Điều chế chất chuẩn đối chiếu phục vụ kiểm nghiệm dược liệu và đông dược

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

- Nguyên liệu bào chế chất chuẩn asiaticosid: Cao Rau má chuẩn hóa do Ban

Nghiên cứu Khoa học – Thư viện, Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố

Hồ Chí Minh sản xuất từ cây Rau má (Centella asiatica (Urb.) L., Apiaceae)

- Nguyên liệu bào chế chất chuẩn diosgenin: Cao Mía dò chuẩn hóa do Ban

Hồ Chí Minh sản xuất từ cây Mía dò (Costus speciosus (Koenig) Smith,

- Nguyên liệu bào chế chất chuẩn damnacanthal: Cao rễ Nhàu chuẩn hóa do

Ban Nghiên cứu Khoa học – Thư viện, Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh sản xuất từ nguyên liệu rễ cây Nhàu (Morinda citrifolia L.-

- Nguyên liệu bào chế chất chuẩn hesperidin: Hesperidin thô (Merck, Đức), hàm lượng nguyên trạng 80%

- Nguyên liệu bào chế chất chuẩn acid oleanolic: Rễ cây Ngưu Tất

(Achyranthes bidenta L – Amaranthaceae) mua tại Cửa hàng Dược liệu Hòa

Thạnh, 72 Triệu Quang Phục, Q.5, TP Hồ Chí Minh

- Nguyên liệu bào chế chất chuẩn berberin clorid: Berberin clorid (Ấn độ, hàm lượng nguyên trạng 98%)

- Nguyên liệu bào chế chất chuẩn curcumin I: Cao Nghệ chuẩn hóa do Ban

Hồ Chí Minh sản xuất từ thân rễ cây Nghệ (Curcuma longa L.,

- Nguyên liệu bào chế ginsenosid-Rb1 và ginsenosid-Rg 1 : Cao Tam thất chuẩn hóa do Ban Nghiên cứu Khoa học – Thư viện, Khoa Dược, Đại học Y Dược

Thành phố Hồ Chí Minh sản xuất từ rễ củ cây Tam thất [Panax notoginseng

- Nguyên liệu bào chế chất chuẩn majonosid – R2: Cao toàn phần Sâm Việt

Nam do Ban Nghiên cứu Khoa học – Thư viện, Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh đã thực hiện nghiên cứu chiết xuất từ thân rễ và rễ cây Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv., thuộc họ Araliaceae).

- Chất chuẩn acid oleanolic: Chuẩn sơ cấp (Primary) của công ty Chromadex (Mỹ), số lô 15303-109, hàm lượng 93,40%

- Chất chuẩn berberin clorid: Chuẩn của Viện Kiểm nghiệm thuốc TP HCM, số lô QT122 030910, hàm lượng 90,62%

- Chất chuẩn curcumin I: Chuẩn của USP, số lô F0H127, hàm lượng 99,0%

- Chất chuẩn ginsenosid-Rg1: Chuẩn sơ cấp (Primary) của hãng Tauto Biotech (Trung Quốc), số lô 10082423, hàm lượng 99,30%

- Chất chuẩn ginsenosid-Rb1: Chuẩn sơ cấp (Primary) của hãng Tauto Biotech (Trung Quốc), số lô 10112621, hàm lượng 97,28%

- Chất chuẩn đối chiếu diosgenin: Chuẩn thứ cấp (SH) của công ty Chromadex (Mỹ), số lô 00004915-227, hàm lượng 98,5%

- Chất chuẩn hesperidin: chuẩn sơ cấp (Primary) của công ty ChromaDex (Mỹ), số lô 00008135-J01, hàm lượng 87,4%

- Các dung môi hóa chất nghiên cứu đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích

- Dung môi dùng cho sắc ký lỏng acetonitril, methanol (Prolabo) đạt tiêu chuẩn dùng cho HPLC Nước cất 2 lần được dùng cho HPLC

- Các dung môi dùng trong sắc ký lớp mỏng thay đổi tùy theo các thực nghiệm cụ thể và được cất lại, làm khan trước khi dùng

Hóa chất Chủng loại Xuất xứ

Ethyl acetat P, PA Trung quốc

Acid sulfuric P, PA Trung quốc Kali dihydrophosphat P, PA Trung quốc Dimethylsulfoxid HPLC Prolabo, Mỹ

Methanol HPLC HPLC Prolabo, Mỹ

Acetonitril HPLC HPLC Prolabo, Mỹ

Nước cất PA Khoa Dược

PA (Pure for analysis): Tinh khiết phân tích

HPLC: Tinh khiết dùng cho sắc ký HPLC

− Sắc ký cột dùng silia gel (Merck) cỡ hạt trung bình 0,04-0,06 mm

− Sắc ký lớp mỏng pha thuận dùng bản silica gel F254 tráng sẵn trên nền nhôm (Merck)

2.1.3 DỤNG CỤ VÀ TRANG THIẾT BỊ

− Máy sấy chân không (Jeiotech, model OV-12)

− Bếp cách thủy (Memmert, model WB-14 LO, 2006)

− Đèn UV 2 bước sóng CN-15-LC (Vilber Loumart)

− Bể siêu âm Sonorex RK-1028H (Bandelin)

− Cân phân tích BP-221S (Sartorius)

− Cân kỹ thuật hiện số EW-600-2M (Kern)

− Tủ vi khí hậu (Binder, Đức) để theo dõi độ ổn định

− Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu LC-20A (Nhật), detector PDA

− Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent (Anh), detector PDA

− Máy đo phổ hồng ngoại Shimadzu FTIR-8201PC (Nhật)

− Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế Shimadzu LC – 8A (Nhật), detector

− Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker 500 MHz NMR (Mỹ)

− Mỏy đo khối phổ Bruker àQ-TOF MS (Mỹ)

− Máy quét nhiệt vi sai DSC Q20 V24.9 Build 121

− Cột Phenomenex C18, 150 x 4,6 mm, kớch thước hạt 5 àm.

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 ĐÁNH GIÁ CHẤT ĐIỀU CHẾ

Đánh giá các chỉ tiêu liên quan đến tạp chất, định tính và xác định cấu trúc được thực hiện thông qua các phương pháp như sắc ký lớp mỏng, xác định điểm chảy, và phân tích bằng phổ IR, phổ UV, phổ MS, và phổ NMR, cùng với các phương pháp định lượng.

- Phương pháp HPLC dựa vào phần trăm diện tích pic

Tiêm dung dịch 1,0 mg/ml vào hệ thống sắc ký theo điều kiện đã định, thực hiện sắc ký gấp đôi thời gian lưu của pic chính Xác định tạp chất liên quan bằng cách tính tổng tạp, loại bỏ những pic có chiều cao nhỏ hơn ba lần độ nhiễu nền và các pic có trong mẫu trắng.

Yêu cầu:Tổng hàm lượng tạp chất có trong mẫu điều chế tính theo phần trăm diện tích pic nhỏ hơn 2%

Tiến hành cân đĩa đựng mẫu và nắp đậy cho cả bên thử và bên chuẩn Cân khoảng 2,0 mg mẫu thử cho vào đĩa Đảm bảo cân chính xác một lượng chuẩn indium sao cho tổng khối lượng (gồm đĩa, nắp đậy và mẫu) ở bên chuẩn tương đương với bên thử Cuối cùng, thực hiện quét nhiệt vi sai.

2.2.1.2 Định tính và xác định cấu trúc

Acid oleanolic với 3 hệ dung môi khai triển sau:

Berberin clorid với 3 hệ dung môi khai triển sau:

- Iso-propanol – acid formic – nước (100:2:10)

- Ethyl acetat – n-buthanol – acid formic – nước (50:30:12:10)

Curcumin I với 3 hệ dung môi khai triển sau:

Asiaticosid với 3 hệ dung môi khai triển sau:

- Cloroform – methanol – nước (65:35:10; lớp dưới)

Diosgenin với 3 hệ dung môi khai triển sau:

Damnacanthal với 3 hệ dung môi khai triển sau:

- Ete dầu – cloroform – acid acetic (6:5:1)

Hesperidin với 3 hệ dung môi khai triển sau:

- Cloroform – n-butanol – n-butanol bão hòa nước – acid acetic (4:2:1:1)

- n-Butanol – acid acetic – nước (6,5:1:2 giọt)

- Cloroform – acid acetic – methanol – nước (16:7:3:2)

Gingsenosid – Rg 1 với 3 hệ dung môi khai triển sau:

- n-BuOH – H 2 O – CH 3 COOH (5:4:1, lớp trên)

Gingsenosid – Rb 1 với 3 hệ dung môi khai triển sau:

- n-BuOH – H 2 O – CH 3 COOH (5:4:1, lớp trên)

Majonosid – R2 với 3 hệ dung môi khai triển sau:

- n-BuOH – H 2 O – CH 3 COOH (5:4:1; lớp trên)

Tiến hành sắc ký mỗi chất với 3 hệ dung môi khác nhau tương ứng ở trên, trên 3 bản sắc ký riêng biệt

Chấm lờn bản mỏng 10 µl dung dịch thử và 10 µl dung dịch đối chiếu, sau đó để khô ở nhiệt độ phòng Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc phun dung dịch acid sulfuric 20% trong ethanol, rồi sấy bản mỏng ở 105 °C trong vài phút Đối với hesperidin, sử dụng sắt (III) clorid 1% trong ethanol, và đối với damnacanthal, dùng dung dịch NaOH 5% trong methanol Trên sắc ký đồ, dung dịch thử cần có các vết cùng giá trị Rf và màu sắc tương đồng với dung dịch đối chiếu.

Mỗi mẫu được đo điểm chảy ba lần bằng máy đo và lấy giá trị trung bình Nghiên cứu này tập trung vào việc đo điểm chảy của các hợp chất diosgenin, hesperidin, berberin clorid, curcumin I, acid oleanolic và damnacanthal.

Phổ UV-Vis mẫu thử phải trùng với phổ UV-Vis chuẩn.

Phổ IR của mẫu thử cần phải khớp với phổ IR chuẩn Trong trường hợp không có phổ chuẩn, phổ mẫu thử vẫn phải thể hiện các đỉnh hấp thu đặc trưng liên quan đến cấu trúc của nó.

Xác định giá trị m/z của ion phân tử giả [M+Na] + , M + , [M-H] - … đặc trưng cho từng chất để từ đó xác định công thức phân tử

Dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của chất chuẩn điều chế phải phù hợp với chất đối chiếu tương ứng hoặc/và theo tài liệu

Các phương pháp định lượng hiện tại chưa được công nhận trong các Dược điển Việt Nam và quốc tế như BP, USP, EP, JP, và IP, cũng như không thuộc về các phương pháp chính thống của AOAC International Do đó, việc đánh giá quy trình định lượng là rất cần thiết, đặc biệt trong việc định lượng acid oleanolic trong các điều kiện sắc ký.

- Nhiệt độ cột : Nhiệt độ phòng

- Tốc độ dòng : 1,0 ml/phút

Để chuẩn bị dung dịch chuẩn, cần cân chính xác khoảng 10,0 mg acid oleanolic vào bình định mức 50 ml Tiếp theo, thêm methanol để hòa tan và điều chỉnh thể tích đến mức yêu cầu Sau đó, lắc đều và lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Để chuẩn bị dung dịch thử, cân chính xác khoảng 10,0 mg mẫu thử vào bình định mức 50 ml Thêm methanol để hòa tan mẫu và điều chỉnh thể tích đến mức yêu cầu Sau đó, lắc đều và lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Tiến hành tiêm dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống, sau đó ghi nhận sắc ký đồ để tính hàm lượng % acid oleanolic (nguyên trạng) trong mẫu thử so với dung dịch chuẩn Đồng thời, thực hiện định lượng asiaticosid theo các điều kiện sắc ký đã được thiết lập.

- Cột: C8 150 x 4,6 mm, kớch thước hạt 5 àm

- Tốc độ dòng: 0,5 ml/ phút

- Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng

- Dung môi pha mẫu: Pha động

Dung dịch asiaticosid điều chế: Cân khoảng 7,5 mg mẫu thử cho vào bình định mức

25 ml Thêm pha động, siêu âm 5 phút Để nguội, bổ sung pha động đến vạch Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 àm

Tiến hành tiêm mẫu trắng và mẫu asiaticosid điều chế vào hệ thống Ghi nhận sắc ký đồ của cả hai mẫu và tính toán tỷ lệ phần trăm diện tích pic asiaticosid trong mẫu sau khi đã loại bỏ các pic từ mẫu trắng Đồng thời, thực hiện định lượng berberin clorid.

Tiến hành theo DĐVN IV, chuyên luận “Berberin clorid”

Dung dịch thử: Hoà tan khoảng 10,0 mg chế phẩm trong pha động và pha loãng thành 100 ml với cùng dung môi

Dung dịch chuẩn: Hoà tan khoảng 10,0 mg berberin clorid chuẩn (đã xác định hàm lượng nước) trong pha động và pha loãng thành 100 ml với cùng dung môi

Pha động: Hoà tan 3,4 g kali dihydro phosphat và 1,7 g natri lauryl sulfat trong hỗn hợp nước - acetonitril (1:1) và pha loãng thành 1.000 ml với cùng dung môi Điều kiện sắc ký:

- Tốc độ dòng : điều chỉnh tốc độ dòng sao cho thời gian lưu của berberin clorid vào khoảng 10 phút

Để tiến hành sắc ký, hòa tan 1 mg berberin clorid và 1 mg palmatin clorid trong 10 ml dung môi Sử dụng cột sắc ký phù hợp để đảm bảo độ phân giải giữa palmatin và berberin đạt tối thiểu 1,5 theo các điều kiện đã nêu.

Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký được thực hiện bằng cách tiêm riêng biệt 5 lần dung dịch chuẩn, với yêu cầu độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic berberin không vượt quá 1,5% Đồng thời, cần định lượng curcumin I theo các điều kiện sắc ký đã được quy định.

Pha động : Acetonitril – dung dịch acid phosphoric 0,1% (55 : 45), điều chỉnh tỉ lệ pha động nếu cần

Tốc độ dòng : 1,0 ml/phút

Để chuẩn bị dung dịch chuẩn, cân chính xác khoảng 10,0 mg curcumin I vào bình định mức 50 ml Thêm pha động để hòa tan và bổ sung thể tích đến mức cần thiết, sau đó lắc đều Tiếp theo, hút 5 ml dung dịch và pha loãng thành 50 ml bằng pha động, cuối cùng lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Cân chính xác khoảng 10,0 mg mẫu thử vào bình định mức 50 ml, sau đó thêm pha động để hòa tan và bổ sung thể tích đến mức yêu cầu Cuối cùng, lắc đều và hút chính xác dung dịch đã chuẩn bị.

5 ml dung dịch trên pha loãng thành 50 ml bằng pha động Lọc qua màng lọc 0,45 àm

Tiến hành tương tự như phần trình bày của acid oleanolic Định lượng diosgenin Điều kiện sắc ký:

- Cột: C8 150 x 4,6 mm, kớch thước hạt 5 àm

- Tốc độ dòng: 1 ml/ phút

- Dung môi pha mẫu: Pha động

Dung dịch chuẩn: Cân khoảng 10,0 mg diosgenin chuẩn cho vào bình định mức

50 ml Thêm pha động, siêu âm 5 phút Để nguội, bổ sung pha động đến vạch Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 àm

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Acid oleanolic

3.1.1 BÀO CHẾ CHẤT CHUẨN ACID OLEANOLIC

Ngưu tất được xắt nhỏ và chiết hồi lưu nóng bằng methanol (MeOH), sau đó dịch chiết MeOH được cô quay dưới áp suất giảm để thu được cao mềm Ngưu tất Tiếp theo, cao Ngưu tất được chiết xuất phân đoạn bằng cột Diaion HP-20, sử dụng nước cất và MeOH làm dung môi rửa giải Sự chiết kiệt các chất trong mỗi phân đoạn được kiểm tra bằng phương pháp sắc ký trên bản mỏng với H2SO4 20%/EtOH 50% Cuối cùng, dịch chiết MeOH được gom lại và cô giảm áp để thu được cắn saponin thô toàn phần.

Thủy phân saponin thô trong H2SO4 20% (pH = 1-2) bằng cách đun hồi lưu cách thủy trong 4 giờ, sau đó để nguội và chiết xuất bằng CHCl3 Tiến hành lắc dịch CHCl3 với nước để loại bỏ acid Dịch chiết CHCl3 thu được được khử nước bằng Na2SO4 và cô đặc dưới áp suất giảm cho đến khi cạn.

Acid oleanolic được kết tinh bằng cách đun sôi CHCl3 trong EtOH nóng kết hợp với than hoạt Sau đó, lọc nóng qua phễu Büchner để thu được dịch lọc Tiếp theo, cô cách thủy để loại bớt EtOH, sau đó để nguội, acid oleanolic sẽ kết tinh và cuối cùng, lọc để thu lấy tinh thể.

Để tinh chế acid oleanolic thô, cần hòa tan tinh thể acid oleanolic trong ethanol nóng cho đến khi tan hoàn toàn Sau đó, để nguội và làm mát dung dịch, rồi lọc lấy tinh thể Quy trình này nên được lặp lại nhiều lần để thu được acid oleanolic tinh khiết.

Kiểm tra độ tinh khiết của mẫu bằng phương pháp SKLM với dung môi CHCl3-MeOH tỉ lệ 95:5 Sử dụng thuốc thử phát hiện H2SO4 10% trong cồn, sau đó sấy ở 110°C trong 10 phút Để nguội và làm lạnh, tiếp theo là lọc lấy tinh thể và kết tinh lại nhiều lần Cuối cùng, thực hiện quá trình đun hồi lưu cách thủy với MeOH trong 3 giờ, lặp lại 3 lần.

Cô giảm áp thu hồi dung môi

Sắc ký phân đoạn qua Diaion HP-20 với nước và MeOH

Phân đoạn MeOH (chứa Saponin)

Cô giảm áp thu hồi dung môi

Thủy phân với H2SO4 20% (pH = 1-2) Đun cách thủy 4h

Rửa nước, khử nước bằng Na2SO 4 khan Lọc Cô giảm áp bốc hơi dung môi

Acid oleanolic Đun nóng với EtOH và than hoạt, lọc nóng

Sau khi thu được acid oleanolic tinh khiết, tiến hành định tính, xác định cấu trúc và thẩm định

3.1.2 ĐịNH TÍNH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC ACID OLEANOLIC

Hình 3.1 Sắc ký đồ kiểm tra acid oleanolic với ba hệ dung môi khác nhau (A) Hệ dung môi 1: Cloroform – ethanol (25:1)

(B) Hệ dung môi 2: Cloroform – methanol (9:1)

(C) Hệ dung môi 3: n-Butanol bão hòa nước

Kết quả kiểm tra acid oleanolic cho thấy, khi sử dụng ba hệ dung môi khác nhau, đều xuất hiện một vết có màu sắc và giá trị Rf trùng khớp với Rf của acid oleanolic chuẩn.

Kết quả trung bình đo điểm chảy acid oleanolic là 309,2 o C nằm trong giới hạn cho phép (309 – 310 o C)

Tiến hành tiêm đồng thời dung dịch mẫu chuẩn và mẫu thử vào hệ thống sắc ký

Thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ của mẫu thử trùng với thời gian lưu của acid oleanolic chuẩn (xem phần định lượng)

Kết quả đo phổ IR cho thấy phổ IR của acid oleanolic điều chế và acid oleanolic chuẩn tương đồng với nhau

C: Acid oleanolic chuẩn T: Acid oleanolic thử

Hình 3.2 Phổ IR của acid oleanolic thử (a) và chuẩn (b)

Phổ HR-MS của acid oleanolic điều chế cho các mảnh ion phân tử giả (quasi- molecular ion) [M-H] - 455,3559 m/z, phù hợp với công thức phân tử C30H 48 O 3 của acid oleanolic

Hình 3.3 Phổ HR-MS của acid oleanolic điều chế

Bảng 3.1 So sánh dữ liệu phổ 13 C-NMR của acid oleanolic điều chế

(125 MHz, δ = ppm, MeOD) và của acid oleanolic (trong C5D 5 N) [36]

Acid oleanolic điều chế Vị trí Acid oleanolic

Hình 3.4 Phổ 1 H-NMR (a) và 13 C-NMR (b) của acid oleanolic điều chế

Nhận xét: Phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của acid oleanolic điều chế phù hợp với acid oleanolic trong tài liệu đã công bố

3.1.3 ĐÁNH GIÁ ACID OLEANOLIC ĐIỀU CHẾ

Bảng 3.2 Kết quả xác định tạp chất liên quan acid oleanolic t R tạp chất (phút) Hàm lượng tạp (%)

Nhận xét:Hàm lượng tạp có trong acid oleanolic điều chế tính theo % diện tích pic là 0,97% < 2,0%

Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu thử xác định tạp chất liên quan acid oleanolic

Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu trắng xác định tạp chất liên quan acid oleanolic

- Đánh giá phương pháp định lượng acid oleanolic

- Tính tương thích hệ thống

Lần lượt bơm 6 lần dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký Kết quả đánh giá tính tương thích hệ thống được trình bày trong Bảng 3.3

Bảng 3.3 Các thông số sắc ký ứng với đỉnh acid oleanolic (n = 6)

Thời gian lưu Diện tích đỉnh Hệ số kéo đuôi Số đĩa lý thuyết

Nhận xét: RSD% của thời gian lưu là 0,89 (< 1,0) và của diện tích đỉnh là 0,22 (< 2,0), hệ số kéo đuôi trung bình 1,132 < 1,5, số đĩa lý thuyết trung bình 32467 >

12000 nên hệ thống đạt tính tương thích

Tiêm mẫu trắng, mẫu thử, mẫu chuẩn, mẫu thử thêm chuẩn acid oleanolic vào hệ thống sắc ký Kết quả cho thấy:

- Sắc ký đồ mẫu thử cho một pic có thời gian lưu ở 10,6 phút trùng với thời gian lưu của acid oleanolic trong sắc ký đồ mẫu chuẩn

Sắc ký đồ mẫu trắng không có pic acid oleanolic, trong khi sắc ký đồ mẫu thử có thêm chuẩn cho thấy chiều cao pic tăng lên so với mẫu thử.

- Phổ UV tại thời gian lưu của acid oleanolic trong sắc ký đồ mẫu thử giống với phổ UV của acid oleanolic trong sắc ký đồ mẫu chuẩn

- Pic acid oleanolic không có thành phần nào khác khi dùng chức năng kiểm tra độ tinh khiết pic

Kết luận: Phương pháp định lượng đã nêu có tính đặc hiệu đối với acid oleanolic

Hình 3.7 Sắc ký đồ thẩm định tính đặc hiệu acid oleanolic

(a): mẫu chuẩn; (b): mẫu thử: (c): mẫu trắng; (d): mẫu thử thêm chuẩn nm

Hình 3.8 Phổ UV tại thời gian lưu của acid oleanolic chuẩn (a) và thử (b)

Kết quả đánh giá độ lặp lại được trình bày trong Bảng 3.4

Bảng 3.4 Kết quả độ lặp lại của phương pháp định lượng (%) acid oleanolic

Số lần xác định Hàm lượng Số liệu thống kê

Nhận xét: Hàm lượng trung bình của acid oleanolic là 104,94%, RSD = 0,41%

Kết luận: Phương pháp định lượng acid oleanolic trên đạt độ lặp lại

Xây dựng đường chuẩn với 6 mẫu dung dịch acid oleanolic chuẩn có nồng độ tăng dần từ 24 – 300 àg/ml Kết quả được trỡnh bày trong Bảng 3.5

Bảng 3.5 Sự tương quan giữa diện tích và nồng độ acid oleanolic

STT Nồng độ (àg/ml) Diện tớch đỉnh

Di ện tíc h đỉ nh

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ acid oleanolic

Kiểm tra tính tương thích hệ thống:

F = 19655 > F α = 7,708  phương trình hồi quy tương thích t = 1,29 < t α = 2,57  Hệ số b không có nghĩa

Nhận xét: R 2 = 0,9998 > 0,995, như vậy có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích đỉnh và nồng độ acid oleanolic

Kết quả đánh giá độ đúng được trình bày trong Bảng 3.6

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ đúng phương pháp định lượng acid oleanolic

Nhận xét: Tỉ lệ hồi phục của các mẫu đều nằm trong khoảng giới hạn 98,0 – 102,0% Kết luậnphương pháp đạt độ đúng

Phương pháp thẩm định cho thấy quy trình xử lý mẫu và điều kiện sắc ký đạt được độ đúng, độ chính xác, tính tuyến tính, tính tương thích hệ thống và độ lặp lại, cho phép định lượng acid oleanolic trong nguyên liệu một cách hiệu quả.

• Áp dụng quy trình trên định lượng acid oleanolic

Hàm lượng trung bình của acid oleanolic là 104,9% (n = 6), tính theo nguyên trạng

K ết luận : Acid oleanolic điều chế đủ điều kiện để thiết lập chất chuẩn

Bảng 3.7 Tóm tắt kết quả đánh giá chất điều chế acid oleanolic

Chỉ tiêu Giới hạn Kết quả

Tạp chất liên quan ≤ 2,0 % Đạt (0,97%) Định lượng

95– 105%, tính theo nguyên trạng Đạt (104,9%)

3.1.4 ĐÓNG GÓI VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỒNG NHẤT LỌ ACID OLEANOLIC 3.1.4.1 Đóng gói

Khối lượng đóng lọ : 10 mg/ lọ

Số lọ đóng được (N) : 100 lọ

3.1.4.2 Đánh giá đồng nhất lọ

- Số lọ cần lấy để đánh giá độ đồng nhất: g = N +1 = 11 lọ.

- Lấy ngẫu nhiên các lọ theo phần mềm Excel, số thứ tự các lọ sẽ lấy để định lượng là: 09, 19, 30, 40, 58, 60, 69, 71, 88, 89, 100, mỗi lọ kiểm tra 2 lần.

Bảng 3.8 Kết quả định lượng acid oleanolic đánh giá đồng nhất lô.

STT Lọ số Lần 1 (%) Lần 2 (%)

Trắc nghiệm Dixon được sử dụng để xác định loại giá trị bất thường trong dữ liệu bằng cách xếp các kết quả theo thứ tự tăng dần Trong trường hợp này, hai kết quả nhỏ nhất và lớn nhất được xem xét: giá trị nhỏ nhất x min = 104,19% với G = 0,111, nhỏ hơn G 0,05 = 0,468; và giá trị lớn nhất x max = 105,40% với G = 0,102, cũng nhỏ hơn G 0,05 = 0,468.

Vậy, kết quả 104,19% và 105,40% không bất thường, nghĩa là chuỗi dữ liệu trên không có giá trị bất thường

- Phân tích phương sai một yếu tố theo ANOVA

Bảng 3.9 Bảng phân tích ANOVA kết quả đánh giá đồng nhất lô acid oleanolic

Nguồn sai số Tổng bình phương

Nhận xét, F = 0,662 < F0,05 = 2,854, khi đó ta có

Do đó áp dụng công thức chuyển đổi để tính u bb Kết quả thu được như sau:

Nhận xét, 0,027 < u bb 2 = 0,035 < 0,109, do đó kết luận các lọ acid oleanolic đồng nhất trong quá trình đóng gói.

3.1.5 ĐÁNH GIÁ ACID OLEANOLIC LIÊN PHÒNG THÍ NGHIỆM

3.1.5.1 Tính tương thích hệ thống tại ba phòng thí nghiệm hợp tác

Bảng 3.10 Các thông số của hệ thống sắc ký định lượng acid oleanolic tại các phòng thí nghiệm hợp tác

Yêu cầu PTN 1 PTN 2 PTN 3

PTN 1: Phòng kiểm tra chất lượng, Công ty Cổ phần Hóa dược phẩm Mekophar PTN 2: Khoa thiết lập chất chuẩn và chất đối chiếu, VKN thuốc TP HCM

PTN 3: Phòng kiểm tra chất lượng, Công ty Cổ phần Dược phẩm OPC

Giá trị RSD của các thông số sắc ký đều nhỏ hơn 2%, cho thấy hệ thống HPLC của ba phòng thí nghiệm hợp tác đạt tính tương thích cao.

3.1.5.2 Xác định giá trị ấn định, độ không đảm bảo đo và giá trị công bố trên phiếu kiểm nghiệm

Bảng 3.11 Kết quả định lượng acid oleanolic (%) tại ba phòng thí nghiệm

Bảng 3.12 Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng acid oleanolic (n = 18) x* (0) x* (1) x* (2) x* (3) x* (4) x* (5) δ = 1,5 x s* - 0,48 0,47 0,47 0,47 0,47 x* - δ - 104,54 104,56 104,57 104,57 104,57 x* + δ - 105,50 105,51 105,51 105,51 105,51

Trung bình 105,03 105,04 105,04 105,04 105,04 105,04 Độ lệch s 0,32 0,28 0,28 0,28 0,28 0,28 x* mới 105,02 105,04 105,04 105,04 105,04 105,04 s* mới 0,320 0,316 0,314 0,313 0,312 0,312

Nhận xét: Sau năm lần thay đổi, giá trị s* không thay đổi (= 0,312), khi đó giá trị x* được chọn là 105,04%

Dựa vào kết quả đã tính toán, giá trị z-core được xác định là 104,36 với |z| = 2,16, vì vậy giá trị này sẽ bị loại Sau khi tính toán trung bình của 17 kết quả còn lại, chúng ta thu được kết quả như sau:

Hàm lượng trung bình : 105,07% (n = 17) Độ lệch s : 0,28 Độ khụng đảm bảo đo à : 0,092

Chất điều chế acid oleanolic, mã lô Olean.Ref.012011, đã đạt tiêu chuẩn để đăng ký chuẩn quốc gia với hàm lượng xác định là 105,07% so với nguyên trạng (n = 17, độ lệch = 0,28, độ không đảm bảo đo = 0,092).

3.1.6 ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA CHẤT CHUẨN ACID OLEANOLIC ĐIỀU CHẾ

Mẫu acid oleanolic 10 mg có độ tinh khiết 0,97% sau khi trải qua quá trình lão hóa cấp tốc trong tủ vi khí hậu với điều kiện 40 ± 2 oC và độ ẩm tương đối 75 ± 5% Để kiểm tra độ tinh khiết của mẫu, các phương pháp sắc ký lớp mỏng và HPLC đã được thực hiện.

Hình 3.10 Sắc ký đồ kiểm tra acid oleanolic với ba hệ dung môi khác nhau

(A) Hệ dung môi 1: Cloroform – ethanol (25:1)

(B) Hệ dung môi 2: Cloroform – methanol (9:1)

Kết quả kiểm tra acid oleanolic sau quá trình lão hóa cấp tốc ở thời điểm 3 tháng và 6 tháng với ba hệ dung môi khác nhau đều cho thấy chỉ xuất hiện một vết.

T 3 : Acid oleanolic ở thời điểm 3 tháng

T 6 : Acid oleanolic ở thời điểm 6 tháng

Thuốc thử phát hiện: Acid sulfuric 20%/EtOH 50%, sấy 110 o C

3.1.6.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Khảo sát tính tương thích của hệ thống được thực hiện trên mẫu đã trải qua quá trình lão hóa cấp tốc trong 6 tháng Trong thí nghiệm, dung dịch thử được bơm vào hệ thống sắc ký tổng cộng 6 lần Kết quả của nghiên cứu được trình bày chi tiết trong bảng.

Bảng 3.13 Bảng kết quả tính tương thích hệ thống

Số lần tiêm t R (phút) Diện tích đỉnh Số đĩa lý thuyết Hệ số kéo đuôi

RSD% của thời gian lưu là 0,14% (< 1,0%) và của diện tích đỉnh là 1,24% (< 2%), hệ số kéo đuôi trung bình 1,06 < 1,5, nên đạt tính tương thích hệ thống

- Sắc ký đồ ở các thời điểm

Hình 3.11 Sắc ký đồ HPLC của acid oleanolic ở thời điểm T3.

Hình 3.12 Sắc ký đồ HPLC của acid oleanolic ở thời điểm T6.

Hình 3.13 Sắc ký đồ HPLC của mẫu trắng.

Kết quả xác định tạp chất liên quan và độ tinh khiết của acid oleanolic ở thời điểm t = 3 tháng được trình bày ở Bảng 3.14

Bảng 3.14 Bảng tính độ tinh khiết của acid oleanolic ở thời điểm 3 tháng

(Lần) Diện tích tổng tạp Diện tích đỉnh chính

Tạp chất (%) Độ tinh khiết (%)

Kết quả xác định tạp chất liên quan và độ tinh khiết của acid oleanolic ở thời điểm t = 6 tháng được trình bày bênBảng 3.15

Bảng 3.15 Bảng tính độ tinh khiết của acid oleanolic ở thời điểm 6 tháng

3.1.6.3 Đánh giá độ ổn định của chất chuẩn acid oleanolic

Hàm lượng của acid oleanolic ở các thời điểm T0, T 3 , T 6 được trình bày ở Bảng 3.16

Bảng 3.16 Bảng hàm lượng acid oleanolic ở các thời điểm.

Thời gian (tháng) Hàm lượng (%)

Ghi chú: Hàm lượng (%) ở T0dựa vào kết quả xác định đã công bố [6]

Hệ số hồi quy được tính toán như sau: b 1 ∑

Vậy hệ số tương quan b1 không đáng kể

Sự bất ổn định không được quan sát thấy

Kết luận : Chất chuẩn acid oleanolic, lọ 10 mg, số lô: Olean.Ref.012011, hàm lượng

105.0% (tính theo nguyên trạng) do Ban NCKH – TV, Khoa Dược, Đại Học Y Dược Tp Hồ Chí Minh sản xuất ổn định ở điều kiện lão hóa cấp tốc: (nhiệt độ 40 ±

2 o C, RH = 75 ± 5%) trong thời gian 6 tháng Độ ổn định chất chuẩn acid oleanolic đang được tiếp tục theo dõi.

Asiaticosid

3.2.1 BÀO CHẾ CHẤT CHUẨN ASIATICOSID

Cao khô Rau má được xử lý qua cột Diaion-HP20 và rửa giải với các dung môi MeOH 10%, 50%, 100% và dicloromethan Các phân đoạn MeOH 50% và 100% được kết hợp, sau đó cô đặc dung môi dưới áp suất giảm để thu được saponin toàn phần Saponin này được phân tách bằng sắc ký cột nhanh với dung môi dicloromethan, rửa giải bằng dung môi dicloromethan – methanol với độ phân cực tăng dần, từ đó thu được các phân đoạn chứa asiaticosid và cuối cùng là asiaticosid thô.

Asiaticosid thô được tinh chế bằng cách sử dụng sắc ký lỏng cao áp điều chế để thu được asiaticosid tinh khiết Điều kiện HPLC điều chế:

- Máy sắc ký: Shimadzu LC 20A

- Cột: Discovery HS C18 250 x 21,2 mm, 10 àm + Cột bảo vệ C18

- Tốc độ dòng: 20 ml/ phút

- Mẫu tiêm: 10 ml ( ~ 20 mg/ ml phân đoạn giàu asiaticosid/ pha động)

- Sắc ký cột Diaion HP-20 với nước, MeOH 10%, MeOH 50%, MeOH 100% và CH 2 Cl 2

- Gom chung phân đoạn MeOH 50% và 100%

- Sắc ký cột nhanh silicagel với hệ dung môi CH 2 Cl 2 – MeOH tăng dần độ phân cực

- Gom và cô các phân đoạn chứa chủ yếu asiaticosid

- HPLC điều chế với cột RP-18

Sau khi thu được asiaticosid tinh khiết, tiến hành định tính, xác định cấu trúc và thẩm định

Asiaticosid Cao khô Rau má

3.2.2 ĐịNH TÍNH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC

Hình 3.14 Sắc ký đồ SKLM kiểm tra asiaticosid điều chế với ba hệ dung môi

(1) Hệ dung môi 1: Cloroform – methanol – acid acetic (5:2:1)

(2) Hệ dung môi 2: Ethyl acetat – methanol – nước (11:4:2)

(3) Hệ dung môi 3: Cloroform – methanol – nước (65:35:10; lớp dưới)

Nhận xét: Sau khi sắc ký qua ba hệ dung môi khác nhau, asiaticosid điều chế sạch do không lẫn tạp kèm theo trên sắc ký lớp mỏng

Phổ IR cho phép xác định một số nhóm chức trong cấu trúc của asiaticosid:

Hình 3.15 Phổ IR của asiaticosid điều chế

Phổ UV-Vis asiaticosid thử trùng với phổ UV-Vis asiaticosid chuẩn

Hình 3.16 Phổ UV-Vis asiaticosid thử (a) và chuẩn (b)

Phổ HR-MS của asiaticosid điều chế cho pic ion [M + Na] + có số khối 981,5029 m/z; phù hợp với công thức phân tử C48H 78 O 19 của asiaticosid

Hình 3.17 Phổ HR-MS của asiaticosid điều chế

Hình 3.18 Phổ 1 H-NMR của asiaticosid điều chế (500 MHz, δ = ppm, CDCl3 và

Nhận xét: Phổ 1 H-NMR của asiaticosid điều chế đo ở 500 MHz trong dung môi CDCl 3 và MeOD cho các tín hiệu proton đặc trưng sau:

- 7 tín hiệu proton – CH3 ở 0,723 ppm (3H, s); 0,778 ppm (3H, s); 0,839 ppm

(3H, d, J = 5,5 Hz); 0,927 ppm (3H, s); 1,003 ppm (3H, s); 1,071 ppm (3H, s); 1,268 ppm (3H, d, J = 6,5 Hz) có thể gán lần lượt cho các nhóm – CH3 ở vị trí 24; 25; 26; 27; 29; 30; 6’’’

- Tín hiệu proton của nhóm methyl nối trực tiếp với oxygen cộng hưởng ở trường thấp 4,280 ppm (2H, d, J = 7,5 Hz); 5,283 ppm (1H, d, J = 7,5 Hz) có thể gán cho 1’’’; 1’

Trong vùng 3,0 – 5,0 ppm, có nhiều tín hiệu có thể liên quan đến proton của các nhóm –CHOH trên aglycon và chuỗi đường Tuy nhiên, do sự chồng chéo của các tín hiệu này, việc xác định chính xác trở nên khó khăn.

Hình 3.19 Phổ 13 C-NMR của asiaticosid điều chế (125 MHz, δ = ppm, CDCl 3 và

Bảng 3.17 So sánh dữ liệu phổ 13 C-NMR của asiaticosid điều chế (125 MHz, δ = ppm, CDCl 3 và MeOD) với asiaticosid theo tài liệu [48]

C Asiaticosid điều chế Asiaticosid [48] C Asiaticosid điều chế Asiaticosid [48]

Nhận xét: Dữ liệu phổ 13 C-NMR của asiaticosid điều chế phù hợp với asiaticosid theo tài liệu

3.2.3 ĐÁNH GIÁ ASIATICOSID ĐIỀU CHẾ

- Phương pháp HPLC dựa vào phần trăm diện tích

Hình 3.20 Sắc ký đồ xác định tạp chất liên quan asiaticosid

Bảng 3.18 Kết quả xác định tạp chất liên quan asiaticosid t R tạp chất (phút) Hàm lượng tạp (%)

Nhận xét: Hàm lượng tạp có trong mẫu asiaticosid điều chế tính theo phần trăm diện tích pic là 1,47% < 2%

Hình 3.21 Sắc ký đồ quét nhiệt vi sai mẫu asiaticosid điều chế

Nhận xét:Độ tinh khiết mẫu asiaticosid điều chế là 92,86 mol% > 92 mol%

Độ tinh khiết của asiaticosid được xác định qua phương pháp quét nhiệt vi sai chỉ mang tính tham khảo, do asiaticosid là một chất vô định hình, không phải tinh thể.

- Đánh giá phương pháp định lượng asiaticosid

Bảng 3.19 Các thông số sắc ký ứng với đỉnh asiaticosid sau sáu lần tiêm liên tiếp

Số lần bơm t R Diện tích đỉnh Số đĩa lý thuyết Hệ số kéo đuôi

Hệ thống đạt tính tương thích với RSD của thời gian lưu là 0,02%, nhỏ hơn 1%, và RSD của diện tích đỉnh, số đĩa lý thuyết, cùng hệ số kéo đuôi lần lượt là 0,076%, 0,293% và 0,146%, đều nhỏ hơn 2%.

Tiêm mẫu trắng, mẫu thử, mẫu chuẩn, mẫu thử thêm chuẩn của asiaticosid vào hệ thống sắc ký Kết quả cho thấy:

Thời gian lưu của pic asiaticosid trong mẫu thử là 6 phút, tương đương với thời gian lưu của pic asiaticosid trong mẫu chuẩn Đặc biệt, mẫu trắng không xuất hiện pic nào trùng với pic asiaticosid, như thể hiện trong Hình 3.22 (a), (b) và (c).

- Khi thêm một lượng chất chuẩn asiaticosid vào mẫu thử, chiều cao và diện tích pic asiaticosid tăng lên so với trước khi thêm chuẩn (Hình 3.22 (d))

- Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic asiaticosid trong mẫu thử giống phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic asiaticosid trong mẫu chuẩn (Hình 3.16)

- Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết cho thấy pic asiaticosid không có các thành phần khác trong tất cả các mẫu (Hình 3.23)

Kết luận:Phương pháp định lượng đã nêu có tính đặc hiệu đối với asiaticosid

Hình 3.22 Sắc ký đồ đánh giá tính đặc hiệu asiaticosid (a): Mẫu chuẩn; (b): Mẫu thử; (c): Mẫu trắng; (d): Mẫu thử thêm chuẩn

Hình 3.23 Hình biểu diễn độ tinh khiết pic asiaticosid chuẩn (a) và thử (b)

- Tính tuyến tính và miền giá trị

Tiến hành sắc ký 6 mẫu chuẩn asiaticosid với nồng độ tăng dần từ 98,64 – 789,12 àg/ml Kết quả được trỡnh bày trong Bảng 3.20

Bảng 3.20 Sự tương quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ

Số thứ tự Nồng độ (àg/ml) Diện tớch đỉnh trung bỡnh

Hình 3.24 Sắc ký đồ mẫu chuẩn asiaticosid ở sáu nồng độ tăng dần từ 98,64 –

Hình 3.25 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ asiaticosid

Kiểm tra tính tương thích phương trình hồi quy: y = 17142x + 61791 t = 1,23 < t 0,05 = 2,78: Hệ số 61791 không có ý nghĩa

F = 34257 > F 0,05 = 7,708: Phương trình trên tương thích

Nhận xét: R 2 = 0,9999 > 0,995, như vậy có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích đỉnh và nồng độ asiaticosid

Kết quả đánh giá độ lặp lại được trình bày trongBảng 3.21

Bảng 3.21 Kết quả độ lặp lại của phương pháp định lượng asiaticosid

Số lần xác định Hàm lượng (%) Số liệu thống kê

Nhận xét: Hàm lượng trung bình của asiaticosid là 97,83%, RSD bằng 0,49% nhỏ hơn 2,0%

Kết luận:Phương pháp định lượng asiaticosid đã nêu đạt độ lặp lại

Kết quả đánh giá được trình bày trong Bảng 3.22

Bảng 3.22 Kết quả đánh giá độ đúng phương pháp định lượng asiaticosid

Mẫu Mức hàm lượng Lượng thêm vào

Nhận xét: Tỉ lệ hồi phục của các mẫu ở từng nồng độ đều nằm trong khoảng giới hạn 95,0 – 105,0% Kết luậnphương pháp đạt độ đúng

Kết quả đánh giá cho thấy phương pháp xử lý mẫu và điều kiện sắc ký đã đạt được tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, miền giá trị, độ lặp lại và độ đúng.

Kết luận: Phương pháp định lượng này có thể được áp dụng để định lượng asiaticosid trong nguyên liệu.

- Áp dụng quy trình trên định lượng asiaticosid

Hàm lượng trung bình của asiaticosid là 97,83% (n = 6) tính theo nguyên trạng

Kết luận:Asiaticosid điều chế đủ điều kiện để thiết lập chất chuẩn

Bảng 3.23 Tóm tắt kết quả đánh giá chất điều chế asiaticosid

- Độ tinh khiết > 92 mol% Đạt (1,47%) Đạt (92,86 mol%) Định lượng asiaticosid

97 – 103%, tính theo nguyên trạng Đạt (97,83%)

3.2.4 ĐÓNG GÓI VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỒNG NHẤT LỌ ASIATICOSID

Khối lượng đóng lọ: 10 mg/ lọ

Số lọ đóng được (N): 100 lọ

- Số lọ cần lấy để đánh giá đồng nhất lọ: g = N + 1= 11 lọ

- Lấy ngẫu nhiên các lọ theo phần mềm Excel, số thứ tự các lọ sẽ lấy để định lượng là 84, 72, 70, 25, 1, 93, 19, 96, 57, 89, 73; mỗi lọ kiểm tra 2 lần

Bảng 3.24 Kết quả định lượng asiaticosid điều chế đánh giá đồng nhất lô

STT Lọ số Lần 1 (%) Lần 2%

Phương pháp trắc nghiệm Dixon được sử dụng để xác định giá trị bất thường trong dữ liệu Đầu tiên, xếp các kết quả theo thứ tự tăng dần và xét hai giá trị nhỏ nhất và lớn nhất Kết quả cho thấy giá trị nhỏ nhất x min = 96,88% với G = 0,083, nhỏ hơn G0,05 = 0,468; trong khi giá trị lớn nhất x max = 99,76% cũng có G = 0,083, vẫn nhỏ hơn G0,05 = 0,468.

Vậy, chuỗi dữ liệu trên không có giá trị bất thường

Bảng 3.25 Bảng phân tích ANOVA kết quả đánh giá đồng nhất lô asiaticosid

Biến thiên Tổng độ lệch bình phương Bậc tự do Phương sai F F 0,05

Nhận xét: F = 2,816 < F 0,05 = 2,854, khi đó ta có: n

= 0,469 < à bb = 0,632 Kết luận: Các lọ asiaticosid đồng nhất trong quá trình đóng gói

3.2.5 ĐÁNH GIÁ ASIATICOSID LIÊN PHÒNG THÍ NGHIỆM

3.2.5.1 Tính tương thích hệ thống tại ba phòng thí nghiệm

Bảng 3.26 trình bày giá trị RSD của các thông số hệ thống sắc ký định lượng asiaticosid tại ba phòng thí nghiệm hợp tác, bao gồm thời gian lưu tR, diện tích đỉnh, số đĩa lý thuyết và hệ số kéo đuôi.

PTN 1: Phòng kiểm tra chất lượng, công ty cổ phần Hóa – Dược phẩm Mekophar PTN 2: Khoa thiết lập chất chuẩn và chất đối chiếu, Viện Kiểm Nghiệm thuốc TP HCM

PTN 3: Khoa kiểm nghiệm các dạng bào chế, Viện Kiểm Nghiệm thuốc TP HCM

Giá trị RSD của các thông số sắc ký ở ba phòng thí nghiệm hợp tác đều nhỏ hơn 2%, chứng tỏ hệ thống HPLC của các phòng thí nghiệm này đạt tính tương thích cao.

3.2.5.2 Xác định giá trị ấn định, độ không đảm bảo đo và giá trị công bố trên phiếu kiểm nghiệm của asiaticosid

Bảng 3.27 Kết quả định lượng (%) asiaticosid tại ba phòng thí nghiệm

Bảng 3.28 Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng (%) asiaticosid (n = 18) x* (0) x* (1) x* (2) δ = 1,5 x s* - 1,012 1,055 x* - δ - 97,743 97,56 x* + δ - 99,767 99,669 Trung bình 98,56 98,614 98,614 Độ lệch s 0,71 0,62 0,62 x* mới 98,755 98,614 98,614 s* mới 0,675 0,704 0,704

Nhận xét: Sau 2 lần thay đổi, giá trị s* không thay đổi (0,704), khi đó giá trị x* mới được chọn là 98,614%

Từ kết quả trên, tính z – score Kết quả có một giá trị 97,19% có z = 2,024 > 2 Tính trung bình 17 kết quả còn lại, thu được kết quả như sau:

Hàm lượng trung bình: 98,64% (n = 17) Độ lệch s: 0,62 Độ khụng đảm bảo đo à: 0,207

K ết luận: Chất điều chế asiaticosid, lô Asia.Ref.012011, đủ điều kiện để đăng ký chuẩn quốc gia với hàm lượng được xác định là 98,64% tính theo nguyên trạng (n 17, s = 0,62, à = 0,207)

3.2.6 ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CHẤT CHUẨN ASIATICOSID ĐIỀU CHẾ

Mẫu asiaticosid 10 mg có 1,46% tạp chất sau khi trải qua quá trình lão hóa cấp tốc trong tủ vi khí hậu với điều kiện 40 ± 2 độ C và độ ẩm tương đối 75 ± 5% Để kiểm tra độ tinh khiết của mẫu, phương pháp sắc ký lớp mỏng và HPLC đã được sử dụng.

Hình 3.26 Sắc ký đồ kiểm tra asiaticosid với ba hệ dung môi khác nhau

(1) Hệ dung môi 1: Cloroform – methanol – acid acetic (5:2:1)

(2) Hệ dung môi 2: Ethyl acetat – methanol – nước (11:4:2)

(3) Hệ dung môi 3: Cloroform – methanol – nước (65:35:10; lớp dưới)

Nhận xét: Kết quả kiểm tra asiaticosid sau khi lão hóa cấp tốc tại thời điểm 3 tháng với ba hệ dung môi khác nhau đều cho một vết

Khảo sát tính tương thích của hệ thống được thực hiện trên mẫu đã lão hóa cấp tốc trong 3 tháng Trong quá trình thử nghiệm, dung dịch thử đã được bơm vào hệ thống sắc ký tổng cộng 6 lần Kết quả khảo sát được trình bày chi tiết trong Bảng 3.29.

Thuốc thử phát hiện: Acid sulfuric 20%/ EtOH 50%, sấy 110 o C

Số lần tiêm t R Diện tích đỉnh Số đĩa lý thuyết Hệ số kéo đuôi

Hình 3.27 Sắc ký đồ HPLC của asiaticosid ở thời điểm T3.

Kết quả xác định tạp chất liên quan và độ tinh khiết của asiaticosid ở thời điểm t = 3 tháng được trình bày ở Bảng 3.30

Bảng 3.30 Bảng tính độ tinh khiết của asiaticosid ở thời điểm 3 tháng

3.2.6.3 Đánh giá độ ổn định của chất chuẩn asiaticosid

Hàm lượng của asiaticosid ở các thời điểm T0, T 3 được trình bày ở Bảng 3.31

Bảng 3.31 Bảng hàm lượng asiaticosid ở các thời điểm.

Nhận xét: Kết quả đánh giá lại không khác biệt quá 0,5%

Kết luận : Chất chuẩn asiaticosid, lọ 10 mg, số lô: Asia.Ref.012011, hàm lượng

98,64 (tính theo nguyên trạng) do Ban NCKH – TV, Khoa Dược, Đại Học Y Dược

Tp Hồ Chí Minh sản xuất ổn định ở điều kiện lão hóa cấp tốc: (nhiệt độ 40 ± 2 o C,

RH = 75 ± 5%) trong thời gian 3 tháng Độ ổn định chất chuẩn asiaticosid đang được tiếp tục theo dõi

- Hòa vào EtOH nóng Hòa tan

- Lọc nóng Để nguội kết tinh

Kết tinh lại nhiều lần như trên

Berberin clorid

3.3.1 BÀO CHẾ CHẤT CHUẨN BERBERIN CLORID

Berberin clorid được điều chế từ berberin clorid (Ấn độ, hàm lượng 98%) bằng cách kết tinh lại nhiều lần trong EtOH nóng với than hoạt

Sau khi thu được berberin clorid tinh khiết, tiến hành định tính, xác định cấu trúc và thẩm định

3.3.2 ĐịNH TÍNH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC BERBERIN CLORID

Hình 3.29 Sắc ký đồ SKLM kiểm tra berberin clorid điều chế với ba hệ dung môi

(A) Hệ dung môi 1: n-Butanol – nước – acid acetic (7:2:1).

(B) Hệ dung môi 2: Ethyl acetat – n-buthanol – acid formic – nước (50:30:12:10)

(C) Hệ dung môi 3: Iso-propanol – acid formic – nước (100:2:10)

Kết quả kiểm tra berberin clorid được điều chế với ba hệ dung môi khác nhau cho thấy đều xuất hiện một vết có Rf trùng khớp với Rf của berberin clorid chuẩn Sự xuất hiện này khẳng định tính chính xác trong quá trình điều chế, đặc biệt khi thêm palmatin.

C: Berberin clorid chuẩn T: Berberin clorid thử T+palmatin: Thử thêm palmatin clorid

Ánh sáng thường và các bước sóng UV 254 nm và UV 365 nm được sử dụng để phân tích mẫu thử Qua việc sử dụng TT Dragendoff, sự xuất hiện rõ ràng của vết palmatin cho thấy hệ dung môi đã phát triển một cách đặc hiệu đối với berberin clorid, đồng thời xác nhận rằng mẫu thử không chứa palmatin clorid, hoặc chỉ có một lượng rất nhỏ không đáng kể.

Kết quả trung bình đo điểm chảy berberin clorid là 204,7 o C nằm trong giới hạn cho phép (204 – 206 o C)

Thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ của mẫu thử trùng với thời gian lưu của berberin clorid chuẩn (xem phần định lượng)

Kết quả đo phổ IR của berberin clorid điều chế so với berberin clorid chuẩn cho thấy hai phổ này tương đồng với nhau

Hình 3.30 Phổ IR của berberin clorid thử (a) và chuẩn (b)

Phổ HR-MS của berberin clorid điều chế cho các mảnh có pic ion phân tử giả [M + ] 336,1257 m/z, phù hợp với công thức phân tử C20H 18 NO 4 của berberin

Hình 3.31 Phổ HR-MS của berberin clorid điều chế

Bảng 3.32 So sánh dữ liệu phổ 13 C-NMR của berberin clorid điều chế

(125 MHz, δ = ppm, CD3OD) và của berberin clorid (DMSO-d6) theo tài liệu [25]

Hình 3.32 Phổ 1 H-NMR (a) và phổ 13 C-NMR của berberin clorid điều chế

Nhận xét: Phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của berberin clorid điều chế phù hợp với berberin clorid theo tài liệu đã công bố

3.3.3 ĐÁNH GIÁ BERBERIN CLORID ĐIỀU CHẾ

Hàm lượng nước berberin clorid theo phương pháp Karl-Fischer là 8,09%, đáp ứng yêu cầu ghi trong DĐVN IV (8 – 12%)

Kết quả xác định tạp chất liên quan berberin clorid được trình bày trong Bảng 3.33.

Bảng 3.33 Kết quả xác định tạp chất liên quan berberin clorid

Tổng diện tích pic tạp trong dung dịch thử 6770

Diện tích pic berberin clorid trong dung dịch chuẩn 77014

Tổng diện tích các pic tạp trong mẫu thử nhỏ hơn nhiều so với diện tích pic berberin clorid trong mẫu chuẩn, cho thấy berberin clorid được điều chế đạt tiêu chuẩn về giới hạn tạp chất theo yêu cầu của DĐVN IV.

Hình 3.33 Sắc ký đồ tạp chất liên quan berberin clorid

- Đánh giá phương pháp định lượng berberin clorid

- Khảo sát tính tương thích hệ thống

Bảng 3.34 Kết quả kiểm tra tính tương thích hệ thống berberin clorid (n=6)

Thời gian lưu Diện tích đỉnh Hệ số kéo đuôi Số đĩa lý thuyết

Nhận xét: Với sáu lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn, RSD của thời gian lưu là 0,4%

< 1,0%; RSD của diện tích pic là 0,7% < 1,5% Do đó, có thể áp dụng phương pháp định lượng này để định lượng berberin clorid trong nguyên liệu

Sắc ký đồ của dung dịch phân giải chứa berberin clorid và palmatin cho thấy hai pic tách biệt hoàn toàn với độ phân giải đạt 2,9, vượt quá mức tối thiểu 1,5 Do đó, cột hiện tại có thể được sử dụng để định lượng berberin clorid một cách hiệu quả.

Kết quả định lượng cho thấy hàm lượng trung bình của berberin clorid đạt 92,99% (n = 6) khi tính theo nguyên trạng Điều này cho thấy hàm lượng berberin clorid trong chế phẩm khan là 101,08%, vượt mức yêu cầu 95,00%.

Vậy, berberin clorid điều chế đủ điều kiện để thiết lập chất chuẩn quốc gia

0 50 100 150 200 250 bar A.Press.(Status) Detector A:345nm

P al m at in/ 8 712 B er ber ine H C L/ 9 923

Hình 3.34 Sắc ký đồ định lượng berberin clorid (a): dung dịch phân giải chứa berberin clorid và palmatin;

Bảng 3.35 Tóm tắt kết quả đánh giá chất điều chế berberin clorid

Tổng diện tích pic tạp trong dung dịch thử phải nhỏ hơn diện tích pic berberin clorid trong dung dịch chuẩn Đạt

95,0 – 102,0%, tính trên chế phẩm khan Đạt (101,99%)

3.3.4 ĐÓNG GÓI VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỒNG NHẤT LỌ BERBERIN CLORID 3.3.4.1 Đóng gói

Khối lượng đóng lọ : 20 mg/lọ

- Lấy ngẫu nhiên các lọ theo phần mềm Excel, số thứ tự các lọ sẽ lấy để định lượng là: 05, 21, 29, 32, 66, 67, 77, 83, 87, 92, 95, mỗi lọ kiểm tra 2 lần.

- Kết quả định lượng được trình bày trong Bảng 3.36

Bảng 3.36 Kết quả định lượng berberin clorid đánh giá đồng nhất lô

Trong việc xác định loại giá trị bất thường bằng trắc nghiệm Dixon, các kết quả được xếp theo thứ tự tăng dần Hai kết quả nhỏ nhất và lớn nhất được xem xét: giá trị nhỏ nhất (x min) là 92,87% với G = 0,235, nhỏ hơn G 0,05 là 0,468; trong khi giá trị lớn nhất (x max) là 94,66% với G = 0,208, cũng nhỏ hơn G 0,05 là 0,468.

Bảng 3.37 Phân tích ANOVA kết quả đánh giá đồng nhất lô berberin clorid

Nhận xét, F = 1,093 < F0,05 = 2,854, khi đó ta có

Nhận xét, 0,010 < u bb 2 = 0,047 < 0,120, do đó kết luận các lọ berberin clorid đồng nhất trong quá trình đóng gói

3.3.5 ĐÁNH GIÁ BERBERIN CLORID LIÊN PHÒNG THÍ NGHIệM

Bảng 3.38 Các thông số của hệ thống sắc ký định lượng berberin clorid tại các phòng thí nghiệm hợp tác

PTN 1: Phòng kiểm tra chất lượng, Công ty Cổ phần Hóa dược phẩm Mekophar PTN 2: Khoa thiết lập chất chuẩn và chất đối chiếu, VKN thuốc TP HCM

PTN 3: Khoa kiểm nghiệm các dạng bào chế, VKN thuốc TP HCM

Giá trị RSD của các thông số sắc ký ở ba phòng thí nghiệm hợp tác đều nhỏ hơn 2%, cho thấy hệ thống HPLC đạt tính tương thích cao.

3.3.5.2 Xác định giá ấn định, độ không đảm bảo đo và giá trị công bố trên phiếu kiểm nghiệm của berberin clorid

Bảng 3.39 Kết quả định lượng berberin clorid (%) tại ba phòng thí nghiệm

Bảng 3.40 Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng berberin clorid (n = 18)

Trung bình 93,71 93,73 93,73 93,73 Độ lệch s 0,47 0,45 0,45 0,45 x* mới 93,83 93,73 93,73 93,73 s* mới 0,550 0,508 0,508 0,508

Nhận xét: Sau ba lần thay đổi, giá trị s* không thay đổi (= 0,508), khi đó giá trị x* được chọn là 93,73%

Từ kết quả trên, tính z-core Kết quả tất cả 18 giá trị đều có |z| ≤ 2,0 Do đó, hàm lượng trung bình berberin clorid được tính như sau:

Hàm lượng trung bình : X = 93,73% (n = 18) Độ lệch : s = 0,45 Độ khụng đảm bảo đo : à = 0,150

Kết luận chung cho thấy chất điều chế berberin clorid, lô Ber.Ref.012011, đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn để đăng ký chuẩn quốc gia với hàm lượng 93,73% tính trên nguyên trạng và 101,82% tính trên hàm lượng khan.

3.3.6 ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA CHUẨN BERBERIN CLORID ĐIỀU

Mẫu berberin hydroclorid 20 mg có độ tinh khiết 0,32% tạp sau khi trải qua quá trình lão hóa cấp tốc trong tủ vi khí hậu với điều kiện 40 ± 2 o C và độ ẩm tương đối RH = 75 ± 5% Để kiểm tra độ tinh khiết của mẫu, phương pháp sắc ký lớp mỏng và HPLC đã được thực hiện.

Hình 3.35 Sắc ký đồ HPLC tạp chất liên quan của berberin hydroclorid ở thời điểm T0

Thời gian lưu của đỉnh chính berberin hydroclorid trên sắc ký đồ HPLC tại thời điểm T3 và T6 khoảng 19 phút, cho thấy sự lệch so với thời điểm T0 và không đáp ứng yêu cầu của DĐVN IV trong chuyên luận “Berberin clorid”, điều này liên quan đến điều kiện sắc ký HPLC tại thời điểm đó.

T 3 , T 6 không cùng điều kiện sắc ký HPLC ở thời điểm T0.

Khảo sát tính tương thích của hệ thống được thực hiện trên mẫu đã trải qua quá trình lão hóa cấp tốc trong 3 tháng Trong thí nghiệm, dung dịch thử được bơm vào hệ thống sắc ký tổng cộng 6 lần Kết quả chi tiết được trình bày trong Bảng 3.41.

Nhận xét: RSD% của thời gian lưu là 0,48% (< 1,0%), hệ số kéo đuôi trung bình 1,2

< 1,5 Diện tích của đỉnh chính có RSD = 0,12% (< 2%), nên đạt tính tương thích hệ thống

Kết quả xác định tạp chất liên quan và độ tinh khiết của berberin hydroclorid ở thời điểm t = 3 tháng được trình bày ở Bảng 3.42

Bảng 3.42 Bảng tính độ tinh khiết của berberin hydroclorid ở thời điểm 3 tháng

Số lần tiêm Diện tích tổng tạp Diện tích đỉnh chuẩn

Khảo sát tính tương thích của hệ thống được thực hiện trên mẫu đã lão hóa cấp tốc trong 6 tháng Các dung dịch thử đã được bơm vào hệ thống sắc ký 6 lần, và kết quả được trình bày chi tiết trong Bảng 3.43.

Nhận xét: RSD% của thời gian lưu là 1,72% (< 2,0%), hệ số kéo đuôi trung bình 1,2

< 1,5 Diện tích của đỉnh chính có RSD = 0,44% (< 2%), nên đạt tính tương thích hệ thống

Kết quả xác định tạp chất liên quan và độ tinh khiết của berberin hydroclorid ở thời điểm t = 6 tháng được trình bày ở Bảng 3.44

Bảng 3.44 Bảng tính độ tinh khiết của berberin hydroclorid ở thời điểm 6 tháng

Số lần tiêm Diện tích tổng tạp

3.3.6.2 Đánh giá độ ổn định của chất chuẩn berberin hydroclorid

Hàm lượng của berberin hydroclorid ở các thời điểm T0, T 3 , T 6 được trình bày ở

Bảng 3.45 Bảng hàm lượng berberin hydroclorid ở các thời điểm:

Ghi chú: Hàm lượng (%) ở T0 dựa vào kết quả thẩm định đã được công bố [6]

K ết luận: Chất chuẩn berberin clorid, lọ 20 mg, số lô: Ber.Ref.012011, hàm lượng

101,80% (khan) do Ban NCKH – TV, Khoa Dược, Đại Học Y Dược Tp Hồ Chí

Minh sản xuất ổn định ở điều kiện lão hóa cấp tốc (nhiệt độ 40 ± 2 o C,

RH = 75 ± 5%) trong thời gian 6 tháng Độ ổn định của berberin clorid đang được tiếp tục theo dõi

- Chiết nhiều lần với EtOAc trên bếp siêu âm

- Gom dịch EtOAc Cô thu hồi dung môi

- Để nguội, làm lạnh để kết tinh

- SKC nhanh qua silica gel với hệ dm CHCl2-MeOH tăng dần độ phân cực

- Kiểm tra, gom và cô các phân đoạn chứa curcumin I

Kết tinh lại nhiều lần trong CHCl3

Curcumin I

3.4.1 BÀO CHẾ CHẤT CHUẨN CURCUMIN I

Cao nghệ được chiết nhiều lần với ethyl acetat bằng cách khuấy và đánh siêu âm

Lọc thu dịch ethyl acetat và loại tạp bằng cách lắc với nước, sau đó gộp dịch ethyl acetat và cô quay giảm áp để thu hồi dung môi, làm lạnh để curcumin toàn phần kết tinh Lọc thu hỗn hợp curcumin toàn phần kết tinh và phân lập curcumin I từ hỗn hợp này bằng phương pháp sắc ký cột cổ điển với hệ dung môi dicloromethan-MeOH Kiểm tra và thu lấy phân đoạn chứa curcumin I, sau đó cô quay dưới áp suất giảm để thu được curcumin I thô, cuối cùng kết tinh nhiều lần trong cloroform để đạt được curcumin I tinh khiết.

Sau khi thu được curcumin I tinh khiết, tiến hành định tính, xác định cấu trúc và thẩm định

3.4.2 ĐỊNH TÍNH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC

Hình 3.38 Sắc ký đồ kiểm tra curcumin I với ba hệ dung môi khác nhau

(A) Hệ dung môi 1: Cloroform – methanol (9:1)

(B) Hệ dung môi 2: Cloroform –ethanol (25:1)

Nhận xét: Kết quả kiểm tra curcumin I với ba hệ dung môi khác nhau đều cho một vết có màu sắc Rf trùng với Rf của curcumin I chuẩn

TP: Curcumin toàn phần C: Curcumin I chuẩn T: Curcumin I thử

(1): Ánh sáng thường (2): UV 254 nm (3): UV 365 nm

Kết quả trung bình đo điểm chảy curcumin I là 182,2 o C nằm trong giới hạn cho phép (181 – 183 o C)

Thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ của mẫu thử trùng với thời gian lưu của curcumin I chuẩn (xem phần định lượng)

Phổ IR của curcumin I điều chế và curcumin I chuẩn tương đồng với nhau

Hình 3.39 Phổ IR của curcumin I thử (a) và chuẩn (b)

Phổ HR-MS của curcumin I điều chế cho pic ion phân tử giả [M+Na] + 391,1152 m/z, phù hợp với với công thức phân tử C21H 20 O 6 của curcumin I

Hình 3.40 Phổ HR-MS của curcumin I điều chế

Bảng 3.46 So sánh dữ liệu phổ 13 C-NMR của curcumin I điều chế (125 MHz, δ = ppm, MeOD) với curcumin I theo tài liệu [34]

Vị trí Curcumin I [34] Curcumin I điều chế

Hình 3.41 Phổ 1 H-NMR (a) và 13 C-NMR (b) của curcumin I điều chế

Nhận xét: Phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của curcumin I điều chế phù hợp với các tài liệu đã công bố

3.4.3 ĐÁNH GIÁ CURCUMIN I ĐIỀU CHẾ

Kết quả xác định tạp chất liên quan curcumin I được trình bày trong Bảng 3.47

Bảng 3.47 Kết quả xác định tạp chất liên quan curcumin I t R tạp chất (phút) Hàm lượng tạp (%)

Nhận xét: Hàm lượng tạp có trong curcumin I điều chế tính theo % diện tích pic là 0,13% < 2,0% Từ đó có thể kết luậncurcumin I điều chế là tinh khiết

250 bar A.Press.(Status) Detector A:426nm

U nk now n/ 4 810 C ur c um in I II /6 271 C ur c um in I I/ 6 842 C ur c um in I /7 590

Hình 3.42 Sắc ký đồ mẫu thử xác định tạp chất liên quan curcumin I

- Đánh giá phương pháp định lượng curcumin I

Lần lượt bơm 6 lần dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký Kết quả đánh giá tính tương thích hệ thống được trình bày trong Bảng 3.48

Bảng 3.48 Các thông số sắc ký ứng với đỉnh curcumin I (n = 6)

Lần bơm Thời gian lưu Diện tích đỉnh Hệ số kéo đuôi Số đĩa lý thuyết

Nhận xét: RSD% của thời gian lưu là 0,06% (< 1,0%) và của diện tích đỉnh là 0,66% (< 2%), hệ số kéo đuôi trung bình 1,21 < 1,5; số đĩa lý thuyết trung bình

40257 > 12000 nên hệ thống đạt tính tương thích

Tiêm mẫu trắng, mẫu thử, mẫu chuẩn, mẫu thử thêm chuẩn vào hệ thống sắc ký

- Sắc ký đồ mẫu thử cho một pic có thời gian lưu ở 8,64 phút trùng với thời gian lưu của curcumin I trong sắc ký đồ mẫu chuẩn.

Sắc ký đồ mẫu trắng không phát hiện pic curcumin I, trong khi sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn cho thấy chiều cao pic curcumin I tăng lên đáng kể tại thời gian lưu.

- Phổ UV tại thời gian lưu của curcumin I trong sắc ký đồ mẫu thử giống với phổ

UV của curcumin I trong sắc ký đồ mẫu chuẩn

- Pic curcumin I không có thành phần nào khác khi dùng chức năng kiểm tra độ tinh khiết pic

0 50 100 150 200 250 300 350 bar A.Press.(Status) Detector A:426nm

Hình 3.43 Sắc ký đồ kiểm tra tính đặc hiệu của curcumin I

(a): mẫu chuẩn; (b): mẫu thử; (c): mẫu trắng; (d): mẫu thử thêm chuẩn

Hình 3.44 Phổ UV tại thời gian lưu của curcumin I chuẩn (a) và thử (b)

Kết luận: Phương pháp phân tích nêu trên có tính đặc hiệu đối với curcumin I và có thể áp dụng để định lượng curcumin I trong nguyên liệu

Kết quả đánh giá độ lặp lại được trình bày trong Bảng 3.49

Bảng 3.49 Kết quả độ lặp lại của phương pháp định lượng curcumin I

Nhận xét: Hàm lượng trung bình của curcumin I là 99,09%, RSD = 0,60% < 2,0%

Kết luận, phương pháp đạt độ lặp lại

Xây dựng đường chuẩn với 6 mẫu dung dịch curcumin I chuẩn có nồng độ tăng dần từ 8 – 100 àg/ml Kết quả được trỡnh bày trong Bảng 3.50

Bảng 3.50 Sự tương quan giữa diện tích và nồng độ curcumin I

STT Nồng độ (àg/ml) Diện tớch đỉnh

Hình 3.45 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ curcumin I

Kiểm tra ý nghĩa các hệ số trong phương trình hồi quy: t 0 = 2,16 < t 0,05 = 2,77  Hệ số b = 40896 không có nghĩa

Kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy

F = 97229 > F 0,05 = 7,708  phương trình hồi quy tương thích

Nhận xét: R 2 = 1,000 > 0,995, như vậy có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích đỉnh và nồng độ curcumin I

Kết quả đánh giá độ đúng được trình bày trong Bảng 3.51.

Bảng 3.51 Kết quả đánh giá độ đúng phương pháp định lượng curcumin I

Nhận xét: Tỉ lệ hồi phục của các mẫu nằm trong khoảng giới hạn 98,0 – 102,0%

Kết luậnphương pháp đạt độ đúng

Kết quả thẩm định quy trình định lượng curcumin I cho thấy phương pháp này đạt độ đúng, độ chính xác, tính tuyến tính, tính tương thích hệ thống và độ lặp lại, cho phép áp dụng hiệu quả để định lượng curcumin I trong nguyên liệu.

- Áp dụng quy trình trên định lượng curcumin I

Hàm lượng trung bình của curcumin I là 99,09%, tính theo nguyên trạng

K ết luận : Curcumin I điều chế đủ điều kiện để thiết lập chất chuẩn

Bảng 3.52 Tóm tắt kết quả đánh giá chất điều chế curcumin I

Tạp chất liên quan ≤ 2,0 % Đạt (0,13%) Định lượng

Curcumin I (C 21 H 20 O 6 ) 95 – 100%, tính theo nguyên trạng Đạt (99,09%)

3.4.4 ĐÓNG GÓI VÀ ĐÁNH GIÁ ĐồNG NHấT Lọ CURCUMIN I

- Lấy ngẫu nhiên các lọ theo phần mềm excel, số thứ tự các lọ sẽ lấy để định lượng là: 16, 34, 37, 49, 52, 59, 67, 73, 88, 93, mỗi lọ kiểm tra 2 lần.

- Kết quả định lượng được trình bày trong Bảng 3.53

Bảng 3.53 Kết quả định lượng curcumin I đánh giá đồng nhất lô

Phương pháp trắc nghiệm Dixon được sử dụng để xác định giá trị bất thường trong dữ liệu Đầu tiên, các kết quả được sắp xếp theo thứ tự tăng dần Đối với hai kết quả nhỏ nhất và lớn nhất, giá trị nhỏ nhất là 98,40% với G = 0,255, nhỏ hơn G 0,05 là 0,468 Giá trị lớn nhất là 99,49% với G = 0,088, cũng nhỏ hơn G 0,05 là 0,468.

Bảng 3.54 Bảng phân tích ANOVA kết quả đánh giá đồng nhất lô curcumin I

Nhận xét:F = 1,414 < F0,05 = 2,854, khi đó ta có

Nhận xét, 0,016 < u bb 2 = 0,017 < 0,055, do đó kết luận các lọ curucmin I đồng nhất trong quá trình đóng gói

3.4.5 ĐÁNH GIÁ CURCUMIN I LIÊN PHÒNG THÍ NGHIỆM

Bảng 3.55 Các thông số của hệ thống sắc ký định lượng curcumin I tại các phòng thí nghiệm hợp tác

PTN 1: Phòng kiểm tra chất lượng, công ty cổ phần hóa dược phẩm Mekophar

PTN 2: Khoa thiết lập chất chuẩn và chất đối chiếu, VKN thuốc TPHCM

PTN 3: Khoa kiểm nghiệm các dạng bào chế, VKN thuốc TPHCM

Giá trị RSD của các thông số sắc ký đều nhỏ hơn 2%, cho thấy hệ thống HPLC của ba phòng thí nghiệm hợp tác có tính tương thích cao.

3.4.5.2 Xác định giá ấn định, độ không đảm bảo đo và giá trị công bố trên phiếu kiểm nghiệm của curcumin I

Bảng 3.56 Kết quả định lượng curcumin I (%) tại ba phòng thí nghiệm

Bảng 3.57 Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng curcumin I (n = 18)

Số lần thay đổi x* (0) x* (1) x* (2) x* (3) δ = 1,5 x s* - 0,78 0,68 0,68 x* - δ - 98,20 98,22 98,22 x* + δ - 99,75 99,59 99,58 Trung bình 98,90 98,90 98,90 98,90 Độ lệch s 0,41 0,40 0,40 0,40 x* mới 98,98 98,90 98,90 98,90 s* mới 0,519 0,456 0,454 0,454

Nhận xét: Sau ba lần thay đổi, giá trị s* không thay đổi (= 0,454), khi đó giá trị x* được chọn là 98,90%

Từ kết quả trên, tính z-core Kết quả tất cả 18 giá trị đều có |z| ≤ 2,0

Tính trung bình 18 kết quả này, kết quả thu được như sau:

Hàm lượng trung bình : 98,90% (n = 18) Độ lệch s : 0,40 Độ khụng đảm bảo đo à : 0,134

Chất điều chế curcumin I lô Cur.Ref.012012 đạt tiêu chuẩn quốc gia với hàm lượng 98,90% theo nguyên trạng, so với chuẩn USP, với n = 18, độ lệch = 0,40 và độ không đảm bảo đo = 0,134.

3.4.6 ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA CHUẨN CURCUMIN I ĐIỀU CHẾ

Mẫu curcumin 20 mg, lô Cur.Ref.012012, có độ tinh khiết đạt 99,87% sau khi lão hóa nhanh trong tủ vi khí hậu ở điều kiện 40 ± 2 o C và độ ẩm 75 ± 5% Sắc ký lớp mỏng và HPLC được sử dụng để kiểm tra chất lượng của mẫu.

(1): Ánh sáng thường (2): UV 254 nm (3): UV 365 nm

Hình 3.46 Sắc ký đồ kiểm tra curcumin I với ba hệ dung môi khác nhau

Nhận xét: Kết quả kiểm tra curcumin I sau khi lão hóa cấp tốc tại thời điểm 3 tháng, 6 tháng với ba hệ dung môi khác nhau đều cho một vết

Khảo sát tính tương thích của hệ thống được thực hiện trên mẫu đã trải qua quá trình lão hóa cấp tốc trong 3 tháng Dung dịch thử được bơm vào hệ thống sắc ký với tổng cộng 6 lần Kết quả khảo sát được trình bày chi tiết trong Bảng 3.58.

Nhận xét: RSD% của thời gian lưu là 0,24% (< 1,0%) và của diện tích đỉnh là 1,56% (< 2%), hệ số kéo đuôi trung bình 1,36 < 1,5, nên đạt tính tương thích hệ thống

Hình 3.47 Sắc ký đồ HPLC của curcumin I ở thời điểm T3.

Hình 3.48 Sắc ký đồ HPLC của curcumin I ở thời điểm T6

Hình 3.49 Sắc ký đồ HPLC của mẫu trắng

Kết quả xác định tạp chất liên quan và độ tinh khiết của curcumin I ở thời điểm t = 3 tháng được trình bày ởBảng 3.59

Bảng 3.59 Bảng tính độ tinh khiết của curcumin I ở thời điểm 3 tháng

Số lần tiêm Diện tích tổng tạp Diện tích đỉnh chính Tạp chất (%) Độ tinh khiết

Kết quả xác định tạp chất liên quan và độ tinh khiết của curcumin I ở thời điểm t = 6 tháng được trình bày ởBảng 3.60

Bảng 3.60 Bảng tính độ tinh khiết của curcumin I ở thời điểm 6 tháng.

Số lần tiêm Diện tích tổng tạp Diện tích đỉnh chính Tạp chất (%) Độ tinh khiết

3.4.6.3 Đánh giá độ ổn định của chất chuẩn curcumin I

Hàm lượng của curcumin I ở các thời điểm T0, T 3 , T 6 được trình bày ởBảng 3.61

Bảng 3.61 Bảng hàm lượng curcumin I ở các thời điểm

Ghi chú: Hàm lượng (%) ở T0dựa vào kết quả thẩm định đã được công bố [6]

Chất chuẩn curcumin I, với hàm lượng 98,90% (tính theo nguyên trạng), được sản xuất bởi Ban NCKH – TV, Khoa Dược, Đại Học Y Dược Tp Hồ Chí Minh, có số lô Cur.Ref.012011 Sản phẩm này duy trì tính ổn định trong điều kiện lão hóa cấp tốc ở nhiệt độ 40 ±.

2 o C, RH = 75 ± 5%) trong thời gian 6 tháng Độ ổn định của curcumin I đang được tiếp tục theo dõi.

Diosgenin

3.5.1 BÀO CHẾ CHẤT CHUẨN DIOSGENIN

Bột thân rễ Mía dò được chiết xuất bằng dung môi ethanol 96%, sau đó dịch chiết được lọc và cô chân không để thu hồi dung môi Tiếp theo, cắn được thủy phân với HCl 20% trong 5 giờ, tách phần rắn và rửa bằng nước cất cùng NaHCO3 10% đến pH 7 Sắc ký cột nhanh được sử dụng để tách phân đoạn chứa diosgenin, bắt đầu với hệ dung môi ether dầu – dicloromethan (3:7) và tăng dần độ phân cực Cuối cùng, diosgenin thô được tinh chế bằng phương pháp kết tinh lại trong methanol.

Sau khi thu được diosgenin tinh khiết, tiến hành định tính, xác định cấu trúc và thẩm định

- Cô thu hồi dung môi.

- Trung hòa đến pH 7 bằng NaHCO 3 10%

- Sắc ký cột nhanh silicagel với hệ dung môi eter dầu – dicloromethan (3:7)

- Kết tinh lại nhiều lần/ MeOH

Hình 3.50 Sắc ký đồ SKLM kiểm tra diosgenin điều chế với ba hệ dung môi

(1) Hệ dung môi 1: Toluen – aceton (12:1)

(2) Hệ dung môi 2: Toluen – ethyl acetat (8:2)

(3) Hệ dung môi 3: Diclorometan – ethyl acetat (9:1)

Sau khi thực hiện sắc ký với ba hệ dung môi khác nhau, vết diosgenin được điều chế cho kết quả màu sắc và Rf tương ứng với vết diosgenin chuẩn Đồng thời, mẫu diosgenin điều chế đạt độ tinh khiết cao, không chứa tạp chất.

Kết quả trung bình đo điểm chảy diosgenin là 205 o C nằm trong giới hạn cho phép

Tiến hành tiêm đồng thời dung dịch mẫu chuẩn và mẫu thử vào hệ thống sắc ký Thời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ của mẫu thử là 5,6 phút, trùng khớp với thời gian lưu của diosgenin chuẩn.

Hình 3.51 Sắc ký đồ diosgenin thử (a) và chuẩn (b)

Phổ UV-Vis diosgenin thử trùng với phổ UV-Vis diosgenin chuẩn

Hình 3.52 Phổ UV-Vis diosgenin thử (a) và chuẩn (b)

Hình 3.53 Phổ IR của diosgenin điều chế

Nhận xét: Phổ hồng ngoại (KBr, FTIR-8210 PC) cho các đỉnh hấp thu tương ứng với các nhóm chức:

- 1647,1 cm -1 : Nối đôi C=C trong vòng

Phổ HR-MS của diosgenin điều chế cho pic ion [M + Na] + 437,3051 m/z ; phù hợp với công thức phân tử C27H 42 O 3 của diosgenin

Hình 3.54 Phổ HR-MS diosgenin điều chế

Hình 3.55 Phổ 1 H-NMR của diosgenin điều chế (500 MHz, δ = ppm, CDCl 3 )

Nhận xét: Phổ 1 H-NMR của mẫu điều chế đo ở 500 MHz trong dung môi CDCl3 cho các tín hiệu proton phù hợp với diosgenin:

- 4 tín hiệu proton ở 0,77 ppm (3H, s), 0,785 ppm (3H, s), 0,973 ppm (3H, d, J

= 7 Hz), 1,02 ppm (3H, s) có thể gán lần lượt cho các nhóm –CH3ở vị trí 27; 18; 21 và 19

- 1 tín hiệu proton ở 3,368 ppm (1H, t, J = 11 Hz), có thể gán cho H – 3

- 1 tín hiệu proton ở 3,47 ppm (2H, m) có thể gán cho các proton ở vị trí 26

- 1 tín hiệu proton ở 4,380 ppm (1H, q, J = 8 Hz và 7 Hz) có thể gán cho H –

- 1 tín hiệu proton ở 5,336 ppm (1H, t-like, J = 3 Hz) có thể gán cho H – 6

Hình 3.56 Phổ 13 C-NMR của diosgenin điều chế (125 MHz, δ = ppm, CDCl 3 )

Bảng 3.62 So sánh dữ liệu phổ 13 C-NMR của diosgenin điều chế (125 MHz, δ ppm, CDCl 3 ) với diosgenin theo tài liệu [23]

Nhận xét:Dữ liệu phổ 13 C-NMR của diosgenin điều chế phù hợp với diosgenin theo tài liệu

3.5.3 ĐÁNH GIÁ DIOSGENIN ĐIỀU CHẾ

Hình 3.57 Sắc ký đồ xác định tạp chất liên quan diosgenin

Bảng 3.63 Kết quả xác định tạp chất liên quan diosgenin t R tạp chất (phút) Hàm lượng tạp (%)

Nhận xét:Hàm lượng tạp chất có trong mẫu diosgenin điều chế tính theo phần trăm diện tích pic là 0,39% (< 2%)

Hình 3.58 Sắc ký đồ quét nhiệt vi sai mẫu diosgenin điều chế

Nhận xét:Độ tinh khiết mẫu diosgenin điều chế là 98,32 mol%

3.5.3.2 Định lượng diosgenin điều chế

- Đánh giá phương pháp định lượng diosgenin

- Tính tương thích hệ thống:

Bảng 3.64 Các thông số sắc ký ứng với đỉnh diosgenin sau sáu lần tiêm liên tiếp

Số lần bơm t R Diện tích đỉnh Số đĩa lý thuyết Hệ số kéo đuôi

Hệ thống đạt tính tương thích với RSD của thời gian lưu là 0,116% (nhỏ hơn 1%), trong khi RSD của diện tích đỉnh, số đĩa lý thuyết và hệ số kéo đuôi lần lượt là 0,026%, 0,598% và 0,052% (tất cả đều nhỏ hơn 2%).

Tiêm mẫu trắng, mẫu thử, mẫu chuẩn, mẫu thử thêm chuẩn của diosgenin vào hệ thống sắc ký Kết quả cho thấy:

Thời gian lưu của pic diosgenin trong mẫu thử là 5,6 phút, tương đương với thời gian lưu của pic diosgenin trong mẫu chuẩn Mẫu trắng không chứa pic diosgenin, như thể hiện trong Hình 3.59 (a), (b) và (c).

- Khi thêm một lượng chất chuẩn diosgenin vào mẫu thử, chiều cao và diện tích pic của diosgenin tăng lên so với trước khi thêm chuẩn (Hình 3.59 (d))

- Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic diosgenin trong mẫu thử giống phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic diosgenin trong mẫu chuẩn (Hình 3.52)

- Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết cho thấy pic diosgenin không có các thành phần khác trong tất cả các mẫu (Hình 3.60)

Kết luận:Phương pháp định lượng đã nêu có tính đặc hiệu đối với diosgenin

Hình 3.59 Sắc ký đồ đánh giá tính đặc hiệu diosgenin (a): Mẫu chuẩn; (b): Mẫu thử; (c) Mẫu trắng; (d): Mẫu thử thêm chuẩn

Hình 3.60 Hình biểu diễn độ tinh khiết pic diosgenin chuẩn (a) và thử (b)

- Tính tuyến tính và miền giá trị

Tiến hành sắc ký 6 mẫu chuẩn diosgenin với nồng độ tăng dần từ 98,5 – 492,5 àg/ml Kết quả được trỡnh bày trongBảng 3.65

Bảng 3.65 Sự tương quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ

Số thứ tự Nồng độ (àg/ml) Diện tớch đỉnh trung bỡnh

Hình 3.61 Sắc ký đồ mẫu chuẩn diosgenin ở sáu nồng độ tăng dần từ 98,5 –

Hình 3.62 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ diosgenin

Kiểm tra tính tương thích phương trình hồi quy: y = 13911x + 96494 t = 3,79 > t 0,05 = 2,78: Hệ số 96494 có ý nghĩa

F = 37788 > F 0,05 = 7,708: Phương trình trên tương thích

Nhận xét: R 2 = 0,9999 > 0,995, như vậy có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích đỉnh và nồng độ diosgenin

Kết quả đánh giá độ lặp lại được trình bày trongBảng 3.66

Bảng 3.66 Kết quả độ lặp lại của phương pháp định lượng diosgenin (n = 6)

Nhận xét:Hàm lượng trung bình của diosgenin là 98,885%, RSD bằng 0,082% nhỏ hơn 2,0%

Kết luận:Phương pháp định lượng diosgenin trên đạt độ lặp lại

Kết quả đánh giá độ đúng được trình bày trongBảng 3.67

Bảng 3.67 Kết quả đánh giá độ đúng phương pháp định lượng diosgenin

Mẫu Mức hàm lượng Lượng thêm vào

Nhận xét: Tỉ lệ hồi phục của các mẫu ở từng nồng độ đều nằm trong khoảng giới hạn 95,0 – 105,0% Kết luậnphương pháp đạt độ đúng

Tóm lại, kết quả đánh giá cho thấy phương pháp xử lý mẫu và điều kiện sắc ký đã đạt được tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, tính tuyến tính, miền giá trị, độ lặp lại và độ đúng.

Kết luận : Phương pháp định lượng này có thể được áp dụng để định lượng diosgenin trong nguyên liệu.

- Áp dụng quy trình trên định lượng diosgenin

Hàm lượng trung bình của diosgenin là 98,885% (n = 6), tính theo nguyên trạng Kết luận : Diosgenin điều chế đủ điều kiện để thiết lập chất chuẩn

Bảng 3.68 Tóm tắt kết quả đánh giá chất điều chế diosgenin

- Độ tinh khiết > 98 mol% Đạt (0,39%) Đạt (98,32 mol%) Định lượng diosgenin

98 – 102%, tính theo nguyên trạng Đạt (98,89%)

3.5.4 ĐÓNG GÓI VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỒNG NHẤT LỌ DIOSGENIN

Khối lượng đóng lọ: 10 mg/ lọ

Số lọ đóng được (N): 100 lọ

- Số lọ cần lấy để đánh giá đồng nhất lọ: g = N + 1= 11 lọ

- Lấy ngẫu nhiên các lọ theo phần mềm Excel, số thứ tự các lọ sẽ lấy để định lượng là 100, 74, 12, 38, 49, 22, 56, 23, 60, 9, 29; mỗi lọ kiểm tra 2 lần

Bảng 3.69 Kết quả định lượng diosgenin điều chế đánh giá đồng nhất lô

Trong việc xác định loại giá trị bất thường bằng trắc nghiệm Dixon, chúng ta xếp các kết quả theo thứ tự tăng dần và phân tích hai kết quả nhỏ nhất và lớn nhất trong chuỗi dữ liệu Kết quả cho thấy giá trị nhỏ nhất (x min = 98,66%) có G = 0,24, nhỏ hơn G0,05 = 0,468, trong khi giá trị lớn nhất (x max = 99,02%) cũng có G = 0,24, vẫn nhỏ hơn G0,05 = 0,468.

Vậy, chuỗi dữ liệu trên không có giá trị bất thường

- Phân tích phương sai một yếu tố theo ANOVA:

Bảng 3.70 Bảng phân tích ANOVA kết quả đánh giá đồng nhất lô diosgenin

Biến thiên Tổng độ lệch bình phương

Bậc tự do Phương sai F F 0,05

Kết luận:Các lọ diosgenin đồng nhất trong quá trình đóng gói

3.5.5 ĐÁNH GIÁ DIOSGENIN LIÊN PHÒNG THÍ NGHIệM

Bảng 3.71 trình bày giá trị RSD cho các thông số của hệ thống sắc ký định lượng diosgenin tại ba phòng thí nghiệm hợp tác, bao gồm thời gian lưu (tR), diện tích đỉnh, số đĩa lý thuyết và hệ số kéo đuôi.

PTN 1: Phòng kiểm tra chất lượng, Công ty Cổ phần Hóa dược phẩm Mekophar PTN 2: Khoa thiết lập chất chuẩn và chất đối chiếu, Viện Kiểm Nghiệm thuốc TP HCM

PTN 3: Khoa kiểm nghiệm các dạng bào chế, Viện Kiểm Nghiệm thuốc TP HCM

Giá trị RSD của các thông số sắc ký trong ba phòng thí nghiệm hợp tác đều nhỏ hơn 2%, cho thấy hệ thống HPLC đạt tính tương thích cao.

3.5.5.2 Xác định giá trị ấn định, độ không đảm bảo đo và giá trị công bố trên phiếu kiểm nghiệm của diosgenin

Bảng 3.72 Kết quả định lượng (%) diosgenin tại ba phòng thí nghiệm

Bảng 3.73 Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng (%) diosgenin (n = 18) x* (0) x* (1) x* (2) x* (3) x* (4) x* (5) δ = 1,5 x s* - 0,356 0,403 0,399 0,397 0,396 x* - δ - 98,44 98,334 98,337 98,338 98,339 x* + δ - 99,151 99,139 99,134 99,131 99,13

Nhận xét: Sau 5 lần thay đổi, giá trị s* không thay đổi (0,264), khi đó giá trị x* mới được chọn là 98,734%

Từ kết quả trên, tính z – score Kết quả có ba giá trị 97,89%, 99,52% và 100,07% có z tương ứng là -3,2; 2,98 và 5,07 với z > 2, loại bỏ ba giá trị này Tính trung bình

15 kết quả còn lại, thu được kết quả như sau:

Hàm lượng trung bình: 98,68% (n = 15) Độ lệch s: 0,233 Độ khụng đảm bảo đo à: 0,078

Kết luận: Chất điều chế diosgenin, lô Dios.Ref.012012, đủ điều kiện để đăng ký chuẩn quốc gia với hàm lượng được xác định là 98,68% tính theo nguyên trạng (n 15, s = 0,233, à = 0,078)

3.5.6 ĐÁNH GIÁ Độ ổN ĐịNH CHấT CHUẩN DIOSGENIN ĐIềU CHế

Mẫu diosgenin 10 mg có độ tinh khiết 1,7% tạp sau khi trải qua quá trình lão hóa cấp tốc trong tủ vi khí hậu với điều kiện 40 ± 2 °C và độ ẩm RH = 75 ± 5% Để kiểm tra độ tinh khiết của mẫu, phương pháp sắc ký lớp mỏng và HPLC đã được thực hiện.

Hình 3.63 Sắc ký đồ kiểm tra diosgenin với ba hệ dung môi khác nhau

(1) Hệ dung môi 1: Toluen – aceton (12:1)

(2) Hệ dung môi 2: Toluen – ethyl acetat (8:2)

(3) Hệ dung môi 3: Diclorometan – ethyl acetat (9:1)

Nhận xét: Kết quả kiểm tra diosgenin sau khi lão hóa cấp tốc tại thời điểm 3 tháng với ba hệ dung môi khác nhau đều cho một vết

Khảo sát tính tương thích của hệ thống đã được thực hiện trên mẫu lão hóa cấp tốc trong 3 tháng Trong quá trình này, 6 lần bơm dung dịch thử vào hệ thống sắc ký đã được thực hiện, và kết quả được trình bày trong Bảng 3.74.

Thuốc thử phát hiện: Acid sulfuric 20%/ EtOH 50%, sấy 110 o C

Hình 3.64 Sắc ký đồ HPLC của diosgenin ở thời điểm T3.

Kết quả xác định tạp chất liên quan và độ tinh khiết của diosgenin ở thời điểm t = 3 tháng được trình bày ởBảng 3.75

Bảng 3.75 Bảng tính độ tinh khiết của diosgenin ở thời điểm 3 tháng

3.5.6.3 Đánh giá độ ổn định của chất chuẩn diosgenin

Hàm lượng của diosgenin ở các thời điểm T0, T 3 được trình bày ởBảng 3.76

Bảng 3.76 Bảng hàm lượng diosgenin ở các thời điểm.

Nhận xét: Kết quả đánh giá lại không khác biệt hơn 0,5%

Kết luận : Chất chuẩn diosgenin, lọ 10 mg, số lô: Dios.Ref.012011, hàm lượng

98,68 (tính theo nguyên trạng) do Ban NCKH – TV, Khoa Dược, Đại Học Y Dược

Tp Hồ Chí Minh sản xuất ổn định ở điều kiện lão hóa cấp tốc: (nhiệt độ 40 ± 2 o C,

RH = 75 ± 5%) trong thời gian 3 tháng Độ ổn định chất chuẩn diosgenin đang được tiếp tục theo dõi.

Hesperidin

3.6.1 BÀO CHẾ CHẤT CHUẨN HESPERIDIN

Để tinh khiết hóa hesperidin thô, tiến hành kết tinh lại trong dung môi bằng cách hòa 1g hesperidin thô với 7ml dimetylformamid và khuấy đều trong 15 phút Sau đó, thêm một ít than hoạt và lọc dưới áp suất kém để thu dịch lọc Đun sôi 20ml nước cất với 0,5ml acid acetic, sau đó cho toàn bộ dịch lọc vào, khuấy đều và làm lạnh để cho hesperidin kết tinh Cuối cùng, lọc lấy tinh thể và lặp lại quá trình kết tinh nhiều lần để thu được hesperidin tinh khiết.

Sau khi thu được hesperidin tinh khiết, tiến hành định tính, xác định cấu trúc và thẩm định

Hòa tan/DMF Than hoạt Lọc

Khuấy đều Làm lạnh Lọc lấy tinh thể

UV 245 nm UV 365 nm FeCl 3 1%/cồn 96 o

Hình 3.66 Sắc ký đồ của hesperidin với ba hệ dung môi khác nhau

C: mẫu chuẩn T: mẫu thử H1: Cloroform – n-butanol – n-butanol bão hòa nước – acid acetic (4:2:1:1)

H2: n-Butanol – acid acetic – nước (6,5:1:2 giọt)

H3: Cloroform – acid acetic – methanol – nước (16:7:3:2)

Sắc ký đồ cho thấy một vết duy nhất, tắt quang ở UV 254 nm, phát quang màu hồng ở UV 365 nm, và xuất hiện màu xanh rêu khi phản ứng với thuốc thử sắt (III) clorid 1% trong cồn 96 độ Trong cả ba hệ, mẫu thử đều cho vết có hình dạng, màu sắc và Rf trùng khớp với mẫu chuẩn, từ đó sơ bộ nhận định rằng đây là hesperidin tinh khiết.

Kết quả trung bình đo điểm chảy của hesperidin là 258,3 o C, nằm trong khoảng

3.6.2.3 Phương pháp HPLC với đầu dò PDA

Tiến hành tiêm đồng thời dung dịch mẫu chuẩn và mẫu thử vào hệ thống sắc ký, đảm bảo rằng thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ của mẫu hesperidin thử trùng khớp với thời gian lưu của hesperidin chuẩn.

Phổ UV tại thời gian lưu của pic hesperidin trong mẫu thử giống phổ UV tại thời gian lưu của pic hesperidin trong mẫu chuẩn (xem phần định lượng)

Hình 3.67 Phổ IR của hesperidin điều chế

So sánh dữ liệu phổ hồng ngoại (IR) của hesperidin điều chế với hesperidin theo tài liệu tham khảo [21] cho thấy rằng phổ IR của hesperidin điều chế tương đồng với phổ đã được công bố trong tài liệu.

Hình 3.68 Phổ MS của hesperidin điều chế

Phổ HR-MS có pic ion [M + Na] + = 633,1818 m/z; phù hợp với công thức phân tử

Hình 3.69 Phổ 1 H – NMR của hesperidin điều chế

Bảng 3.77 So sánh dữ liệu phổ 1 H – NMR của hesperidin điều chế (500 MHz, δ = ppm, DMSO) và hesperidin theo tài liệu tham khảo [37] (250 MHz, DMSO–d 6 )

Vi trí Hesperidin điều chế

2 – H 5,50 (1H, dd; J = 12,0 Hz; 3,0 Hz) 5,50 (1H, dd; J = 12,1 Hz; 3,3 Hz)

3a – H 2,78 (1H, dd; J = 17,0 Hz; 3,0 Hz) 2,78 (1H, dd; J = 17,1 Hz; 3,3 Hz)

Hình 3.70 Phổ 13 C – NMR của hesperidin điều chế.

Bảng 3.78 So sánh dữ liệu phổ 13 C – NMR của hesperidin điều chế (125 MHz, δ = ppm, DMSO) và hesperidin theo tài liệu tham khảo [37] (63 MHz, DMSO – d 6 )

Vi trí Hesperidin điều chế

Hesperidin tài liệu [37] Vị trí Hesperidin điều chế

Nhận xét: Phổ 1 H – NMR và 13 C – NMR của hesperidin điều chế phù hợp với phổ hesperidin trong tài liệu đã công bố

3.6.3 ĐÁNH GIÁ HESPERIDIN ĐIỀU CHẾ

Hình 3.71 Sắc ký đồ HPLC xác định tạp chất liên quan của hesperidin

Bảng 3.79 Kết quả xác định tạp chất liên quan của hesperidin t R tạp chất (phút) Hàm lượng tạp (%)

Nhận xét: Hàm lượng tạp có trong mẫu hesperidin điều chế tính theo % diện tích pic là 1,945% < 2,0% Từ đó có thể kết luận hesperidin điều chế là tinh khiết

- Phương pháp quét nhiệt vi sai

Hình 3.72 Phổ DSC kiểm tra độ tinh khiết của hesperidin điều chế

Nhận xét:Hesperidin điều chế có độ tinh khiết 94,05 mol% theo DSC

3.6.3.2 Định lượng hesperidin điều chế

- Đánh giá phương pháp định lượng hesperidin

Bảng 3.80 Các thông số sắc ký ứng với đỉnh hesperidin sau sáu lần tiêm liên tiếp

Sắc ký 6 lần dung dịch chuẩn cho thấy các thông số thời gian lưu và diện tích đỉnh đều có giá trị RSD dưới 2% Điều này chứng tỏ quy trình đạt tiêu chuẩn về tính tương thích hệ thống.

Hình 3.73 Sắc ký đồ đánh giá tính đặc hiệu của hesperidin

(a): Mẫu thử; (b): Mẫu trắng; (c): Mẫu chuẩn; (d): Mẫu thử thêm chuẩn

Hình 3.74 Phổ UV và kết quả kiểm tra độ tinh khiết pic của hesperidin

- Thời gian lưu của pic chính trong mẫu thử tương đương với thời gian lưu của pic chính trong mẫu chuẩn

- Sắc ký đồ mẫu trắng không có pic trùng với pic của hesperidin

Khi bổ sung một lượng chất chuẩn vào mẫu thử, cả chiều cao và diện tích đỉnh của pic hesperidin đều gia tăng so với trước khi thêm chất chuẩn.

- Phổ UV tại thời gian lưu của hesperidin trong sắc ký đồ mẫu thử giống với phổ UV của hesperidin trong sắc ký đồ mẫu chuẩn

- Pic hesperidin không có thành phần nào khác khi kiểm tra độ tinh khiết pic

Kết luận: Phương pháp phân tích đặc hiệu đối với hesperidin

Xây dựng đường chuẩn với 6 mẫu hesperidin chuẩn có nồng độ tăng dần từ

Bảng 3.81 Sự tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh của hesperidin

Số thứ tự Nồng độ (àg/ml) Diện tớch đỉnh

Hình 3.75 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ hesperidin

Kiểm tra tính tương thích và ý nghĩa các hệ số:

F = 64188,72 > F 0,05 = 7,71 ⇒ Phương trình hồi quy tương thích t b = 1,16 < t 0,05 = 2,78 ⇒ Hệ số b = 30277 không có ý nghĩa t a = 253,35 > t 0,05 = 2,78 ⇒ Hệ số a = 36724 có ý nghĩa

Nhận xét: R 2 = 0,9999 > 0,995 nên có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích đỉnh và nồng độ hesperidin

Bảng 3.82 Kết quả độ lặp lại của phương pháp định lượng hesperidin

Số lần xác định Hàm lượng (%) Kết quả xử lý thống kê

Nhận xét: Hàm lượng trung bình của hesperidin là 94,43% và RSD = 0,36% < 2,0% nên phương pháp định lượng hesperidin đạt độ lặp lại

Bảng 3.83 Kết quả đánh giá độ đúng phương pháp định lượng hesperidin

Lượng thêm vào (àg/ml)

Lượng tìm thấy (àg/ml)

Nhận xét: Tỉ lệ phục hồi của các mẫu đều nằm trong khoảng 98,0 – 102,0% Tỉ lệ phục hồi trung bình là 99,86%, RSD < 2% Vậy, phương pháp đạt độ đúng

Kết luận: Quy trình phân tích cần đảm bảo tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại và độ chính xác để có thể áp dụng hiệu quả trong việc định lượng hesperidin.

- Áp dụng quy trình định lượng hesperidin

Hàm lượng trung bình của hesperidin là 94,43% (n = 6), tính theo nguyên trạng

K ết luận: Hesperidin điều chế đủ điều kiện để thiết lập chất chuẩn

Bảng 3.84 Tóm tắt kết quả đánh giá chất điều chế hesperidin

Tạp chất liên quan ≤ 2,0% Đạt (1,945%) Định lượng

92,0 – 100,0%, tính theo nguyên trạng Đạt (94,43%)

3.6.4 ĐÓNG GÓI VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỒNG NHẤT LỌ HESPERIDIN

- Số lọ cần lấy để đánh giá độ đồng nhất: g = N+1 = 11 lọ

- Lấy ngẫu nhiên các lọ theo phần mềm Excel, số thứ tự các lọ sẽ lấy để định lượng là: 2, 5, 19, 22 45, 52, 65, 71, 72, 82, 98; mỗi lọ kiểm tra 2 lần

- Kết quả định lượng đánh giá đồng nhất lô của hesperidin được trình bày ở Bảng 3.85

Bảng 3.85 Kết quả định lượng hesperidin đánh giá đồng nhất lọ

STT Lọ số Lần 1 (%) Lần 2 (%) STT Lọ số Lần 1 (%) Lần 2 (%)

- Loại giá trị bất thường bằng trắc nghiệm Dixon: x min = 93,90% ⇒ Q = 0,283 < Q 0,05 = 0,468 x max = 95,44% ⇒ Q = 0,283 < Q 0,05 = 0,468

K ết luận: Chuỗi dữ liệu trên không có giá trị bất thường

Bảng 3.86 Bảng phân tích ANOVA kết quả đánh giá đồng nhất lọ hesperidin

Trung bình của bình phương

Kết luận:Các lọ hesperidin đồng nhất trong quá trình đóng gói

3.6.5 ĐÁNH GIÁ HESPERIDIN LIÊN PHÒNG THÍ NGHIỆM

Bảng 3.87 Giá trị RSD của các thông số sắc ký định lượng hesperidin tại ba phòng thí nghiệm hợp tác

PTN 1: Phòng kiểm tra chất lượng – Công ty Cổ phần Hóa dược phẩm Mekophar PTN 2: Khoa thiết lập chất chuẩn và chất đối chiếu – Viện Kiểm nghiệm thuốc

PTN 3: Khoa kiểm nghiệm các dạng bào chế – Viện Kiểm nghiệm thuốc TPHCM

Giá trị RSD của các thông số sắc ký ở ba phòng thí nghiệm hợp tác đều nhỏ hơn 2%, cho thấy hệ thống HPLC đạt tính tương thích cao.

3.6.5.2 Xác định giá trị ấn định, độ không đảm bảo đo và giá trị công bố trên phiếu kiểm nghiệm hesperidin

Bảng 3.88 Kết quả định lượng (%) hesperidin tại ba phòng thí nghiệm

Bảng 3.89 Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng (%) hesperidin x* (0) x* (1) x* (2) x* (3) x* (4) x* (5) δ = 1,5 × s* - 0,846 0,900 0,893 0,890 0,888 x* - δ - 93,579 93,591 93,599 93,603 93,605 x* + δ - 95,271 95,391 95,385 95,383 95,381

Nhận xét: Sau 5 lần thay đổi, giá trị s* không thay đổi (0,592), khi đó giá trị x* được chọn là 94,493%

Từ kết quả trên, tính z – score Kết quả có 1 giá trị có |z| > 2 nên loại giá trị này (giá trị 95,69 có |z| = 2,022)

Tính trung bình 17 kết quả còn lại, thu được kết quả như sau:

Hàm lượng trung bình : 94,433 % (n = 17) Độ lệch s : 0,558 Độ khụng đảm bảo đo à : 0,174

Kết luận, chất điều chế hesperidin từ lô Hes.Ref.012012 đáp ứng đủ tiêu chuẩn đăng ký quốc gia với hàm lượng xác định đạt 94,43% theo nguyên trạng (n = 17; độ lệch chuẩn s = 0,558; độ không đảm bảo đo à = 0,174).

3.6.6 ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CHẤT CHUẨN HESPERIDIN ĐIỀU CHẾ

Mẫu hesperidin 10 mg, với 1,5% tạp chất, đã được lão hóa nhanh trong tủ vi khí hậu ở điều kiện 40 ± 2 oC và độ ẩm 75 ± 5% Để kiểm tra độ tinh khiết của mẫu, phương pháp sắc ký lớp mỏng và HPLC đã được thực hiện.

Hình 3.76 Sắc ký đồ kiểm tra hesperidin với ba hệ dung môi khác nhau

H1: Cloroform – n-butanol – n-butanol bão hòa nước – acid acetic (4:2:1:1)

H2: n-Butanol – acid acetic – nước (6,5:1:2 giọt)

H3: Cloroform – acid acetic – methanol – nước (16:7:3:2)

Nhận xét: Kết quả kiểm tra hesperidin sau khi lão hóa cấp tốc tại thời điểm 3 tháng với ba hệ dung môi khác nhau đều cho một vết

Thuốc thử phát hiện: FeCl 3 1%/ Ethanol

Khảo sát tính tương thích của hệ thống được thực hiện trên mẫu đã lão hóa cấp tốc trong 3 tháng Dung dịch thử được bơm vào hệ thống sắc ký 6 lần Kết quả chi tiết được trình bày trong Bảng 3.90.

Hình 3.77 Sắc ký đồ HPLC của hesperidin ở thời điểm T3.

Kết quả xác định tạp chất liên quan và độ tinh khiết của hesperidin ở thời điểm t = 3 tháng được trình bày ởBảng 3.91

Bảng 3.91 Bảng tính độ tinh khiết của hesperidin ở thời điểm 3 tháng

3.6.6.3 Đánh giá độ ổn định của chất chuẩn hesperidin

Hàm lượng của hesperidin ở các thời điểm T0, T 3 được trình bày ở Bảng 3.92

Bảng 3.92 Bảng hàm lượng hesperidin ở các thời điểm.

Nhận xét: Kết quả đánh giá lại không khác biệt hơn 0,5%

Kết luận : Chất chuẩn hesperidin, lọ 10 mg, số lô: Hes.Ref.012011, hàm lượng

94,43% (tính theo nguyên trạng) do Ban NCKH – TV, Khoa Dược, Đại Học Y Dược Tp Hồ Chí Minh sản xuất ổn định ở điều kiện lão hóa cấp tốc: (nhiệt độ 40 ±

2 o C, RH = 75 ± 5%) trong thời gian 3 tháng Độ ổn định chất chuẩn hesperidin đang được tiếp tục theo dõi.

Damnacanthal

3.7.1 BÀO CHẾ CHẤT CHUẨN DAMNACANTHAL

Cao khô rễ Nhàu được thủy phân trong acid HCl 10% trong 6 giờ, sau đó rửa lại bằng nước đến pH 6-7 và sấy khô dưới áp suất giảm Phần cắn còn lại được ngâm trong dicloromethan, và dịch dicloromethan cô chân không thu được phần rắn chứa nhiều damnacanthal Phần rắn này được phân tách bằng sắc ký cột cổ điển và sắc ký cột nhanh, sử dụng dung môi ether dầu – dicloromethan (5:5) với độ phân cực tăng dần, thu lấy các phân đoạn chứa damnacanthal thô Cuối cùng, các phân đoạn này được tinh chế bằng sắc ký cột kết hợp với kết tinh trong methanol để thu được damnacanthal tinh khiết.

Sau khi thu được damnacanthal tinh khiết, tiến hành định tính, xác định cấu trúc và thẩm định

Phân tán trong dicloromethan để hòa tan Lấy dịch dicloromethan, cô chân không

Thủy phân trong 6 giờ với HCl 10%

SKC silica gel nhiều lần với hệ dm ether dầu-CH2Cl2tăng dần độ phân cực Kết tinh lại nhiều lần trong MeOH

3.7.2.1 Sắc ký lớp mỏng Ánh sáng thường UV 254 nm UV 365 nm NaOH 5%/MeOH

Hình 3.79 Sắc ký đồ của damnacanthal với ba hệ dung môi khác nhau

T: mẫu thử D1: Ete dầu – cloroform – acid acetic (6:5:1)

Sắc ký đồ cho thấy ở cả ba hệ đều xuất hiện một vết duy nhất có màu vàng khi quan sát dưới ánh sáng thường, tắt quang ở bước sóng UV 254 nm, phát quang màu vàng nâu ở UV 365 nm, và cho vết màu cam vàng khi phản ứng với thuốc thử NaOH 5% trong methanol Điều này cho phép đưa ra nhận định sơ bộ rằng damnacanthal là tinh khiết.

Kết quả trung bình đo điểm chảy của damnacanthal là 217,6 o C, nằm trong khoảng từ 217 – 219 o C

Hình 3.80 Phổ UV của damnacanthal điều chế

Quan sát phổ UV tại thời gian lưu của đỉnh chính trên HPLC cho thấy các đỉnh hấp thu cực đại xuất hiện tại các bước sóng λ max = 213,31 nm, 251,75 nm, 286,26 nm và 384,29 nm.

Hình 3.81 Phổ IR của damnacanthal điều chế

Nhận xét: Phổ IR cho đỉnh hấp thu tại 1676 cm -1 , 1645 cm -1 dao động của hai nhóm

Phân tích dữ liệu phổ IR của damnacanthal điều chế cho thấy sự tương đồng với phổ damnacanthal đã được công bố trong tài liệu tham khảo [45] Cụ thể, nhóm chức –CHO và nhóm –C=O trong cấu trúc của damnacanthal được xác định rõ ràng qua các tín hiệu phổ IR.

Hình 3.82 Phổ HR-MS của damnacanthal điều chế

Nhận xét: Phổ HR-MS có [M + Na] + = 305,0433; phù hợp với công thức phân tử

Hình 3.83 Phổ 1 H-NMR damnacanthal điều chế

Bảng 3.93 So sánh dữ liệu phổ 1 H – NMR của damnacanthal điều chế (500 MHz, δ = ppm, CDCl 3 + MeOD) và damnacanthal theo tài liệu [32] (400 MHz, CDCl 3 )

Vị trí Damnacanthal điều chế Damnacanthal tài liệu [32]

Hình 3.84 Phổ 13 C-NMR damnacanthal điều chế

Bảng 3.94 So sánh dữ liệu phổ 13 C-NMR của damnacanthal điều chế (125 MHz, δ = ppm, CDCl 3 +MeOD) và damnacanthal theo tài liệu [32] (100 MHz, CDCl 3 )

Vị trí Damnacanthal điều chế

Damnacanthal tài liệu [32] Vị trí Damnacanthal điều chế

Nhận xét: Phổ 13 C – NMR và 1 H – NMR của damnacanthal điều chế phù hợp với damnacanthal trong tài liệu đã công bố

3.7.3 ĐÁNH GIÁ DAMNACANTHAL ĐIỀU CHẾ

Hình 3.85 Sắc ký đồ HPLC xác định tạp chất liên quan của damnacanthal

Bảng 3.95 Kết quả xác định tạp chất liên quan của damnacanthal t R tạp chất (phút) Hàm lượng tạp (%)

Nhận xét: Hàm lượng tạp có trong mẫu damnacanthal điều chế tính theo % diện tích pic là 0,880% (< 2,0%) Từ đó có thể kết luận damnacanthal điều chế là tinh khiết

Hình 3.86 Phổ DSC kiểm tra độ tinh khiết của damnacanthal điều chế

Nhận xét: Damnacanthal điều chế có độ tinh khiết 99,96 mol% theo DSC, đạt yêu cầu về độ tinh khiết để sử dụng làm chất chuẩn

3.7.3.2 Định lượng damnacanthal điều chế

- Đánh giá phương pháp định lượng damnacanthal

Bảng 3.96 Các thông số sắc ký ứng với đỉnh damnacanthal sau sáu lần tiêm liên tiếp (n = 6)

Sắc ký 6 lần dung dịch chuẩn cho thấy thời gian lưu và diện tích đỉnh đều có giá trị RSD < 2%, chứng tỏ quy trình đạt tính tương thích hệ thống.

Hình 3.87 Sắc ký đồ đánh giá tính đặc hiệu damnacanthal

Hình 3.88 Phổ UV và kết quả kiểm tra độ tinh khiết pic của damnacanthal

- Sắc ký đồ mẫu trắng không có pic trùng với pic của damnacanthal

- Pic damnacanthal không có thành phần nào khác khi dùng chức năng kiểm tra độ tinh khiết pic

Kết luận: Phương pháp phân tích đặc hiệu đối với damnacanthal

Xây dựng đường chuẩn với 6 mẫu damnacanthal điều chế có nồng độ tăng dần từ 6,25 – 100 àg/ml

K ẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Tiêu đề	Điều chế chất chuẩn đối chiếu phục vụ kiểm nghiệm dược liệu và đông dược
Tác giả	GS. TS. Nguyễn Minh Đức
Trường học	Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia TP.HCM
Chuyên ngành	Khoa học dược
Thể loại	Báo cáo
Năm xuất bản	2012
Thành phố	Thành phố Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	273
Dung lượng	5,09 MB