Giám định bệnh virus chồi giống tạo cây in vitro sạch virus và khảo sát tính kháng virus của cây dứa cayenne bằng kỹ thuật công nghệ sinh học

BÁO CÁO NGHIỆM THU ðỀ TÀI GIÁM ðỊNH BỆNH VIRUS CHỒI GIỐNG, TẠO CÂY IN VITRO SẠCH VIRUS VÀ KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG VIRUS CỦA CÂY DỨA CAYENNE BẰNG KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Cơ quan quản

BÁO CÁO NGHIỆM THU ðỀ TÀI

GIÁM ðỊNH BỆNH VIRUS CHỒI GIỐNG,

TẠO CÂY IN VITRO SẠCH VIRUS VÀ KHẢO SÁT

TÍNH KHÁNG VIRUS CỦA CÂY DỨA CAYENNE BẰNG KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Cơ quan quản lý ñề tài: Sở Khoa học và Công Nghệ Tp HCM

Cơ quan chủ trì ñề tài: Trường ðại học Nông Lâm Tp HCM

Chủ nhiệm ñề tài: TS Trần Thị Dung

Tp Hồ Chí Minh

7 / 2007



Trang

Phần một: Mở ñầu 1

1.1 ðặt vấn ñề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

Phần hai: Tổng quan tài liệu 3

2.1 Giới thiệu nhóm dứa Cayenne 3

2.2 Bệnh héo virus trên dứa và môi giới truyền bệnh 4

2.3 Virus PMWaV-2 và HSP 70 protein 7

2.4 Các phương pháp tạo cây sạch virus 8

2.5 Các phương pháp giám ñịnh virus trên thực vật 13

2.5.1 Phương pháp kiểm tra dựa trên huyết thanh học 13

2.5.2 Phương pháp hiển vi quang học và vi ñiện tử 14

2.5.3 Phương pháp sinh học phân tử 14

2.6 Các kỹ thuật ñánh giá tính ña dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử 16

2.6.1 ða dạng di truyền và chỉ thị phân tử 16

2.6.2 Các phương pháp nghiên cứu tính ña dạng di truyền 18

2.6.3 Bulked segregant analysis 20

2.7 Các chiến lược nghiên cứu tính kháng bệnh trên thực vật 21

2.7.1 Tính kháng bệnh trên thực vật 21

2.7.2 Các chiến lược nghiên cứu tính kháng 22

2.8 Một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước 27

2.8.1 Nghiên cứu ngoài nước 27

2.8.2 Nghiên cứu trong nước 28

Phần ba: Nội dung, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 30

• Nội dung nghiên cứu 30

• Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 32

3.1 Nội dung 1: Giám ñịnh bệnh virus chồi giống dứa Cayenne 32

3.1.1 Xây dựng và hoàn thiện quy trình giám ñịnh PMWaV trên chồi dứa Cayenne 32

3.1.2 Thu thập và kiểm tra bệnh virus trên chồi giống dứa Cayenne 34

3.2.1 Tạo cây dứa Cayenne in vitro sạch virus bằng phương pháp nuôi

cấy ựỉnh sinh trưởng và xử lý nhiệt 35

3.2.2 Giám ựịnh PMWaV trên cây dứa Cayenne in vitro tái sinh từ ựỉnh sinh trưởng 39

3.3 Nội dung 3: đánh giá tắnh sạch virus của cây dứa Cayenne in vitro 39

3.3.1 Trồng cây dứa Cayenne in vitro trong vườn ươm 39

3.3.2 Kiểm tra tắnh sạch virus và mức ựộ biến dị của cây dứa Cayenne in vitro 40

3.4 Nội dung 4: Xác ựịnh marker liên kết tắnh kháng virus 40

3.4.1 đánh giá tắnh ựa dạng di truyền của cây dứa Cayenne bằng kỹ thuật RAPD 40

3.4.2 Phát hiện marker liên kết tắnh kháng 42

3.5 Nội dung 5: Xác ựịnh gene liên quan với tắnh kháng virus 43

Phần bốn: Kết quả và thảo luận 46

4.1 Nội dung 1: Giám ựịnh bệnh virus chồi giống dứa Cayenne 46

4.1.1 Xây dựng và hoàn thiện quy trình giám ựịnh PMWaV trên chồi dứa Cayenne 46

4.1.2 Thu thập và kiểm tra bệnh virus trên chồi giống dứa Cayenne 54

4.2 Nội dung 2: Tạo cây dứa Cayenne in vitro sạch virus bằng phương pháp nuôi cấy ựỉnh sinh trưởng và xử lý nhiệt 55

4.2.1 Khảo sát khả năng tái sinh của đST nuôi cấy trên môi trường MS 55

4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của giống và quá trình xử lắ nhiệt lên sự sinh trưởng của cây tái sinh từ đST 57

4.2.3 Giám ựịnh PMWaV trên cây dứa Cayenne in vitro tái sinh từ đST 59

4.3 Nội dung 3: đánh giá tắnh sạch virus của cây dứa Cayenne in vitro 64

4.3.1 Trồng cây dứa Cayenne in vitro ngoài vườn ươm 64

4.3.2 Kiểm tra tắnh sạch virus các chồi dứa in vitro ngoài vườn ươm 66

4.3.3 Khảo sát mức ựộ biến dị của cây dứa Cayenne in vitro ngoài ựồng ruộng 67

4.4 Nội dung 4: Xác ựịnh marker liên kết tắnh kháng virus 69

4.4.1 đánh giá tắnh ựa dạng di truyền của cây dứa Cayenne bằng kỹ thuật

4.4.2 Kết quả chủng bệnh 77

4.4.3 Xác ñịnh chỉ thị RAPD liên quan kiểu hình không biểu hiện bệnh wilt81 4.5 Nội dung 5: Xác ñịnh gene liên quan với tính kháng virus 83

4.5.1 Kết quả tối ưu PCR thoái hoá 83

4.5.2 Reamplify sản phẩm PCR 89

4.5.3 Kết quả PCR trên các loại mô khác nhau 90

Phần năm: Kết luận và ñề nghị 92

Tài liệu tham khảo 94 Phụ lục

PHẦN 1

MỞ đẦU 1.1 đặt vấn ựề

Dứa là một trong những loại cây ăn quả ựược ưa chuộng trên thị trường thế giới bởi hương vị ựặc trưng và giàu chất dinh dưỡng; ngoài ra enzyme bromelin chiết xuất từ dứa có nhiều ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, thuộc da và nhiều ngành khác

Riêng ở Việt Nam, cây dứa có ưu thế về tắnh chống chịu với ngoại cảnh như: không kén ựất, có thể trồng trên những vùng ựất phèn hay vùng ựất không thể canh tác cây rau quả nào khác Từ những ựiều kiện thuận lợi trên, trong 5 năm qua dứa Cayenne với ựặc ựiểm ựạt tiêu chuẩn về năng suất, chất lượng cũng như các yêu cầu cần thiết khác cho chế biến ựồ hộp ựã ựược ưu tiên phát triển Bộ Nông nghiệp xác ựịnh tập trung cho việc phát triển vùng nguyên liệu dứa Sở Nông nghiệp các tỉnh ựã thực hiện qui hoạch phát triển dứa và rà soát lại vùng nguyên liệu phục vụ các nhà máy chế biến Sở Nông Nghiệp Tp HCM ựã thực hiện chương trình giống cây trồng chất lượng cao trong ựó có cây dứa Cayenne Ngoài ra, các tỉnh thuộc vùng đông Nam bộ (đồng Nai, Bình Dương), Tây Nguyên (Gia Lai) và miền Trung cũng dự kiến qui hoạch vùng nguyên liệu quả các loại gắn với xây dựng nhà máy chế biến các sản phẩm quả ựạt tiêu chuẩn xuất khẩu, chủ lực là cây dứa

Tuy nhiên, theo kết quả ựiều tra hầu hết các ruộng dứa tại Tp HCM, Long An,

Tiền Giang, Lâm đồng ựều xuất hiện những bệnh như: bệnh héo ựỏ ựầu lá (bệnh wilt), thối trái, thối nõn làm ảnh hưởng nghiêm trọng ựến năng suất và chất lượng dứa, gây thiệt hại về mặt kinh tế Một trong những nguyên nhân lây lan bệnh hại là nguồn chồi giống ban ựầu không sạch các mầm bệnh, quan trọng nhất là virus gây bệnh ựỏ ựầu lá

PMWaV (Pineapple mealybug wilt Ờ associated virus) chiếm tỉ lệ cao và gây thiệt hại

nặng nề, ựặc biệt là thời gian ủ bệnh dài (khoảng 6 tháng) vì thế nhiều khi không thể nhận biết ựược cây giống nào ựã bị nhiễm bệnh và hiện nay không có loại hóa chất nào diệt trừ virus hiệu quả Giống dứa Cayenne nhập nội mẫn cảm với bệnh ựỏ ựầu lá hơn dứa Queen; giống nhập từ Thái Lan, Trung Quốc có mức ựộ nhiễm cao và lây lan nhanh hơn giống của Việt Nam (Lâm đồng) Việc trồng nhầm những cây giống mang PMWaV gây hao tổn về thời gian, tiền bạc và công sức của người nông dân

ðể cây dứa Cayenne ngày càng mở rộng và chuyên canh hơn nhằm ñáp ứng nhu cầu quả tươi và nguyên liệu phục vụ cho việc chế biến ñồ hộp xuất khẩu, việc xác ñịnh cây giống sạch PMWaV có ý nghĩa rất lớn về mặt kinh tế và là một vấn ñề cấp thiết hiện nay ðồng thời, cần phải có cây giống sạch bệnh ñảm bảo chất lượng ñể cung cấp cho các khu vực trồng dứa Với ñề tài “Giám ñịnh bệnh virus chồi giống, tạo

cây in vitro sạch virus và khảo sát tính kháng virus của cây dứa Cayenne bằng kỹ thuật

công nghệ sinh học” chúng tôi hi vọng góp phần tạo ñược nguồn giống dứa Cayenne sạch bệnh nhằm bảo vệ năng suất và phẩm chất cây dứa, mang lại hiệu quả kinh tế cao

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Thiết lập qui trình phát hiện virus gây bệnh héo ñỏ ñầu lá PMWaV – 1 và PMWaV – 2 trên dứa Cayenne và thực hiện giám ñịnh chồi giống cho 3 loại dứa Cayenne Lâm ðồng, Thái Lan, Trung Quốc

- Tạo các chồi dứa Cayenne sạch virus thông qua xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy

ñỉnh sinh trưởng và kiểm tra virus PMWaV – 1 và PMWaV – 2 ở chồi dứa in vitro

bằng kỹ thuật RT-PCR

- Xây dựng quy trình ñánh giá tính ña dạng di truyền của cây dứa Cayenne và xác ñịnh marker liên kết tính kháng virus PMWaV – 1 và PMWaV – 2 bằng kỹ thuật RAPD ðồng thời xây dựng phương pháp xác ñịnh gene liên quan ñến tính kháng bằng

kỹ thuật PCR với primer thoái hóa

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu nhóm dứa Cayenne

Dứa có tên khoa học là Ananas comosus (L.) Merr thuộc:

ðặc ñiểm của nhóm dứa Cayenne là lá dài, không có gai hoặc có một ít ở ñầu chóp lá, dày, lòng máng lá sâu, có nhiều phấn ở mặt dưới nhất là ở phía gốc Hoa có màu xanh nhạt, hơi ñỏ Quả có dạng hình trụ, mắt rất nông, quả nặng bình quân 1,5 – 2,0 kg rất phù hợp cho việc chế biến làm ñồ hộp Khi chưa chín quả màu xanh ñen, sau

ñó chuyển dần và ñến lúc chín quả có màu ñỏ hơi pha da ñồng Cây ñẻ yếu, trung bình chỉ cho 1 – 2 chồi một gốc trong một năm Trong ñiều kiện chăm sóc kém có thể không có chồi cuống

Quả dứa Cayenne chứa nhiều nước và vỏ mỏng nên rất dễ thối khi vận chuyển

Vì thế việc chọn vùng, ñịa ñiểm trồng và qui hoạch ñồng ruộng phải quan tâm ñến ñặc ñiểm này

Giống Cayenne du nhập vào nước ta cuối những năm ba mươi, ñầu những năm bốn mươi ở một số ñịa phương miền Bắc chủ yếu trong những ñồn ñiền do người Pháp quản lí Chân Mộng (thuộc Vĩnh Phú) là một trong những nơi tiếp nhận giống ñầu tiên,

về sau người ta quen gọi là Cayenne Chân Mộng

Các giống Cayenne ñược trồng phổ biến hiện nay là giống Cayenne Thái Lan, Cayenne Trung Quốc và Cayenne Lâm ðồng Theo tài liệu của Viện cây ăn quả miền

Nam, giống Cayenne Thái Lan và Trung Quốc ñều cho trái to và phát triển tốt; tuy nhiên là giống mới nhập nội nên cần có thời gian ñể kết luận Giống Cayenne Lâm ðồng ñã phát triển lâu ñời ở Việt Nam, chống chịu bệnh wilt và phẩm chất tốt nên phát triển trong giai ñoạn hiện nay

Với ưu ñiểm năng suất cao, quả to và mang nhiều ñặc ñiểm phù hợp với công nghệ chế biến ñồ hộp, giống Cayenne ñược chú ý phổ biến ra diện rộng Các vùng trồng dứa nguyên liệu ñược hình thành nhằm cung cấp nguyên liệu cho các nhà máy chế biến dứa

2.2 Bệnh héo virus trên dứa và môi giới truyền bệnh

Theo Sether et al (1998), bệnh héo do virus (Mealybug wilt of pineapple- MWP) gây thiệt hại ở nhiều khu vực trồng dứa trên thế giới Bệnh biểu hiện ñầu tiên trên các lá già nhất, sau ñó ñến các lá già và lá bên trên; các lá ñỏ dần lên, vỏ lụa bung

ra, lá kém trương nước, mép lá và ñầu lá bị héo, hóa nâu và khô dần Tùy theo giống

từ khi cây bị nhiễm bệnh tới khi biểu hiện triệu chứng mất từ 2 tuần ñến 6 tháng Nhiều cây con bị nhiễm trong vườn ươm không có dấu hiệu bệnh, sau một thời gian trồng mới biểu hiện Bệnh trở nên nặng hơn khi cây ra hoa, nuôi quả và ở các mùa gốc

Hình 2.1: Cây dứa và quả dứa Cayenne bị nhiễm bệnh ñỏ ñầu lá do virus PMWaV

Bệnh héo thường trải qua 4 giai ñoạn phát triển:

• Xâm nhiễm (biểu hiện bệnh là chót lá có màu ñỏ)

• Lây lan (gây biến màu lá, lá chuyển từ ñỏ sang hồng, mép phiến lá uốn cong về phía mặt dưới)

• Héo lá (các lá bị bệnh héo khô dần, lá ở nõn vẫn mọc bình thường )

• Gây chết cây

Hậu quả của bệnh wilt là quả bị nhỏ, chua, khô, mắt lộ rõ, không có giá trị thương phẩm

Nguyên nhân gây bệnh

Các nghiên cứu ñã chứng minh rằng một yếu tố tiềm tàng liên quan ñến bệnh là virus Một dạng closterovirus hình que gấp khúc ñược phân lập từ những cây có triệu chứng MWP ở Hawaii Tuy nhiên sau ñó những tiểu phần closterovirus cũng ñược tìm thấy ở cả cây dứa có và không có thể hiện triệu chứng trên phạm vi thế giới Virus liên quan ñến bệnh héo ở dứa (PMWaV) thực chất là phức hợp của 2 loại virus PMWaV-1

và PMWaV-2 Dựa vào các ñặc ñiểm về di truyền, hai loại virus này ñược xếp vào họ

Closterovirus, loài Ampelovirus, giống Vinivirus Các phân tích về phát sinh loài ở

trình tự gene cho thấy PMWaV-1 và PMWaV-2 có ñộ tương ñồng trung bình 50% PMWaV-2 liên quan rất mật thiết với virus gây bệnh cuốn lá ở nho (GLRaV-3) có ñộ tương ñồng từ 64% - 72% thông qua 4 khung ñọc (open reading frame-ORF)

Tác nhân lây truyền bệnh

PMWaV-1 và PMWaV-2 ñược truyền bởi 2 loài rệp sáp: Dysmicoccus brevipes (rệp màu hồng) và D neobrevipes (rệp màu xám) Rệp sáp có kích thước khoảng 2 – 3

mm, mình phủ một lớp sáp ñể tự vệ Rệp sáp bám vào các lá non, vào gốc là già, vào mắt quả, vào rễ cây ñể hút dịch cây Rệp thực chất không chứa virus; chúng sống trên cây dứa nhiễm PMWaV và thu ñược virus Rệp tiếp thu và truyền virus trong suốt quá trình dinh dưỡng Không có kí chủ khác của virus ñược tìm thấy ngoài cây dứa mặc dù nhiều loài cỏ cũng là kí chủ của hai loài rệp này ðiều ñó cho thấy cây dứa nhiễm PMWaV là nguồn chứa virus duy nhất cho rệp truyền sang các cây khác

Kiến thường xuất hiện ñồng thời với rệp tạo ñiều kiện thuận lợi cho rệp phát triển Với sự che chở của kiến cùng chu kì sinh sản ngắn từ 35 – 45 ngày, rệp mắn ñẻ

và phát triển rất nhanh Hiện tượng cộng sinh giữa rệp và kiến làm phát triển sự lây lan bệnh Kiến sử dụng mật do rệp tiết ra, dùng ñất và rác hữu cơ xây dựng thành nơi ẩn náu xung quanh ñàn rệp ñể che chở cho chúng khỏi mưa nắng và tạo nên một tiểu khí hậu thích hợp cho rệp sinh sản Người ta phát hiện ra ba loại kiến trên những vùng

trồng dứa ở Hawaii gồm: kiến ñầu to Pheidole megacephala Fabricius, kiến Argenetina Iridomyrmex humilis Mayr (Fluker and Beardsley) và kiến lửa Solenopsis

geminata Fabricius (Rohrbach, K.G et al., 1998)

Hình 2.6: Kiến Argenetina Iridomyrmex humilis Mayr,

Kiến lửa Solenopsis geminata Fabricius và Kiến ñầu to Pheidole megacephala

Fabricius

2.3 PMWaV và gene HSP 70

2.3.1 PMWaV

PMWaV thuộc họ Closterovirus, loài Ampelovirus, giống Vinivirus

Closterovirus có mã di truyền là những sợi RNA ñơn (Bar-Joseph and Hull, 1974) Chúng có khoảng trên 30 loài kí sinh trên thực vật với bộ gene ñơn bội hoặc lưỡng bội (Karasev, 2000) Những nghiên cứu về phát sinh loài dựa trên phân tích về

sự sao mã, dịch mã và biểu hiện của protein cho thấy tính chuyên biệt của RNA phụ

thuộc vào RNA polymerase và heat shock protein HSP 70 (Koonin, 1991; Koonin and

Dolja, 1993) Môi giới truyền bệnh của Closterovirus là rệp vừng (aphids), rệp sáp

(mealybugs) và rầy trắng (whiteflies) (Agranovsky, 1996; Dolja et al., 1994; Karasev,

2000) Họ Closteroviridae gồm 2 giống: Closterovirus ñược phát triển từ những virus

có bộ gene ñơn bội và Crinivirus hình thành từ những virus có bộ gene lưỡng bội

(Agranovsky, 1996; Dolja et al., 1994) Hệ thống phân loại này dựa trên số lượng của các sợi DNA mà không quan tâm ñến vector truyền bệnh Một hệ thống phân loại khác

dựa trên vector truyền bệnh thì Closterovirus có vector truyền bệnh là rệp vừng, rầy trắng là vector truyền bệnh của Crinivirus, và rệp sáp là vector truyền bệnh của

Ampelovirus.

MWP (Mealybug Wilt of Pineapple) là tác nhân bệnh chính trên dứa ðây là những virus hình gậy (kích thước 12x1200 nm), phân tử lượng của cả sợi ñôi RNA là 8.35*106 Da dsRNA chỉ tìm thấy ở những mô cây bị nhiễm MWP, không tìm thấy ở những cây khoẻ mạnh Dựa vào hình thái học, nucleic acid và protein ñặc trưng, người ta xếp chúng vào họ Closterovirus Vector truyền bệnh virus này là rệp sáp hồng

và xám Ở Hawaii, người ta phát hiện thấy có ít nhất 2 kiểu serotype của PMWaV Những nghiên cứu về phân tử và hoá sinh của PMWaV ñã xác ñịnh vị trí tiến hoá của chúng có quan hệ thân thuộc với MWP

2.3.2 Gene HSP70 của PMWaV

• Vị trí gene hsp-70 trong bộ gene

Gene hsp-70 mã hóa cho enzyme HSP-70 thuộc OFR2 trong tổ chức genomes

(gồm có 9 ORF nằm trong 2 RNA là RNA1 và RNA2) và gene này thuộc RNA2 của

họ Closteroviridae ðây là gene có tính bảo tồn cao ở nhiều loài, ñặc biệt với nhóm

Closterovirus, ñã có rất nhiều nghiên cứu dựa vào gene này ñể xây dựng cây phân loài ðây là vùng gene chính cho các thí nghiệm khuếch ñại gene ñể phát hiện PMWaV và

cũng dựa vào HSP 70 mà PMWaV ñược phân ra thành 2 loài: 1 và

PMWaV-2 (Sether D.M et al., PMWaV-2001)

• Chức năng

Protein HSP-70 có trọng lượng phân tử 70 kD ñược mã hóa từ gene hsp-70 có

vai trò quan trọng trong quá trình tồn tại của sinh vật trong môi trường có sự thay ñổi ñột ngột về nhiệt ñộ, giúp tái ñóng xoắn các protein bị biến tính vì nhiệt, giúp sinh vật

có thể tồn tại ñược ở những ñiều kiện khắc nghiệt bất thường Cũng chính vì thế mà

chúng ñược ñặt tên là heat shock protein Ngoài ra, protein HSP-70 còn tham gia vào

một số quá trình ñiều hòa quan trọng khác như: giúp sự hình thành cấu trúc protein,

vận chuyển protein xuyên qua các màng tế bào và riêng ở Closterovirus, HSP 70 là

một thành phần của protein vỏ trong quá trình tạo virion của virus (Dolja V.V et al., 1999)

Do gene hsp-70 mã hoá protein HSP70 là gene bảo tồn trong họ nên ñược lựa chọn thực hiện phản ứng RT-PCR ñể xác ñịnh PMWaV thuộc họ Closteroviridae

2.4 Phương pháp tạo cây sạch virus

“Sạch virus” có nghĩa là không có sự hiện diện của loài virus ñã ñược xác ñịnh thông qua các thí nghiệm kiểm tra (Quak, 1966) Mô phân sinh là mô sạch virus nhất

Mô phân sinh gồm các tế bào chưa phân hóa, có hoạt ñộng phân chia tế bào mạnh DNA polymerase có trong quá trình phân chia tế bào này sẽ ức chế sự nhân lên của virus Virus sẽ không theo kịp sự tăng trưởng của ðST và không thể di chuyển ñến các

tế bào ở ðST Nhiệt ñộ cao cũng có thể làm virus bất hoạt và chết Do ñó, trong qui trình tạo cây sạch virus phương pháp xử lí nhiệt và nuôi cấy ðST ñược áp dụng

Sự nhiễm bệnh do virus, mycoplasma, vi khuẩn và nấm rất khó loại trừ Hầu như không thể tiêu diệt các tác nhân gây bệnh kí sinh trên cây bằng hóa chất, ñặc biệt

là virus

Theo Pierik (1987) có 5 phương pháp tạo cây sạch virus:

• Xử lí nhiệt (heat treatment)

• Nuôi cấy ðST (meristem culture)

• Xử lí nhiệt sau ñó nuôi cấy ðST

• Tạo chồi ngẫu nhiên kết hợp nuôi cấy ðST

• Ghép ðST lên cây sạch virus (micrografting)

Khi nghi ngờ cây bị nhiễm virus cần thực hiện các bước sau (Quak, 1977):

• Xác ñịnh virus

• Thực hiện các biện pháp loại trừ virus

• Tiến hành thí nghiệm xác ñịnh cây nghi ngờ có nhiễm virus hay không

• Ngăn chặn bất kì sự tái nhiễm nào

ñến nhiệt ñộ và thời gian xử lí, ñảm bảo cây (chồi, cành) sống sót trong khi virus bị bất hoạt

Phương pháp này ñã ñược áp dụng và mang lại kết quả tốt chống lại virus và mycoplasma hiệu quả ở cây ăn quả, cây mía, sắn dây và cây khoai mì (Morel, 1964; Quak, 1966, 1977; Kartha and Gamborg, 1975) Phương pháp này rất thuận tiện ñối với cây ăn quả vì nuôi cấy ðST khó áp dụng cho ñối tượng này

Ở cây thân gỗ, chỉ xử lí nhiệt chồi bên rồi ghép với cây con (cây từ hạt ñược vô mẫu) Thường thời gian xử lí nhiệt dao ñộng từ 20 – 40 ngày hay vài tháng với nhiệt

ñộ cố ñịnh hay thay ñổi từ 37 – 380

C Với phương pháp này có thể thu ñược cây sạch bệnh với một tỉ lệ cao (Fridlund, 1980)

2.4.2 Nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng

ðỉnh sinh trưởng (ðST)

Mô phân sinh ngọn chứa những tế bào ðST, ñược bao bọc bởi một lớp vỏ cutin

ñể hạn chế tối ña sự mất nước Lớp cutin này bao bọc luôn cả chồi ngọn

Ở thực vật, sự hình thành mới cơ quan bắt ñầu từ trong các mô phân sinh ngọn, các mô này ñược phân hóa ngay từ những giai ñoạn phát triển ñầu tiên của phôi do sự phân hóa của các tế bào sơ khởi Tất cả các tế bào còn lại ñều xuất phát từ tế bào sơ khởi

Vì mô phân sinh có kích thước tương ñối ổn ñịnh nên các tế bào sinh ra từ tế bào sơ khởi qua vài lần phân chia sẽ tách rời khỏi mô phân sinh Quá trình sinh trưởng của ñỉnh sinh trưởng ñược chia thành 3 giai ñoạn:

-Giai ñoạn thứ nhất thường ñược gọi là giai ñoạn khởi sinh, trong các ñiểm sinh trưởng (trong các mô phân sinh ngọn) xảy ra sự hình thành mầm cơ quan và sự phân chia ñầu tiên của nó thành các mô riêng biệt

-Giai ñoạn thứ hai là giai ñoạn kéo dài do sự tăng trưởng nhanh chóng, mầm cơ quan ñạt ñến kích thước tối ña và trở nên có hình dạng nhất ñịnh

-Giai ñoạn thứ ba, kết thúc sự phân hóa tế bào, bắt ñầu dẫn ñến sự hóa gỗ các thành tế bào, và kết quả là mô không còn khả năng sinh trưởng.Trước hết các u lồi dần dần ñược tạo thành và ñược gọi là những u lá Thể tích và chiều dài của u lá tăng rất nhanh kéo theo phần lớn của ðST U lồi chuyển dần thành phác thể lá (thể nguyên thủy của lá) và phác thể lá phát triển nhanh về chiều dài Sau khi lá ñược tách ra, sự

phân chia tế bào sẽ ñược lặp lại Kết quả là ðST ñược khôi phục nhanh chóng và sự hình thành lá mới lại bắt ñầu

Ở mỗi nách lá ñều có chồi nách (chồi bên) Chồi bên thực chất có cấu tạo không khác ðST thân Do hiện tượng ưu thế ngọn, chồi bên không phát triển, nhưng khi thoát khỏi sự áp chế của chồi ngọn thì chúng bắt ñầu tăng trưởng và có lá ñầy ñủ như thân chính

Nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng

White (1943) cho rằng virus khảm thuốc lá (TMV) có mặt trong các phần khác nhau trên rễ cây thuốc lá, mật ñộ virus giảm dần khi ñến chóp rễ, và ngay ở chóp rễ hoàn toàn không có virus Limasset và Cornuet (1949) cho rằng có một khuynh ñộ về mật ñộ virus trong chồi ngọn cây thuốc lá và ở mô phân sinh thì hoàn toàn sạch virus Các nghiên cứu cho rằng ðST ngọn và chóp rễ không mang virus Tuy nhiên ở một số loài thực vật virus cũng hiện diện trong ðST của cây (Pierik, 1987) Theo Quak (1966)

ở ðST có sự canh tranh giữa sự sinh sản của virus và sự phân chia của tế bào mô phân sinh (Pierik, 1987) Trong quá trình phân chia của tế bào, quá trình sinh tổng hợp acid nucleic ñược tăng cường do ñó gây bất lợi cho sự tăng sinh của virus Lúc này các tế bào phía dưới ðST chủ yếu gia tăng kích thước do ñó virus có thể sản sinh ñược Quak (1966) còn cho rằng trong ðST không có sự hiện diện của bó mạch và cầu liên bào nên gây trở ngại cho sự chuyển ñộng của virus Có nhiều giả thuyết về yếu tố gây trở ngại cho sự xâm nhập của virus vào ðST như nồng ñộ auxin và cytokinin, enzym cần thiết cho sự tăng sinh của virus…nhưng các giả thuyết trên chưa ñược chứng minh

Morel và Martin (1952) ñã ñưa ra sáng kiến cô lập ðST cây thược dược bị

nhiễm virus ñưa vào nuôi cấy in vitro và thu ñược cây sạch bệnh Họ cũng là những

người ñầu tiên tạo ñược cây thược dược và khoai tây sạch bệnh bằng cách nuôi cấy ðST Sau ñó, phương pháp này ñược áp dụng với những cây trồng quan trọng như khoai tây, Trifolium, mía … và những cây thân gỗ

Khi nuôi cấy ðST nên chọn những cây ñang tăng trưởng ñể thu ðST Nếu ðST

cô lập ñang ở trong trạng thái hoạt ñộng (gồm vùng mô phân sinh và cả phần dưới ngọn) thì cơ hội loại trừ virus sẽ lớn hơn

Nên tách lấy vòm mô phân sinh (meristematic dome) và 1 cặp lá ñầu tiên Nếu lấy ñoạn lớn hơn sẽ tạo ñiều kiện truyền virus Kích thước của mô phân sinh và lá từ 0,1 – 0,5 mm Vòm ñỉnh (apical dome) có kích thước từ 0,1 – 0,25 mm phụ thuộc vào

loài và sự cân bằng về kích thước ðST phải ñủ nhỏ ñể ñảm bảo sạch virus và các tác nhân gây bệnh khác ñồng thời ñủ lớn ñể có thể phát triển thành chồi Mặc dù rễ có thể hình thành trực tiếp từ chồi trong cùng môi trường, nhưng thường chồi phải ñược chuyển sang môi trường tạo rễ ñể phát triển

Tỉ lệ cây sạch virus thu ñược phụ thuộc vào nhiều yếu tố như vật liệu khởi ñầu như ðST của chồi ngọn hay chồi bên (Styer and Chin, 1983), thời gian thu mẫu trong năm (Van Os, 1964), thành phần môi trường, nhiệt ñộ nuôi cấy, nhiệt ñộ xử lí…

Tỉ lệ cây sạch bệnh thu ñược bằng phương pháp nuôi cấy ðST thường rất nhỏ Nguyên nhân là do mẫu bị nhiễm, bị hư hại, bị khô nước và bị hóa nâu, môi trường nuôi cấy không phù hợp; có khi ðST không tăng trưởng do ñang ở trong trạng thái hưu miên Trong trường hợp thu ñược cây hoàn chỉnh từ nuôi cấy ðST thì cần kiểm tra xem cây có thực sự sạch virus không Nếu cây sạch virus thì sẽ ñược sử dụng làm cây mẹ ñể nhân giống vô tính, tạo ra nhiều cây sạch virus

2.4.3 Xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ðST

ðể làm tăng cơ hội thu ñược cây sạch bệnh trong những trường hợp khó khăn (cây bị nhiễm bởi nhiều loại virus) thì nên xử lí nhiệt trước khi thu ðST ñể nuôi cấy nhằm làm giảm số lượng virus hoặc làm tăng diện tích vùng không bị nhiễm virus Thời gian xử lí nhiệt thay ñổi từ 5 – 10 tuần với nhiệt ñộ 35 – 380C (Quak, 1977) Phương pháp trên ñã ñược sử dụng thành công với khoai tây, cúc, cẩm chướng và dâu tây Theo Morel (1964), khi giữ củ khoai tây ở nhiệt ñộ 37 – 380C trong một tháng trước khi tiến hành nuôi cấy ðST thì sẽ thu ñược cây sạch bệnh

Xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ðST có thể loại bỏ virus, vi khuẩn, và nấm nhưng không loại bỏ ñược viroid Khác với virus, viroid là RNA không có vỏ protein – chúng

là RNA trần và rất khó loại bỏ

2.4.4 Tạo chồi bất ñịnh kết hợp nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng

Brierley (1962) mô tả sự tạo căn hành bất ñịnh in vitro từ vảy của Lilium

longiflorum Hildebrant (1971) cũng có những kết luận tương tự trên cây glaieul Phôi

soma hình thành từ mô phôi tâm Citrus khi tái sinh thường tạo ra những cây sạch bệnh

(Button and Bornman, 1971; Bitters et al., 1972)

Việc tạo cây sạch bệnh từ phương pháp tạo chồi bất ñịnh ñã ñược tiến hành thành công ở Lily (Allen, 1974; Asjes et al., 1974) và cây Dạ lan hương Trong thí nghiệm này, các mẫu cấy Lily bị nhiễm virus ñược kích thích ñể tạo thành củ bi bất

định in vitro; khi kích thước ðST của các chồi mọc từ củ tăng đến 1mm thì được

chuyển sang mơi trường nuơi cấy khác để ðST tiếp tục phát triển

Phương pháp tạo chồi bất định được thực hiện theo một hướng khác để thu

được cây sạch bệnh ở một số lồi như: Petunia, thuốc lá, bắp cải Ở những cây này,

trên lá cĩ những vùng đặc biệt khơng bị nhiễm virus trong khi tồn cây đã bị nhiễm Những vùng này được cơ lập và kích thích để tạo chồi bất định thì sẽ tạo được những cây sạch bệnh (Murakishi and Carlson, 1979)

2.4.5 Vi ghép

Nếu như khơng cảm ứng được sự tăng trưởng của ðST hoặc thu hút được chồi

từ nuơi cấy ðST thì cĩ thể ghép ðST vào cây con in vitro để nĩ cĩ thể tăng trưởng

Phương pháp vi ghép này rất cĩ ý nghĩa đối với những cây thân gỗ khơng thể tiến hành nuơi cấy ðST Phương pháp này lần đầu tiên được thực hiện bởi Morel và Martin trên đối tượng là cây thược dược vào năm 1952 Sau đĩ, vi ghép được thực hiện thành cơng

bởi Murashige et al (1972), Navaro et al (1975) trên cây Citrus và đã loại trừ được

hai loại virus Trong một số trường hợp (mơ ghép với nho) thì trước khi ghép, mẫu phải được xử lí nhiệt

2.5 Các phương pháp giám định virus trên thực vật

Các kỹ thuật chẩn đốn virus gây hại thực vật được phân thành các quá trình huyết thanh học, các quá trình liên quan nucleic acid và kết hợp cả hai quá trình Yêu cầu của các phương pháp chẩn đốn virus phải nhanh, nhạy và chính xác

2.5.1 Phương pháp kiểm tra dựa trên huyết thanh học

Cơ sở khoa học của phương pháp này chủ yếu dựa vào hoạt động hệ miễn dịch ở động vật: khi cĩ protein lạ (kháng nguyên) xâm nhập vào máu của cơ thể động vật, hệ thống bạch huyết sẽ sinh ra protein đặc hiệu (kháng thể) để chống lại protein lạ trên Phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể sẽ tạo kết tủa ðây là phản ứng tự vệ của động vật, làm cho kháng nguyên gây bệnh bất hoạt và cơ thể động vật được bảo vệ

Phương pháp ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)

Nguyên tắc phương pháp dựa trên khả năng gắn kết giữa kháng nguyên và kháng thể Sử dụng kháng thể phủ lên đĩa sau đĩ cho mẫu cần kiểm tra vào giếng (nhựa cây hay mẫu bệnh phẩm đã được ly trích) Nếu virus quan tâm cĩ trong mẫu kiểm tra, kháng nguyên của virus sẽ gắn vào kháng thể cố định Kháng thể thứ hai nhận biết kháng thể thứ nhất được thêm vào, cho phép phát hiện virus gián tiếp nhờ phân tử tín

hiệu (reporter molecule), thường là do một enzyme tác động lên cơ chất đổi màu Sự đổi màu cơ chất được đánh giá bằng quang phổ

Phương pháp này cĩ thể được sử dụng để kiểm tra một loại virus trên nhiều cây, mỗi giếng một mẫu cây Cĩ thể kiểm tra đồng thời nhiều virus trong 1 đĩa đơn với các kháng thể khác nhau phủ ở mỗi giếng với 2 hoặc 3 lần lặp lại

Ưu điểm: độ chính xác cao, đơn giản và giá thành thấp

Hạn chế: địi hỏi huyết thanh kháng thể đơn dịng hay đa dịng đặc hiệu với virus và khơng phản ứng chéo protein thực vật

Một hình thức khác của ELISA gọi là Thí nghiệm đo điện thế miễn dịch

enzyme (Voltametric enzyme immunoassay) Phương pháp nhằm mục đích phát hiện

sự thay đổi độ dẫn điện của cơ chất khi enzyme gắn vào kháng thể thứ hai Phương

pháp này nhạy hơn ELISA, được sử dụng để phát hiện virus khảm dưa leo (Cucumber

mosaic virus)

Phương pháp TBIA (Tissue blot immunoassay)

Giống ELISA, phương pháp này sử dụng kháng thể kháng virus Nhựa từ mơ thực vật được chuyển lên giấy thấm, màng nylon hay nitrocellulose và virus được phát hiện nhờ các probe đã đánh dấu thường là các chất phát quang Quá trình này ít thao tác hơn so với ELISA, nhanh hơn, nhạy hơn, đơn giản (khơng địi hỏi tách chiết virus)

và rẻ tiền hơn (cần rất ít thiết bị), thích hợp khi cần kiểm tra 1000 – 2000 mẫu mỗi ngày

Bên cạnh các kỹ thuật hiện đại, các phương pháp quan sát phản ứng huyết thanh như: quan sát kết tủa của phản ứng dưới kính hiển vi cĩ tụ quang đen, phản ứng khuếch tán gel… cũng được sử dụng để chẩn đốn virus

2.5.2 Phương pháp hiển vi quang học và vi điện tử

Quan sát bằng kính hiển vi quang học

Trong quá trình kí sinh, virus thực vật thường cĩ khả năng tạo dạng kết tinh vơ định hình hoặc dạng đặc trưng do vơ số cá thể virus kết hợp lại với nhau Virus khảm thuốc lá thường tạo dạng kết tinh trong suốt ở mơ tế bào cây bệnh Tinh thể virus cĩ thể nhuộm màu và quan sát được trên kính hiển vi quang học thơng thường ở độ phĩng đại 80 lần

Quan sát bằng kính hiển vi điện tử

Nhờ kính hiển vi điện tử, sợi virus hay hạt virus cĩ thể được quan sát chính xác hình thái và cấu tạo Hình thái virus cĩ thể được mơ tả một cách chính xác ở độ phĩng đại hàng vạn lần Ngày nay, kính hiển vi điện tử tia xuyên được sử dụng như một cơng

cụ rất tích cực để tìm hiểu hình thái và cấu tạo của virus thực vật

2.5.3 Phương pháp chẩn đốn sinh học phân tử

Các kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên vật chất di truyền của virus (RNA/DNA)

và quá trình tái tổ hợp của chúng

Khi xâm nhập vào tế bào kí chủ, RNA virus được phĩng thích khỏi lớp vỏ protein Các enzyme cảm ứng tổng hợp RNA (RNA replicase, RNA synthetase) cùng với RNA virus (sợi +) đĩng vai trị là sợi khuơn mẫu giúp cho sự tổng hợp RNA virus (sợi - và sợi +) Với các loại virus cĩ RNA (sợi -) thì chúng buộc phải chuyển sang dạng mRNA (sợi +) Khi xâm nhiễm vào tế bào kí chủ, virus đã đưa RNA (sợi -) và enzyme vào tế bào Các virus cĩ RNA sợi kép thì quá trình hình thành RNA (sợi – và sợi +) được thực hiện nhờ RNA polymerase Với các virus chứa DNA thì sự tổng hợp vật chất di truyền được sự trợ giúp của enzyme từ tế bào kí chủ

Polymerase chain reaction (PCR) và Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)

PCR và RT-PCR là các kỹ thuật phổ biến để phát hiện và xác định RNA và DNA của virus thực vật Phương pháp này cực kì nhạy, khơng quá đắt tiền và địi hỏi

ít kỹ năng thực hiện Trong trường hợp RNA virus, một sợi cDNA bổ sung với RNA virus được tổng hợp với xúc tác reverse transcriptase (RT) Các primer được kéo dài bởi DNA polymerase bền nhiệt trong một chuỗi các bước biến tính và kéo dài, làm tăng DNA mục tiêu theo cấp số nhân Hiện nay cĩ 3 loại primer cơ bản được sử dụng

để khuếch đại RNA virus ðối với DNA virus thì bước RT khơng cần thiết

Cĩ nhiều dạng khác nhau phát triển trên kỹ thuật cơ bản nhằm tăng độ nhạy, thay đổi tính đặc hiệu hay cho phép tự động phát hiện Các dạng thường gặp: Multiplex RT-PCR, Fluorescence RT-PCR using TaqmanTM technology, Competitive flourescence PCR (CF-PCR), Immunocapture PCR (IC-PCR), Nested PCR

Restriction fragment length polymorphism – RFLP

RFLP được sử dụng kết hợp với PCR để xác định sự khác nhau giữa các virus dựa trên sự hiện diện của các vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn Sau khi khuếch

ựại PCR, các mẫu ựược phân cắt bởi enzym cắt giới hạn và các kắch thước của ựoạn phân cắt ựược phân tắch bằng ựiện di

RFLP là một phương pháp phân biệt các dòng virus không cần thực hiện cloning và sequencing Hiệu của quả phương pháp này phụ thuộc vào sự ựa hình trong phạm vi vị trắ nhận biết của enzyme cắt giới hạn

Probe ựánh dấu (Labelled probes)

Việc lai probe DNA hay RNA giúp cho việc phát hiện nucleic acid virus ở cả hai dạng, sợi ựơn và sợi ựôi cDNA probe có thể ựược gắn nhãn với các isotope hay probe không có chất phóng xạ cDNA probe thường ựược sử dụng ựể phát hiện RNA virus vì dạng lai giữa RNA/RNA bền vững hơn dạng lai DNA/RNA Dịch ly trắch RNA từ mô nhiễm ựược chuyển lên màng, cho lai với probe và phát hiện RNA virus

2.6 Các kỹ thuật ựánh giá tắnh ựa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử 2.6.1 đa dạng di truyền và chỉ thị phân tử

Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự bộ gene khác nhau Trình tự bộ gene của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau, do sự xuất hiện của một loại ựột biến nào ựó đôi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền Cụ thể là ựột biến xuất hiện tại vị trắ của một gene nào ựó trong bộ gene của một cá thể, làm cho gene ựó không biểu hiện hay biểu hiện khác ựi thành một tắnh trạng khác với những cá thể khác cùng giống Sự khác biệt về di truyền như vậy ựược gọi là tắnh ựa dạng di truyền

Sự khác nhau về di truyền của các cá thể trong cùng một giống (hay giữa các giống trong cùng một loài) có thể biểu hiện hay không biểu hiện thành những tắnh trạng bên ngoài Người ta thường tìm kiếm những dấu hiệu ựể nhận ra ựược sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể (hoặc giữa các giống), gọi là những chỉ thị (marker)

Chỉ thị hình thái

Gene thể hiện bản chất di truyền sẽ ựược liên kết với một tắnh trạng hình thái nào ựó mà người ta có thể phát hiện ựược Tuy nhiên nếu dựa vào những chỉ thị loại này ựể lập bản ựồ gene và chọn lọc sẽ mất thời gian, số lượng chỉ thị ắt do không phải tất cả những tắnh trạng kiểu hình nào cũng có thể nhận diện ựược, ựồng thời ựộ chắnh xác và ựộ tin cậy thấp

Chỉ thị isozyme

Isoenzyme hay isozyme là một nhóm enzyme xúc tác cùng một phản ứng, nhưng bị ức chế bởi những phân tử khác nhau do ñó có nhiều dạng và hiệu quả xúc tác khác nhau

Isozyme có bản chất protein và là chất ña ñiện ly, nên trong dung dịch nó ở trạng thái phân cực Dưới tác dụng của dòng ñiện một chiều, các phân tử protein khác nhau về kích thước, trọng lượng phân tử, lực tích ñiện… sẽ chuyển ñộng với tốc ñộ khác nhau và sẽ phân bố ở vị trí khác nhau trên gel sau khi ñiện di Các phân tử protein enzyme là do gene quy ñịnh Trong quá trình tiến hoá, dưới tác ñộng của môi trường bên ngoài và bên trong cơ thể, các gene biến ñổi hình thành các allen khác nhau và nó

mã hoá cho quá trình tổng hợp các phân tử protein khác nhau về trong lượng, kích thước, lực tích ñiện Vì vậy, dùng phương pháp ñiện di có thể tách ñược các loại protein khác nhau Trong nghiên cứu ña dạng di truyền sự khác nhau của các protein phản ánh sự khác nhau về ñặc ñiểm di truyền giữa các cá thể Chính vì vậy isozyme ñược dùng làm marker trong phân tích mức ñộ ña dạng về di truyền của loài

Phân tích isozyme nhìn chung là phương pháp khả thi, ñồng tính trội và tương ñối rẻ tiền Khoảng 90 isozyme ñã ñược sử sụng trên thực vật, với những vị trí (loci) isozyme ñang ñược lập bản ñồ trong nhiều lĩnh vực (Tanksley và ctv, 1991) Tuy nhiên số lượng marker isozyme ít do ñó không ñủ ñể nghiên cứu toàn vẹn sự ña dạng

di truyền, phân tích dựa trên kiểu hình nên dễ bị ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường

Ứng dụng của marker isozyme ñã ñược sử dụng thành công ñể nhận diện giống

ở một số loài cây ăn trái như bơ (Goldring và ctv, 1985), táo (Weeden và Lamb, 1985), xoài (Chemda Degani và Ruth EI-Batsri, 1990 - 1992) ðối với dứa, marker isozyme cũng ñã ñược sử dụng ñể phân nhóm 161 dòng dứa dựa vào 6 enzyme (Aradhya M.K

trường Các chỉ thị di truyền phân tử ñược sử dụng ñể xác ñịnh mối quan hệ giữa các

cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài, là cơ sở cho việc phân loại dưới loài (thứ), phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hoá giữa loài (Ahn và cs., 1993; Dunforal

và cs., 1995) Chúng có thể ñược dùng ñể chọn các tổ hợp lai (Nair và cs., 1995; Zhang và cs., 1995)

Các chỉ thị DNA có thể chia thành 2 nhóm sau (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004):

-Chỉ thị dựa trên cơ sở chuỗi phản ứng polymerase (PCR - Polymerase Chain Reaction) (PCR-based): RAPD, AFLP, SSR, SSCP, STS

-Chỉ thị trên cơ sở ñánh dấu thăm dò và lai DNA (DNA / DNA based): RFLP, minisatellite

hydridization-Lợi ích của chỉ thị DNA so với chỉ thị hình thái và chỉ thị isozyme:

• ðo lường trực tiếp các vật liệu di truyền

• Có rất nhiều chỉ thị DNA trong quần thể

• Phân tích không bị ảnh hưởng bởi môi trường và giai ñoạn phát triển của ñối tượng

2.6.2 Các phương pháp nghiên cứu tính ña dạng di truyền

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

RFLP - ña hình chiều dài các ñoạn DNA cắt ngẫu nhiên bởi enzyme giới hạn dựa vào các ñặc tính sau:

- Tính chất ñặc trưng của các enzyme giới hạn (Restriction enzyme - RE), có nghĩa

là mỗi loại enzyme giới hạn chỉ cắt ở những trình tự nucleotide nhất ñịnh của DNA (loại enzyme 6 cắt và 4 cắt) Như vậy DNA của genome sẽ bị enzyme cắt ở những trình tự nucleotide ñặc trưng và tạo thành những ñoạn có kích thước khác nhau

- Tính chất bắt cặp tương ñồng giữa các chuỗi DNA theo nguyên tắc bổ sung, có ý nghĩa là chuỗi DNA mẫu dò sẽ bắt cặp (lai) với chuỗi có trình tự nucleotide tương ñồng với nó trên DNA genome

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

AFLP – ña hình chiều dài các ñoạn DNA ñược khuếch ñại chọn lọc, là kỹ thuật ñược áp dụng ñể phân tích tính ña dạng của sinh vật từ hàng trăm ñoạn DNA giới hạn

ñã ñược khuếch ñại ñồng thời nhờ phản ứng PCR Trên nguyên tắc, AFLP gồm hai nội dung cơ bản:

-Cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn có bổ sung các adapter ñặc hiệu tạo nên các ñoạn có ñầu mút giống nhau, ñặc trưng cho các primer ñã chọn trước Adapter là một ñoạn oligonucleotide ñôi, ñược tổng hợp nhân tạo và có trình tự tương ứng với trình tự

ở ñầu ñoạn DNA ñược phân cắt bởi một loại enzyme nhất ñịnh

-Nhân ñoạn DNA bằng kỹ thuật PCR qua hai giai ñoạn với hai loại primer khác nhau

Microsatellite (SSR: Simple Sequence Repeat)

SSR là các trình tự hai nucleotide ((AC)n, (AG)n, (AT)n) hoặc ba nucleotide ((TAT)n, (TCT)n, (CAG)n) lặp lại Do vậy nguyên tắc của phương pháp này là dựa trên

sự khuếch ñại các trình tự lặp lại trên bộ gene bằng các primer ñặc hiệu có khả năng bổ sung vào hai ñầu của locus microsatellite Sản phẩm PCR là các ñoạn DNA có chiều dài khác nhau do sự biến thiên về ñộ dài ñược tách ra trên gel polyacrylamid hoặc trong mao quản của máy giải trình tự DNA Do số lần lặp lại cao của microsatellite ở các cá thể nên sự ña hình cao hơn ở các trường hợp khác như RFLP, RAPD và sự ña hình ở các cá thể khác nhau tất nhiên là khác nhau Chiều dài các ñoạn DNA qua ñiện

di thường có kích thước 100 – 200 bp Tuy nhiên, SSR thường ñược phân tích trên DNA hệ gene nhỏ mang trình tự lặp lại và kích thước của chúng ñược nhận biết sau khi ñiện di trên gel

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

RAPD là phương pháp xác ñịnh sự ña hình về kích thước các ñoạn DNA sau khi thực hiện PCR mẫu DNA thí nghiệm Kỹ thuật này cho phép phát hiện thể ña hình mà không cần biết trước thứ tự các nucleotide bằng cách dùng các primer tổng hợp, ñơn, ngắn, dãy mã ñược thiết kế ngẫu nhiên ñể thực hiện PCR Sau khi bắt cặp tại các vị trí chuyên biệt trên sợi DNA, primer tiến hành sự khuếch ñại ñể tạo ra các ñoạn có kích thước khác nhau, có khi lên tới 2 kb Các ñoạn với kích thước khác nhau này ñược nhận biết bằng ñiện di Một primer có thể tạo nên sự ña hình DNA giữa các cá thể và các ñoạn ña hình này có thể ñược dùng như những marker ñể xác ñịnh sự ña dạng di truyền RAPD ñược xem như một phương pháp tạo sự ña hình DNA nhanh và hữu hiệu

Kỹ thuật RAPD ra ñời sau RFLP, tuy khả năng tạo ña hình tương ñương nhưng quy trình thực hiện ñơn giản hơn, chi phí thấp hơn và thu ñược kết quả nhanh hơn nên nhanh chóng có vị trí xứng ñáng trong nghiên cứu ña dạng di truyền một số cây trồng một và hai lá mầm như lúa, chuối, dứa, bông cải, cà chua, dừa, cacao, ñiều… Ngoài ra RAPD còn dùng ñể phát hiện ñột biến, phát hiện chỉ thị phân tử, xây dựng bản ñồ gene

2.6.3 Bulked segregant analysis

Bulked segregant analysis (BSA) là phương pháp kiểm tra sự khác nhau giữa các nhóm ñược phân li từ quần thể các cá thể con cháu của tổ hợp lai một cặp tính trạng Các nhóm này chỉ khác nhau ở tính trạng ñang xét Khi kết hợp với RAPD thì trên kết quả ñiện di, band có liên kết với tính trạng ñang xét sẽ ñồng nhất trong mỗi nhóm, còn các band không liên kết với tính trạng ñang xét thì xuất hiện ngẫu nhiên Hiện nay phương pháp này ñược sử dụng phổ biến và rộng rãi trong việc xác ñịnh marker phân

tử và chọn giống

Hình 2.7: Minh họa marker liên kết: band B liên kết với locus R

Một số nghiên cứu sử dụng BSA trong việc xác ñịnh maker liên kết tính kháng bệnh

Marker phân tử liên kết gene Vbj kháng bệnh nấm vảy trên táo bắt nguồn từ táo dại Malus baccata jackii (M Gygax và ctv, 2004): Quần thể 173 cá thể từ tổ hợp lai A722-7× cv Golden Delicious (A×GD) Giống A722-7 mang gene Vbj kháng bệnh nấm vảy, còn giống Golden Delicious là giống mẫn cảm Chọn ra 10 cây kháng và 10 cây mẫn cảm với bệnh, dùng 506 mồi ngẫu nhiên (10 nucleotide) ñể chạy phản ứng PCR cho 20 cây này M.Gygax và ctv ñã xác ñịnh ñược 3 mồi RAPD là: OPB08, OPK08, OP123 khuếch ñại các ñoạn 710bp, 848bp, 869bp có hiện diện trong 2 nhóm kháng và mẹ A722-7 (có gene Vbj) nhưng không hiện diện trong 2 nhóm mẫn cảm và

bố GD Phân tích 173 cây AxGD thì thấy 3 marker ñã liên kết với Vbj với tầng số liên kết là 16,2% - 22%

Xác ñịnh marker liên kết tính kháng bệnh nấm vảy ở lúa mì (Guihong Yu và ctv, 2003): Dùng 520 mồi RAPD phân tích quần thể F7của tổ hợp lai Ning894037 (kháng)

x Alondra (mẫn cảm), Guihong ñã xác ñịnh ñược 3 mồi S1384, S1360, S1319 khuếch ñại 4 band (640bp, 600bp, 350bp, 820bp) liên kết với tính kháng bệnh nấm vảy ở lúa

mì

B Moury (2000) và ctv ñã sử dụng 250 mồi RAPD phân tích 153 cá thể F2 của

tổ hợp lai PI195301(mẫn cảm) x PI152225 (kháng bệnh) ñã xác ñịnh ñược 4 marker liên kết tính kháng bệnh héo ñốm do virus cà chua trên tiêu (OPAC10-593bp, OPAH13-800bp, OPAF16-250bp, OPB01-750bp)

2.7 Các chiến lược nghiên cứu tính kháng bệnh trên thực vật

2.7.1 Tính kháng bệnh trên thực vật

Cây thể hiện tính kháng ñối với ký sinh gây bệnh là do chúng mang các ñặc tính phân loại khác với nhóm ký chủ của ký sinh gây bệnh, hoặc là cây chứa các gene kháng mà ký sinh không có gene tương ứng ñể phá vỡ Hiện tượng từ kháng trở thành nhiễm của cây trồng ñối với vi sinh vật gây bệnh là do số lượng khác nhau của gene kháng hiện diện ở mỗi giống cây và ảnh hưởng của gene kháng ñối với ký sinh Trường hợp giống rất nhiễm ñối với vi sinh vật gây bệnh thể hiện sự kiện không có gene kháng một cách hiệu quả chống lại nòi gây bệnh ñó Như vậy, sự kháng bệnh của cây trồng là do gene ñiều khiển Một số giống cây trồng có thể có tính kháng ñơn gene hoặc ña gene tuỳ theo số gene ñối kháng với một ñối tượng bệnh cây mà nó có

Kháng bệnh ñơn gene (monogeneic resistance):

Tính kháng bệnh ñơn gene thường do một gene có tính trội ñiều khiển hoặc có thể do một vài gene ñiều khiển nhưng các gene này ñịnh vị rất gần nhau và liên kết với nhau rất chặt chẽ Các gene kháng này có tính chuyên biệt cao ñối với một dòng sinh

lý của mầm bệnh Do ñó các giống có tính kháng ñơn gene thường kháng rất mạnh ñối với dòng sinh lý của mầm bệnh tương ứng Tuy nhiên, khi gặp dòng sinh lý khác của mầm bệnh, các giống này trở thành nhiễm bệnh và nhiễm nặng Sử dụng thường xuyên giống kháng ñơn gene rất dễ dẫn ñến sự chuyển ñổi dòng sinh lý mới của mầm bệnh

và tấn công ñược giống này

Kháng bệnh đa gene (polygeneic resistance):

Tính kháng bệnh của nhĩm này được biểu hiện bởi nhiều gene Các gene kháng này cĩ thể cĩ gene trội lẫn gene lặn Do cĩ nhiều gene kháng nên các giống trong nhĩm này cĩ thể kháng với nhiều dịng sinh lý khác nhau của mầm bệnh Nhờ đĩ, tính kháng của giống thường bền hơn, lâu bị phá vỡ hơn nhĩm giống kháng đơn gene Tuy nhiên, tính kháng của nhĩm này thường khơng mạnh bằng nhĩm kháng đơn gene Các giống kháng đa gene thường gây phiền phức cho các nhà lai tạo giống do cĩ nhiều gene kháng và cĩ cả gene lặn nên phân ly rất phức tạp và khĩ chọn lọc về sau

Chức năng và cấu trúc gene kháng:

Nhiều năm qua, người ta đã thực hiện thành cơng việc clone hĩa những gene kháng bệnh hại chính trên cơ sở những nguyên tắc của sinh học phân tử (Staskawicz

và ctv 1995, Baker và ctv 1997) Phân tích chuỗi ký tự protein được dự đốn là gene kháng, người ta thấy rằng chúng cĩ những motif về cấu trúc rất giống nhau, bao gồm: Leucine rich repeat - LRR, nucleotide binding site - NBS, ser/thr protein kinase - KIN, domain coiled coil - CC, domain thụ thể của Toll và interleukin – TIR Những cấu trúc này cĩ thể đứng đơn lẻ hoặc phối hợp lại để hình thành những tổ hợp tồn tại ở nhiều vị trí trong tế bào thuận lợi cho tương tác giữa các protein hay cụ thể hơn là đĩng một vai trị trong sự tương tác giữa gene kháng với những phân tử downstream trong con đường truyền tín hiệu

2.7.2 Các chiến lược nghiên cứu tính kháng

Xem xét giá trị thích nghi của pathogen đối với gene kháng chuyên tính

Chiến lược này cĩ thể thực hiện bằng phương pháp gây đột biến gene avr (avirulence) của pathogen chuyên tính Giá trị đột biến được xác định bằng khả năng gây bệnh trên ký chủ, sau đĩ được so sánh với dịng nguyên thuỷ Trong trường hợp sự khác biệt là cĩ giá trị, áp dụng phương pháp DNA fingerprinting để nghiên cứu mức

độ tiến hố của các nịi trước và sau khi thích ứng với một tổ hợp gene kháng nào đĩ

Chiến lược MAS và lập bản đồ QTL

Tính kháng số lượng từ lâu được xem như một loại hình lý tưởng cho tính kháng

ổn định do bản chất khơng chuyên tính nịi của nĩ Mặt khác, do những gene kháng chính cĩ ảnh hưởng che khuất, nên rất khĩ khăn trong việc chọn lọc tính kháng số lượng Do đĩ, lý thuyết về chọn giống nhờ marker phân tử (MAS = marker assisted selection) cĩ thể được áp dụng để kết hợp gene đơn cĩ tính kháng mạnh với gene số

lượng khơng chuyên tính nịi Tuy nhiên, vấn đề chung nhất của bản đồ QTL (Quantative trait loci) là hầu hết những marker gắn với QTL cịn cách biệt quá xa với nhau, chưa đủ sức dự đốn chính xác cho một chương trình chọn lọc giống hiệu quả

Áp dụng phân tử đánh dấu EST

Những đoạn phân tử đánh dấu EST (expressed sequence tag) về phản ứng tự vệ của cây khi gặp stress được phát hiện ngày càng nhiều Nhiều EST được lập bản đồ trên những vùng của nhiễm sắc thể định vị cho những gene kháng bệnh đã biết Như vậy, người ta cĩ thể chuyển từ việc sử dụng các marker cĩ tính chất ngẫu nhiên sang việc xác định các gene mục tiêu cho kỹ thuật QTL mapping Phương pháp này đã được

áp dụng khá thành cơng trong việc lập bản đồ gene kháng sâu đục quả bắp và trên một

số đối tượng cây trồng khác

Hiện nay, một số cơng nghệ mới như DNA chip cũng đã được sử dụng nhằm tăng khả năng khám phá chức năng gene ứng cử viên thơng qua phân tích kiểu hình, kiểu gene đột biến và bố mẹ Mặc khác, việc tạo ra những đột biến với những khiếm khuyết trong hệ thống kháng sẽ cho ta đánh giá được chức năng và giá trị cụ thể của từng gene Tuy nhiên, các phương pháp này khá đắt đỏ và địi hỏi phải cĩ một cơ sở dữ liệu lớn về genome của đối tượng cần nghiên cứu

Phương pháp PCR thối hố

Dựa trên rất nhiều nghiên cứu về gene kháng, người ta nhận thấy rằng sản phẩm của chúng cĩ một sự tương đồng cao về mặt cấu trúc mặc dù những gene này được clone từ những đối tượng thực vật rất khác biệt và liên quan đến cơ chế kháng các lồi

kí sinh cũng rất khác nhau (virus, vi khuẩn, nấm, nematode…) Như vậy, cĩ thể đi đến kết luận rằng hầu hết các loại gene kháng là khá giống nhau hay các lồi thực vật khác nhau đều cĩ những domain tương đồng nhau trong trình tự mã hố gene kháng

Theo đĩ, một chiến lược được đưa ra để định vị và phân lập những gene kháng

mới bằng kỹ thuật khuyếch đại in vitro (PCR) với mồi thối hố được thiết kế dựa trên

những các motif trình tự phổ biến của những gene kháng đã biết Những gene kháng clone được sử dụng cho các phân tích tiếp theo để phát hiện ra những marker chuyên biệt cho tính kháng của từng lồi Việc giải trình tự của marker và so sánh với trình tự của những gene kháng đã biết trong cơ sở dữ liệu cho phép ta biết được trình tự của một loại gene kháng mới hay cĩ thêm thơng tin về cơ chế của tính kháng Các marker kháng cịn rất hữu ích trong việc lập bản đồ những loci liên quan đến tính kháng và bổ

sung thêm marker cho bản ựồ di truyền Chiến lược này ựã ựược áp dụng khá hiệu quả

và ựã ựạt ựược nhiều kết quả to lớn trên nhiều ựối tượng thực vật khác nhau

Phương pháp PCR với mồi thoái hoá thì gần như là tương tự với PCR truyền thống duy chỉ có một khác biệt chắnh đó là thay vì sử dụng primer chuyên biệt cho một trình tự ựã biết, người ta sử dụng một hỗn hợp primer Hỗn hợp này ựược tạo ra trong quá trình tổng hợp oligonucleotide một trình tự DNA thoái hoá Một trình tự DNA ựược gọi là thoái hóa nếu một hoặc nhiều vị trắ có thể ựược thay thế bằng một hoặc vài loại nucleotide khác

Năm 1990, Compton ựã mô tả việc sử dụng những oligonucleotide có chiều dài

14 nucleotide có khoảng 4 Ờ 5 ựiểm thoái hoá như những primer xuôi và ngược trong phản ứng khuyếch ựại in vitro (PCR) ựối với gene mã hoá glycoprotein B (gB) từ các loài herpesvirus có quan hệ họ hàng với nhau

Phương pháp này nhanh chóng ựược áp dụng trong ngành thực vật, ựặc biệt trong lĩnh vực nghiên cứu tắnh kháng Yu và ctv (1996) ựã thiết kế những cặp primer trên cơ

sở vùng NBS của gene kháng N và RPS2 ựể khuyếch ựại nhiều lần thể orthologs (thể tương ựồng chắnh thống) của gene này trong ựậu nành Tác giả ựã thu ựược 11 lớp (class) của chuỗi mã di truyền ựược phân lập, ựại diện cho một họ NBS Trong những lớp này, 5 lớp ựã ựược lập bản ựồ gene kháng bệnh polyvirus trên ựậu nành Áp dụng phương pháp tương tự, Kanazin và ctv (1996) ựã xác ựịnh ựược 9 lớp analog của gene kháng và lập bản ựồ nhiều lớp trong lớp này ựịnh vị bên những gene kháng ựã ựược biết trước ựó Sử dụng những primer thiết kế từ LRR của gene RPS2 trong cây

Arabidopsis thaliana và gene N trong cây thuốc lá, Leister và ctv (1996a) ựã xác ựịnh

ựược loci của những gene kháng ứng với gene Gro1 (kháng tuyến trùng) và R7 (kháng bệnh héo rũ) trên khoai tây

Tuy có rất nhiều ưu ựiểm, nhưng phương pháp PCR thoái hoá trong xác ựịnh và phân lập gene kháng còn tuỳ thuộc vào tắnh chất giống nhau giữa các trình tự gene kháng Hiện nay, vẫn chưa có ước ựoán chắnh xác nào về tỉ lệ gene kháng có motif bảo tồn Nhiều câu hỏi ựang ựược ựặt ra: Liệu rằng chúng ta có mất rất nhiều gene kháng khi chỉ sử dụng ựơn ựiệu phương pháp này hay không? Có khác biệt cơ bản giữa gene kháng trội và gene kháng lặn hay không?

Hạn chế của phương pháp này còn thể hiện qua việc rất khó xác ựịnh chức năng của gene mục tiêu, cho dù chúng ựược phân lập bản ựồ tại vùng có nhiều gene kháng

ñã biết vì những gene có vùng bảo tồn giống nhau có thể hoàn toàn khác nhau về chức năng sinh học trong tế bào thực vật

Thiết kế primer thoái hóa

ðây là một bước rất quan trọng ñảm bảo cho sự thành công của thí nghiệm và cần phải ñược thực hiện một cách thận trọng Vì hầu hết các gene trong cùng một họ ñều

có cấu trúc khá tương ñồng Do ñó, bằng việc sắp gióng cột và phân tích cho phép phát hiện ra và sử dụng những motif bảo tồn ñể làm cơ sở cho việc thiết kế primer thoái hoá

Việc thiết kế một primer bao gồm các bước:

-Sắp gióng cột (align) trình tự gene hoặc protein (hoặc cả hai)

-Xác ñịnh ít nhất hai vùng bảo tồn trên chuỗi trình tự ñã gióng cột với ñiều kiện trình tự mục tiêu phải nằm giữa hai trình tự này

-Bước cuối cùng là tìm cặp primer thỏa mãn các thuộc tính như nhiệt ñộ bắt cặp, hàm lượng GC, ñầu dính (vùng 3`) bắt cặp chính xác, ñộ thoái hóa thấp và khoảng cách hợp lý giữa hai vùng bảo tồn

Thông thường, primer thoái hóa ñược thiết kế dựa trên các phần mềm như: GeneFisher, CODEHOP, HYDEN, DePiCt…

Trong những ngày ñầu tiên mới xuất hiện, phương pháp PCR thoái hoá cũng khuyếch ñại thành công một vài gene mới có ñộ thoái hoá trên 1000 lần Tuy nhiên, những báo cáo như vậy là không nhiều Trong khi những công bố gần ñây cho thấy mồi thoái hoá với ñộ thoái hoá từ 100 lần trở lại cho kết quả tốt Có 5 phương pháp nhằm giảm ñộ thoái hoá trong việc thiết kế primer như sau:

- Chọn ñúng vùng motif ñể thiết kế primer

Motif ñược chọn ñể thiết kế primer phải là sự cân nhắc giữa những codon có ñộ bảo tồn cao nhất hoặc những codon có ñộ bảo tồn thấp hơn nhưng ñộ thoái hoá tổng thể lại thấp hơn

- Sử dụng inosine như một base trung hoà

Inosine là một purine xuất hiện trong thành phần tự nhiên của tRNA và có khả năng bắt cặp với cytidine, thymidine, and adenosine (mặc dù sự bắt cặp giữa inosine

và adenosine là không chặt chẽ trong cấu trúc DNA mạch kép) Gần ñây, người ta có

xu hướng sử dụng inosine ở những vị trí ñòi hỏi có sự thay thế của cả 4 base Do khi

sử dụng inosine, ñộ thái hoá sẽ giảm xuống 4 lần Tuy nhiên, mismatch I : G sẽ tăng lên

- Tổng hợp hỗn hợp oligo ở tại một vị trí

Một nổ lực ñể sử dụng những primer có ñộ thoái hoá thấp là trên cùng một tổ hợp codon, tiến hành tổng hợp hai hay nhiều hỗn hợp primer thay vì chỉ tổng hợp một hỗn hợp chứa tất cả các codon Mỗi hỗn hợp sau ñó sẽ ñược sử dụng riêng rẽ trong phản ứng PCR

- Chọn những codon ñặc biệt ở ñầu primer 3’

Nhiều codon mã hoá cho một amin acid hay một nhóm các amino acid tương ñồng nhau thì thường giống nhau ở vị trí nucleotide ñầu tiên hoặc thứ 2 và khác nhau ở

vị trí nucleotide thứ 3 Do ñó, sẽ có thuận lợi khi chỉ phải tổng hợp ở vị trí ñầu tiên hoặc thứ hai ở codon cuối cùng của ñầu 3’ một nucleotide không thoái hoá Vì vậy, sự bắt cặp vẫn chính xác ở ñầu 3’ mà không cần gia tăng ñộ thoái hoá

- Sử dụng những codon phổ biến cho sinh vật mục tiêu

Một sự thiên vị mạnh mẽ cho một vài codon ñặc biệt ñể mã hoá cho một vài amino acid Do ñó, theo lý thuyết, có thể làm giảm ñộ thoái hoá của hỗn hợp primer bằng cách chỉ sử dụng những codon này

2.8 Một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước

2.8.1 Các nghiên cứu ngoài nước

Về bệnh héo ñỏ ñầu lá

Bệnh wilt lần ñầu tiên ñược mô tả bởi các nhà khoa học thuộc phòng thí nghiệm Hiệp hội những người trồng mía Hawaii (HSPA) năm 1910 Năm 1900, bệnh này ñã gây thiệt hại nặng nề cho công nghiệp trồng dứa ở Hawaii, cho ñến nay bệnh xuất hiện

ở hầu hết các khu vực trồng dứa trên thế giới

• Sử dụng phương pháp phân tích miễn dịch mô (TBIA), nhóm tác giả (J S Hu

và cs., 1997) ñã xây dựng thành công phương pháp phân tích nhanh sự phân bố của Closterovirus trên dứa ở Hawaii Họ rút ra kết luận virus hiện diện chủ yếu ở mô trắng phần gốc lá và ở chồi quả Trên cơ sở ñó, ñề tài lựa chọn vật liệu nghiên cứu chủ yếu lấy từ lá những cây nghi ngờ bị nhiễm bệnh ñể xây dựng qui trình giám ñịnh bệnh và chồi giống của cây con ñể test kiểm tra virus

• Nghiên cứu về vai trò của hai loài rệp sáp (Dysmicoccus spp.), nhóm tác giả

(D M Sether, D E Ullman and J S Hu, 2001) ñã ñưa ra kết luận về mối quan hệ tương quan giữa rệp sáp và việc lan truyền bệnh ñỏ ñầu lá trên dứa

• Nghiên cứu sự phân bố, sự khác biệt và ñặc tính của 2 loài virus PMWaV trên dứa (J S Hu, D M Sether và cs., 2001), các tác giả ñã thành công trong việc sử dụng

kỹ thuật RT-PCR và Southern Blot ñể phát hiện PMWaV và bước ñầu ứng dụng phương pháp nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng ñể tạo cây sạch virus

• Nghiên cứu về rệp sáp và khả năng truyển bệnh của chúng trong các ñiều kiện khác nhau: ñồng ruộng và phòng thí nghiệm, D M Sether và J S Hu (2002) kết luận rệp sáp và PMWaV-2 là hai ñiều kiện cần và ñủ ñể gây bệnh cho cây Kiến làm gia tăng tốc ñộ lây lan bệnh và ở dứa, cây non dễ nhiễm bệnh hơn cây già

Về phân tích ña dạng di truyền dứa

• Nghiên cứu sự ña dạng di truyền dứa bằng marker AFLP, Cecilia Y Kato và

cs (1992) tiến hành trên 70 giống dứa (Ananas comosus L.) và 3 họ có liên quan (Ananas ananassoidies, Ananas bracteatus và Ananas erctifolius) Kết quả cho thấy việc lai khác loài giữa A comonus và A ananassoidies với mức tương quan của A

comonus (0.398) và A.ananassoidies (0.381) Qua ñó cho thấy sự khác biệt di truyền

trong số các giống dứa phần lớn có thể do ñột biến

• Phân tích ña dạng di truyền phân tử dứa bằng marker RFLP (Duval và cs.,

2001) ñã cho thấy ñược sự giống nhau giữa Ananas comosus và Pseudananas comosus

là 58,7% qua sử dụng 18 probe tương ñồng ñể lai

• Xác ñịnh ñộ tin cậy kiểu gene của cây dứa vi nhân giống liên quan ñến marker isozyme và RAPD (Sergio Feuse và cs., 2003)

2.8.2 Các nghiên cứu trong nước

Về bệnh héo ñỏ ñầu lá

Theo kết quả ñiều tra tình hình bệnh wilt của trường ðH Nông Lâm Tp HCM năm 2003 cho thấy bệnh wilt xuất hiện ở tất cả các ruộng với tỉ lệ bệnh cao: nông trường Thọ Vực (ðồng Nai) có tỉ lệ bệnh cao nhất (12,1%), tiếp theo là nông trường Phạm Văn Hai (6%) và nông trường Lê Minh Xuân (7%); còn ở Bến Lức (Long An), Tân Phước (Tiền Giang) và ðức Trọng (Lâm ðồng) tỉ lệ bệnh lần lượt là 9,3%, 8,1%

và 4,1% Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu về bệnh này, các ñề tài chỉ dừng lại ở bước xác ñịnh mối liên quan mật số rệp và mức ñộ bệnh dứa

Về phân tích ña dạng di truyền dứa

Kết quả nghiên cứu sự ña dạng di truyền của các giống (dòng) dứa bằng chỉ thị RAPD (Hoàng Thị Bích Thuỷ và Bùi Văn Lệ, 2004) ñã phân nhóm ñược 7 giống (dòng) Qua sử dụng 9 loại primer ñã xác ñịnh ñược các quần thể Trung Quốc 220 và Trung Quốc 250; ðắc Lắc và Thái Lan có cùng nguồn gốc Quần thể dứa Lâm ðồng

và ðắc Lắc; Lâm ðồng và Thái Lan là các quần thể xa nhau về mặt nguồn gốc

ðề tài “Nghiên cứu ña dạng nguồn gene dứa Cayenne bằng phương pháp marker phân tử” của Lê Thị Thanh Tuyền và Nguyễn Thị Lang (2005) sử dụng 13 primer RAPD (10 nucleotide) ñể khảo sát tính ña dạng di truyền của 50 dòng dứa Cayenne ở ñồng bằng Sông Cửu Long (Long ðịnh và viện lúa ðBSCL) Bên cạnh phân tích bằng sinh học phân tử ñề tài còn tiến hành ñánh giá ña dạng nguồn gene dựa vào kiểu hình Kết quả phân nhóm di truyền của 50 giống Cayenne dựa trên dữ liệu sản phẩm PCR - RAPD phân thành 3 nhóm chính, với khoảng cách phân nhóm là 0,66 Nhóm I gồm 20 dòng dứa, nhóm II gồm 3 dòng và nhóm III là 27 dòng, trong mỗi nhóm ñều chứa những dòng dứa có nguồn gốc nhập ngoại và nhập nội Sự tương ñồng về di truyền giữa nhóm I hoặc nhóm II với nhóm III là 49 % và nhóm I với nhóm II là 63 %; trong cùng một nhóm thì nhóm III có mức tương ñồng về di truyền cao nhất 71 % Khoảng cách di truyền giữa 50 dòng dứa Cayenne qua phân nhóm dao ñộng từ 0,27 – 1,0 với những dòng dứa ñược trồng từ nuôi cấy mô có sự tương ñồng về di truyền cao nhất

PHẦN 3 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

* Nội dung 1: Giám ựịnh bệnh virus chồi giống dứa Cayenne

- Xây dựng và hoàn thiện quy trình giám ựịnh PMWaV trên chồi dứa Cayenne: xây dựng quy trình phát hiện PMWaV bằng phương pháp RT-PCR ựể áp

dụng cho việc giám ựịnh virus trên chồi dứa thương phẩm và trên cây tái sinh từ ựỉnh sinh trưởng

- Thu thập và kiểm tra bệnh virus trên chồi giống dứa Cayenne: tạo nguồn

nguyên liệu in vitro ban ựầu cho các thắ nghiệm tạo cây dứa in vitro sạch virus tiếp

theo và ựánh giá sơ bộ tình hình nhiễm PMWaV trên các chồi giống dứa Cayenne nội ựịa và nhập nội

* Nội dung 2: Tạo cây dứa Cayenne sạch virus

- Tạo cây dứa Cayenne in vitro sạch virus bằng phương pháp nuôi cấy ựỉnh sinh trưởng và xử lý nhiệt: xác ựịnh thời gian, nhiệt ựộ thắch hợp cho quá trình xử lý

nhiệt và nghiên cứu khả năng tái sinh chồi từ ựỉnh sinh trưởng của các giống dứa

- Giám ựịnh PMWaV trên cây dứa Cayenne in vitro tái sinh từ ựỉnh sinh trưởng: ựánh giá hiệu quả của phương pháp xử lý nhiệt chồi dứa và nuôi cấy ựỉnh sinh

trưởng ựể loại trừ virus gây bệnh và chọn lọc các cây in vitro cho kết quả âm tắnh ựể

nhân nhanh thành nguồn chồi giống sạch virus

* Nội dung 3: đánh giá tắnh sạch virus của cây dứa Cayenne in vitro

Kiểm tra tắnh sạch virus và khảo sát mức ựộ biến dị của cây dứa Cayenne in vitro ngoài vườn ươm: Cây dứa Cayenne in vitro sạch bệnh virus ựược thuần hóa

trong phòng ươm cây, sau ựó trồng ngoài vườn ươm và ựồng ruộng Kiểm tra tắnh sạch

virus của các chồi dứa in vitro ngoài vườn ươm nhằm ựánh giá tắnh sạch virus ở chồi dứa một cách chắnh xác Kiểm tra các dạng biến dị của cây dứa in vitro trồng ngoài

ựồng ruộng

* Nội dung 4: Xác ñịnh marker liên kết tính kháng virus

Phân tích ña dạng di truyền của các giống dứa Cayenne và phát hiện marker liên kết: Tiến hành chủng bệnh từ cây nhiễm bệnh héo ñỏ ñầu lá cho cây dứa

Cayenne in vitro ñể thu thập mẫu Thực hiện PCR với mồi RAPD ñể ñánh giá ña dạng

và xác ñịnh band ña hình liên kết tính kháng bệnh héo ñỏ dầu lá dứa

* Nội dung 5: Xác ñịnh gene liên quan với tính kháng virus

Xây dựng phương pháp xác ñịnh gene liên quan ñến tính kháng bằng kỹ thuật PCR với primer thoái hóa: xác ñịnh vùng gene quy ñịnh tính kháng virus

PMWaV dựa vào nguồn gene sẵn có trong quần thể dứa và xác ñịnh cặp primer chuyên biệt cho gene quy ñịnh tính kháng

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Nội dung 1: Giám ñịnh bệnh virus chồi giống dứa Cayenne

3.1.1 Xây dựng và hoàn thiện quy trình giám ñịnh PMWaV trên chồi dứa Cayenne

Vật liệu

Mẫu dứa: gồm các mẫu lá bệnh và chồi dứa Cayenne thương phẩm của 3 giống

Thái Lan, Trung Quốc, Lâm ðồng lấy tại Nông trường Thọ Vực - ðồng Nai, Công ty giống cây trồng TP HCM và Chi cục BVTV ðơn Dương - Lâm ðồng

Hoá chất: các bộ kit AurumTM Total RNA Mini Kit (BioRad), Access RT-PCR System (Promega), các hóa chất cho ñiện di RNA và DNA

Bảng 3.1: Primer cho phản ứng RT-PCR

(Theo thiết kế của Sether D.M và ctv, 2001)

Primer

PMWaV-1F 5'-ACAGGAAGGACAACACTCAC-3' 57,3

o

C PMWaV-1 Primer

PMWaV-2R 5’-CCATCCACCAATTTTACTAC-3’ 60

o

C

Enzyme reverse AMV (5 Unit/µl) 2,5 µl

Enzyme Taq polymerase Tfl (5 Unit/µl) 2,5 µl

* ðiện di sản phẩm tách chiết RNA

Dung dịch RNA ñược làm biến tính ở 65oC / 30 phút rồi làm lạnh nhanh trong nước ñá 1 phút Sử dụng gel agarose 1,8% với buffer MOPS 1X và formaldehyde 0,02% (v/v) ðiện di ở 30 Vol, 150 phút

*Tối ưu hóa các thành phần trong phản ứng RT-PCR

- Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng ñộ primer ở 3 nghiệm thức 0,8 mM, 0,9 mM và 1

5 RT-PCR V: 45oC/45’, 94oC/2’, 10 chu kỳ (92oC/30’’, 58oC/1’, 68oC/1’30’’), 35 chu kỳ (92oC/30’’, 54oC/1’, 68oC/1’30’’), 68oC/8’

*ðiện di sản phẩm RT-PCR

Sản phẩm PCR ñược ñem ñiện di trên gel agarose 1,5% với hiệu ñiện thế 50V trong 90 phút Quan sát kết quả ñiện di dưới ñèn cực tím Kích thước các sản phẩm PCR ñược ghi nhận thông qua sự so sánh với thang chuẩn 100 bp DNA ladder (Promega) Những mẫu khuếch ñại có chứa band với kích thước 589 bp hay 609 bp (tương ñương 600 bp) sẽ là những mẫu dương tính (bị nhiễm PMWaV)

*Giải trình tự sản phẩm RT-PCR

Mẫu sản phẩm RT-PCR dương tính qua ñiện di ñược giải trình tự So sánh kết quả thu ñược với trình tự chuẩn trên GeneBank bằng phần mềm Clustal X 1.83 và phân tích bằng công cụ BLAST của NCBI

3.1.2 Thu thập và kiểm tra bệnh virus trên chồi giống dứa Cayenne

Vật liệu

Chồi dứa: Mẫu lá bệnh và chồi dứa Cayenne thương phẩm của 3 giống Thái

Lan, Trung Quốc, Lâm ðồng ñược lấy tại nông trường Thọ Vực - ðồng Nai, công ty giống cây trồng TP.HCM và chi cục BVTV ðơn Dương - Lâm ðồng

Chồi giống dứa ñược lấy ngẫu nhiên từ nguồn chồi giống thương phẩm, mỗi giống 100 chồi Mẫu lá bệnh ñược lấy trực tiếp từ những cây dứa biểu hiện triệu chứng của bệnh héo ñỏ ñầu lá, ñó là các cây có lá bị héo ñỏ, bắt ñầu từ các lá già héo lên, vỏ lụa bung ra, mép lá và ñầu lá bị héo, hóa nâu và khô dần Cây dứa bị héo ñỏ ñầu lá ñược phân biệt với dứa bị héo do thiếu nước hay do nhiễm phèn ở chỗ các cây héo do nắng hay phèn thì lá non héo trước, trên lá không xuất hiện các ñốm khô rộp, mép lá không bị uốn cong và ñầu lá không bị hóa nâu, khô quắt lại

Phương pháp

*Giám ñịnh PMWaV trên chồi thương phẩm

Tiến hành giám ñịnh PMWaV trên 100 mẫu chồi giống dứa Cayenne thương phẩm thu thập ñược của 3 giống Thái Lan, Trung Quốc và Lâm ðồng Các chồi dứa ñược lột bỏ hết các lá ngoài, lấy phần lõi trắng bên trong ñem ly trích RNA và thực hiện phản ứng RT-PCR

3.2 Nội dung 2: Tạo cây dứa Cayenne sạch virus

3.2.1 Tạo cây dứa Cayenne in vitro sạch virus bằng phương pháp nuôi cấy ñỉnh

sinh trưởng và xử lý nhiệt

Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng tái sinh của ðST nuôi cấy trên môi trường MS

Thí nghiệm ñược bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD), 3 yếu tố, 12 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại Mỗi nghiệm thức gồm 10 chồi tái sinh từ ðST

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của giống và quá trình xử lí nhiệt lên sự sinh

trưởng của cây tái sinh từ ðST

Thí nghiệm ñược bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 2 yếu tố, 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại Mỗi nghiệm thức gồm 10 chồi tái sinh từ ðST

Bảng 3.3: Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát khả năng tái sinh ðST chồi dứa

Phương pháp tiến hành

*Tạo nguồn chồi dứa in vitro

Các chồi dứa ñược lột bỏ hết các lá bên ngoài, lấy phần lõi trắng bên trong, lắc với xà phòng loãng trong 5 phút trước khi ñem vào tủ cấy Ở ñiều kiện vô trùng, mẫu ñược rửa 3 lần bằng nước cất, ngâm trong cồn 700 1-2 phút, chuyển vào dung dịch javel 30% trong 15 phút rồi rửa lại bằng nước cất 3 lần Sau ñó, mẫu chồi ban ñầu ñược cắt thành nhiều mẫu nhỏ và cấy vào môi trường MS

Các chồi dứa in vitro sau khi hình thành ñược tiến hành nhân chồi bằng cách

chuyển sang môi trường MS bổ sung BA 2 mg/l

ðiều kiện nuôi cấy: nhiệt ñộ: 27 + 20

C, thời gian chiếu sáng: 16 giờ / ngày, cường ñộ ánh sáng: 1000 - 2000 lux, ẩm ñộ: 65% – 70%

Sau khi tách chồi và chuyển sang môi trường MS từ 30 – 40 ngày, chồi dứa ñạt ñược ñộ lớn cần thiết ñể xử lý nhiệt

*Xử lý nhiệt

Cây dứa in vitro cao khoảng 4 – 5 cm ñược cấy chuyền sang môi trường MS

trước xử lí nhiệt 2 tuần Các bình nuôi cấy ñược ñặt trong tủ xử lí nhiệt Environmental Test Chamber MLR-350 (ETC) Nút ñậy cao su của bình ñược thay bằng nylon chịu nhiệt ñể tạo ñiều kiện trao ñổi nhiệt tốt

ðiều kiện xử lí: nhiệt ñộ 370

C + 0,1, ẩm ñộ 55%, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường ñộ chiếu sáng 2000 lux, thời gian xử lí 30 ngày

*Nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng (ðST)

Mẫu nuôi cấy là ðST chồi dứa Cayenne in vitro ñã qua xử lí nhiệt và ñối chứng

là ðST không xử lí nhiệt Các thao tác nuôi cấy mô ñược tiến hành trong tủ cấy vô trùng Môi trường và dụng cụ nuôi cấy ñược hấp tiệt trùng ở 1210C, 1,2 atm trong 25 phút Quan sát bằng kính hiển vi soi nổi Olympus, dùng dao lam tách ðST kích thước 0.3 – 1 mm và ñặt nhẹ lên bề mặt môi trường Mỗi ðST ñược cấy vào một ống nghiệm chứa 10 ml môi trường MS và ñược bảo quản ở ñiều kiện phòng tăng trưởng Ghi nhận các chỉ tiêu theo dõi sau 30, 50 và 70 ngày

Hình 3.1: Chồi dứa Cayenne thương phẩm

Hình 3.2: Chồi dứa in vitro nuôi cấy trên môi trường MS

Hình 3.3: Chồi dứa trước khi tách ðST và ðST ñược tách quan sát dưới kính

hiển vi soi nổi SZ40