Hoàn chỉnh quy trình phân tích selen khảo sát hàm lượng selen trong một số thực phẩm chính và trong máu người ở tp hồ chí minh

SỞ KHOA HỌC – CÔNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM DỊCH VỤ PHÂN TÍCH THÍ NGHIỆM HOÀN CHỈNH QUI TRÌNH PHÂN TÍCH SELEN, KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG SELEN TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM CHÍNH VÀ TRONG MÁU NG

SỞ KHOA HỌC – CÔNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM DỊCH VỤ PHÂN TÍCH THÍ NGHIỆM

HOÀN CHỈNH QUI TRÌNH PHÂN TÍCH SELEN, KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG SELEN TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM CHÍNH VÀ TRONG MÁU

NGƯỜI Ở TP HỒ CHÍ MINH

Chủ Nhiệm Đề Tài: TS PHẠM THỊ HUỲNH MAI

Cán Bộ Tham Gia:

Th.S : NGUYỄN HOÀNG NGỌC HÂN Cử nhân : ĐOÀN THỊ BỘI HANH

Cử nhân : NGUYỄN THỊ DIỆU HỒNG Kỹ sư : NGUYỄN THỊ NGỌC YẾN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Tháng 07 năm 2007

LỜI CẢM ƠN

-   -

Xin trân thành Cảm ơn tất cả cộng tác viên nhiệt tình giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cảm ơn hội đồng xét duyệt đề tài đã đóng góp ý kiến quí báu để đề tài được hoàn chỉnh

Cảm ơn những cán bộ tham gia đã tích cực nhiệt tình hăng hái không ngại khó để hoàn tất đề tài

TS PHẠM THỊ HUỲNH MAI

MỤC LỤC

PHẦN 1 : MỞ ĐẦU 1

PHẦN 2 : CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SELEN 13

1 Phân tích định tính 13

2 Phân tích định lượng 13

2.1 Phương pháp phân tích khối lượng 13

2.2 Phương pháp trắc quang 14

2.3 Phương pháp huỳnh quang 15

2.4 Phương pháp Vol-ampe hòa tan catốt xung vi phân 15

2.5 Phương pháp quang phổ phát xạ plasma ICP-AES 16

2.6 Phương pháp phân tích khối phổ ICP-MS 17

2.7 Phương pháp kích hoạt nơtron INAA 17

2.8 Phương pháp quang phổ hấp thu nguyên tử (AAS) 18

2.8.1 Nguyên tắc 18

28.2 Nguyên tử hóa bằng ngọn lửa 19

2.8.3 Nguyên tử hóa bằng lò graphite 19

2.8.4 Nguyên tử hóa kết hợp với kỹ thuật hóa hơi (AAS- HG) 20 PHẦN 3 : QUI TRÌNH PHÂN TÍCH SELENIUM (Se) TRONG THỰC PHẨM ··· 23

I Nguyên tắc của phương pháp ··· 23

II Thiết bị và dụng cụ ··· 24

II.1.Dụng cụ ··· 24

II.2.Thiết bị ··· 24

III Hóa chất và thuốc thử ··· 27

IV Qui trình phân tích ··· 28

1.Chuẩn bị mẫu ··· 28

2.Phương pháp vô cơ hoá mẫu ··· 30

3.Phương pháp tách chiết Selen ··· 31

4.Xây dựng đường chuẩn ··· 31

V Kết qủa và thảo luận ··· 33

PHẦN 4 : QUI TRÌNH PHÂN TÍCH SELENIUM (Se) TRONG MÁU ·· 38

I Nguyên tắc của phương pháp ··· 38

II Thiết bị và dụng cụ ··· 38

II.1.Dụng cụ ··· 38

II.2.Thiết bị ··· 39

III Hóa chất ··· 41

IV Qui trình phân tích ··· 41

1 Nguồn gốc mẫu ··· 41

2 Chuẩn bị mẫu ··· 42

3 Vô cơ hóa mẫu ··· 42

4 Xây dựng đường chuẩn ··· 43

V Kết quả và thảo luận ··· 45

PHẦN 5 : KẾT LUẬN ··· 50

PHẦN 6 : MỘT SỐ VÍ DỤ VỀ THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG TRONG KHẨU PHẦN ĂN HÀNG NGÀY CÓ CHỨA SELEN (Se) ··· 55

PHỤ LỤC 1: PHƯƠNG PHÁP XÁC XUẤT THỐNG KÊ ĐỂ XỬ LÝ SỐ LIỆU ··· 74

PHỤ LỤC 2 : KẾT QUẢ PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG SELEN TRONG MÁU ··· 86 PHỤ LỤC 3 :KẾT QUẢ TỔNG HỢP TRÊN PHIẾU THĂM DO ··· 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO ··· 95

DANH SÁCH CÁC BẢNG, SƠ ĐỒ

VÀ ĐỒ THỊ

1 Bảng 1.1 Quan hệ giữa sự dung nạp Se qua việc sử dụng thực phẩm với

nồng độ Selen có trong máu người ở các quốc gia khác nhau 5

2 Bảng 1.2 Mức chỉ định nhu cầu cần bổ sung hàm lượng Selen của một

số nước trên Thế giới 6

3 Sơ đồ 1.3 Chu trình chuyển hóa Selen trong cơ thể 8

4 Hình 3.II.1.1: Bộ xử lý mẫu 25

5 Hình 3.II.2.1- Máy quang phổ hấp thu nguyên tử AAS-HG

(SpectrAA-200) 26

6 Hình 3.II.2.2 - Sơ đồ hoạt động của bộ hóa hơi VGA-77 26

7 Hình 3.II.2.3 : Bộ Hydrua hóa GVA-77 và ống thạch anh hình chữ T

27

8 Bảng 3.IV.2.1 : Lượng mẫu cần phân tích và lượng acid HNO3 cho từng

loại mẫu 30

9 Bảng 3.IV.4.1 : Cách chuẩn bị các dung dịch chuẩn 32

10 Bảng 3.V.1 : Kết quả khảo sát hàm lượng Selen trong một số thực phẩm

tại thành phố Hồ Chí Minh 33

11 Hình 4.II.2.1 : Máy hấp thu nguyên tử Shimadzu AA-6300 40

12 Bảng 4.IV.1 : Khảo sát hàm lượng Se trong máu của 161 người tình

nguyện 45

13 Đồ thị 4.IV.2 : Thống kê và so sánh tỷ lệ % 46

14 Bảng 4.IV.2a: Thống kê và so sánh tỷ lệ % 46

15 Đồ thị 4.IV.3 : biểu diễn phần trăm theo giới tính nam, nữ trong khoảng

hàm lượng selen đã khảo sát 47

16 Bảng 4.IV.3a : Biểu diễn phần trăm theo giới tính nam, nữ trong

khoảng hàm lượng selen đã khảo sát 58

17 Bảng 6.III.1 : Nhu cầu dinh dưỡng đã được khuyến nghị dành cho người

Việt Nam 60

18 Bảng 6.III.2 : Phân phối nhu cầu dinh dưỡng theo các bữa ăn trong ngày

63

19 Bảng 6.III.3 : Thực đơn cho bữa ăn bình thường 64

20 Bảng 6.III.4 Thực đơn cho bữa ăn đã chú ý đến hàm lượng Se có trong

thực phẩm 67

21 Bảng 6.III.5 Với đối tượng trẻ 4-6 tuổi có bổ sung trong bữa ăn những

loại thực phẩm chứa Se 69

22 Bảng 6.III.6 Với đối tượng là người trưởng thành từ 30 – 60 tuổi (lao

động nhẹ) có bổ sung trong bữa ăn những loạiù thực phẩm chứa Se 70

23 Bảng PL1.1: Hiệu suất thu hồi của phương pháp trên một số mẫu thực

phẩm 84

24 Bảng PL2.1 : Kết qủa phân tích hàm lượng Selen trong máu của CNV

trường PTTH Ngôi Sao 86

25 Bảng PL2.2 : Kết quả hàm lượng selen trong máu người làm việc tại

Thông Tấn Xã Việt Nam 89

26 Bảng PL2.3 : Kết qủa phân tích hàm lượng Se trong máu của các CNVC

làm việc tại Trung Tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm 92

27 Bảng PL2.4 : Kết qủa phân tích Se của các bệnh nhân của Bệnh viện

tim chuyển đến 93

28 Bảng PL3: Kết quả tổng hợp trên phiếu thăm dò 94

Se có bốn trạng thái oxy hóa được tìm thấy trong thiên nhiên

Se0, Se2-, Se4+, Se6+ Trong đó Se4+, Se6+ xuất hiện chiếm ưu thế trong nước tự nhiên, trong khi Se2- có trong thực vật và mô động vật

Nguyên tố Se được sử dụng khá rộng rãi trong công nghiệp cũng như nông nghiệp Ví dụ như Se xám có tính bán dẫn, dưới tác dụng của ánh sáng, độ dẫn điện của Se tăng lên mạnh, do đó Se xám được sử dụng trong tế bào quang điện và lộ sáng kế Se còn được dùng trong máy điện kỹ thuật in nhanh Se của kẽm (Zn), cadmium (Cd) và nhiều kim loại khác có tính bán dẫn Se còn được sử dụng trong các ngành sản xuất nhựa, sơn, men, gốm, xăng dầu, luyện kim …

Trong thiên nhiên Se được tìm thấy đặc biệt là từ bùn nham thạch núi lửa Từ đây Se tích tụ lên cây cỏ, rau quả, lương thực (ngũ cốc), thực phẩm (động thực vật) Nhiều qui trình nghiên cứu đã công bố hàm lượng Se trong một số cây trồng như lúa mì có khả năng tập trung Se dao động từ 0,1-1,9mg/kg Một số vùng đất ở Mỹ có chứa hàm lượng Se cao nên trong lúa mì có chứa tới 4mg/kg Một số cây ngũ cốc khác cũng có chứa Se nhưng không bằng lúa mì, lúa mạch và kiều mạch Các loại đậu có hàm lượng Se thấp hơn của ngũ cốc, nhưng lớn hơn các loại rau Những loại cây mọc ở vùng đất ẩm thấp như gạo thường có hàm lượng Se thấp

Trước thập niên 70 của thế kỷ 20, người ta chỉ quan tâm xem xét nguyên tố Se ở góc độ độc tính của nó, ví dụ như đối với động vật ăn những cây cỏ có tích tụ một lượng Se quá lớn thì sẽ bị bệnh thối móng Còn đối với con người, nếu hấp thụ một lượng Se lớn hơn 1000µg/ngày thì sẽ bị ngộ độc Hiện tượng của ngộ độc cấp tính trong quá trình hít khói hoặc bụi chứa Se được nhận thấy như: ho, buồn nôn, nôn, đau đầu, tổn thương mũi, da và mắt Còn hiện tượng ngộ độc mãn tính do Se thể hiện qua buồn nôn, nôn mửa, gây các bệnh tổn hại đến da, răng và tóc Khi tiếp xúc lâu ngày với Se sẽ gây nên các rối loạn nội tạng nghiêm trọng

Nhưng từ thập niên 70 cho đến nay, ngoài các khuyết điểm do

Se thì các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng nguyên tố Se có vai trò sinh học rất lớn đối với sức khoẻ của con người Người ta phát hiện được những vi lượng Se trong võng mạc mắt người, động vật và chim

Trong võng mạc chim đại bàng có thị giác rất tinh, ở đấy có chứa một hàm lượng Se lớn gấp trăm lần trong võng mạc của người

Vai trò cơ bản của Se trong cơ thể là chống oxy hóa, ngoài ra nó còn ảnh hưởng đến nhiều vấn đề khác :

- Các gốc tự do là những chất oxy hóa cực kỳ hoạt động gây ra nhiều tổn hại lên các loại tế bào và sự xuất hiện của Se như một nguyên tố cơ bản bảo vệ cấu trúc khác nhau của tế bào chống lại sự oxy hóa và lão hóa

- Se làm giảm độc tính của Cu và Hg Se có vai trò là chất cảm ứng trong tổng hợp Hem (chất cấu thành Hemolobin), Se tương tác với Vitamin E và ảnh hưởng lên sự giãn nở mạch

- Đối với các động vật nuôi nếu không hấp thụ đủ hàm lượng

Se cần thiết thì sẽ chậm phát triển và ít sinh sản

Con người hấp thụ hàng ngày từ 40-80µg Se trong thực phẩm Tá tràng là nơi chủ yếu hấp thụ Se và khả năng hấp thụ thay đổi theo dạng hợp chất của Se được đưa vào cơ thể; cơ thể hấp thụ hoàn toàn (90%) đối với dạng Selenomethionin (phân tử hữu cơ) và giảm xuống 60% đối với Selenit (dạng vô cơ) Các Vitamin A, B và C làm tắng khả năng hấp thụ Se của cơ thể Sau khi được chuyển qua thành ruột, một phần Se được gắn trên hồng cầu và một phần khác được gắn trên protein huyết thanh và acid amin tuần hoàn

Cơ và xương là nơi chứa nhiều Se nhất, ngoài ra có 3 cơ quan khác cũng chứa nhiều là gan, thận và tuyến giáp Se được loại ra ngoài chủ yếu qua đường nước tiểu, trong trường hợp hàm lượng Se rất cao trong thức ăn thì quá trình bài tiết có thể qua đường hô hấp

và qua mồ hôi Nhưng chưa có tài liệu nào đề cập đến việc loại Se ra ngoài qua phân

Tác dụng của Se trong cơ thể có thể bị thay đổi do sự có mặt của các nguyên tố khác như: Ag và Cu chống lại tác dụng của Se; Co làm tắng khả năng hấp thụ Se trong ruột; ngược lại, Se chống lại tác dụng của Ca, Pb, P và Hg

Qua các nghiên cứu của các nhà khoa học, người ta đã làm rõ vai trò của Se trong việc điều trị tim ở Trung Quốc (hội chứng Keshan) Một số bệnh lý về tim được quan sát ở Tây Âu và qua các trường hợp này người ta đã bổ sung Se vào thực đơn và kết quảù cuối cùng đem lại rất khả quan Ngoài ra, việc điều tra dịch tể học tiến hành ở Mỹ và một số nước Bắc Âu, đã cho thấy có mối liên hệ giữa thiếu Se và sự gia tăng khả năng mắc bệnh như bệnh tim mạch, huyết áp cao, não dẫn đến tử vong đối với con người

Rất nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra mối quan hệ trái ngược nhau giữa tỷ lệ mắc bệnh ung thư và hàm lượng Se có trong thức ăn và máu Tuy nhiên, sự bảo vệ của Se trong một số bệnh ung thư ruột, tuyến tiền liệt và ung thư máu là rõ ràng hơn so với bệnh ung thư da và tuyến tụy Ngoài ra Se có khả năng khử độc đối với các kim loại nặng như Hg, Cu, Pb bằng cách đẩy chúng ra theo đường nước tiểu Đặc biệt Se hoạt hóa Enzyme Glutathion Peroxydase (GPX) để góp phần phục hồi các màng tế bào bị hư hại, bảo vệ các protein của mô tế bào và enzyme hay ADN bị thương tổn (tức là xúc tiến khôi phục phân tử AND)… Se còn phối hợp với GPX và Vitamin E cùng các

acid béo không no để làm lỏng máu và dự phần trong các phản ứng của hệ miễn dịch

Tổ chức Y tế thế giới (WHO- World Health Organnization) đã nghiên cứu nồng độ Se trong máu liên quan đến hàm lượng Se được hấp thụ qua việc sử dụng thực phẩm trong đời sống hàng ngày của con người ở những đất nước khác nhau (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Quan hệ giữa sự dung nạp Se qua việc sử dụng thực

phẩm với nồng độ Selen có trong máu người ở các quốc gia khác nhau

thể được người dung nạp qua thực phẩm (µg/ngày)

Hàm lượng Selen có trong máu (µg/ml)

Trung Quốc (vùng nghèo Selen) 9 – 10 0.01 – 0.02*

Trung Quốc (vùng giàu Selen) 3000 – 6690 0.44 – 3.20**

* Hàm lượng Selen trong máu quá thấp

** Hàm lượng Selen quá cao (3.20 µg/ml máu)

Bảng 1.1 cho thấy hàm lượng Se trong máu của người Trung Quốc rất khác biệt tuỳ thuộc vào nơi sinh sống và khả năng dung nạp Se qua sử dụng thực phẩm Trong khi đó hàm lượng Selen trong máu người trung bình phải đạt là 0.15 µg/ml (Theo tài liệu nghiên cứu của Tổ chức ‚Sức khoẻ Thế giới‛) Một số công trình đã nghiên cứu về Se theo hệ thống ‚đất – nước – thực phẩm – máu‛ (hoặc huyết thanh) của con người đã nêu ra được sự tương tác của chúng tới sức khỏe con người ở các quốc gia khác nhau Nhờ vậy các Bộ Y tế của Anh Quốc hay Hoa Kỳ đã đưa ra kiến nghị chính thức và chỉ định việc sử dụng cho chính các dân cư cư ngụ tại nước mình mà thôi

Mức hấp thụ Selen cần bổ sung hàng ngày cũng còn phụ thuộc vào lứa tuổi, trọng lượng cơ thể, tập quán sử dụng thực phẩm nơi cư trú của mỗi nước (xem bảng 1.2)

Bảng 1.2 Mức chỉ định nhu cầu cần bổ sung hàm lượng Selen của

một số nước trên Thế giới

Tuổi

Mức chỉ định Selen của Anh quốc (µg/ngày)

Mức chỉ định Selen của Hoa Kỳ (µg/ngày)

Theo các tài liệu nghiên cứu đã được công bố, con người hàng ngày cần hấp thụ từ 40µg - 80µg Selen trong thực phẩm Sau khi cơ thể tiếp nhận thực phẩm (xem sơ đồ 1.3), tá tràng là nơi chủ yếu hấp thụ Selen và khả năng hấp thụ phụ thuộc vào cơ thể mỗi người và dạng Selen đưa vào Cơ thể hấp thụ tốt (90%) đối với dạng Selenomethionin (Selen hữu cơ có trong thực phẩm) và giảm xuống 60% đối với dạng Selenit vô cơ Sau khi chuyển qua thành ruột, một

phần Selen được gắn trên hồng cầu, ở đó nó được trộn lẫn với phân tử Glutathion Peroxydase Một phần khác, ít hơn nhiều, được gắn trên Protein huyết thanh và Acid amin, do vậy hàm lượng Selen trong máu có liên quan mật thiết đến hàm lượng Selen có trong thực phẩm Vấn đề Se thừa hay thiếu đều rất có hại cho cơ thể, đặc biệt đối với hệ tim mạch và hệ thần kinh con người

Sơ đồ 1.3 Chu trình chuyển hóa Selen trong cơ thể

Gan, thận,

tim, hồng cầu

Selennoenzym (selenocystein containing protein)

(50 – 80%) Selen amino acid

Selen liên kết protein

Plasma

Thành ruột

MỘT SỐ KẾT QỦA NGHIÊN CỨU VỀ VAI TRÒ CỦA SELENIUM TRONG

CUỘC SỐNG CON NGƯỜI

Qua nghiên cứu, người ta biết được những qủa táo cũng như Se có khả năng hạ thấp nguy cơ bệnh hen Trong táo có chất flavonoids giúp chống lại bệnh hen và nhóm nghiên cứu cũng cho biết ở những người tiêu thụ 54 - 90 µg Se/ngày thì nguy cơ mắc bệnh hen giảm một nửa so với những người chỉ tiêu thụ 23 – 30 µg Se/ngày

Hai nhà dinh dưỡng học người Mỹ của Trung tâm nghiên cứu

nông nghiệp đã nghiên cứu và báo cáo về bông cải xanh (Brocoli) có

chứa methylseleno-cystein (SEM-SC) - một phần tử có thể chuyển thành Methyl Selenol là chất chống ung thư Sau khi tiêm một chất

có khả năng gây ung thư cho chuột, các nhà nghiên cứu nuôi các chuột này với bông cải xanh Họ nhận thấy chuột ít bị tổn thương tiền ung thư ở kết tràng

Những năm gần đây, nhà nghiên cứu Larry Clark thuộc trường Đại học Arizona, Mỹ đã nghiên cứu trên 1.312 bệnh nhân mắc bệnh

ung thư da, đã chứng minh rằng nếu sử dụng 200g Se trong vòng 10

năm thì gần như bệnh ung thư không phát triển thêm và giảm đáng kể hậu qủa các bệnh ung thư tuyến tiền liệt, phổi và đại tràng

Thêm vào đó, gần đây các nhà khoa học đã tìm ra một protein có chứa Se tránh cho tinh trùng khỏi bị đứt ra từng đoạn, chính điều này đã giải thích tại sao thiếu Se gây ra vô sinh trên động vật giống đực và có thể trên người

MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI

Thực phẩm là nguồn chủ yếu cung cấp Selen cho con người nhưng hàm lượng cung cấp thường chỉ vài ppb đến vài ppm Khi được hấp thụ thì hàm lượng Selen có trong máu cũng chỉ có ở dạng vết mà thôi (ppb (µg/l) đến ppm (µg/ml)) Để có số liệu về hàm lượng Selen chính xác, người ta phải làm phân tích và đòi hỏi phải có phương pháp đúng cho từng đối tượng và những phương pháp đó phải có độ phát hiện nhỏ đến ppb hay µg/kg, µg/l, độ chính xác cao

Ở Việt Nam chưa có một tài liệu nào thống kê một vùng hay một khu vực trong nước cho thấy hàm lượng Selen chứa trong một số loại thực phẩm cụ thể trồng ở đây là bao nhiêu? Cũng như chưa có một kết qủa nào về hàm lượng Selen có trong máu của người Việt nam (chỉ cần một địa điểm cụ thể) để biết rằng hàm lượng Selen trong máu của chúng ta đạt mức độ thấp, trung bình hay quá cao?

Công trình này nghiên cứu về Se có hệ thống nhằm gắn kết giữa thực phẩm với cơ thể sống là con người thông qua việc phân tích máu, tuy rằng mới chỉ nghiên cứu ở phạm vi của một thành phố

Mục tiêu của đề tài làõ nghiên cứu :

- Qui trình phân tích Se trong thực phẩm bằng phương pháp Hấp thu Nguyên tử ghép nối với bộ hydrua hóa (AAS-HG) và khảo sát hàm lượng Se trong một số thực phẩm chính tại thành phố Hồ Chí Minh

- Qui trình phân tích Se trong máu bằng phương pháp Hấp thu Nguyên tử ghép nối với bộ hydrua hóa (AAS-HG) và khảo sát hàm lượng Se trong máu người tại thành phố Hồ Chí Minh

Mục đích của đề tài :

* Các qui trình phân tích có độ nhậy và độ đúng cao, có khả năng áp dụng rộng rãi cho các phòng thí nghiệm

* Các kết qủa phân tích làm tài liệu tham khảo cho các nhà dinh dưỡng học và các Bác sĩ chuyên khoa nghiên cứu trong công tác điều trị

PHAÀN TOÅNG QUAN

PHẦN 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SELEN

- Phản ứng với Fe(II) EDTA : tạo tủa đỏ (hoặc dung dịch đỏ cam)

- Phản ứng với axit thioxyanic : tạo tủa đỏ

2 PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG :

2.1 Phương pháp phân tích khối lượng : (khi nồng độ Se cao >1%)

Dùng các chất khử khác nhau như SO2, thioure, natri hypophotphit, thiosemicacbazit, glucoza… chuyển những hợp chất

selenat, selenit về Se nguyên tố kết tủa đỏ Lọc, rửa, sấy khô rồi cân, tính kết quả

2.2 Phương pháp trắc quang :

Tạo phức màu Dipiazoselenol với 3,3’-diaminobenzidin

Se(IV) trong môi trường vô cơ hóa được chuyển sang môi trường HCl 6N Nâng pH của dung dịch đến 2-3 bằng NH4OH (1:1).Thêm complexon III và HCOOH 2.5M Sau đó thêm vào dung dịch thử 3-3’diaminobenzidin 0.5% Để trong tối 1giờ, nâng pH lên 8 và chiết bằng toluen rồi đo quang để định lượng Se ở bước sóng = 420nm

Phức màu Dipiazoselenol

Nhược điểm :

- Ngoài ánh sáng phức bị phá hủy tạo những phẩm vật có màu

- Các chất oxy hóa mạnh có tác dụng oxy hóa thuốc thử ngăn cản việc tạo phức (NO3- , SO42- ngăn cản việc định lượng)

Sử dụng KI và thuốc thử Variamine Blue (VB) :

Dựa trên phản ứng của Se với KI trong môi trường acid nhẹ cho ra

I2 tự do I2 tự do này sẽ oxy hóa thuốc thử VB thành một sản phẩm có màu tím hấp thu cực đại ở 546nm Giới hạn phát hiện của phương pháp này là 0,2ppm

N

N N

N

Se Se

Se O32- + 4 I- + 6H+ Se0 + 2I2 + 3H2O Phản ứng tạo màu:

Những ion gây cản trở trong phép xác định :

- Fe2+, Sn2+, CrO42-, SO3-, IO3- khi hàm lượng > 1ppm sẽ cho sai số dương

- VO43-, Fe3+, Cu2+, Mn2+, Ce4+ ( với sự có mặt của chất che EDTA 5000ppm) sẽ gây cản trở khi hàm lượng > 30ppm

2.3 Phương pháp huỳnh quang :

Tạo phức phát huỳnh quang với 2,3-diaminonaphtalen (DAN)

Mẫu được vô cơ hóa bằng hỗn hợp HNO3-HClO4 Sau khi vô cơ hóa mẫu xong, khử tất cả các dạng Se về Se (IV) bằng cách đun cách thủy với HCl loãng Thêm vào đó dung dịch trilon B 0.2M và dung dịch NH4OH 10% đưa pH đến 2 Thêm dung dịch hydroxylamin 1% và 5ml thuốc thử DAN, đun sôi trong 2 phút, để yên tại nhiệt độ phòng trong vòng 1-2h Chiết với 6ml cyclohexan, lắc 5 phút Chiết lấy pha hữu cơ, ly tâm 5 phút để tách nước, đo huỳnh quang ở bước sóng 520nm với bước sóng kích thích là 380nm

2.4 Phương pháp Vol-ampe hòa tan catốt xung vi phân :

Cu2+ cộng kết với Se(IV) trên điện cực giọt Hg, khi phân cực catốt thu được pic Se (IV) rõ nét có thế bán sóng E1/2 = -0.71V, bán chiều rộng cở 50mV Có thể xác định Se(IV) đến nồng độ 10-8M

I2 + CH3O NH NH2 CH3O N NH2

Sử dụng điện cực làm việc : điện cực giọt Hg treo

Điện cực so sánh : điện cực Ag/AgCl

Điện cực phụ trợ : điện cực platin

- Quét thế từ -0.5 V đến -0.9V trong thời gian 30 giây, biên độ xung là 50mV, tốc độ quét là 20mV/giây, thế hấp phụ làm giàu –0.6V

- Quá trình điện hóa hòa tan catot diễn ra theo 2 bước :

1/ Sự hình thành hydroselenua qua phản ứng trao đổi 6 e- :

2Cu2+ + H2SeO3 + 4H+ + 6e - Cu2Se + 3H2O Ngay sau đó là quá trình oxy hóa Hg :

Cu2Se + Hg HgSe + 2Cu2+ + 4e- 2/ Quá trình hòa tan Hg Se thành hydroselenua :

HgSe + 2H+ < > Hg + H2Se Lấy 5ml dung dịch mẫu đã vô cơ hóa vào cốc thủy tinh, thêm 10ml HCl đặc, đun hoàn lưu để chuyển toàn bộ Se (VI) thành Se(IV), cô cạn và định mức bằng nước cất Thêm 2.64g (NH4)2SO4, 1ml EDTA 0.01M, 100 l dd Cu2+ 1g/l, định mức thành 10ml Đem xác định Se

2.5 Phương pháp quang phổ phát xạ plasma ICP-AES:

Nguyên tố phân tích được đưa lên trạng thái kích thích nhờ nguồn nhiệt Trạng thái kích thích này rất không bền nên điện tử ở các mức kích thích chuyển về trạng thái cơ bản đồng thời phát ra các bức xạ Đo cường độ bức xạ đặc trưng của nguyên tố đó để xác định chúng Se tổng được đo trên máy quang phổ phát xạ plasma (ICP-AES), ở bước sóng đặc trưng nhất 196.03 nm Máy ICP-AES có nguồn

plasma cung cấp nhiệt độ 8000-100000K., có thể xác định Se với hàm lượng từ 0.1ppm – vài trăm ppm tùy vào nguyên tố Se có chứa trong mẫu cần phân tích

2.6 Phương pháp phân tích khối phổ ICP- MS :

ICP -MS đã được dùng cho việc phân tích Se và các hợp chất hữu

cơ của nó Phương pháp này cần những hợp chất tinh khiết và có khả năng cho đầy đủ những thông tin về định tính và định lượng về hợp chất cần xác định Sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với đầu dò khối phổ ( HPLC-ICP-MS) có thể phân tách và xác định chọn lọc các hợp chất của Se Phương pháp này có độ nhạy cao nên có thể xác định Se ở nồng độ từ ppb đến ppt

2.7 Phương pháp kích hoạt neutron INAA :

Chiếu mẫu vật phân tích bằng dòng neutron có thông lượng Phản ứng hạt nhân sẽ tạo ra một đồng vị phóng xạ B* và một hạt b nào đó theo phản ứng : A (n,b) B*, trong đó :

A : là hạt nhân của nguyên tố cần khảo sát

B* : là nhân của đồng vị phóng xạ hình thành sau phản ứng

n : là neutron của nguồn

b : có thể là proton, hạt anpha, hạt gama hoặc 2 neutron

Với Se ta có thể thực hiện các phản ứ ng sau đây :

76Se (n, 2n) 74Se

80Se (n, ) 77g + m Ge

Áp dụng phương pháp kích hoạt tương đối để xác định hàm lượng nguyên tố cần phân tích có trong mẫu

m = mch * D/ Dch

mch : khối lượng nguyên tố cần phân tích của mẫu chuẩn

m : khối lương nguyên tố cần phân tích của mẫu

Dch : số xung đo được đã chuẩn hóa tới cùng một điều kiện đo của mẫu chuẩn

D : số xung đo được đã chuẩn hóa tới cùng một điều kiện đo của mẫu

Phương pháp này xác định được Se ở hàm lượng ppb

2.8 PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THU NGUYÊN TỬ (AAS) :

Phương pháp AAS có khả năng phân tích được nhiều nguyên tố trong bảng tuần hoàn Mendeléep với độ chọn lọc, độ nhạy và độ chính xác cao, khả năng tự động hóa phép đo, tính đơn giản và giá tiền thiết bị tương đối không cao - tất cả những đăïc tính đó đã làm cho phương pháp AAS trở thành một công cụ phân tích được ứng dụng hết sức rộng rãi không những trong các lĩnh vực truyền thống như luyện kim, địa chất, khai thác mỏ, công nghiệp hóa học, mà còn trong những lĩnh vực tương đối mới mẻ đối với các nhà phân tích như

y học, sinh học, công nghệ thực phẩm, thủy sản, nông nghiệp và môi trường

2.8.1 Nguyên tắc :

Cơ sở của phương pháp dựa trên quá trình hấp thụ năng lượng của đám hơi nguyên tử mà ở đó điện tử ở mức năng lượng cơ bản được

đưa lên mức kích thích cao (thường là mức gần nhất) khi đám hơi nguyên tử được chiếu bằng một chùm tia sáng có năng lượng đúng bằng năng lượng chuyển mức này

Kết cấu cơ bản của một máy đo AAS gồm : nguồn tia sáng đơn sắc (đèn catod lõm-HCL hoặc đèn phóng điện phi điện cực-EDL), bộ phận nguyên tử hóa (ngọn lửa đèn khí hoặc nguồn nhiệt điện), bộ phận đơn sắc (cách tử) và thiết bị ghi tín hiệu (máy vi tính cùng các phần mềm điều hành và xử lý số liệu)

Cường độ hấp thu tuân theo định luật Bouger – Lamber – Beer :

A = log (I0 / I ) = .I C

A : độ hấp thu

: hệ số hấp thu nguyên tử tùy thuộc vào từng nguyên tố ở các mức chuyển dời khác nhau

I0 : cường độ bức xạ tới từ đèn catod hoặc đèn phóng điện tại bước sóng

I : cường độ sau khi đi qua đám hơi nguyên tử có chứa nguyên tố cần phân tích

C : nồng độ hơi nguyên tử trong dung dịch đem phân tích

2.8.2 Nguyên tử hoá bằng ngọn lửa :

Trong phương pháp này ta dùng ngọn lửa của C2H2 / không khí hoặc C2H2/N2O

2.8.3 Nguyên tử hóa bằng lò graphite :

Mẫu phân tích được đưa vào lò bằng bộ hút mẫu tự động với thể tích rất nhỏ khoảng 20 l Quá trình phân tích Se có thể chia làm 4 giai đoạn chính :

1 Làm khô mẫu : 5-10 giây ở 85-95-1200C, làm bốc hết hơi nước trong mẫu

2 Tro hóa mẫu :7 giây ở 10000C, đốt cháy hoàn toàn các hợp chất hữu cơ

3 Nguyên tử hóa mẫu : 5giây ở 26000C, chuyển tất cả các dạng muối

Se lên trạng thái hơi nguyên tử tự do

4 Giai đoạn làm sạch lò : ở 30000C, bốc hơi các chất còn lại trong lò, chuẩn bị cho lần phân tích mẫu kế tiếp

Trong quá trình phân tích Se dễ bay hơi nếu sử dụng nhiệt độ tro hóa cao Để khắc phục ta sử dụng thêm các chất đệm-dung dịch Pd

500 g/ml để tạo với Se hợp chất bền nhiệt Phương pháp có thể phân tích lượng vết Se (ppb)

2.8.4 HẤP THU NGUYÊN TỬ KẾT HỢP VỚI KỸ THUẬT HÓA HƠI (AAS-HG) :

Dựa vào nguyên lý của phổ Hấp thu Nguyên tử và tính chất hóa học của một số nguyên tố dễ bay hơi, người ta đưa ra những phương pháp đặc biệt cho phép tách chúng ra khỏi các thành phần nền trước khi đưa chúng vào buồng nguyên tử hóa và đo phổ hấp thụ Các nguyên tố đó bao gồm Sb, As, Bi, Pb, Ge, Se, Te và là những nguyên tố dễ dàng tạo hợp chất hydrua bay hơi khi được khử với NaBH4

Se +4 + 6 e- Se-2

6H-1 - 6e- 6 H0

Se-2 + 4H0 SeH2 + 2H+Khả năng phát hiện rất thấp do quá trình sinh hydrua được kết hợp nguyên tử hóa trong ống thạch anh đặt đồng trục với trục quang học của máy AAS

Ưu điểm lớn của phương pháp AAS-HG thể hiện qua việc làm giàu và tách nguyên tố ra khỏi ảnh hưởng gây nhiễu của nền và hơi hydrua được đưa vào buồng nguyên tử hóa với hiệu suất cao Nhờ vậy phương pháp AAS-HG có độ nhạy và độ chính xác cao

Tuy nhiên sự có mặt các kim loại quí hiếm như Ag, Au, Pt, Pd … với hàm lượng 100 g/L (ppb), các nguyên tố chuyển tiếp như Cu,

Pb, Ni với nồng độ 1mg/L và các nguyên tố tạo hydrua như Bi, Sb,

Sn, Te với nồng độ từ 0,1-1mg/L có thể làm giảm độ nhạy xác định của các hydrua As và Se

Kỹ thuật AAS-HG bao gồm một số công đoạn tách biệt nhau, cụ thể là chuyển hóa nguyên tố phân tích về dạng hydrua, thu nhận và nguyên tử hóa và được đo phổ hấp phụ của nguyên tố cần được phân tích

PHẦN THỰC NGHIỆM

PHẦN 3

QUI TRÌNH PHÂN TÍCH SELENIUM (Se)

TRONG THỰC PHẨM

I NGUYÊN TẮC CỦA PHƯƠNG PHÁP :

Mẫu được vô cơ hóa ướt bằng hỗn hợp acid HNO3 và HClO4 Sau khi phá mẫu, tất cả Se ở dạng Se(VI) được chuyển về Se(IV) bằng acid HCl

Se (IV) được cho kết hợp với thuốc thử O-phenylenediamine tạo phức piaselenol theo phản ứng sau :

N

N Se

NH 2

NH 2

+ [SeIV]

piazselenol

II TRANG THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ

II.1 Dụng cụ

1 Bộ vô cơ hóa mẫu Foss : gồm 12 ống thủy tinh chịu nhiệt, 1 bếp điện có 12 chỗ sâu lòng để đặt ống phá mẫu và một hệ thống hoàn lưu.(Hình 3.II.1.1: Bộ xử lý mẫu )

2 Bếp đun cách thủy

3 Phễu lọc thủy tinh và giấy lọc

4 Cân phân tích chính xác đến 0,0001g

5 Các dụng cụ chuyên dụng khác trong phòng thí nghiệm (tất cả đều là thủy tinh DIN A đã được công nhận chất lượng) :

- Becher : 50ml, 100ml, 150ml, 250ml

- Phễu chiết hình qủa lê có khóa bằng Teflon : 125ml

- Bình định mức : 25ml, 50ml, 100ml

- Pipét các loại : từ 1–10ml

II.2 Trang thiết bị

1 Máy Quang Phổ Hấp Thu Nguyên Tử (AAS), model

SpectrAA-200 ghép với bộ hydrua hóa VGA –77 (Varian)

2 Đèn cathod lõm nguyên tố Se của hãng Varian, cường độ đèn là 20mA (sử dụng ở 10mA)

3 Ống hấp thu hình chữ T bằng thạch anh chịu nhiệt có chiều dài 170mm, đường kính trong là 13mm

4 Khí mang argon 99,99%

25

Các thông số vận hành của máy hấp thu nguyên tử

SpectrAA-200 (Varian) ghép với bộ hydrua hóa VGA-77

* Máy quang phổ SpectrAA-200 (hình 3.II.2.1) :

+ Nguồn sáng đơn sắc : đèn cathod lõm làm việc ở bước sóng 196,0nm, A=10mA

+ Hỗn hợp khí đốt : khí C2H2–không khí nén (13,5 /1,5) + Chiều rộng khe đo : 0,5 mm

+ Thời gian hút mẫu : 65s

+ Thời gian ghi tính hiệu : 15s

* Bộ hydrua hóa VGA-77 (hình 3.II.2.2, 3.II.2.3):

+ Tốc độ bơm mẫu : 6mL/phút

+ Tốc độ bơm chất khử : 1mL/phút

+ Tốc độ bơm acid : 1mL/phút

Hình 3.II.1.1: Bộ xử lý

mẫu Foss

Hình 3.II.2.1- Máy quang phổ hấp thu nguyên tử AAS-HG (SpectrAA-200)

Hình 3.II.2.2 - Sơ đồ hoạt động của bộ hóa hơi VGA-77

Hình 3.II.2.3 : Bộ Hydrua hóa GVA-77 và ống thạch anh hình chữ T

III HÓA CHẤT VÀ THUỐC THỬ :

Tất cả các hóa chất sử dụng đều là hóa chất tinh khiết phân tích

1 Nước cất trao đổi ion

2 Acid nitric HNO3 đậm đặc (65%), Merck

3 Acid percloric HClO4 đậm đặc (70%), Merck

4 Acid hydrocloric HCl đậm đặc (37%), Merck

5 O-phenylenediamin (OPDA) 0,2% - Merck (chỉ pha khi sử dụng) : hòa tan 0,0500g OPDA trong 25ml nước cất có vài giọt HCl 0,1M

6 Acid formic HCOOH 99,9% - Merck

7 Amoniac đậm đặc NH4OH đđ – Merck

8 Cloroform - Merck

9 Muối natri tetrahydrobodrat NaBH4, Merck

10 Natri hydroxyd NaOH, Merck

11 Dung dịch khử NaBH4 0,3%: hòa tan 0,3g NaBH4 và 0,5g NaOH trong nước cất, định mức dung dịch đến 100ml (dung dịch chỉ bền trong ngày)

12 Dung dịch chuẩn gốc Se 1000ppm, Merck

IV QUI TRÌNH PHÂN TÍCH SELEN

1 CHUẨN BỊ MẪU

Mẫu đại diện được chia làm 4 nhóm :

- Nhóm rau, củ, nấm

- Nhóm gạo

- Nhóm thịt, cá, thận, tôm

- Nhóm trứng

Nguồn gốc của các loại mẫu :

- Rau, củ, nấm tươi được mua tại chợ đầu mối Hóc môn

- Gạo mua tại huyện Bến lức tỉnh Long An

- Thịt, thận mua của Vissan và cá, tôm mua tại các CoopMark tại thành phố Hồ Chí Minh

- Trứng gà mua của CP tại CoopMark thành phố Hồ Chí Minh

Phương pháp lấy mẫu rau, củ, qủa, nấm được tham khảo theo TCVN 5102-1990 (ISO 874-1980)

Phương pháp lấy mẫu thịt, cá, tôm, thận và một số mẫu khác được tham khảo theo TCVN 4833-1 : 2002

1.1 Nhóm mẫu rau, củ , nấm :

Mẫu đem cắt bỏ gốc rễ, phần hư dập, rửa lại với nước cho

sạch đất đai, bụi bặm, để ráo Xắt mẫu ra nhỏ khoảng 3-5 mm

trộn đều Lấy ngay ra một phần mẫu đem xác định độ ẩm Phần còn lại sấy chân không ở 60 ± 50C đến trọng lượng không đổi Để nguội và trộn đều cất vào bao nilon được hàn kín miệng, để chỗ khô ráo và thoáng mát Khi dùng để xác định hàm lượng Se, ngưới

ta đem xay mẫu thành dạng bột có kích thước khoảng 0,07mm

(qua rây số 75-90)

1.2 Nhóm mẫu gạo :

Gạo phải mới đã xay trắng hoặc gạo còn lớp lụa bọc ngoài, không bị mốc Loại bỏ những hạt hư, hạt sạn, bụi bặm,… Lấy ra một phần đem xác định ngay độ ẩm Phần còn lại sấy chân không

ở 60 ± 50C đến trọng lượng không đổi Để nguội và cất vào bao được hàn kín miệng và đặt nơi thoáng, bảo quản ở 250C Khi tiến hành xác định hàm lượng Se, người ta đem mẫu xay đều thành bột với kích thước hạt khoảng 0,07mm

1.3 Nhóm mẫu thịt, cá, thận, tôm :

Mẫu rửa sạch, để ráo Xắt nhỏ và mỏng, nếu là tôm thì bóc vỏ Lấy ra một phần đem xác định ngay độ ẩm Phần còn lại sấy chân không ở 60 ± 50C đến trọng lượng không đổi Để nguội và cất vào bao nilon được hàn kín miệng, bảo quản ở 250C Khi tiến hành xác định hàm lượng Se, người ta đem mẫu xay đều thành bột với kích thước hạt khoảng 0,07mm

1.4 Nhóm mẫu trứng :

Mẫu được phân ra lòng trắng và lòng đỏ Mỗi phần được sấy chân không ở 60 ± 50C đến trọng lượng không đổi Để nguội và cất vào bao nilon được hàn kín miệng, bảo quản ở 250C Khi tiến hành phân tích, người ta đem mẫu xay đều thành bột mịn

2 PHƯƠNG PHÁP VÔ CƠ HÓA MẪU (Tham khảo theo tài liệu AOAC 969.06)

Quy trình tổng quát

Cân Xg mẫu vào ống phá mẫu Foss (xem hình 3.II.2.1) Thêm vào Yml HNO3 đđ, ngâm qua đêm (theo bảng II-1) Cho ống vào lò phá mẫu, đun ở 1000C trong 2h (dung dịch sẽ chuyển sang màu vàng nhạt) Để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm vào 0,5 - 1,0ml HClO470%, lắc đều Đun nóng mẫu dần đến 1500C, đun ở nhiệt độ này đến khói trắng xuất hiện, đun tiếp 5 - 10 phút thì ngừng Thêm 5ml HCl, định mức 50ml, đun cách thủy (700C) 10 phút, để nguội, Se đã chuyển về Se (IV)

Bảng 3.IV.2.1 : Lượng mẫu cần phân tích và lượng acid HNO3 cho từng loại mẫu

3 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ĐỂ LÀM GIÀU SELEN

Dung dịch mẫu Se (IV) vô cơ hoá ở trên được trung hòa với NaOH (1:1) Thêm 4ml HCOOH 80%, rồi chỉnh pH đến 3 bằng dung dịch

NH4OH đđ Thêm tiếp 5ml dung dịch O-phenylenediamin 0,2%, khuấy đều và để yên 120 phút Sau đó chuyển dung dịch vào phễu chiết 100ml đã có sẵn 10ml Cloroform Lắc mạnh trong vòng 25 giây, để yên cho tách lớp Tách cẩn thận để lấy lớp dung môi cloroform có chứa Se và được nhắc lại quá trình tách với 10ml Cloroform thêm một lần nữa

Vô cơ hóa lớp dung môi bằng 12ml hỗn hợp HNO3 : HClO4 (4 :1), đun đến khi xuất hiện khói trắng khoảng 15 phút Thêm 5ml HCl, để nguội rồi định mức 50ml bằng dung dịch HCl, đun cách thủy (700C)

30 phút, để nguội, Se đã chuyển về Se (IV)

4 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG Se TRONG MẪU

- Pha dung dịch chuẩn Se 100ppm : hút 10ml dung dịch chuẩn

gốc Se 1000ppm cho vào bình định mức 100ml, thêm 1ml HNO3 đđ, định mức bằng nước cất

- Pha dung dịch chuẩn Se 10ppm : hút 10ml dung dịch Se

100ppm cho vào bình định mức 100ml, thêm 1ml HNO3 đđ, định mức bằng nước cất

- Pha dung dịch chuẩn Se 1ppm (1000ppb) : hút 10ml dung dịch

Se 10ppm cho vào bình định mức 100ml, thêm 1ml HNO3 đđ, định mức bằng nước cất

- Pha dung dịch chuẩn Se 50ppb : hút 5ml dung dịch Se 1000ppb

cho vào bình định mức 100ml, thêm 1ml HNO3 đđ, định mức bằng nước cất

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn Se để đo : 5ppb ; 10ppb ; 20ppb ; 30

Thêm HCl đ.đặc (ml)

Định mức (ml)

T đun ở

70 0 C (phút)

Nồng độ Se (ppb)

Đo chuẩn và mẫu trên cùng nguyên tắc như sau :

Se (IV) trong mẫu được khử về Se2- bởi dung dịch khử NaBH40,3% trong môi trường HCl 6M và tạo thành hơi H2Se Đem đo trên máy HG-AAS ở bước sóng =196.0nm Số lần lập lại tính hiệu đo là

10 lần

Hóa chất:

- Chất khử NaBH4 0,3% (pha trong NaOH 0.5%),

- Dung dịch tạo môi trường là HCl 6M

) H

%

% 100 ( 1000

100 X

50 C ) g 100 / g (

Dựng đường tuyến tính của 5 dung dịch chuẩn ở trên Từ độ hấp thu đo được của mẫu, dựa vào đường chuẩn để tính nồng độ Se có trong dung dịch và có trong mẫu ban đầu Song song thực hiện một mẫu trắng

Công thức tính (G) hàm lượng Se trong 100g mẫu tươi :

Cx : nồng độ Se của dung dịch thử (ppb) suy từ phương trình tuyến tính (ppb)

X: lượng mẫu cân (g)

%H: phần trăm ẩm có trong mẫu ban đầu

V KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả phân tích Selen trong thực phẩm đã được khảo sát trên

4 loại mẫu đại diện cho thực phẩm thường được dùng cho các bữa ăn hàng ngày của người Việt Nam nói chung và cho người dân tại thành phố Hồ Chí Minh nói riêng Nguồn gốc mẫu đã trình bày ở trên

Bảng 3.V.1 : Kết quả khảo sát hàm lượng Selen trong một số thực

phẩm tại thành phố Hồ Chí Minh

mẫu tươi)

Độ bất ổn (U)

Hiệu suất thu hồi (%)