Hỗ trợ định danh các loài nấm thuộc chi cordyceps và tương tự bằng kỹ thuật sinh học phân tử kết hợp tin sinh họ

Tổng quan về Cordyceps Fr (họ Clavicipitaceae)

Sơ lược về chi nấm Cordyceps

Cordyceps Fr là chi nấm ký sinh trên côn trùng lớn nhất thuộc họ Clavicipitaceae (bộ

Hypocreales là một bộ nấm thuộc ngành Ascomycota, bao gồm hơn 400 loài đã được phát hiện Chi nấm này lần đầu tiên được Fries đặt tên và mô tả một cách có hệ thống vào năm.

Năm 1818, loài nấm này được đặt tên từ chữ Hy Lạp "cordyle" (dùi cui) và chữ Latin "caput" (đầu), mang ý nghĩa là nấm có hình dạng đầu giống như dùi cui (Hình 1.1).

Hình 1.1 Nấm Ophiocordyceps sinensis (màu xám đen) ký sinh trên ấu trùng Hepialus sp (Lepidoptera) ngoài tự nhiên [74]

Các loài nấm thuộc chi Cordyceps Fr phân bố rộng rãi trên toàn cầu, ngoại trừ Nam Cực, với sự đa dạng cao nhất tập trung ở Đông Á và Đông Nam Á Phổ vật chủ của chi nấm này rất phong phú.

Cordyceps là một nhóm nấm đa dạng, bao gồm mười bộ thuộc ngành Chân khớp và các loài nấm trong chi Elaphomyces, cũng như thực vật như Beilschmiedia erythrophloia Gần đây, có nhiều nghiên cứu chỉ ra sự cộng sinh hoặc ký sinh của một số loài nấm trong hệ sinh thái này.

Nấm Cordyceps chủ yếu ký sinh trên các loài côn trùng, làm cho chúng trở thành một nhóm nấm ký sinh côn trùng lớn.

Nấm Cordyceps Fr là một chi nấm quan trọng, nổi bật với khả năng ký sinh trên côn trùng và đang được nghiên cứu sâu rộng Tương tự như các loài nấm khác trong họ Clavicipitaceae, Cordyceps Fr đã có mối quan hệ lâu dài với con người, đặc biệt trong nông nghiệp, nơi chúng được sử dụng như một tác nhân kiểm soát sinh học, và trong y dược, với vai trò là một loại thuốc quý giá.

Ứng dụng

1.1.2.1 Trong lĩnh vực nông nghiệp

Theo nghiên cứu của Gul và cộng sự (2014), các loài nấm ký sinh côn trùng quan trọng trong nông nghiệp thuộc chi Cordyceps Fr., bao gồm Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae và Isaria fumosorosea Những loài nấm này được ứng dụng rộng rãi trong kiểm soát sâu bệnh nhờ khả năng tấn công côn trùng ở mọi giai đoạn phát triển, kể cả giai đoạn nhộng Đặc biệt, tính an toàn sinh học của chúng là một lợi thế lớn, vì các chất độc sinh ra trong quá trình ký sinh không gây ảnh hưởng đến con người và không gây dị ứng như một số loài nấm khác, chẳng hạn như Aspergillus flavus.

Tại Việt Nam, nấm ký sinh côn trùng như Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana đã được nghiên cứu và ứng dụng hiệu quả trong việc phòng trị các loại côn trùng và sâu hại cây trồng, bao gồm mối nhà, sâu khoang hại cải xanh, sâu hại đậu tương và đậu xanh, rầy mềm, cũng như các loài sâu hại lúa.

Hiện nay, một số loài nấm thuộc chi Cordyceps đang được sử dụng như thuốc chữa trị cho nhiều bệnh khác nhau ở con người.

Ophiocordyceps sinensis, hay còn gọi là Đông trùng hạ thảo, là một loại nấm có giá trị y học cao, được sử dụng từ lâu trong y học cổ truyền ở nhiều quốc gia châu Á, bao gồm cả Việt Nam Các hợp chất có trong nấm này được cho là mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe.

Ophiocordyceps sinensis chứa nhiều hợp chất quý giá như cordycepin, polysaccharide ngoại bào và nội bào, adenosine, guanosine, và cordymin, với nhiều tác dụng tích cực như điều hòa miễn dịch, kháng ung thư, kháng di căn, chống oxi hóa, hạ đường huyết, và hỗ trợ điều trị suy thận mãn tính Do đó, nhu cầu sử dụng các sản phẩm từ nấm này ngày càng tăng cao.

Ophiocordyceps sinensis ngày càng tăng

Các loài nấm khác thuộc chi Cordyceps Fr cũng có các tác dụng dược tính quý báu như

Cordyceps militaris, commonly known as caterpillar fungus, along with Cordyceps pseudomilitaris, Elaphocordyceps ophioglossoides, and Ophiocordyceps heteropoda, are notable species within the Cordyceps genus Research conducted in Vietnam has revealed that several native species of Cordyceps also possess significant properties.

Các loài nấm Cordyceps Fr có tiềm năng lớn trong việc phát triển thuốc mới nhờ vào các dược tính như khả năng kháng oxi-hóa và bảo vệ tế bào gan Để ứng dụng trong y dược, việc phân loại và định danh chính xác các loài nấm này đến mức loài là yêu cầu tiên quyết Tuy nhiên, hệ thống phân loại của chi nấm này vẫn đang trong quá trình nghiên cứu và làm rõ.

Phân loại học

Theo quan niệm hình thái học (Morphological analysis)

Phương pháp phân loại sinh vật theo hình thái là phương pháp cổ điển và lâu đời nhất, được định nghĩa dựa trên các khác biệt cơ học có thể đo đếm được Nó thừa nhận tính liên tục về khả năng sinh sản trong loài và sự gián đoạn của biến dị giữa các loài.

Cordyceps Fr thuộc họ Clavicipitaceae, nổi bật với đặc điểm túi bào tử dạng trụ và miệng túi dày Bào tử của nó thường có dạng sợi và dễ bị phân mảnh thành tiểu bào tử So với các chi khác trong họ Clavicipitaceae, Cordyceps Fr đặc trưng bởi sự hình thành các thể quả dạng chai, có thể nổi lên trên bề mặt hoặc ẩn trong thân nấm, với thể bó biến chuyển từ dạng chùy đến dạng hình đầu.

Hình 1.2 Hình thái đặc trưng của chi nấm Cordyceps Fr [74] A – Túi bào tử của nấm

Ophiocordyceps variabilis chứa các bào tử túi dạng sợi phân đốt với đỉnh túi dày; B –

Bào tử túi phân đốt của Elaphocordyceps subsessilis; C – Quả thể dạng chai nằm ẩn trong thể đệm của nấm Cordyceps cardinalis; D – Thể đệm hình chùy của nấm

Elaphocordyceps ophioglossoides; E – Thể đệm hình đầu của nấm Ophiocordyceps gracilis

Theo Khoản 59 của Bộ quy tắc Danh pháp Quốc tế về Thực vật (2006), các loài nấm không tạo thành địa y được đặt tên theo hệ thống lưỡng danh, với các dạng hữu tính và vô tính phân vào các chi khác nhau Chẳng hạn, nấm hữu tính Ophiocordyceps sinensis có dạng vô tính là Hirsutella sinensis Thống kê cho thấy, chi nấm vô tính có thể hữu tính thuộc Cordyceps Fr rất đa dạng và được phân vào nhiều chi như Beauveria, Simplicillium, Isaria, Paecilomyces, Hirsutella, Hymenostilbe, và Metarhizium.

Khóa phân loại của Kobayasi trên chi Cordyceps Fr., bao gồm cả phân chi Cordyceps subg Bolacordyceps, hiện đang được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu và phân loại.

5 hình thái [74] Ngoài ra, còn có một số khóa phân loại khác nhưng không phổ biến bằng khóa phân loại của Kobayasi [38]

Mặc dù có lịch sử lâu đời, phương pháp định danh dựa trên hình thái có nhiều yếu điểm:

Các tiêu chí hình thái quan sát hiện còn đơn giản, cùng với sự đa dạng về kiểu hình của nhiều loại nấm, đã gây ra khó khăn trong công tác định danh.

Sự không thống nhất giữa các nhà phân loại học đã làm cho việc định danh dựa trên hình thái trở nên phức tạp Cụ thể, Kobayasi và Mains có quan điểm khác nhau về các đặc tính mang ý nghĩa phân loại ở mức dưới chi.

Thông tin về vật chủ được các nhà phân loại học sử dụng để xác định các loài nấm ký sinh côn trùng, như Cordyceps Fr., thể hiện nhiều khuyết điểm Sự đa dạng lớn về phổ vật chủ khiến quá trình định danh gặp khó khăn, đặc biệt khi sinh vật có thể ở dạng chưa trưởng thành hoặc vật chủ đã bị phân hủy khi mẫu nấm được thu thập.

Các mẫu vật nấm thường được tìm thấy ở trạng thái vô tính, thuộc các chi vô tính khác nhau trong họ Clavicipitaceae, song song với các chi hữu tính Sự phức tạp này làm khó khăn cho việc định danh dựa trên hình thái, do có sự khác biệt về tiêu chí phân loại và tính linh hoạt trong hình thái của nấm Cordyceps Fr Do đó, các phương pháp định danh và phân loại khác đã được phát triển để hỗ trợ cho quy trình này Tuy nhiên, sau hơn 200 năm, phương pháp định danh bằng hình thái vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng Các phương pháp khác, như phát sinh phân tử, thường đi kèm với các công bố để đánh giá độ chính xác và mối quan hệ giữa các loài.

1.2.1.1 Theo quan niệm phát sinh phân tử (Molecular phylogenic analysis)

Theo Cracraft (1983, 1989), loài được phân loại dựa trên quan điểm phát sinh phân tử, định nghĩa là nhóm sinh vật chia sẻ các tính trạng đặc trưng từ tổ tiên chung Phương pháp phân tích phát sinh phân tử dựa trên trình tự DNA, hay còn gọi là phương pháp phân tử, được ưa chuộng trong nghiên cứu nấm nhờ vào sự tiện lợi trong giải trình tự và tính chính xác của phân tích Phương pháp này giúp khắc phục những hạn chế của các quy tắc phân loại dựa trên hình thái.

Hiện nay, các loài thuộc chi Cordyceps Fr đang được các nhà hệ thống học phân tử nghiên cứu và phân loại lại vào các họ mới trong bộ Hypocreales Một trong những nghiên cứu quan trọng nhất là công bố của Sung và cộng sự (2007), tập trung vào mối quan hệ giữa các loài nấm.

Nghiên cứu của Sung và cộng sự đã sử dụng dữ liệu từ 5 đến 7 vùng gen để chỉ ra rằng các loài Cordyceps Fr thuộc họ Clavicipitaceae cần được nâng cấp lên mức họ Kết quả cho thấy phần lớn các loài Cordyceps sensu lato đã được tách biệt rõ ràng.

The classification of species within the genus Cordyceps Fr has led to the reorganization of the family Clavicipitaceae s.l., resulting in the establishment of two new families: Cordycipitaceae, which includes the genus Cordyceps sensu stricto, and Ophiocordycipitaceae, which encompasses the genera Ophiocordyceps and others.

Elaphocordyceps là một chi nấm mà một số loài đã được giữ lại trong họ Clavicipitaceae s.s sau khi phân tích phát sinh phân tử loại bỏ một số loài thuộc chi Cordyceps Fr Những loài này sau đó được chuyển vào chi Metacordyceps Nghiên cứu cũng thừa nhận sự tồn tại của các loài Cordyceps sp không thể phân loại và xếp vào chi khác.

Nghiên cứu về Cordyceps s.l đã dẫn đến việc các nhóm nghiên cứu khác tiếp tục phân tích các loài Cordyceps còn lại, từ đó đề xuất các nhóm phân loại mới dựa trên công trình của Sung và cộng sự (2007).

Johnson và cộng sự (2009) đã thực hiện một phân tích chi tiết về chi nấm Torrubiella, một nhóm nấm hữu tính ký sinh trên côn trùng thuộc họ Clavicipitaceae Chi nấm này có đặc điểm sinh học và sinh thái tương tự như các chi khác trong họ Clavicipitaceae.

Cordyceps Fr Trong công bố của Sung và cộng sự (2007), các loài thuộc chi nấm

Torrubiella phân bố dàn trải trong cả ba họ Clavicipitaceae s.s., Ophiocordycipitaceae

Phát sinh phân tử

Định nghĩa

Phát sinh phân tử hay phả hệ học phân tử là một nhánh của phả hệ học, nghiên cứu mối liên hệ tiến hóa giữa các loài, cá thể, gen hoặc protein từ dữ liệu phân tử như DNA hoặc protein thông qua các thuật toán xác định Kết quả nghiên cứu được thể hiện dưới dạng cây phát sinh phân tử, một hệ thống cấp bậc phân nhánh Hiện nay, nhờ vào sự tiến bộ công nghệ và thuật toán, phát sinh phân tử không chỉ áp dụng cho các đối tượng sinh vật mà còn ở mức độ phân tử, dẫn đến việc thuật ngữ này đôi khi được gọi là phát sinh loài phân tử khi phân tích tập trung vào cá thể hoặc loài.

Cây phát sinh phân tử là kết quả của quá trình phân tích phát sinh phân tử, thể hiện mối liên hệ giữa các loài hoặc gen Hai thông tin quan trọng trong cây phát sinh là cấu trúc liên kết (địa hình học) và chiều dài của các nhánh.

Cây phát sinh phân tử là biểu đồ gồm các nhánh và nốt, trong đó cấu trúc liên kết hình thành từ sự sắp xếp của các nốt Mỗi nhánh chỉ nối hai nốt, với các nốt đại diện cho các đơn vị phân loại Gốc của cây, là nốt đầu tiên, thể hiện tổ tiên chung nhất của các trình tự phân tích, trong khi các nốt trung gian, hay nốt nội tại, đại diện cho các đơn vị phân loại giả thuyết.

Mỗi nhánh trong phân tích trình tự chứa các đơn vị phân loại hiện hữu (OTU), còn được gọi là lá hoặc taxa OTU bao gồm các trình tự acid nucleic hoặc amino acid, đóng vai trò quan trọng trong việc phân tích phát sinh phân tử.

Hình 1.4 Hai dạng cây phát sinh phân tử A – Cây có gốc; B – Cây không gốc [68]

Một nhóm các taxa thuộc cùng một nhánh được gọi là có mối quan hệ đơn huyết thống (monophyletic) và được định nghĩa là một tập hợp (cluster/clade).

Các taxa A, B và C có quan hệ đơn huyết thống với tổ tiên chung nhất là H, như thể hiện trong Hình 1.4A Ngược lại, C, D và E không thể hình thành một tập hợp mà không có sự bổ sung của taxa A và B.

D và E không có mối quan hệ đơn huyết thống Mối quan hệ này được gọi là cận huyết thống (paraphyletic) [68]

Cây phát sinh phân tử có thể có gốc (rooted) hoặc không có gốc (unrooted) [34], [60],

Cây phát sinh phân tử có thể được chia thành hai loại: cây có gốc và cây không gốc Hình 1.4A minh họa cây có gốc với taxa K làm điểm gốc, trong khi Hình 1.4B thể hiện cây không gốc, chỉ tập trung vào mối liên hệ giữa các taxa mà không xem xét chiều hướng tiến hóa Để xác định chiều hướng tiến hóa, cần sử dụng cây có gốc, đại diện cho tổ tiên chung nhất của các OTU Hai phương pháp phổ biến để tạo gốc cho cây phát sinh phân tử là sử dụng nhóm ngoại (outgroup) và tạo gốc tại điểm trung gian (midpoint rooting) Nhóm ngoại là một hoặc một vài taxa có mối liên hệ xa nhất với các OTU đang nghiên cứu, giúp làm rõ mối quan hệ giữa các taxa trong nhóm nghiên cứu.

Ví dụ, trình tự DNA của gen myoglobin ở động vật không xương sống được sử dụng

11 như là outgroup trong nghiên cứu sự tiến hóa của gen myoglobin ở động vật có vú

Việc chọn outgroup có mối quan hệ quá xa hoặc quá gần với các taxa đang phân tích có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích Do đó, việc sử dụng nhiều hơn một outgroup thường được áp dụng để nâng cao độ chính xác của cấu trúc liên kết trong cây phát sinh phân tử.

Hình 1.5 Các phương pháp xây dựng gốc của cây phát sinh phân tử [60]

Cây phát sinh phân tử có hai dạng chính: phylogram và cladogram Phylogram, với đơn vị tỷ lệ xích, thể hiện mối liên hệ giữa các OTU và độ dài nhánh phản ánh sự khác biệt về trình tự nucleic acid hoặc amino acid giữa các taxa Ngược lại, cladogram không có đơn vị tỷ lệ xích, chỉ cho thấy cấu trúc liên kết giữa các taxa mà không phản ánh sự khác biệt về trình tự Dạng cây này rất hữu ích khi số lượng OTU lớn, giúp đơn giản hóa việc thể hiện mối liên hệ giữa các OTU.

Hình 1.6 Cây tiến hóa và cây phân loại [60]

Cây phát sinh gen và cây phát sinh loài

Trong phân tích phát sinh phân tử, các trình tự được chọn phải có tính chất đồng nhất (homologous), nghĩa là chúng xuất phát từ một tổ tiên chung Tính đồng nhất này được thể hiện qua độ tương đồng giữa các acid nucleic hoặc amino acid Tuy nhiên, trong quá trình tiến hóa, độ tương đồng có thể giảm, dẫn đến việc các chuỗi dữ liệu không còn đủ thông tin về mối quan hệ giữa các gen Hơn nữa, các trình tự này cũng trải qua nhiều biến đổi, dẫn đến hiện tượng bão hòa Do đó, thuật ngữ đồng nhất chỉ được áp dụng khi tổ tiên chung không quá xa, đảm bảo các trình tự vẫn giữ được sự tương đồng cần thiết cho phân tích Thực tế, các phương pháp phân tích phát sinh phân tử chủ yếu dựa vào độ tương đồng giữa các trình tự hơn là tính đồng nhất của chúng.

Trong phân tích phát sinh phân tử, cần làm rõ hai khái niệm quan trọng là orthologue và paralogue Orthologue đề cập đến các gen đồng nhất ở các loài khác nhau trong quá trình phát sinh loài, trong khi paralogue liên quan đến hiện tượng nhân đôi gen trong một cá thể Các trình tự orthologue thường được sử dụng trong phân tích phát sinh gen, trong khi các trình tự paralogue phục vụ cho việc nghiên cứu lịch sử của một họ gen.

Cây phát sinh gen (gene tree) thể hiện lịch sử tiến hóa của một gen hoặc chuỗi DNA Việc sử dụng cây phát sinh gen để đại diện cho một loài phụ thuộc vào việc các gen được sắp xếp là orthologue hay paralogue Để xây dựng mối quan hệ tiến hóa giữa các loài, chỉ các gen orthologue mới được sử dụng Cần lưu ý rằng các nốt trong cây tiến hóa không đại diện cho sự phát sinh loài mới mà thể hiện sự hình thành các đột biến trên các gen, những đột biến này có thể xảy ra trước và sau khi hình thành loài.

Phương pháp phân tích

Quá trình phân tích phát sinh phân tử được thể hiện trong Hình 1.8

Hình 1.8 Tóm tắt các bước trong phân tích phát sinh phân tử [68]

Khi thực hiện phân tích phát sinh phân tử, việc xác định mục tiêu nghiên cứu là rất quan trọng để hướng dẫn quá trình lấy mẫu Để nghiên cứu sự phát sinh loài trong một nhóm sinh vật, cần thu thập tối đa các trình tự từ các cá thể cùng loài và các loài liên quan Bên cạnh đó, việc lựa chọn outgroup cũng đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo hiệu quả của phân tích phát sinh phân tử.

Các phân tích phân tử thường dựa vào dữ liệu trình tự tổng hợp từ nhiều nghiên cứu khác nhau Sự gia tăng nhanh chóng của lượng trình tự đã dẫn đến sự hình thành các cơ sở dữ liệu, đóng vai trò là nơi lưu trữ và truy hồi thông tin Các cơ sở dữ liệu này thường tích hợp các công cụ tìm kiếm hiệu quả và có mối liên hệ chặt chẽ với nhau Bên cạnh dữ liệu trình tự, chúng còn chứa nhiều thông tin chú giải như nguồn thu nhận trình tự, loài và loại tế bào, phương pháp giải trình tự, cũng như các đặc tính đã biết.

Sắp gióng cột là bước quan trọng trong phân tích phát sinh phân tử, giúp phát hiện và phân tích sự thay đổi trong các trình tự [72] Việc thực hiện sắp gióng cột cần cẩn thận và chính xác, vì sai sót có thể dẫn đến kết quả phân tích không chính xác [72] Do số lượng trình tự lớn, quá trình này thường bắt đầu bằng việc sắp gióng giữa hai trình tự, sau đó bổ sung các trình tự khác để tạo thành sắp gióng đa trình tự [68] Mặc dù lý thuyết cho phép sử dụng thuật giải quy hoạch động, nhưng việc tăng số lượng trình tự làm cho các phương pháp thông thường khó có thể tìm ra phương án tối ưu [67], [68] Vì vậy, các phương pháp gần đúng, đặc biệt là sắp gióng cột liên hoàn, được áp dụng phổ biến [27], [61], [68] Phương pháp này sử dụng cây định hướng để xác định khoảng cách giữa các trình tự và sắp gióng theo cấu trúc kết nối của cây, với các trình tự gần nhất được sắp gióng trước [68].

Quy trình này cho phép sắp gióng cột hàng trăm trình tự nhanh chóng Sau khi sắp gióng, những vùng không rõ ràng sẽ được loại bỏ trước khi tiến hành phân tích phân tử Đối với các vị trí có khoảng trống, quyết định giữ lại hay loại bỏ sẽ phụ thuộc vào độ rõ ràng của khoảng trống tại vị trí đó Nếu rõ ràng cần có khoảng trống, thì việc giữ lại là cần thiết.

Việc thêm 16 khoảng trống là rất quan trọng Thông tin trong các cột có chứa khoảng trống sẽ được áp dụng tùy thuộc vào phương pháp phân tích phát sinh phân tử được sử dụng.

Bước tiếp theo trong phân tích phát sinh phân tử là chọn mô hình tiến hóa phù hợp cho dữ liệu đã sắp xếp Mô hình này mô tả sự biến đổi nucleotide trong dữ liệu thu thập được Hiệu quả của mô hình phụ thuộc vào sự tương hợp với dữ liệu, và do sự khác biệt về kích cỡ, trình tự nucleotide, cũng như tốc độ tiến hóa giữa các nhóm dữ liệu, không có mô hình nào có thể phù hợp với tất cả Hiện nay, việc tìm kiếm mô hình tiến hóa tương thích nhất được thực hiện qua các phương pháp như kiểm tra tỷ lệ khả năng theo cấp bậc (hLRTs), chuẩn thông tin, Bayesian, hoặc các phương pháp dựa vào năng lực.

Mục tiêu của việc phát sinh phân tử là xác định cây tiến hóa chính xác nhất cho quá trình tiến hóa của gen hoặc các loài đang được nghiên cứu Hiện nay, có nhiều phương pháp để tìm kiếm cây tiến hóa tối ưu, và các phương pháp này có thể được chia thành hai nhóm lớn.

Nhóm phương pháp khoảng cách dựa trên các thuật toán kết hợp với mô hình tiến hóa để tính toán ma trận khoảng cách, từ đó xây dựng cây phát sinh phân tử Khoảng cách giữa các trình tự được xác định bởi số lượng khác biệt giữa các cặp trình tự Mô hình tiến hóa mô tả quá trình biến đổi nucleotide hoặc amino acid từ tổ tiên chung Cuối cùng, cây phát sinh phân tử được tái dựng từ ma trận, với các trình tự gần gũi được nhóm lại và tách biệt với các nhóm xa hơn.

Nhóm phương pháp dựa vào đặc tính tìm kiếm cây tiến hóa phù hợp nhất cho các trình tự khảo sát dựa trên từng vị trí trong sắp gióng cột thông qua một giả thuyết được đặt ra.

Phương pháp hà tiện tối đa (Maximum parsimony) được sử dụng để tìm cây phát sinh phân tử với số lượng biến đổi ít nhất nhằm giải thích quá trình tiến hóa của nhóm trình tự Trong khi đó, phương pháp khả năng tối đa (Maximum likelihood) dựa trên các mô hình xác suất tiến hóa để xác định cây phát sinh phân tử phù hợp nhất, tối đa hóa xác suất khối dữ liệu dưới các mô hình đó Cuối cùng, suy luận Bayes (Bayesian inference) tập trung vào việc tìm kiếm mô hình tiến hóa và các thông số cây sao cho xác suất của mô hình và thông số cây đạt giá trị lớn nhất dựa trên bộ dữ liệu thu thập được.

Không có phương pháp tối ưu duy nhất để xây dựng cây phát sinh phân tử; thay vào đó, cần tổng hợp và so sánh kết quả từ nhiều phương pháp khác nhau để xác định cây phát sinh phân tử tốt nhất Thông thường, các cây được xây dựng từ nhóm phương pháp dựa vào khoảng cách sẽ được sử dụng trước để đánh giá sơ bộ sự phân nhóm của các trình tự, sau đó áp dụng các phân tích dựa trên các phương pháp đặc tính mới.

Phương pháp kiểm tra

Sau khi xây dựng cây phát sinh phân tử bằng các phương pháp khác nhau, cấu trúc của cây sẽ được đánh giá để kiểm tra độ tin cậy Các clade sẽ được kiểm tra bằng phương pháp phân tích bootstrap, một kỹ thuật lấy mẫu phổ biến để ước lượng sai số thống kê khi phân phối mẫu không rõ ràng Phương pháp này giúp ước lượng sự phân bố mẫu thông qua việc lấy mẫu lặp từ bộ dữ liệu ban đầu Dữ liệu trình tự sẽ được bootstrap, tức là phần mềm sẽ tạo ra các cột dữ liệu mới bằng cách lấy ngẫu nhiên các cột từ bộ dữ liệu gốc Cột có thể được lấy nhiều lần hoặc không được lấy trong mỗi lần phân tích, cho đến khi một tập hợp trình tự có độ dài tương tự được tạo ra, được gọi là bộ lặp bootstrap Trong quá trình này, một số vị trí có thể không được sử dụng, trong khi một số vị trí có thể được sử dụng nhiều lần.

Mười tám phân tử sẽ được xây dựng thông qua phương pháp dựng cây đang thực hiện Các clade trên cây phát sinh phân tử mới sẽ được so sánh với các clade trên cây phát sinh ban đầu Với số lượng bộ lặp bootstrap xác định, phần mềm sẽ tính toán tỷ lệ các clade được lặp lại trên cây ban đầu, từ đó cung cấp độ tin cậy thống kê cho tính đơn huyết thống của các clade (Hình 1.9) [68].

Phương pháp bootstrap là một công cụ phân tích hiệu quả để kiểm tra độ ổn định của các nhóm trong cây phát sinh phân tử, với khả năng áp dụng cho nhiều phương pháp dựng cây khác nhau Tuy nhiên, phương pháp này yêu cầu thời gian đáng kể do cần lặp lại toàn bộ quá trình phân tích, thường từ 200 đến 2000 lần Ngưỡng tin cậy của bootstrap được xác định từ 70% hoặc 75% trở lên, và các giá trị nhỏ hơn 70% cần được kiểm tra cẩn thận để đảm bảo độ chính xác của kết quả.

Hình 1.9 Phương pháp phân tích bootstrap [68].

Vai trò của phát sinh phân tử trong hỗ trợ phân loại và định danh chi nấm Cordyceps Fr

Kể từ khi phân tử ra đời, nấm thuộc chi Cordyceps Fr đã được nghiên cứu rộng rãi Các nghiên cứu ban đầu dựa trên vùng gen ribosome cho thấy họ Clavicipitaceae là một nhóm đơn huyết thống Tuy nhiên, các nghiên cứu sau với dữ liệu phong phú hơn đã chỉ ra sự không thống nhất trong mối quan hệ giữa chi nấm Cordyceps Fr và họ Clavicipitaceae.

Nghiên cứu của Sung và cộng sự (2007) đã đóng góp quan trọng vào việc phân loại các loài nấm, đồng thời chứng minh khả năng định hướng của phát sinh phân tử trong việc xác định các loài nấm, đặc biệt khi các đặc điểm hình thái không rõ ràng.

Phân tử phát sinh đóng vai trò quan trọng trong việc làm rõ mối quan hệ giữa sinh sản hữu tính và vô tính ở nấm Cordyceps Chẳng hạn, nghiên cứu của Chen và cộng sự (2001) dựa trên trình tự ITS đã xác nhận rằng loài vô tính của Cordyceps sinensis là Hirsutella sinensis.

Nghiên cứu đã đóng góp quan trọng vào việc định danh chính xác nấm Corydceps sinensis, trong khi nhiều loài vô tính thuộc các chi khác nhau cũng đã được đề xuất Một loài vô tính khác được cho là thể vô tính của Cordyceps sinensis cũng đã được xác định.

Paecilomyces sinensis thường được tìm thấy cùng với nấm Cordyceps sinensis Tuy nhiên, dựa vào dẫn liệu phân tử, Wang và cộng sự (2012) đã chứng minh

Paecilomyces sinensis thuộc vào chi Polycephalomyces [78]

Phân tích phát sinh phân tử đã đóng góp quan trọng vào việc phân loại các loài nấm thuộc chi Cordyceps Fr Sự không rõ ràng về hình thái thường được làm sáng tỏ thông qua các nghiên cứu này, giúp xác định các đặc điểm phân loại có giá trị ở mức loài.

PCR suy biến

Khái niệm

Một bước quan trọng trong nghiên cứu phát sinh phân tử là khả năng khuếch đại trình tự mục tiêu Đối với nghiên cứu sự tiến hóa của các loài, phương pháp PCR cần khuếch đại trình tự mục tiêu cho nhiều loài khác nhau Trong một số trường hợp, thay vì sử dụng các mồi PCR đặc hiệu, người ta sử dụng một hỗn hợp các mồi có kích thước tương đương, chỉ khác nhau ở một vài nucleotide Tập hợp mồi này được gọi là mồi suy biến và phương pháp PCR sử dụng được gọi là phương pháp PCR suy biến.

Mồi suy biến

Việc thiết kế mồi suy biến dựa trên tính suy biến của bộ ba mã hóa Đầu tiên, các trình tự amino acid của gen mục tiêu từ các loài khác nhau được sắp xếp để xác định các vị trí bảo tồn Những vị trí bảo tồn này sẽ được áp dụng trong quá trình thiết kế mồi.

Việc thiết kế 21 loại mồi dựa trên bộ ba mã hóa tương ứng là rất quan trọng, do tính thoái hóa của mã bộ ba cho phép tồn tại nhiều nucleotide tương ứng tại một số vị trí nhất định Để khuếch đại các trình tự ở các loài khác nhau, cần sử dụng hỗn hợp mồi với sự khác biệt tại một số vị trí cụ thể Độ suy biến tại các vị trí này được xác định bởi số lượng nucleotide tương ứng: nếu có 2 nucleotide, độ suy biến là 2; với 3 nucleotide, độ suy biến là 3; và tương tự cho 4 nucleotide Tổng độ suy biến của mồi được tính bằng tích độ suy biến của tất cả nucleotide trong mồi.

Bảng 1.1 Ký hiệu cho mồi suy biến

Ký hiệu Nucleotide tương ứng

Khi độ suy biến của mồi tăng, nồng độ mồi đặc hiệu trong phản ứng giảm, gây khó khăn cho quá trình khuếch đại Để giảm độ suy biến này, nucleotide inosine (I) có thể được sử dụng thay thế cho các vị trí có độ suy biến 4 Tuy nhiên, việc áp dụng inosine đòi hỏi sử dụng các polymerase có khả năng khuếch đại trên khung chứa inosine, chẳng hạn như Taq polymerase.

Tối ưu hóa phương pháp PCR suy biến với mồi suy biến

Nhiệt độ bắt cặp là yếu tố quan trọng nhất trong quá trình PCR suy biến Bên cạnh đó, nồng độ mồi, chu kỳ khuếch đại và thời gian kéo dài cũng có thể ảnh hưởng đến kết quả Trong PCR suy biến, các thông số này thường được giữ cố định để đảm bảo tính chính xác của quá trình.

22 độ bắt cặp sẽ được khảo sát để tìm ra nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho từng gen trong nghiên cứu [7].

Dự đoán cấu trúc bậc hai (secondary structure) rDNA trong hỗ trợ định

Trong phân tích phả hệ phân tử, sự khác biệt nucleotide không đủ để xác định ranh giới loài, nhưng có thể ảnh hưởng đến năng lượng hình thành cấu trúc bậc hai Nghiên cứu về định danh nấm, đặc biệt là nấm ký sinh côn trùng, cho thấy xây dựng cấu trúc bậc hai là giải pháp hữu ích để làm rõ mối quan hệ loài mà cây phả hệ chưa giải quyết thỏa đáng Kuo và cộng sự (2008) đã dự đoán cấu trúc bậc hai của vùng ITS2 với hai loài Cordyceps roseostromata và Cordyceps militaris Kết quả cho thấy sự khác biệt trong vùng ITS2 của hai loài này tại các vị trí 130 và 272, cùng với một khoảng trống ở Cordyceps militaris.

Theo nghiên cứu của Kuo và cộng sự (2008), khi dự đoán cấu trúc bậc hai của mạch mang mã (sense) của hai loài Cordyceps roseostroma và Cordyceps militaris, kết quả cho thấy chúng có cấu trúc hoàn toàn giống nhau Ngược lại, mạch không mang mã (antisense) lại có cấu trúc bậc hai hoàn toàn khác nhau Từ đó, các tác giả kết luận rằng việc phân tích cấu trúc bậc hai của vùng ITS2 có thể giúp phân biệt một số loài có mối quan hệ gần gũi trong chi Cordyceps.

Một số mẫu nấm Cordyceps thu nhận tại vùng núi LangBiang, Lâm Đồng [4]

Tổng quát

Phân tích hình thái và giải phẫu của 10 mẫu nấm thuộc chi Cordyceps từ vùng núi LangBiang, Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng được trình bày trong công bố của Trương Bình Nguyên và Đinh Minh Hiệp (2013) Trong số đó, 3 mẫu nấm đã được xác định đến mức loài, trong khi các mẫu còn lại chỉ được định danh đến mức chi, kèm theo một số hình ảnh minh họa.

DL0004 – Ophiocordyceps neovolkiana

Mẫu nấm DL0004 được phát hiện tại núi LangBiang, tỉnh Lâm Đồng, ở độ cao 1650 m, trên thảm lá mục dưới tán rừng cây lá rộng Quả thể nấm có màu vàng chùy, chia thành hai phần rõ rệt: phần sinh sản màu vàng chanh, dạng cầu hơi dẹp, kích thước 2 – 3 mm chiều rộng và 3 – 5 mm chiều dài Thịt nấm có màu vàng và khá dai, với thể chén dạng trụ, vách dày, nhô lên nhẹ khỏi bề mặt đỉnh thể bó, kích thước từ 350 – 400 mm, bên trong chứa các thể tỳ song song.

24 đỉnh thể chén mở ra, cho phép túi bào tử nhô ra và giải phóng bào tử túi Thể túi có dạng sợi, thuôn nhọn ở đầu gắn với đáy thể chén, và mở rộng ở đầu kia với nắp đậy bán cầu, kích thước từ 250-300 µm x 7-9 µm Mỗi thể túi chứa năm chuỗi bào tử túi xếp khít nhau một cách trật tự Bào tử túi có hình trụ, thắt eo hai lần, chia thành ba đoạn, với vỏ dày và kích thước 4-5 µm x 2-3 µm.

Quan sát dưới kính hiển vi sau 4 ngày, hệ sợi nuôi cho thấy sự hình thành của cơ quan sinh bào tử cuống bào tử đính và thể bình Thể bình xuất hiện tại nhiều vị trí khác nhau trên sợi nấm, có kích thước từ 20 - 25 µm x 2 – 3 µm Bào tử vụ tính có hình elip, kích thước khoảng 5 - 7 µm x 3– 4 µm.

Sau 12 ngày quan sát khuẩn lạc trên môi trường PGA ở nhiệt độ 25 ± 2 o C, hệ sợi phát triển nhanh chóng với đường kính đạt 24 – 30 mm Khuẩn lạc có màu trắng, đồng nhất và mép khuẩn lạc nhẵn, tạo thành vòng tròn đồng tâm Sợi nấm màu trắng, có vách ngăn và phân nhánh mạnh mẽ.

Hình 1.11 Hình thái giải phẫu mẫu nấm DL0004 [4] A – Thể bó ngoài tự nhiên; B

– Thể chén; C – Thể túi; D – Bào tử túi; E – Khuẩn lạc phát triển trên môi trường

DL0015 – Cordyceps pseudomilitaris

DL0015 là loại quả mọc thành đám, có hình dạng gốc đơn, thẳng đứng và không phân nhánh trên cơ thể sâu non Mẫu vật được thu thập từ lớp thảm mục thực vật rừng cây lá rộng tại núi Langbiang, ở độ cao khoảng 1650 m, với chín quả thể mọc thành hai hàng dọc.

25 theo hai bên hông của sâu non là ấu trùng của côn trùng bộ cánh vẩy (Lepidoptera) (Hình 1.12A và B)

Hình 1.12 mô tả hình thái giải phẫu của mẫu nấm DL0015, bao gồm các phần như quả thể tự nhiên (A), ký chủ ấu trùng Lepidoptera (B), thể chén nhô cao trên bề mặt vùng sinh sản (C), thể chén (D), túi (E), bào tử túi (F), và sự phát tán túi cùng bào tử túi khỏi thể chén (G).

Hệ sợi nấm trên môi trường chứa saccharose bao gồm hai phần chính: phần sinh sản và phần cuống Phần sinh sản có hình dạng trụ, hơi phình ở giữa và thót lại ở đỉnh, có màu nâu đỏ, bên ngoài được bao phủ bởi lớp bụi bào tử màu trắng bạc với kích thước 9-12 × 1-1,5 mm Thể chộn có hình dạng trứng kéo dài, kích thước 300-350 × 175-200 mm, nhô cao lên khỏi bề mặt vùng sinh sản Túi nang có dạng sợi với kích thước đặc trưng.

Bào tử tỳi có hình dạng filiform, không có vỏ ngăn, thon nhọn ở hai đầu với kích thước 200 x 3-4 µm Phần cuống của bào tử có màu sắc tương tự như phần sinh sản, có hình trụ với kích thước từ 4-7 x 0,7-1 mm.

Hệ sợi nấm DL0015 phát triển nhanh trên môi trường PDA với màu trắng thuần Trong ống thạch nghiêng, mầm nấm xuất hiện sau 25 ngày nhưng không phát triển tới giai đoạn trưởng thành Cơ quan sinh bào tử vụ tớnh xuất hiện rải rác dọc theo sợi nấm, có kích thước từ 15-20 µm và 2-2,5 µm.

(Hình 1.12I) Bào tử vô tính có hình trụ, kích thước thay đổi trong khoảng 2-8 × 2-4 àm, một số cú vỏch ngăn ngang (Hỡnh 1.12J)

Hệ sợi nấm DL0015 phát triển mạnh mẽ trong điều kiện nuôi trồng nhân tạo, có khả năng hình thành quả thể trên nhiều loại cơ chất khác nhau Sau giai đoạn ủ sợi, mầm nấm xuất hiện và quả thể có thể phát triển đến giai đoạn trưởng thành, bao gồm sự hình thành thể chén và bào tử túi.

DL0038A và DL0038B – Cordyceps takaomontana

Hệ sợi nấm DL0038A bao phủ hoàn toàn cơ thể ấu trùng của bộ cánh vẩy (Lepidoptera), tạo thành hạch nấm màu trắng Từ hạch nấm này, một thể bó màu vàng chanh, hình trụ kéo dài hoặc dạng chày, được hình thành.

Cá thể mọc rời hoặc liền gốc, thường tạo thành đám với chất thịt giòn và kích thước chiều dài từ 1-5 cm, đường kính có thể lên đến 3,5 mm ở vùng sinh sản Khi còn non, chúng được phủ lớp bụi bào tử vô tính màu trắng Cuống có màu vàng nhạt, nhẵn, trong khi chất thịt có màu vàng đặc Phần sinh sản nằm ở đỉnh thể bó, thường có màu vàng sậm hơn cuống, kích thước thay đổi và mang nhiều thể chén nhô lên, tạo điểm màu vàng sậm Khi trưởng thành, thể túi nhô ra khỏi miệng chén để phóng thích bào tử Thể chén có dạng bầu dục, kích thước khoảng 500-600 µm chiều dài và 200-300 µm chiều rộng, trong khi tỳ hình trụ có kích thước khoảng 350 µm chiều dài và 4 µm chiều rộng, với nắp đậy hình bầu cầu Bào tử có hình trụ cụt, thường tách rời sau khi giải phóng, kích thước khoảng 4-5 µm chiều dài và 1 µm chiều rộng.

Hệ sợi DL0038A phát triển mạnh trên môi trường PGA, có màu trắng khi non và chuyển sang màu vàng khi già Độ dày của hệ sợi không đồng nhất, với vùng mép phát triển không đều Quan sát dưới kính hiển vi cho thấy cơ quan sinh sản vô tính là thể bình, có hình dạng giống dấu phảy, phình to ở giữa và thon nhọn hai đầu, kích thước từ 4-6 µm đến 20-25 µm, hình thành rải rác dọc theo sợi nấm Bào tử vô tính có dạng elip, thường dính với nhau thành chuỗi, kích thước từ 3-4 µm đến 5-6 µm.

Hình 1.13 Hình thái giải phẫu mẫu nấm DL0038A [4] A – Thể bó nấm DL0038A trong tự nhiên; B – Ký chủ bị bao bọc bởi lớp sợi dày tạo giả hạch màu trắng;

C – Thể chén nhô cao; D – Hệ sợi phát triển trên môi trường agar, màu vàng khi già; E – Hệ sợi phân nhánh mạnh; F – Thể bình; G – Hình thành bào tử đốt;

Mẫu nấm DL0038B có thể bó non với vùng sinh sản được phủ bởi lớp bụi bào tử trắng, trong khi thể chén chưa nhô lên khỏi bề mặt quả thể Khi nuôi cấy trên môi trường PGA, hệ sợi có màu trắng, chuyển sang vàng nhạt khi trưởng thành Quan sát dưới kính hiển vi cho thấy hệ sợi vô tính có nhiều cấu trúc thể bình, tạo ra các bào tử vô tính, với thể bình phân bố rải rác dọc theo sợi nấm.

Hình 1.14 trình bày hình thái giải phẫu của mẫu nấm DL0038B, bao gồm: A – Quả thể DL0038B còn non; B – Hệ sợi phát triển trên môi trường PGA; C và D – Một số dạng bào tử vô tính; E – Hệ sợi với nhiều cấu trúc thể bình.

DL0006, DL0050 và DL0067 – Paecilomyces sp

Mẫu nấm DL0006 được tìm thấy trong thảm lá mục ẩm ướt, với thể bó mọc trên các bộ phận của vật chủ Thể bó có chân nấm màu trắng đục và phần thể sinh sản màu cam nhạt, hình cầu Thể chén nhô lên từ phần sinh sản, bao bọc đỉnh thể bó và chứa các túi bào tử Khi trưởng thành, thể chén mở ra để các túi bào tử nhô ra ngoài, giải phóng bào tử túi.

Dưới kính hiển vi, hệ sợi nuôi cấy trên lame trong 3 ngày cho thấy sự hình thành bào tử của loài thuộc chi Paecilomyces, với thể bình hình thành đơn lẻ từ sợi nấm hoặc từ cuống bào tử kết hợp với 1 hoặc 2 thể bình Thể bình có hình dạng phình to ở phần cơ bản, tròn và thuôn nhọn ở đỉnh (Hình 1.15C, D và E) Bào tử có dạng hình trụ (Hình 1.15B).

Hình 1.15 Hình thái giải phẫu mẫu nấm DL0006 [4] A – Mẫu nấm DL0006;

B – Bào tử đính; C  F – Cấu trúc cuống bào tử đính và thể bình

Dưới kính hiển vi, hệ sợi nuôi cấy trên lame trong 2 ngày cho thấy cấu trúc sinh bào tử của loài thuộc chi Paecilomyces Thể bình hình thành từ sợi nấm hoặc cuống bào tử đính, với 1 – 3 thể bình, có dạng hình trụ tròn hoặc thuôn dài, nhọn ở đỉnh, nơi sinh bào tử vô tính Bào tử vô tính có hình dạng tròn hoặc hình trụ.

Hình 1.16 Hình thái giải phẫu mẫu nấm DL0050 [4] A – Mẫu nấm DL0050;

B – Bào tử đính; C  F – Cuống bào tử đính và thể bình

Mẫu nấm DL0067 được phát hiện trong thảm lá mục ẩm ướt, với vật chủ thuộc loài Lepidopteran Mẫu nấm có chiều dài 8 mm và đường kính từ 0,7 đến 1 mm, với chỉ một thể bó và một cuống được hình thành Thân nấm mảnh, màu vàng, trong khi phần sinh sản có màu trắng đến kem, và bào tử phân bố xung quanh phần đỉnh đầu của nấm.

Hình 1.17 Hình thái giải phẫu mẫu nấm DL0067 [4]; A – Mẫu nấm DL0067;

B – Hệ sợi khuẩn lạc; C – Bào tử đính;

D và E – Cấu trúc cuống bào tử đính và thể bình; F – Vật chủ

Trên môi trường PGA khuẩn lạc phát triển khá nhanh, đường kính 6,2 – 6,5 cm trong

Sau 14 ngày ở nhiệt độ 25°C, hệ sợi ban đầu có màu trắng đã chuyển sang màu kem và xuất hiện bụi bào tử khi già Mép khuẩn lạc đều, nhưng không nhẵn, phát triển thành các vòng tròn đồng tâm.

Quan sỏt dưới kính hiển vi có kích thước từ 7,5 – 20 µm, với hình dạng bình, phần đầu phình lên thành trụ tròn và thon nhọn ở đỉnh, tạo thành hình dạng giống cái cổ Bào tử được sinh ra từ thể bình này có dạng hình trụ hơi cong, kích thước từ 2,5-3,25 x 1,25-2 µm Hệ sợi quan sỏt có kích thước tương đối đồng nhất khoảng 0,5 µm, thường phân thành hai nhánh ở đầu mút với góc khoảng 30 độ.

DL0069, DL0075 và DL0077 – Cordyceps sp

Mẫu nấm DL0069 được phát hiện dưới tán rừng lá rộng ở độ cao 1650m tại núi Langbian, tỉnh Lâm Đồng Nấm có hình dạng mảnh, với gốc màu nâu và thân thon dài.

31 nấm màu trắng đục có hình thành thể chén màu nâu đen đã trưởng thành gần đỉnh nấm (Hình 1.18A)

Quan sát dưới kính hiển vi cho thấy mẫu nấm có sự hình thành thể chén dạng trụm với vách dày, nhô lên khỏi bề mặt sinh sản Trong chén chứa các túi bào tử xếp song song, khi trưởng thành, đỉnh chén mở ra cho phép túi bào tử nhô ra ngoài và giải phóng bào tử Bên cạnh đó, thể túi dạng sợi chứa bào tử túi có hình dạng trụ.

Quan sát dưới kính hiển vi sau 3 ngày nuôi cấy trên lame cho thấy cấu trúc sinh bào tử ở dạng thể bình, với chỉ một thể bình được hình thành từ hệ sợi nấm (Hình 1.18B và C) Bào tử vô tính xuất hiện dưới dạng chuỗi, có hình dạng trụ dài hoặc hơi cong (Hình 1.18A và D).

Hình 1.18 Hình thái giải phẫu mẫu nấm DL0069 [4] A – Mẫu nấm DL0069;

B – Thể chén; C và D – Bào đính; E và F – Thể bình

Dưới kính hiển vi, hệ sợi nuôi cấy trên lame trong 3 ngày cho thấy sự hình thành bào tử vô tính hình tròn (Hình 1.19A) Hệ sợi có vách ngăn cách đều (Hình 1.18B) và rẽ nhánh ở góc 90 độ, sau đó tiếp tục rẽ hướng 45 độ (Hình 1.19C).

Hình 1.19 Hình thái giải phẩu mẫu nấm DL0075 [4] A – Bào tử đính; B – Vách ngăn trên hệ sợi; C – Hệ sợi

Mẫu nấm DL0077 được phát hiện trên lá khô trong môi trường ẩm ướt của rừng cây lá rộng tại độ cao 1650m ở núi Langbiang, Lâm Đồng Nấm có hình dạng bó dài, mảnh và thuôn nhọn ở đỉnh, màu nâu và có hình lông xù xung quanh quả thể Quan sát dưới kính hiển vi cho thấy cấu trúc sinh bào tử ở dạng thể bình, với mỗi vị trí hình thành một thể bình có phần cơ bảng phồng lên và thuôn nhọn ở đỉnh Bào tử vô tính xuất hiện dưới dạng chuỗi, với hình dạng hình trụ dài, trong khi nhánh thứ cấp của hệ sợi được hình thành dưới góc.

Hình 1.20 Hình thái giải phẫu của nấm DL0077 [4] A – Mẫu nấm DL0077; B và

C – Bào tử vô tính; D và F – Hệ sợi được nuôi cấy trên lame và cấu trúc sinh bào tử ở dạng thể bình; E – Nhánh thứ cấp của hệ sợi

Vật liệu

Bộ 27 trình tự ITS1-5,8S-ITS2 của nấm Cordyceps đã được chỉnh sửa và cung cấp bởi TS Đinh Minh Hiệp từ Khu Nông Nghiệp Công Nghệ Cao và TS Trương Bình Nguyên từ Trường Đại Học Đà Lạt nhằm xây dựng cấu trúc bậc hai cho vùng gen này.

Bộ mẫu nấm bao gồm hệ sợi nấm của 10 mẫu nấm ký sinh côn trùng được thu thập từ bộ sưu tập của TS Trương Bình Nguyên và TS Đinh Minh Hiệp Hệ sợi này đã được nuôi cấy trên môi trường PGA và được ký hiệu theo Bảng 2.1.

Bảng 2.1 Danh sách bộ mẫu sử dụng trong đề tài Mẫu Ký hiệu Định danh hình thái

Dụng cụ, thiết bị, hóa chất, phần mềm sử dụng

Dụng cụ, thiết bị

- Đầu tip các loại (Watson)

- Bộ dụng cụ điện di DNA (Bio-Rad)

- Bộ dụng cụ đọc kết quả điện di DNA (Bio-Rad)

- Máy luân nhiệt (Bio-Rad)

- Máy đo OD (Bio-Rad)

Hóa chất

- Nước cất một lần và hai lần

Phần mềm

Phương pháp nghiên cứu

Khảo sát mồi

Trình tự chi tiết của 6 cặp mồi đặc hiệu cho các vùng gen tương ứng được thể hiện trong Bảng 2.2

Bảng 2.2 Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu

Gen Tên mồi Trình Tự (5’ – 3’) Chiều Tham

NS4 CTTCCGTCAATTCCTTTAAG R nrLSU LR0R GTACCCGCTGAACTTAAGC F [64]

The amplified genes include nrSSU (nuclear ribosomal small subunit), nrLSU (nuclear ribosomal large subunit), TEF1 (elongation factor 1α), RPB1 (largest subunit of RNA polymerase II), TUB (β-tubulin), and ATP6 (mitochondrial ATP synthase subunit).

Quá trình phân tích mồi được thực hiện theo quy trình trình bày trong Hình 2.1, tập trung vào việc phân tích các thông số vật lý và tính đặc hiệu của mồi.

Phân tích thông số vật lý của mồi được thực hiện qua 5 tiêu chí: độ dài mồi, nhiệt độ nóng chảy (Tm), tỷ lệ GC, cấu trúc kẹp tóc (hairpin) và cấu trúc tự bắt cặp (self-dimer) Đánh giá cặp mồi dựa trên hiệu số nhiệt độ nóng chảy và khả năng hình thành cấu trúc bắt cặp chéo (hetero-dimer) Dựa vào những phân tích này, các đề xuất về nhiệt độ bắt cặp (Ta) và thời gian kéo dài cho bước khuếch đại sẽ được đưa ra.

Về tính đặc hiệu, các mồi sẽ được đánh giá khả năng bắt cặp của mồi trên các họ Cordycipitaceae (mã taxon – taxid: 474943), họ Ophiocordycipitaceae (taxid:

474942) và họ Clavicipitaceae (taxid: 34397) Đối với các trình tự có chứa nucleotide

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát hiện 36 suy biến (trừ mã N) và inosine mà công cụ Primer-BLAST không thể nhận diện Do đó, các mồi thay thế với nucleotide được chuyển đổi về dạng A, T, G, C đã được sử dụng để đánh giá khả năng bắt cặp của mồi trên các loài quan tâm.

Hình 2.1 Tiến trình phân tích mồi dùng trong nghiên cứu

Dựa trên hướng dẫn của Integrated DNA Technologies (IDT, Hoa Kỳ) và nghiên cứu của Quyền Đình Thi và Nông Văn Hải (2008), các thông số vật lý của mồi đã được kiểm tra bằng phần mềm OligoAnalyzer 3.1, như được trình bày trong Bảng 2.3 [7], [86].

Bảng 2.3 Tiêu chí trong lựa chọn mồi sử dụng cho phản ứng PCR

Tiêu chí Tiêu chuẩn Độ dài mồi Từ 17 đến 30 Nu

Nhiệt độ nóng chảy Từ 55 đến 72 o C

Hiệu số nhiệt độ nóng chảy mồi ≤ 2 o C

Tỷ lệ GC Từ 35 đến 65% (tối ưu tại 50%)

Các cấu trúc thứ cấp:

- Cấu trúc tự-dimer hóa

- Cấu trúc dimer hóa chéo

Năng lượng tự do (ΔG) cần đạt giá trị lớn hơn hoặc bằng -9,0 kcal/mol để đảm bảo tính đặc hiệu của mồi Các mồi được sử dụng trong nghiên cứu này chỉ khuếch đại trình tự quan tâm mà không ảnh hưởng đến các trình tự khác.

Khảo sát quy trình tách chiết DNA

Quy trình tách chiết DNA từ hệ sợi được thực hiện qua ba phương pháp chính: phương pháp phenol/chloroform, phương pháp sử dụng proteinase K với SDS, và phương pháp sử dụng proteinase K với CTAB Cụ thể, 1 g hệ sợi nấm được thu thập bằng que cấy và cho vào ống 1,5 mL chứa 700 µL nước cất hoặc dung dịch phá mẫu, tùy thuộc vào phương pháp áp dụng.

Sử dụng 700 µL hỗn hợp PCI (Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol tỷ lệ 25:24:1) để tiến hành tách chiết DNA Đối với Phương pháp 2 và 3, bổ sung proteinase K với nồng độ 1 mg/mL và ủ ở 65 °C trong 3 giờ Sau đó, ly tâm mẫu ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong một phút để loại bỏ tủa Dung dịch thu được tiếp tục bổ sung 700 µL hỗn hợp PCI và thực hiện tách chiết DNA.

Bảng 2.4 Quy trình tách chiết DNA từ hệ sợi nấm

Phương pháp 1 Phương pháp 2 Phương pháp 3

Proteinase K CTAB Tách chiết DNA Phương pháp Phenol/Chloroform

Tủa DNA bằng isopropanol là một quy trình quan trọng trong phân tích sinh học phân tử Sau khi thêm hỗn hợp PCI, cần đảo đều ống để đảm bảo trộn lẫn hoàn toàn Tiếp theo, ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút ở nhiệt độ 4 độ C trong 10 phút Cuối cùng, thu dịch nổi phía trên vào ống mới và tiếp tục bổ sung các thành phần cần thiết.

Để tiến hành thí nghiệm, đầu tiên cho thể tích chloroform vào ống và đảo đều để trộn hỗn hợp Sau đó, ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút tại 4 độ C trong 10 phút Thu dịch nổi vào ống mới, bổ sung 1 thể tích isopropanol lạnh và 1/20 thể tích sodium acetate 3M, rồi đảo đều Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ -20 độ C trong ít nhất 2 giờ, tiếp theo ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút tại 4 độ C trong 20 phút Loại bỏ dịch nổi, bổ sung 1 mL ethanol 70 độ, và ly tâm tiếp tục ở tốc độ 13.000 vòng/phút tại 4 độ C trong 10 phút Cuối cùng, loại bỏ dịch nổi và để tủa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô hoàn toàn, sau đó hòa tan tủa trong 50 µL TE.

Ba mẫu nấm bất kỳ được lựa chọn để áp dụng trên 3 phương pháp tách chiết Tỷ lệ

Tỷ lệ OD260/OD280 được sử dụng để đánh giá chất lượng DNA thu nhận DNA trong dung dịch TE được pha loãng 50 lần trước khi đo độ hấp thụ Một mẫu DNA được coi là sạch khi tỷ lệ OD260/OD280 đạt yêu cầu.

38 nằm trong khoảng từ 1,8 đến 2,0 Phương pháp cho ra lượng DNA sạch nhất và nhiều nhất sẽ được sử dụng trong nghiên cứu.

Khảo sát suy trình PCR

Quá trình khuếch đại gen mục tiêu diễn ra trên máy luân nhiệt với các thông số cụ thể như được trình bày trong Hình 2.2 Mỗi phản ứng PCR bao gồm 7,5 µL master mix 2X, 1 µL mồi xuôi, 1 µL mồi ngược (nồng độ mồi: 10 mM), 4,5 µL nước cất và 1 µL khuôn DNA Nhiệt độ bắt cặp và thời gian kéo dài được xác định dựa trên kết quả khảo sát mồi.

Hình 2.2 Sơ đồ phản ứng PCR sử dụng trong đề tài

Kết quả phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1,5% với 1 µL mẫu cùng thang DNA để kiểm tra Các trình tự khuếch đại thành công sau đó được tinh sạch bằng phương pháp phenol/chloroform và gửi đi giải trình tự tại công ty Nam Khoa.

Các mẫu không hình thành sản phẩm sẽ được tối ưu hóa thông qua việc điều chỉnh nhiệt độ bắt cặp trong phản ứng Nhiệt độ bắt cặp trong phản ứng PCR sẽ được khảo sát lại bằng cách áp dụng gradient tăng dần nhiệt độ bắt cặp.

Phản ứng PCR được coi là thành công khi không xuất hiện kết quả dương tính giả và sản phẩm PCR được phát hiện tại vị trí của gen mục tiêu.

Giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự

Sản phẩm tại công ty Nam Khoa được giải trình tự theo hai chiều, với kết quả được hiệu chỉnh bằng phần mềm MEGA 5.2 Đầu tiên, mạch ngược được chuyển thành mạch xuôi và sắp gióng cột với mạch xuôi Các vùng tại hai đầu của mồi được lựa chọn dựa trên chất lượng của phổ đồ thu nhận được.

Trình tự sau khi được hiệu chỉnh sẽ được BLAST để xác định tính chính xác của quá trình PCR và ghi nhận loài tương đồng nhất trên Genbank.

Xây dựng cơ sở dữ liệu

Dựa trên các công bố về chi nấm Cordyceps Fr., đã xây dựng các cơ sở dữ liệu cục bộ cho từng gen Hơn nữa, các loài tương ứng nhất từ Genbank, dựa trên kết quả giải trình tự, cũng được tích hợp vào các cơ sở dữ liệu này.

Phần mềm SeaView 4.5.4 hỗ trợ việc sắp gióng cột cho các cơ sở dữ liệu cục bộ, giúp hiệu chỉnh và loại bỏ những vùng trình tự không rõ ràng trong quá trình xử lý.

Sau khi hoàn tất việc sắp gióng cột và hiệu chỉnh, các khối dữ liệu sẽ được kết hợp trên phần mềm MEGA 5.2, phục vụ cho nghiên cứu phát sinh phân tử.

Phân tích phát sinh phân tử

Phân tích các khối dữ liệu đơn gen và đa gen được thực hiện để tìm mô hình thay thế nucleotide tối ưu nhất bằng phần mềm MEGA 5.1 Các thông số phân tích bao gồm việc sử dụng cây định hướng tự động (Neighbor-Joining tree).

The statistical method employed is Maximum Likelihood, utilizing nucleotide data types To address gaps or missing data, all available sequences are used For protein-coding sequences, all codon positions are selected Additionally, a very strong branch swap filter is implemented.

Hình 2.3 Thông số cho phân tích dò tìm mô hình biến đổi nucleotide phù hợp nhất

Các cây phát sinh loài phân tử được xây dựng dựa trên kết quả của mô hình tiến hóa phù hợp nhất Phương pháp Neighbor-Joining, Maximum Parsimony và Maximum Likelihood được sử dụng để xây dựng cây phát sinh loài đơn gen và đa gen, với phép kiểm bootstrap 1000 lần Dữ liệu phân tích cho cây phát sinh loài đa gen bao gồm 4 gen (nrSSU, nrLSU, TEF1, RPB1) và 6 gen (nrSSU, nrLSU, TEF1).

Kết quả của phép kiểm bootstrap là căn cứ để đánh giá mức độ ủng hộ các nhánh trong cây phân loại Cụ thể, mức độ ủng hộ rất thấp được xác định khi giá trị dưới 50% Mức độ ủng hộ thấp nằm trong khoảng từ 50% đến 69% Mức độ ủng hộ trung bình được đánh giá từ 70% đến 89% Mức độ ủng hộ cao có giá trị từ 90% đến 95%, trong khi mức độ ủng hộ rất cao được xác định từ 96% đến 99% Cuối cùng, giá trị 100% biểu thị sự ủng hộ tuyệt đối về mặt thống kê.

Phương pháp dự đoán cấu trúc bậc hai vùng gen ITS1-5,8S-ITS2

Dự đoán cấu trúc bậc hai của vùng trình tự ITS2 được thực hiện bằng phần mềm MFOLD 3.1, với các thông số thiết lập như nồng độ ion Na+ là 0,05, ion Mg++ là 0,00 và nhiệt độ gấp cuộn DNA là 25 độ C.

Kết quả dự đoán cấu trúc bậc hai vùng gen ITS1-5,8S-ITS2

Khảo sát mồi

Xây dựng cây phát sinh phân tử

Tổng hợp kết quả phân tích các mẫu nấm T001 đến T010