tính ñối với WSSV, YHV, MBV, IHHNV và cả với một virus mới

ñược phát hiện là IMNV (Infectious Myonecrosis Virus)

Hình 12 Tôm bị bệnh ñuôi ñỏ hoại tử

A: mẫu tôm sú thu tại Cần Giờ B: mẫu tôm thu tại Long An C: mẫu tôm càng

xanh nước ngọt thu ở chợ Phần ñuôi quạt và ñốt thân liền kề chuyển màu ñỏ ñậm khi tôm còn sống

Cũng trong năm 2000, ở vùng nuôi tôm Bình Châu - Sóc Trăng và Vĩnh Châu - Bạc Liêu cũng xuất hiện hiện tượng bệnh ñuôi ñỏ này Ở những ao bị bệnh lúc ñầu chỉ thấy hiện tượng hao hụt tôm nhiều, sau ñó khoảng 1 tháng ñến 1,5 tháng sau khi thả, tôm thường nổi ñầu vào buổi chiều, thân chuyển màu xám, ñuôi ñỏ bầm, sau ñó chuyển sang màu ñen, thối rữa và rụng ñi Tuy vậy tỷ lệ tôm bị bệnh này thấp, hàng ngày người nuôi thường vớt ñể vứt ñi khoảng 20-30 con /ao

Năm 2001, trong mục “Câu hỏi thảo luận” trên trang web chuyên về thủy sản của Việt Linh có nhiều bà con nuôi tôm ở bến Tre hỏi về việc “tôm còn sống nhưng phần ñuôi ñỏ rực như nhúng vào nước sôi, không biết là bệnh gì”

Các mẫu tôm với biểu hiện bệnh tương tự sau ñó ñã thu ñược ở Cần Giờ - TP Hồ Chí Minh năm 2003 (Hình 12A) Trong năm 2003 bệnh này lại tái xuất hiện ở Bạc Liêu và ñược thông báo xuất hiện nhiều ở Bình Thuận, Ninh Thuận và ðồng Nai Năm 2007, “Tỉnh Cà Mau có trên 33.800 ha tôm sú từ 1-2 tháng tuổi bị bệnh chết với các triệu chứng: ñỏ thân, cụt ñuôi, ñốm trắng… tập trung chủ yếu ở huyện Trần Văn Thời, U Minh, ðầm Dơi Nhiều nơi tỉ lệ tôm chết lên ñến 70% Nhiều hộ nông dân thuộc hai huyện Cái nước, ðầm Dơi và các xã phía Nam Cà Mau ñã phải trời khi vụ nuôi tôm ñầu tiên chết sạch Trên ñường xuống huyện Cái Nước, huyện

có 14 xã ñược chuyển ñổi 41.530 ha từ lúa sang tôm, ñi ñâu cũng nghe dân bàn làm sao bán chạy cho hết số tôm ñang ñỏ ñuôi, phù ñầu bán ñược ñồng nào hay ñồng ấy Một hộ nuôi tôm, chị Nguyễn Thị Út nói: “ñuôi tôm ñỏ dần lên, ñầu nổi mụt, râu ñỏ rồi rụng sau ñó thì chết” [2]

Ngoài ra, mẫu ñuôi ñỏ tương tự cũng thu ñược ở tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) vào năm 2003 (Hình 12C)

A B C

Vào thời gian này chưa có bất kỳ báo cáo nào trong và ngoài nước ựề cập ựến dấu hiệu bệnh trên Vì dấu hiệu ựỏ ựuôi ựược xem là ựặc trưng cho bệnh gây ra bởi TSV nên thoạt ựầu chúng tôi cho rằng ựây có thể là bệnh gây ra bởi TSV hoặc dạng TSV biến thể Trên cơ sở các khảo sát bước ựầu trên, chúng tôi ựã ựề nghị và ựược Sở Khoa học và Công nghệ thành phố cấp kinh phắ thực hiện ựề tài nghiên cứu về tác nhân bệnh này (2003-2006) (Văn Thị Hạnh, 2006) Kết quả của ựề tài ựã ựạt ựược như sau:

1 đã phân lập ựược virus gây bệnh từ mẫu tôm sú thu ở Long An

2 đã nhân ựược virus trong tế bào côn trùng Sf9 thắch ứng

3 đã thu ựược ảnh hiển vi ựiện tử của virus trong tế bào nuôi cấy Hạt virus có

dạng khối 20 mặt, kắch thước khoảng 37,5 nm

4 đặc trưng protein virus rất giống TSV bao gồm các vạch protein 55, 52, 51 và

40 kDa Ngoài ra còn có các vạch khoảng 108 kDa và một vạch lớn hơn 108 kDa

5 Sử dụng dịch tế bào nhiễm virus cho vào nước nuôi tôm giống tôm có tỷ lệ chết cao và có dấu hiệu ựỏ ựuôi giống như mẫu tôm ban ựầu

6 Tiến hành kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi ựặc hiệu TSV (9195 và 9992) các mẫu

tế bào nhiễm virus và tôm bị bệnh ựỏ ựuôi không cho sản phẩm ựặc hiệu TSV Giải trình tự sản phẩm này cho tỷ lệ tương ựồng với TSV rất thấp Chúng tôi cũng thiết kế 7 cặp mồi khác dựa trên vùng bảo tồn của genome TSV nhưng cả 7 cặp này ựều không cho tắn hiệu Kết quả trên ựã khẳng ựịnh virus này không phải là TSV

để phân biệt với TSV và ựể phản ánh ựặc trưng gây bệnh như mô tả ở trên của ựối

tượng nghiên cứu, chúng tôi tạm gọi virus này là virus gây bệnh ựuôi ựỏ hoại tử và tạm sử dụng từ tiếng Anh là Red Tail Virus (RTV)

được sự hỗ trợ của Sở KH&CN thành phố Hồ Chắ Minh, chúng tôi ựược tiếp tục

thực hiện ựề tài giai ựoạn tiếp theo ựể xác ựịnh một số ựặc trưng cơ bản về di truyền

và sinh hóa của virus này Mục tiêu của ựề tài là xác ựịnh ựược một số ựặc trưng cơ bản về genome của virus, ựặc biệt là có ựược trình tự một phân ựoạn gen của virus làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo là xác ựịnh ựược trình tự genome virus và vị trắ phát sinh loài của virus này đề tài cũng ựược giao nhiệm vụ phối hợp với một

ựơn vị nghiên cứu chuyên ngành ựể ựánh giá khả năng gây nhiễm thực nghiệm của

virus ựối với tôm và ựiều tra mức ựộ tác hại của virus này ựối với tôm nuôi trong thực tế

PHẦN II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thu nhận virus từ tế bào nuôi cấy

Nhân dòng virus trong tế bào nuôi cấy

PP tủa PEG cô ñặc virus

Tinh sạch virus bằng

PP siêu ly tâm

Tách a.Nucleic bằng phenol-chloroform

PP enzyme xác ñịnh kiểu genome virus

ðiện di xác ñịnh thành

phần protein virus

PP proteomics xác ñịnh trình tự ñoạn peptid

ðiện di agarose, ước tính

kích thước genome virus

Xử lý genome virus với một số RE

Vì ñề tài ñược tiến hành qua nhiều giai ñoạn nên trong báo cáo này chúng tôi không trình bày một số phương pháp ñã ñược thực hiện và báo cáo ở giai ñoạn trước như phương pháp gây tạo miễn dịch ở gà ñể thu nhận và tách chiết kháng thể tinh sạch

từ lòng ñỏ trứng Các phương pháp ñược thực hiện bởi các ñơn vị phối hợp ñược giữ nguyên và trình bày ở phần phụ lục Dưới ñây là các phương pháp ñã ñược thực hiện ở giai ñoạn tiếp theo này

II.1 Nuôi cấy tế bào côn trùng Sf9

Vật liệu:

- Tế bào Sf9 (ATCC, CRI 1711 - USA)

- Môi trường: Sf-900 II SFM (Cat No 20903-027 GIBCO BRL)

- Chất bổ sung: S9- 900 II supplement (Cat No 10903)

- Huyết thanh bào thai bê: Fetal Bovin Serum - FBS (J.R.H Biosciences # 10378) DMSO (Sigma # D2650)

12 Thuốc nhuộm neutral red (Sigma # N7005) và trypan blue (Sigma # T 6146)

- Chai nuôi cấy tế bào, ñĩa nhựa 6, 24 và 96 giếng, pipet và micropipet các loại

- Tủ giữ tế bào ở nhiệt ñộ 27oC

- Kháng sinh: Gentamicine

Phương pháp thực hiện:

Các phương pháp nuôi cấy và duy trì tế bào, cơ bản dựa theo nguyên tắc của Summers và Smith (Summers, 1987) Môi trường nuôi cấy không dùng huyết thanh bào thai bê

- Cấy chuyển tế bào ở pha phát triển logarit, mật ñộ cấy chuyển: 1.5 x106 tế bào/chai nuôi cấy 25cm2 / 5ml môi trường nuôi cấy

- Vì tế bào Sf9 có tốc ñộ nhân ñôi khoảng 18- 20 giờ nên sự cấy chuyển tiếp theo thường thực hiện sau 2 – 3 ngày

II.2 Thu nhận virus từ tôm bị bệnh

Vật liệu

Cối nghiền mô, giấy lọc, màng lọc vô trùng 0.22 µm, thiết bị ly tâm lạnh, ống nghiệm vô trùng

Phương pháp thực hiện

- Thu nhận tôm bị bệnh tự nhiên với dấu hiệu lâm sàng ñặc trưng: quạt ñuôi và hai

ñốt thân tiếp theo, chân bò và chân bơi của tôm có màu ñỏ

- Tách nội quan và phần ñuôi hoại tử của tôm nghiền với môi trường nuôi cấy hoặc dung dịch ñệm PBS theo tỷ lệ 1:4 Lọc qua giấy lọc và ly tâm dịch lọc ở

14000 vòng/phút trong 10 phút Thu dịch trên cặn và lọc qua màng vô trùng 0.22

µm Giữ dịch virus ở – 20oC hoặc – 70 oC

II.3 Chuẩn ñộ virus theo phương pháp pha loãng nồng ñộ (Reed & Muench,

1938)

Vật liệu và dụng cụ:

- Tế bào Sf9 ở pha phát triển logarit

- Dịch virus cần chuẩn ñộ, ñĩa chuẩn ñộ 6, 24 và 96 giếng

- Máy lắc, micropipet các loại

Phương pháp thực hiện:

- Dịch virus cần chuẩn ñộ ñược pha loãng ở nồng ñộ từ 10-1 – 10-7 bằng PBS hoặc môi trường nuôi cấy tế bào

- Cho vào mỗi giếng chuẩn ñộ 100 µl tế bào Sf9 có mật ñộ 3x105 tế bào/ml

- Tiếp tục cho vào mỗi giếng 10µl dịch virus ở các nồng ñộ pha loãng khác nhau Mỗi hàng một nồng ñộ pha loãng

- Hàng ñối chứng cho thêm 10µl môi trường nuôi cấy không chứa virus

- Kiểm tra tế bào hàng ngày Quan sát hiệu ứng hủy hoại tế bào

Tính mật ñộ virus (sau 7 ngày gây nhiễm) theo công thức của Reed và Muench:

Lg TCID50 = Lg B+ (b -50) / (b - a) x d

Trong ñó:

B: liều virus gây nhiễm mà ở ñó nhận ñược hiệu quả nhiễm >50%

b: số % nhiễm lớn hơn và gần sát 50%

a: số % nhiễm nhỏ hơn ngay sau 50%

d: logarit của hệ số pha loãng

ðơn vị mật ñộ virus là TCID50 / ml Có thể chuyển ñổi ñơn vị TCID50 / ml thành ñơn vị pfu / ml bằng cách nhân giá trị TCID50 với 0.69

II.4 Phân lập và tinh sạch virus theo phương pháp Plaque (Summers, 1987)

- Chuẩn bị các nồng ñộ pha loãng từ 10-3 ñến 10-5 trong môi trường nuôi cấy tế bào có chứa 3% serum

- Dùng ñĩa nuôi cấy 6 giếng Cho vào mỗi giếng 3ml huyền phù tế bào có mật ñộ

105 tế bào/ml Lắc nhẹ ñể tế bào dàn ñều khắp mặt giếng ðể yên ở 27 oC khoảng 1 giờ ñể tế bào bám chặt vào bề mặt bám

- Sau khi tế bào ñã bám chặt, hút môi trường ra khỏi giếng và thêm vào 1ml dung dịch virus ñã pha loãng Mỗi nồng ñộ dùng hai giếng Lắc nhẹ ñể virus dàn ñều toàn bộ bề mặt Giữ ñĩa ở 27 oC ít nhất hai giờ Trong thời gian này chuẩn bị môi trường phủ như sau:

- Tính lượng môi trường phủ sao cho ñủ 2 ml/giếng

- Chuẩn bị dung dịch 3.0% agarose tan ở nhiệt ñộ thấp bằng nước cất khử ion Khử trùng autoclave ở 120oC khoảng 15-20 phút

- Trước khi dùng, giảm nhiệt ñộ dung dịch agarose xuống còn 40oC, trộn kỹ dung dịch trên với môi trường nuôi cấy stock x 2 theo tỷ lệ 1:1

- Hút bỏ dịch virus trong các giếng, thêm vào mỗi giếng 2 ml dung dịch phủ Lắc nhẹ ñể dung dịch tràn ñều và không làm xáo trộn lớp tế bào

- Giữ ñĩa mở trong tủ cấy vô trùng khoảng 1 giờ cho agarose ñông lại

- Giữ ñĩa ở nhiệt ñộ 27oC trong môi trường ẩm cho tới khi plaque hình thành

- Plaque là những ñốm tròn gồm những tế bào ñã bị hủy hoại bởi virus Những

ñốm này không bắt màu thuốc nhuộm Neutral red

- ðếm số plaque trong một giếng

- Dùng pipet pasteur thu lấy toàn bộ tế bào của mỗi plaque Hòa tan trong 1ml môi trường nuôi cấy chứa 10% serum ðây là stock P1 dùng ñể gây nhiễm lại cho tế bào Giữ stock ở 4oC Từ stock 1, tiến hành lặp lại hai lần tiếp ñể thu stock 2 và stock 3 ðây là stock virus ñã ñược tinh sạch

Tính toán chuẩn ñộ PFU (plaque Forming Unit) /ml như sau:

1 1

Mật ñộ virus (PFU /ml) = x số plaque x

ðộ pha loãng lượng virus / ñĩa

Ví dụ trong giếng tế bào ñược ủ với virus có nồng ñộ pha loãng 10-5 ñếm ñược 15 plaque Mật ñộ virus trong dung dịch ñược tính như sau:

1 1

Mật ñộ virus (PFU /ml) = x 15 x = 1.5 x 106pfu/ml

1/ 100 000 1ml

II.5 Sử dụng tế bào ñể nhân virus:

- Sử dụng tế bào ở pha phát triển logarit Cho vào chai nuôi cấy 25 cm2 khoảng 3x106 tế bào/5ml môi trường nuôi cấy mới ðể 2 giờ cho tế bào bám vào chai

- Hút bỏ môi trường cũ, thêm vào chai 1 ml môi trường mới và khoảng 50 – 100

µl virus có mật ñộ khoảng 107 – 108 pfu/ml (hay TCID50/ml) ðể trên máy lắc nhẹ 2 giờ, sau ñó thêm vào mỗi chai 4 ml môi trường mới

- Quan sát hiệu ứng hủy hoại tế bào hàng ngày dưới kính hiển vi

- Thu hoạch dịch tế bào nhiễm virus trong vòng 3 - 5 ngày sau khi gây nhiễm Sử dụng dịch tế bào này ñể gây nhiễm tiếp tục cho tế bào ở các thế hệ sau Giữ các stock virus ở –70oC hay trong nitơ lỏng

II.6 Thu nhận virus từ tế bào Sf9 cảm nhiễm

Sự sinh trưởng và giải phóng virus phụ thuộc vào sự thoái hóa của tế bào ðể giải phóng hoàn toàn các phần tử virus, tế bào ñược xử lý trong dung dịch nhược trương

và ñược phá vỡ qua nhiều chu kỳ làm ñông lạnh và tan lạnh Dung dịch nhược trương làm tế bào trương lên và dễ vỡ, sự hình thành tinh thể nước trong quá trình làm ñông lạnh sẽ giúp ñâm thủng màng tế bào, cộng thêm với tác ñộng cơ học (vortex) sẽ làm tăng hiệu quả của quá trình phá vỡ tế bào Dịch nuôi cấy giàu virus sau ñó ñược ly tâm ở tốc ñộ thấp ñể tách ñược phần lớn virus ra khỏi tế bào

2 Hòa tan cặn trong PBS với 1/10 thể tích (so với thể tích huyền phù ban

ñầu) bằng vortex Ly tâm ở 4000 g trong 5 phút Chuyển dịch nổi sang ống

nghiệm T1

3 Hòa cặn trong 50 mM Tris-Cl với 1/20 thể tích (so với thể tích huyền phù ban ñầu), vortex ñều

4 ðặt hỗn hợp trên ở -200

C ñến khi ñông hoàn toàn Sau ñó ñể tan lạnh

5 Lặp lại bước 4 thêm 2 lần

6 Ly tâm ở 5000 g trong 10 phút Hút dịch nổi sang ống nghiệm T1, loại cặn

7 Dịch virus ñược bảo quản ở -700C

II.7 Làm ñậm ñặc virus bằng PEG 6000

ðậm ñặc virus bằng các phương pháp tủa là một bước khởi ñầu rất hữu ích cho quá

trình tinh sạch virus Phương pháp tủa virus bằng PEG có ưu ñiểm hơn các phương pháp ñậm ñặc bằng siêu ly tâm hoặc phương pháp lọc qua màng Phương pháp siêu

ly tâm thường ñóng các virion lại rất chặt, chúng không thể ñược hòa tan nếu không mất một lượng sinh khối virus lớn, còn phương pháp siêu lọc thì một lượng lớn virus bị bắt giữ trên màng lọc Các phương pháp tủa cồn, tủa ammonium sulfate và tủa ammonium chloride mặc dù cũng ñược sử dụng trong việc tủa virus nhưng hiệu quả thấp hơn so với tủa PEG (Gillian, 1998)

Tủa PEG (6000-8000 Da) là một phương pháp cô ñặc hiệu quả cho phép virus kết tủa chậm trong môi trường lạnh và muối cao ñể bảo vệ chúng khỏi biến tính hóa học và vật lý PEG trong dung dịch nước có dạng sợi cuộn xoắn ngẫu nhiên Nước

ñược giữ trong cấu trúc cuộn xoắn và sợi gấp Tăng khối lượng phân tử hay chiều

dài phân tử cho kết quả những cuộn xoắn phức tạp hơn và vì vậy lượng nước sẽ bị giữ nhiều hơn (H 14) Khả năng kết tủa phụ thuộc vào khối lượng phân tử PEG

ñược sử dụng PEG có khối lượng phân tử 1,500 Da hầu như không có khả năng kết

tủa, PEG có khối lượng phân tử lớn hơn hay bằng 6000 Da có khả năng kết tủa gần như nhau và tốt nhất Ngoài ra, nồng ñộ PEG cũng ảnh hưởng rất lớn ñế khả năng kết tủa Khi tăng nồng ñộ polymer thì sự gấp khúc của PEG tăng thêm và khả năng kết tủa cũng tăng lên (Poison (1993)

Hình 14 Cấu trúc cuộn xoắn của PEG trong dung dịch nước

Chiều dài của chuỗi gấp tỉ lệ với khối lượng phân tử

Với việc bổ sung một lượng ñủ PEG, nồng ñộ protein vượt quá khả năng hòa tan của nó, sẽ gây nên hiện tượng kết tủa Vì PEG ñược bổ sung sẽ gây ra sự co của vùng xoắn polymer và gây ra kết tủa nhiều protein hơn từ vùng xoắn này

Khả năng kết tủa virus tỉ lệ trực tiếp với nồng ñộ PEG và nồng ñộ tối ưu thay ñổi trong khoảng 2-10 % ñối với PEG 6000, tùy thuộc vào kích thước và cấu trúc của virus cần tinh sạch Vì RTV là một virus hạt ña diện và có kích thước khoảng 40

nm, gần giống với virus hepatitis A nên chúng tôi ñã chọn nồng ñộ PEG ñược chứng minh là có hiệu quả ñối với virus này ñể áp dụng cho TSV với nồng ñộ PEG

6000 cuối cùng là 8,0% (wt/vol) và NaCl 2,7% trong dịch nuôi cấy tế bào Sf9 cảm nhiễm virus (Lewis,1988)

2 ðặt bình chứa dịch nổi trong ñá lạnh, có khuấy từ Cho từ từ NaCl rắn vào

dịch virus ñạt nồng ñộ cuối cùng 2,7 %, khuấy từ nhẹ cho tới khi NaCl tan hoàn toàn Sau ñó cho từ từ PEG-6000 rắn vào dung dịch virus ñến nồng ñộ cuối cùng 8,0 % Tiếp tục khuấy từ thêm 1,5-2 giờ ñể ñảm bảo PEG tan hoàn toàn

3 ðặt bình chứa hỗn hợp dịch virus và PEG ở 40C, qua ñêm Ly tâm ở 15000 g trong 20 phút ở 30C Thu tủa

4 Hòa tủa trong TES-buffer với 1/100 thể tích (so với thể tích dịch virus ban

ñầu) Vortex kỹ Ly tâm loại cặn PEG ở 13000 g trong 4 phút ở 230

C Thu dịch nổi

5 Dịch nổi thu ñược là dịch virus ñậm ñặc 10-100 lần so với dịch virus ban

ña sự xáo trộn các phân lớp

2 Cho 1,2 ml mẫu virus RTV nhẹ nhàng trên lớp trên của gradient sucrose

3 Tất cả các thao tác ñều thực hiện trên ñá lạnh

4. ðặt ống siêu ly tâm vào rotor Siêu ly tâm ở tốc ñộ 286 200 xg (70 000rpm),

2 giờ, 4oC Acel: 5, Decel:7

5 Thu nhận các phân ñoạn: mẫu sau khi siêu ly tâm ñược thu thành nhiều phân

ñoạn, mỗi phân ñoạn 0.8 ml, các phân ñoạn này ñem ño ở bước sóng 254 nm,

và ño khúc xạ kế ñể tiến hành xác ñịnh mật ñộ nổi

II.9 Tinh sạch virus bằng ly tâm gradient sucrose

Sau khi xác ñịnh ñược mật ñộ nổi của RTV trong sucrose là 1,151 g/cm3, tập trung

ở phân ñoạn sucrose 35% sau siêu ly tâm gradient sucrose, nên chúng tôi tiếp tục

quá trình tinh sạch RTV từ dịch tủa PEG ñậm ñặc bằng cách siêu ly tâm vùng với nồng ñộ sucrose 35%, tốc ñộ ly tâm 80 000 g trong 4 giờ ở 40C

Vật liệu

- Mẫu virus: dịch virus ñậm ñặc sau khi tủa PEG

- ðệm Tris - NaCl (0,02M Tris HCl, 0,4 NaCl, pH 7,4)

- Sucrose 35% (w/w) pha trong 50mM Tris-Cl (pH 7,5)

- Tăng tốc (accel)/giảm tốc (decal): ñặt ở mức 5/7

- Bấm nút “vaccum” ñể ñưa buồng ly tâm vào chế ñộ chân không Khi màn hình hiện chỉ số VAC mức 2 thì bấm “start” ñể tiến hành chạy rodai cho máy

- Thiết lập chương trình ly tâm sau khi rodai kết thúc

b Chuẩn bị ống ly tâm

1 Chuẩn bị mỗi ống ly tâm với 4,5 ml sucrose 35% ðể ở 40C qua ñêm

2 Load dịch virus (1,5-2 mg protein /1 ống ly tâm) lên ñỉnh của lớp sucrose 35% cho ñầy ống, cách nút nhựa khoảng 1-3 mm ðậy nút nhựa và nắp nhôm của ống, cân bằng các ống ñối trọng rồi tiến hành khóa nắp bằng bộ dụng cụ ñóng nắp ñi kèm thiết bị

3 ðặt các ống ly tâm vào rotor và ñóng nắp của buồng ly tâm

4 Vào chương trình ly tâm ñã cài ñặt (36 500 rpm tương ñương với 80 000 g trong 4 giờ ở 40C) và bấm start

c Thu mẫu

Dùng kim tiêm ñâm thủng 1 lỗ gần miệng ống ñể tạo lỗ thông khí, sau ñó sử dụng kim tiêm thứ 2 ñâm thủng ñáy ống (tránh cặn ly tâm nếu có) rồi thu các phân ñoạn sucrose từ ñáy ống lên trên, mỗi phân ñoạn khoảng 500 µ l theo thứ tự ñánh số Thu cặn ly tâm nếu có ñựng trong một ống riêng

d ðo OD: ño mẫu từ các phân ñoạn sucrose thu ñược ở bước sóng 254 nm ñể kiểm

tra các phân ñoạn chứa protein virus

immunofluorescence) chỉ thị tế bào nhiễm virus

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang là một kỹ thuật rất ưu thế trong việc ñịnh vị các protein trong tế bào Ngoài ra, phương pháp này còn cho phép nghiên cứu ñộng học

của sự di chuyển protein trong tế bào, trên màng hay ngoài màng, vào nhân hay ra khỏi nhân, và qua các con ñường vận chuyển trên màng (Donaldson, 2002)

Phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp là phương pháp rất hữu hiệu trong việc phát hiện và xác ñịnh ñịnh khu của các kháng nguyên (virus) trong tế bào và

mô Phương pháp này dựa trên cơ sở của phản ứng kháng nguyên – kháng thể ñặc hiệu, trong ñó kháng thể sơ cấp ñặc hiệu với kháng nguyên ñược gắn huỳnh quang (FITC) (hình 15) Phức hợp kháng nguyên – kháng thể ñặc hiệu sau ñó sẽ ñược phân tích và ñánh giá dưới kính hiển vi huỳnh quang với các tín hiệu huỳnh quang màu xanh lá cây

Hình 15 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp

Sự cố ñịnh hóa học và sự biến ñổi tính thấm của tế bào trước khi xử lý với các dung dịch kháng thể sẽ giúp ñịnh vị kháng nguyên (virus) trên tế bào và làm tăng hiệu quả của phản ứng kháng nguyên-kháng thể Các dung môi như alcohol và acetone là những chất cố ñịnh mạnh và làm biến ñổi tính thấm của màng Chúng có khả năng phá vỡ liên kết hydro và phá vỡ cấu trúc bậc 3 của protein làm tủa protein và làm tan lipid của màng, vì thế chúng vừa hiệu quả trong việc cố ñịnh protein và tăng tính thấm của màng với kháng thể

Vật liệu:

- Kháng thể ñặc hiệu RTV ñược thu nhận và tinh sạch từ lòng ñỏ trứng gà gây miễn dịch với RTV phát triển trong tế bào côn trùng Sf9 (Văn Thị Hạnh, 2006)

- Kháng thể gắn huỳnh quang (DFA): ñược cung cấp bởi phòng thí nghiệm Miễn dịch học, Viện Pasreur TP HCM trên cơ sở kháng thể ñặc hiệu thu

ñược

- Dung dịch PBS pH 7,2 (1X), Blue Evan (Sigma), Glycerol 90%, nước javen

Thiết bị: tủ ấm, buồng cấy, kính huỳnh quang

Quy trình thực hiện: áp dụng quy trình của phòng thí nghiệm Arbo virus, Viện

Pasteur TP HCM:

1 Thu tế bào nhiễm virus sau 3 - 5 ngày Lấy khoảng 5 - 10 x105 tế bào, ly tâm

1000 vòng/5 phút, ñổ bỏ dịch nổi Thêm vào cặn tế bào 0,5 ml dung dịch PBS, vortex nhẹ ñể trộn ñều tế bào

2 Hút khoảng 10 - 15 µl hỗn dịch tế bào nhỏ vào mỗi giếng trên lame (ghi ký hiệu trên lame cho các mẫu khác nhau), ñể khô lame trong buồng cấy

3 Ngâm lame vào acetone lạnh (-200C) trong 10 phút, lấy lame ra khỏi acetone lạnh và ñể khô ở nhiệt ñộ phòng (ñể vào trong buồng cấy)

4 Nhỏ vào mỗi giếng 15 µl kháng thể gắn huỳnh quang (DFA) pha loãng ở một

số nồng ñộ thích hợp (từ 1/4 ñến 1/16 ) trong dung dịch PBS (7.2) có Blue Evan (1/200) Ủ 30 phút ở 370C trong hộp ẩm

5 Rửa lame trong PBS 10 phút (có khuấy từ tốc ñộ nhỏ) Rửa bằng nước cất 2 lần, thấm khô lame

6 Nhỏ glycerol 90% vào giữa mỗi giếng, gắn lamelle (tránh tạo bọt khí dưới lame, thấm glycerine dư bằng giấy thấm)

7 ðọc lame dưới kính hiển vi huỳnh quang (có thể quan sát tế bào ở ñộ phóng ñại kính x200 hoặc x400) Ghi nhận kết quả:

Mẫu Dương tính: khi nguyên sinh chất của tế bào bắt màu huỳnh quang màu xanh lá mạ Âm tính: khi tế bào có màu ñỏ

II.11 Phương pháp hiển vi ñiện tử xác ñịnh kích thước và hình dạng virus

(Phương pháp ñược thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hiển vi ðiện tử, Viện Vệ sinh Dịch tễ Hà Nội)

Các thông số kỹ thuật của kính hiển vi ñiện tử:

Kính hiển vi ñiện tử: JEM 1010 (JEOL, Japan) ðộ phóng ñại mẫu: M = 50 ÷ 600.103 ðộ phân giải: 1,4 ÷2 Ao

ðiện thế sử dụng: UA = 20÷100 KV

Phim chụp: 10,8 x 11,8 cm, giấy ảnh Kodak

II.12 Phương pháp SDS-PAGE

SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) là phương pháp ñiện di protein ñứng ñể phân tách ñược các thành phần protein theo trong lượng phân tử Nguyên tắc hoạt ñộng của phương pháp này là:

Gel polyacrylamide là lưới gel hình thành do các sợi polymer của acrylamide (polyacrylamide) liên kết lại với nhau bằng các cầu nối ñồng hóa trị (khác với lưới gel agarose là sự liên kết các sợi polymer phân tử ñường bằng các cầu nối không

ñồng hoá trị) Gel polyacrylamide ñược pha từ hai thành phần chính là acrylamide

và biacrylamide Các sợi polyacrylamide ñược hình thành nhờ tác nhân hóa học hay tác nhân quang học

Có hai tác nhân hóa học cần thiết, ñó là ammonium persulfate làm vai trò chất peroxide khởi ñộng (initiator peroxide), và quaternary amine, N.N.N’.N’- tetramethylethylenediamine (TEMED) làm vai trò chất xúc tác

Tác nhân quang học là ánh sáng UV bước sóng dài phối hợp với riboflavin làm tác nhân khởi ñộng, và TEMED làm tác nhân xúc tác

Sự hình thành polyacrylamide ñể tạo lưới gel là một quá trình có sinh nhiệt Do vậy, cần phải tối ưu hàm lượng tác nhân khởi ñộng và tác nhân xúc tác ñể quá trình hoàn tất không nhanh quá, mà trong vòng 20 ñến 60 phút là vừa

Nhờ Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) hoạt ñộng như một chất tẩy mà làm biến tính

ñược protein bằng cách bọc quanh phân tử protein, vì vậy ñã tạo thành một lớp bọc ñiện tích âm chung quanh phân tử protein Phân tử protein lúc này trở thành dạng

que và mang ñiện tích âm nhiều hay ít tùy thuộc vào chiều dài (hay trọng lượng phân tử) của nó ðây là ñộng lực chính ñể các protein ñược phân giải theo trọng lượng phân tử của chúng khi ñiện di trong gel

Có hai hệ thống ñiện di, một loại là hệ thống ñệm liên tục, và một loại là hệ thống

ñệm không liên tục Hệ thống ñệm không liên tục cho ñộ phân giải tốt hơn nhiều

lần hệ thống ñệm liên tục Hiện nay, SDS-PAGE thường dùng hệ thống ñệm không liên tục và phổ biến nhất là hệ thống Laemmli (Laemmli, 1970), cải tiến từ hệ thống của Ornstein (1964) và Davis (1964) [17]

Trong hệ thống này, gel polyacrylamide ñược ñổ thành hai lớp Lớp ở trên có kích thước lưới gel lớn và không hạn chế, ñược gọi là lớp Stacking gel Lớp ở dưới là lớp gel ñể phân tách các thành phần protein chạy ñiện di, ñược gọi là Running gel Hai lớp gel này ñược pha với hai dung dịch ñệm khác nhau về nồng ñộ muối ñệm cũng như pH Dung dịch ñiện di cũng ñược pha bằng một dung dịch ñệm khác, gọi

là Tank buffer Trong hệ thống ñệm không liên tục này, khi bắt ñầu ñiện di, các ion

và thành phần protein di chuyển trước hết vào lớp Stacking gel Các thành phần protein tập trung thành một lớp mỏng giữa các ion dẫn ñầu (leading ion) và các ion

ñi sau (trailing ion), và lớp mỏng protein này ñược di chuyển dần ñến ñể tiếp cận

lớp Running gel Chính nhờ vậy mà các thành phần protein ñược phân giải rất tốt khi di chuyển trong Running gel

Vật liệu

- Mẫu virus RTV ñã siêu ly tâm

- Monomere solution (30.8% T, 2.7%Cbis)

- 4X Running Gel Buffer (1.5 M Tris HCl, pH 8.8)

- 4X Stacking Gel Buffer (0.5 M Tris HCl, pH 6.8)

- SDS 10%

- Ammonium Persulfate 10%

- 2X Treatment Buffer (0.125 M Tris HCl, 4% SDS, 20% v/v Glycerol, 0.2 M DTT, 0.02% Bromophenol Blue, pH 6.8)

- Tank Buffer ( (0.025 M Tris HCl, 0.1% SDS, 0.192 M Glycine, pH 8.3)

- Dung dịch nhuộm (0.025% Coomassie Brillant Blue R250, 40% methanol, 7% acetic acid)

- Dung dịch giải nhuộm I (Destaining solution I) (40% methanol, 7% acetic acid)

- Dung dịch giải nhuộm II (Destaining solution II) (5% methanol, 7% acetic acid)

Thiết bị

- Thiết bị chụp ảnh Versa.doc

- Bộ ñiện di SDS-PAGE Mini và nguồn PowerPac Universal TM (Bio-rad)

Quy trình thực hiện (Phạm Hùng Vân, 2004)

a/ ðổ gel, chuẩn bị buồng ñiện di

1 Lắp ráp các khuôn ñổ gel theo ñúng sự hướng dẫn của nhà cung cấp

2 Pha dung dịch running gel 10%

3 Trong khi ñợi running gel trùng hợp pha dung dịch stacking gel 4% acrylamide, Khi running gel trùng hợp hoàn toàn, Cho tiếp vào khuôn stacking gel cho ñến khi gần ñầy khuôn Cắm lược vào, ñể yên 30-60 phút

4 Sau khi stacking gel ñã trùng hợp hoàn toàn, rút lược nhẹ nhàng ra khỏi gel,

tránh di lệch gel giữa các răng lược Rửa sạch các giếng gel bằng tank buffer

Ráp khuôn gel vào buồng ñiện di ðổ ñầy tank buffer vào hai máng trên và dưới của buồng ñiện di

b/ Chuẩn bị mẫu ñể ñiện di

1 Trong một tube Eppendorf, trộn một thể tích (V) mẫu protein thử nghiệm với một thể tích (V) 2X Treatment buffer ðặt vào máy cách thủy ñang sôi ñể trong 5phút Mẫu sau khi chuẩn bị xong nên giữ trong ñá bào cho ñến khi thực hiện thí nghiệm

2 Dùng pipette với ñầu tip (cone) nhỏ, cho mẫu từ từ vào giếng gel Luôn luôn chừa một giếng chứa mẫu là thang protein chuẩn

c/ Thực hiện ñiện di

1 ðậy nắp máng ñiện di Nối hai ñiện cực vào bộ cấp ñiện

2 Bật ñiện bộ nguồn Chỉnh dòng ñiện 20mA

3 Quan sát sự di chuyển của vạch màu trong gel ñiện di, nếu vạch màu chạm

ñáy gel, tắt bộ ñiện nguồn Quá trình ñiện di ñã hoàn tất

4 ðổ bỏ dung dịch ñiện di Gở khuôn gel ra máng Cẩn thận gở tách gel ra khỏi

khuôn gel ñể tiến hành nhuộm hay blotting

d/ Nhuộm gel ñã ñiện di

1 Cho gel vào khay nhuộm, ñổ vào khay thuốc nhuộm Coomassie Blue cho ngập gel Lắc ñều và chậm trên máy lắc có xoay tròn (rotary shaker) trong 4 giờ hay qua ñêm