Chuyển gen bar kháng thuốc trừ cỏ và gen gna kháng côn trùng vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn agrobacterium

BÁO CÁO NGHIỆM THU Tên đề tài: Chuyển gen bar kháng thuốc trừ cỏ và gen gna kháng cơn trùng vào cây thuốc lá thơng qua vi khuẩn Agrobacterium Chủ nhiệm đề tài:Phạm Thị Hạnh Cơ quan chủ t

BÁO CÁO NGHIỆM THU

Tên đề tài: Chuyển gen bar (kháng thuốc trừ cỏ) và gen gna (kháng cơn trùng) vào cây thuốc lá thơng qua vi khuẩn Agrobacterium

Chủ nhiệm đề tài:Phạm Thị Hạnh

Cơ quan chủ trì:TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ

Thời gian thực hiện đề tài: 18 tháng

Kinh phí được duyệt: 50.000.000 đ

Kinh phí đã cấp: 45.000.000 đ theo TB số : TB-SKHCN ngày 13 /12 /05

Thực hiện đề tài này cĩ sự hổ trợ hố chất, vật tư và thiết bị của Phịng Cơngnghệ gen (Viện Sinh học Nhiệt đới) và Phịng Thí nghiệm Trọng điểm phía Nam về Cơng nghệ Tế bào thực vật

Mục tiêu: Với đề tài này, chúng tơi muốn từng bước sử dụng các kỹ thuật

sinh học phân tử như tái tổ hợp ADN để tạo các vector plasmid mới mang gen kháng cơn trùng và biến nạp gen này vào cây để tạo một dịng thuốc lá mới mang gen kháng rầy rệp chích hút

Nội dung: (Theo đề cương đã duyệt và hợp đồng đã ký)

Cơng việc dự kiến Cơng việc đã thực hiện

- Sử dụng các kỹ thuật sinh

học phân tử như cắt, lắp ghép

gen bằng các enzyme giới hạn

tạo ra vector (plasmid) mới

mang gen gna thích hợp cho

việc chuyển gen vào cây trồng

- Tạo cây thuốc lá kháng

thuốc trừ cỏ và cơn trùng bằng

phương pháp gián tiếp thơng

qua vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens.

- Đã thành cơng trong việc tái cấu trúc

plasmid mới mang gen bar , gusA và

gna.

- Tạo được trên 10 dịng thuốc lá khángthuốc trừ cỏ và cơn trùng bằng phươngpháp gián tiếp thơng qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens chứa plasmid

mới mang gen bar , gusA và gna.

- Đã kiểm tra sự hiện diện của gen gus

bằng phản ứng mơ hĩa Kiểm tra sự hiêndiện của gen bar và gen gna bằng phản

- Phân tích và đánh giá cây

thuốc lá mang gen kháng thuốc

trừ cỏ và kháng côn trùng gna.

ứng PCR với mồi chuyệt biệt Kiểm tra

sự biểu hiện của gen kháng thuốc trừ cỏ bằng phương pháp nuôi cấy cây thuốc lá chuyển gen trong môi trường chứa chất chọn lọc và phun thuốc trừ cỏ Basta tại vườn ươm

2 - Một bài báo đăng tại Tạp

chí trong nước hoặc Hội nghị

khoa học công nghệ sinh học

toàn quốc

- Đã gửi đăng 1 bài báo tại Hội nghị Nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống ngày 10/ 8/2007(đang in và sẽ xuất bản vào tháng 12/2007)

MỤC LỤC

Trang PHẦN MỞ ĐẦU

Tên đề tài

Chủ nhiệm đề tài:

Cơ quan chủ trì:

Thời gian thực hiện:

Kinh phí được duyệt:

Kinh phí đã cấp: theo TB số: TB-SKHCN ngày /

Danh sách hình 7

1.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 10

2.1.7 Một số thiết bị, dụng cụ dùng trong nghiên cứu 17

2.2.1.1 Chuẩn bị DNA plasmid (pCAMBIA3301) và DNA gen

mục tiêu (gna) cho cấu trúc vector tái tổ hợp

19

2.2.1.2 Phương pháp nối kết plasmid gốc pCAMBIA3301 và

cassette gen gna để tạo plasmid tái tổ hợp

21

2.2.2 Biến nạp vào vi khuẩn E coli và khảo sát sự hiện diện

của plasmid mới

22

2.2.2.1 Phương pháp tạo E coli có khả năng biến nạp 22

2.2.2.2 Phương pháp biến nạp plasmid mới vào vi khuẩn E coli 23

2.2.3 Biến nạp plasmid mới vào Agrobacterium tumefaciens

chuẩn bị cho thao tác chuyển gen

24

2.2.3.1 Quy trình tạo vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens khả

biến

24

2.2.3.2 Quy trình chuyển plasmid vào vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens khả biến

25

2.2.3.4 Phân tích PCR để xác định sự hiện diện của gen gna

trong plasmid mới

25

2.2.4 Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá (Nicotiana

tabacum L.) nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

26

2.2.4.1 Xác định nồng độ chọn lọc tối ưu chuẩn bị cho các thí

nghiệm chuyển gen

27

2.2.4.2 Chuyển gen vào thuốc lá nhờ vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens

27

2.2.5 Khảo sát sự hiện diện và biểu hiện của các gen được

chuyển ở cây thuốc lá chuyển gen

29

2.2.5.1 Khảo sát sự hiện diện của gen chỉ thị gusA bằng kỹ

thuật hóa mô

29

2.2.5.2 Tái kiểm tra (in vitro) sự biểu hiện của gen chọn lọc bar 29

2.2.5.3 Thử tính kháng thuốc trừ cỏ Basta của cây chuyển gen

ngoài vườn ươm

29

2.2.5.4 Kiểm tra sự hiện diện của gen bar và gna bằng phân

tích PCR

29

3.1.1 Tách chiết DNA plasmid từ hai dòng vi khuẩn E coli

DH5 mang pBluescript SK+ và pCAMBIA3301 Kiểm

tra bằng enzyme cắt giới hạn và điện di trên gel agarose

3.1.2.2 Biến nạp và nhân bản plasmid mới trong E coli 34

3.1.3 Tách chiết plasmid mới từ E coli được biến nạp và kiểm

tra sự hiện diện của gen gna trong plasmid mới

34

3.2 TẠO DÒNG AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

MANG PLASMID MỚI pCAMBIA3301GNA

36

3.2.1 Biến nạp pCAMBIA3301GNA vào A tumefaciens

LBA4404

36

3.2.2 Phân tích PCR gen gna của plasmid tách chiết từ dòng

A tumefaciens LBA4404 được biến nạp

37

3.3 NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC

TRỪ CỎ VÀ CÔN TRÙNG VÀO CÂY THUỐC LÁ

37

3.3.1 Khảo sát tính chống chịu tự nhiên Phosphinothricin đối

với của giống thuốc lá K326

38

3.3.2 Kết quả chuyển gen bằng vi khuẩn A tumefaciens

LBA4404

39

3.3.3 Kiểm tra sự hiện diện và biểu hiện của các gen được

chuyển ở cây thuốc lá giả định chuyển gen

41

3.3.3.1 Kiểm tra sự biểu hiện gen bar (gen kháng thuốc trừ cỏ

Basta) của cây chuyển gen in vitro và ngoài vườn ươm

42

3.3.3.2 Sự biểu hiện của gen chỉ thị gusA chuyển gen 43

3.3.3.3 Sự hiện diện của của gen bar và gna trong cây thuốc lá

chuyển gen bằng phân tích PCR

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ATP : Adenosine 5’- triphosphate

bar : gen kháng Phosphinothricin

CAMBIA :Center for Application of Molecular Biology to International Agriculture

EDTA : Ethylenediamine tetraacetic acid

gusA : Gen tạo enzyme -D-glucuronidase

hph : Hygromycin phosphotransferase (gen)

HPH : Hygromycin phosphotransferase (enzyme)

IPTG : Isopropyl thio--D-galactoside

NPT II : Neomycin phosphotransferase (enzyme)

PAT : enzym phosphinothricin acetyl transferase

RE : Restriction enzyme

X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside

X-gluc : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronide

DANH SÁCH BẢNG

1 Sơ đồ1: Cấu trúc plasmid pCAMBIA3301 46

2 Sơ đồ 2: Trình tự nhận biết và vị trí cắt của hai enzyme

giới hạn Sac I và Kpn I

46

3 Sơ đồ 3: sự tạo dịng gen mục tiêu gna vào

pCAMBIA3301

47

4 Sơ đồ 4: Quy trình tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng

thuốc trừ cỏ và côn trùng

48

5 Hình điện di và chọn lọc cây thuốc lá chuyển gen 48

6 Hình biểu hiện gen gus và kết quả PCR 49

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Sự phát triển của công nghệ gen đang tạo ra những bước đột phá mới, đặc biệt trong lĩnh vực công nghệ sinh học Công nghệ gen đã cho phép đưacác gen hữu dụng vào thực vật, từ đó tạo ra cây trồng thể hiện tính trạng mong muốn Cách đây khoảng ba thập kỷ, kể từ khi những báo cáo đầu tiên công bố

sự thành công trong việc chuyển gen trên cây trồng, các phương pháp đưa gen

lạ trực tiếp vào tế bào thực vật không thông qua lai hữu tính đã phát triển dần với tốc độ tiến bộ ngày một nhanh

Thuốc lá, cùng với cà chua và khoai tây là những cây trồng được sử

dụng để chuyển gen Bt ngay từ năm 1987 Trong các đối tượng đó, thuốc lá là

nguyên liệu tốt cho các nghiên cứu về di truyền vì người ta dễ dàng kiểm soát được sự thụ phấn của cây cũng như có thể thu được số lượng lớn hạt giống Bên cạnh đó, thuốc lá rất thích hợp cho nuôi cấy mô và chuyển gen nhờ khả năng hơn hẳn trong việc tái sinh chồi và phân hóa thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo, tế bào huyền phù hoặc tế bào trần

Cây trồng mang gen kháng sâu Bt (Bacillus thuringiensis) là một trong

những ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc cải tiến cây trồng từ rất sớm Cây mang gen tạo độc tố này có khả năng kháng với các sâu hại chính

thuộc họ Lepidoptera, Coleoptera và Diptera Nhiều phòng thí nghiệm ở Việt

Nam và trên thế giới đã chuyển nạp thành công gen này vào cây thuốc lá như:

- Nguyễn Hữu Hổ & ctv (1998): chuyển các gen kháng sâu CryIIB, gen

kháng hygromycin hpt, gen chỉ thị gusA nhờ vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens.

- Strizkov (1996): chuyển gen CryIC vào cây thuốc lá qua trung gian vi

khuẩn Agrobacterium, cùng với gen chitinase chiAII (có nguồn gốc từ

Serratia marcescens) nhằm nâng cao hiệu quả của độc tố Bt do chitinase có

khả năng phá hủy màng chitin trong ruột côn trùng Kết quả gây chết 100%

sâu Spodoptera exigua ở các giai đoạn phát triển khác nhau.

- Kota & ctv (1999): nhận thấy gen Cry2Aa2 khi chuyển vào lục lạp của

cây thuốc lá thì gây tử vong hoàn toàn cho sâu Heliothis virescens, Heliothis

zea, Spodoptera exigua vốn được xác định không còn mẫn cảm với Cry1A và Cry2Aa2 Lá cây chuyển gen biểu hiện tiền độc tố Cry2Aa2 ở mức 2 - 3%

protein hòa tan tổng số, cao gấp 20 đến 30 lần so với cây chuyển gen vàonhân tế bào như hiện tại

Nghiên cứu chuyển gen trong những năm gần đây đã có những bước phát triển đáng kể nhờ vào việc đưa một số gen có ý nghĩa và quan trọng trong lĩnh vực nông nghiệp vào cây trồng Đối với nhiều loại côn trùng thuộc

Homoptera như rầy nâu hoặc các loại rầy rệp khác truyền bệnh virus cho cây

trồng, người ta ghi nhận hợp chất lectin có nguồn gốc từ thực vật có khả năng gây độc đối với chúng (Powell và ctv, 1993) cũng như một số các ấu trùng

thuôc họ Lepidoptera và họ Coleoptera (Shukle và Murdock, 1983; Czaph và

Lang, 1990; Gatehouse và cộng sự, 1995) Nhiều nghiên cứu và thí nghiệm trên thế giới cho thấy lectin thực vật rất có hiệu quả đối với hiện tượng làmgiảm sức sống, sự phát triển, sự đẻ trứng của rầy nâu (Powell và cộng sự., 1993), giảm tuổi thọ và khả năng sinh dục của rầy mềm, đặc biệt là trên concái (Rahbe và Febvay 1993, Sauvion và cộng sự., 1996) cũng như nhiều loại rầy rệp gây hại khác Tuy nhiên không phải tất cả lectin nào cũng diệt được côn trùng Người ta ghi nhận có nhiều mức độ hữu hiệu khác nhau của những hợp chất lectin khác nhau trên các loài côn trùng khác nhau

Nhóm lectin với thuật ngữ chuyên môn “snowdrop lectin” (Galantus

nivalis agglutinin - GNA) có độc tính mạnh nhất (Powell và cộng sự, 1995a)

và đặc biệt có độc tính đối với côn trùng nhưng không ảnh hưởng đối với các loài động vật hữu nhũ (Pusztal 1991) Protein GNA và các gen mã hóa cho nó

đã được xác định trong phòng thí nghiệm bởi W Peumans và E van Damme(Leuven, Bỉ).

Cho đến nay, cơ chế tác động của lectin GNA đối với côn trùng vẫn chưa được mô tả thật đầy đủ Có ý kiến cho rắng protein này gắn vào mặt ngoài của màng ruột theo cơ chế nối với thụ quan (Eisemann và cộng sự, 1994)) Những côn trùng thường có khả năng phân giải thấp protein ở ruột bởi

vì chúng sử dụng amino acid tự do trong nhựa luyện như một nguồn cung cấp chất đạm cho cơ thể sống Birch và cộng sự (1999) đã chứng minh được lectin của khoai tây chuyển nạp gen GNA được tìm thấy gắn ở các tế bào

màng ruột của rầy mềm in-vivo.

Lợi dụng những tính chất trên, hiện nay trên thế giới người ta đã tổng

hợp nhân tạo gen gna (mã hóa cho protein trên) để chuyển nạp vào trong cây

trồng Nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đã tạo được một số giống cây trồng có khả năng kháng rầy rệp chích hút rất hiệu quả, như cây lúa kháng rầy

nâu (Nilaparvata lugens), rầy xanh đuôi đen (Nephotettix spp.); khoai tây kháng ấu trùng Lacanobia oleracea, rầy mềm Aulacorthum solani…, và đặc biệt là cây thuốc lá kháng côn trùng thuộc họ Aphididae, một nhóm quan

trọng nhất có khả năng lây lan bệnh do vi trùng hay siêu vi trùng cho thực vật

Điển hình của nhóm này là rầy mềm Myzus persicae, một loài côn trùng ăn

tạp rất phổ biến trên thế giới Chúng là tác nhân truyền hơn 100 loại bệnh khác nhau do virus

Hilder và ctv (1995) là một trong những tác giả đầu tiên thành công

trong nghiên cứu chuyển gen này vào cây trồng với cấu trúc promoter CAMV

35S, kết quả tạo cây thuốc lá kháng rầy rệp chích hút rất hiệu quả, đặc biệt đối

với rầy mềm Myzus persicae Xác định hàm lượng protein tổng số bằng

phương pháp Bradford (1976) và nồng độ GNA bằng dot-blot immunoassay,kết quả khả quan đến 2,5% protein GNA trong lá và chưa xác định được trongmạch Tuy nhiên, qua thí nghiệm miễn dịch tế bào cho thấy hàm lượng

protein này rất cao Cùng một gen gna nhưng với các promoter khác nhau như

RSs1 và Ubi-1 (promoter này không có sự chuyên biệt rõ ràng về mô),

K.V.Rao và ctv, 1988 cũng đã tạo được nhiều dòng lúa kháng cao với rầy nâu

Nilaparvata lugens và rầy xanh đuôi đen Nephotettix cinciteps Ước lượng từ

các phân tích Western blots , tác giả cho thấy 71% các dòng mang gen gna được điều khiển bởi promoter RSs1 biểu hiện protein 0,01-0,25% so với

lượng protein tổng số Trong khi đó, hàm lượng này lên đến 2% trong cấu trúc

với promoter Ubi Gần đây nhất là Nagadhara và ctv (2003) cũng đã chuyển nạp thành công với cấu trúc promoter RSs1 tạo được hai dòng lúa kháng cao đối với rệp lưng trắng Sogatella furcifera.

Tác giả Yang Z.N và ctv đã tạo được cây bưởi chuyển gen kháng côn

trùng gna qua lây nhiễm trụ trên lá mẫm với vi khuẩn A.tumefaciens chủng C58 Gen mã hóa cho protein vỏ virus (Citrus tristeza virus) và gen gna được

cấu trúc vào vector kép pBin34GUS Kiểm tra bằng lai Southern trên nhiễm

sắc thể cây chuyển gen đã chứng minh gen gna đã tích hợp vào bộ gen thực

vật từ 1-5 bản sao ở những cây dương tính với phản ứng GUS Bên cạnh đó,

sự biểu hiện gen được xác định bằng phân tích Western blot và hầu hết những cây biểu hiện dương tính ở kiểm tra Southern đều thấy có sự hiện diện của protein GNA

WU Chang-Yin và ctv cũng đã tái sinh thành công cây cà chua mang

gen gna với cấu trúc promoter RSs-1 qua lây nhiễm lá mầm với vi khuẩn

A.tumefaciens Kết quả ban đầu qua phân tích PCR và Southern blot chứng

minh sự hiện diện của gen chọn lọc nptII trong bộ gen cây Cây cà chua chuyển gen cũng thể hiện tính kháng cao với ấu trùng rầy mềm Myzus

persicae Sulzer khi cho lây nhiễm với loài côn trùng này.

Tuy rằng độc tính của các lectin thực vật vẫn còn đang là một vấn đề cần nghiên cứu và cơ chế gây độc trên côn trùng vẫn chưa được biết đầy đủ nhưng hiệu quả gây độc trên nhiều loài côn trùng chích hút của protein này đã

được chứng minh và gen gna hiện đang được lựa chọn như là một “ứng cử

viên tốt nhất” cho kỹ thuật di truyền ứng dụng tạo giống cây trồng có khả năng tự bảo vệ trước sự cắn phá

1.2.Tính cần thiết của đề tài

Như chúng ta đã biết, rầy rệp là những côn trùng gây hại nghiêm trọng đối với các vụ mùa cây lương thực, hoa màu cũng như một số cây công nghiệp quan trọng trên toàn Châu Á Sự cắn phá của chúng không những làm cây khôngphát triển mà còn làm lây lan nhiều bệnh do virus, đặc biệt như bệnh khảm ở cây thuốc lá, bệnh siêu vi trùng lúa cỏ, bệnh lùn, xoắn lá ở cây lúa… Hàngnăm cả thế giới phải mất nhiều tỉ USD trong việc phòng trừ sâu hại cây trồng

Dù đã được kiểm soát bằng chiến lược sử dụng giống kháng và phun thuốc trừ sâu hóa học nhưng khả năng phát sinh loại hình sinh học mới của rầy, rệp

đã làm cho chiến lược này có mức độ ổn định thấp

Như đã nói trên, thử thách lớn nhất đối với ngành trồng trọt nói chung vànông nghiệp nói riêng là những bệnh do virus – mà chính côn trùng là tácnhân lây truyền bệnh Nghiên cứu này bước đầu góp phần đưa ra một giải pháp hiệu quả trong việc nâng cao chất lượng cây trồng và không gây ô nhiễm môi trường, phù hợp với xu thế phát triển của nền nông nghiệp hiện đại.

Vấn đề này chỉ có thể được giải quyết thông qua sự phối hợp đúng đắn giữa khoa học hiện đại và ý thức giữ gìn sinh thái môi trường Một trong những hướng để giải quyết vấn đề trên là tạo ra những cây trồng tự bản thân có khả

năng chống chịu với các loài sâu hại Snowdrop (Galanthus nivalis) lectin

(GNA) và gen mã hóa cho protein này được chọn như là một “ứng cử viên”tốt nhất cho kỹ thuật di truyền tạo cây trồng kháng được nhiều rầy rệp gây hại quan trọng trên thế giới hiện nay

Với đề tài này, chúng tôi muốn từng bước sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử như tái tổ hợp ADN để tạo plasmid mới mang gen kháng thuốc trừ cỏ Basta và gen kháng côn trùng và biến nạp các gen này vào cây thuốc lá để tạo một dòng thuốc lá mới mang kháng thuốc trừ cỏ Basta và gen kháng côntrùng

2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

Thí nghiệm được tiến hành tại Phòng Công nghệ Gen, Viện Sinh học Nhiệt đới, Tp HCM

2.1 Vật liệu

2.1.1 Chủng vi khuẩn

- Chủng vi khuẩn E coli chứa pBluescript SK+-GNA mang gen gna.

- Chủng vi khuẩn E.coli chứa plasmid pCAMBIA3301 [mang gen kháng Phosphinothricin (bar) + gen gusA]

- Chủng vi khuẩn E coli DH5α được dùng trong biến nạp nhằm khuyếch đại

số lượng bản sao các plasmid

- Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 dùng để biến nạp plasmid mới và chuyển gen vào thuốc lá Chủng này có mang sẵn helper

plasmid pAL4404 chứa gen vir và gen kháng Streptomycin-mã hóa cho

enzyme streptomycin phosphotransferase

Một số đặc điểm của pCAMBIA3301:

- Có các vị trí cắt giới hạn duy nhất của nhiều enzyme trên MCS (multiple

cloning sites - nằm giữa trình tự gusA và gen kháng Phosphinothricin (PPT)) thuận lợi cho việc tạo dòng Trong đó có vị trí cắt của hai enzyme SacI và

KpnI.

- Có mang gen gusA là một gen chỉ thị để đánh giá hiệu quả chuyển gen

Thực vật được chuyển gen sẽ biểu hiện protein GUS và tính khángPhosphinothricin ( PPT) Trong khi đó, một intron chèn vào trình tự mã hóa

gen gus bảo đảm cho gen này không thể biểu hiện trong vi khuẩn [Ohta và

ctv, (1990) Plant Cell Physiology 31: 805-813]

2.1.3 Enzyme cắt và nối tạo DNA tái tổ hợp

- Enzyme giới hạn Sac I, Kpn I (Amersham)

- T4 DNA ligase (Life technologiesTM)

Sử dụng giống thuốc lá sợi vàng Kutsaga 326 Hạt được khử trùng bằng Javel

và cấy trên môi trường MS (Murashige Skoog 1962) Lá thuốc lá trong ống nghiệm được cắt thành từng mảnh 1x1 cm dùng làm nguyên liệu chuyển gen

2.1.6 Hoá chất và môi trường

Hóa chất

- Bộ kit tách chiết plasmid từ vi khuẩn: WizardPlus SV Minipreps

DNA Purification System (Promega)

Thành phần:

 Cell Resuspension Solution (50mM Tris, 10mM EDTA, 100g/mlRnase A, pH 7,5)

 Cell Lysis Solution (0,2% NaOH và 1% SDS)

 Neutralization Solution (potassium acetate)

 WizardTM

Minipreps DNA Purification Resin

 Column Whash Solution (80 mM Potassium acetate, 8,3mM HCL, pH 7,5, 40g EDTA, 55% ethanol)

Tris- WizardTM

Minicolumn và Syringe Barrels

- Bộ kit dùng để tách chiết và tinh sạch DNA từ gel agarose: QIAquick Gel Extraction Kit Ptotocol

- Hóa chất dùng để tách chiết DNA nhiễm sắc thể từ thực vật

 NaCl 5M

 Tris-HCl 1M

 EDTA 5M

 Phenol/ Chloroform 1:1

- Hóa chất dùng để biến nạp plasmid vào vi khuẩn

 CaCl20,1M pha trong glycerol 20%

 Nước lên thể tích 1 lít Hấp vô trùng

- Hóa chất dùng trong nhuộm X-gluc

X-gluc tan trong DMSO rồi pha trong nước Lọc vô trùng, nồng độ

- Hóa chất dùng trong phản ứng định tính gen lacZ

X-gal 20mg/ml tan trong DMSO rồi pha trong nước cất Lọc vô trùng

IPTG 25 mg/ml pha trong nước cất Lọc vô trùng

- Hóa chất dùng trong thí nghiệm chuyển gen

Kanamycin 10mg/ml Pha trong nước Lọc vô trùng

Cefotaxim pha trong nước cất Lọc vô trùng

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

- Môi trường LB (Luria-Bertani): nuôi cấy và giữ giống E.coli và

Agrobacterium tumefaciens.

- Môi trường AB (Chilton và ctv, 1974): nuôi Agrobacterium tumefaciens

cho thí nghiệm chuyển gen

- Nhiệt độ nuôi cấy đối với Agrobacterium tumefaciens là 28oC và E.coli là

37oC

2.1.7 Một số thiết bị, dụng cụ dùng trong nghiên cứu

2.2.1 Cấu trúc plasmid mới

2.2.1.1 Chuẩn bị DNA plasmid (pCAMBIA3301) và DNA gen mục

tiêu (gna) cho cấu trúc vector tái tổ hợp

a Tách chiết plasmid DNA từ hai chủng vi khuẩn E.coli mang pBluescript

SK+-GNA (mang gen gna) và pCAMBIA3301

Để chuẩn bị cho thí nghiệm này, phải lắc vi khuẩn trong môi trường dinh dưỡng LB qua đêm (bổ sung kháng sinh tương ứng Kanamycin 50g/ml)nhằm khuyếch đại số lượng lớn bản sao các plasmid

Các bước tiến hành:

1 Ly tâm 1-10ml dung dịch vi khuẩn lắc qua đêm trong 5 phút

2 Huyền phù và vortex kỹ sinh khối thu được với 250l CellResuspension Solution

3 Thêm vào 250l Cell Lysis Solution, đảo ngược ống vài lần

4 Thêm 10l Alkaline Protease Solution, đảo ngược ống vài lần để trộn đều rồi ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng.

5 Cho vào 350l Neutralization Solution, đảo ngược vài lần

6 Ly tâm 14 000v/p ở nhiệt độ phòng

7 Dung dịch sau ly giải được cho qua cột và ly tâm khoảng 1 phút

8 Rửa cột với 750l Wash Solution Ly tâm 14 000v/p

9 Rửa lại lần nữa với 250l dung dịch rữa trên Ly tâm 2 phút

10 Cho vào cột 100l Nuclease-Free Water, ly tâm 1 phút để thu lấy dịch qua cột có chứa DNA plasmid Giữ ở –20oC

b Kiểm tra các plasmid thu được sau tách chiết bằng enzyme cắt giới hạn vàđiện di trên gel agarose

Chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật tái tổ hợp DNA để cắt đoạn gen gna Phương

pháp xử lý enzym để cắt DNA plasmid theo qui trình của Sambrook vàManiatis

Trong cấu trúc hai plasmid trên đều có các vị trí cắt giới hạn duy nhất của hai

enzyme SacI và KpnI Thí nghiệm này chúng tôi đã xử lý cassette gen

nguyên vẹn bao gồm: Promoter Ubiquitin-1 + trình tự mã hóa protein GNA

(gen gna) + Terminator Nopaline synthase (nos)

Với pBluescript SK+-GNA khi cắt bằng hai enzyme này kết quả điện di sẽ cho ra hai đoạn DNA có kích thước khác nhau, trong đó có một đoạn khoảng

gần 3kb Đây là nguyên cassette chứa gen gna mà ta quan tâm.

Vector pCAMBIA3301 sau khi bị cắt tại vùng mã hóa enzyme

-galactosidase, vùng này có mang trình tự polylinker có điểm cắt của SacI và

KpnI, kết quả điện di sẽ chỉ cho thấy một đoạn có kích thước 11,3Kb.

Thành phần các phản ứng cắt như sau:

- pCAMBIA 3301 hoặc pBluescript SK+-GNA: 10l ( nồng độ khoảng 0,5

g)

- Buffer: 2l

- SacI và KpnI: 2l mỗi enzyme

Tổng thể tích: 16l

Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 2-3 giờ ở 37oC Sản phẩm cắt được đem điện di cùng với thang chuẩn Lamda cắt bởi HindIII

Cách chạy điện di DNA trên bảng gel:

Cân 2 g Agarose cho vào 200ml dung dịch TAE đun cho nóng chảy, để nguội đến 60o

C cho 4 l của Ethidium bromide (mang găng tay khi tiếp xúc với chất này) Sau đó đổ vào khuôn đã có sẵn lược để tạo giếng, chờ dung dịch nguội hoàn toàn Cho dung dịch đệm TAE vào nhẹ nhàng rút lược ra và chodịch AND plasmid (đã có dung dịch đệm màu xanh) vào, cắm điện cực chạy

ở khoảng 60 volt trong 2-3 giờ (điện thế càng cao DNA trong gel chạy càngnhanh) Xem bản gel dưới đèn cực tím

c Thu nhận và tinh sạch sản phẩm cắt từ gel

Cắt và thu nhận miếng gel có chứa vạch DNA cần thiết Trước khi tiến hànhnối kết, DNA từ gel sẽ được tinh sạch bằng bộ kit QIAquick Gel Extraction

1 Cân miếng gel có chứa vạch DNA vào eppendorf Cho buffer QX1 với thể tích gấp ba lần so với thể tích gel

2 Ủ 50oC trong 10 phút, vortex cho đến khi miếng gel tan hoàn toàn Khi đódung dịch sẽ có màu vàng

3 Thêm vào một thể tích isopropanol và trộn đều hỗn hợp

4 Cho mẫu vào cột gắn DNA, ly tâm một phút

5 Cho thêm vào cột 0,5ml Buffer QX1 Ly tâm một phút

6 Rửa cột với 0,75ml Buffer PE Ly tâm một phút

7 Ly tâm thêm một lần nữa để loại bỏ hoàn toàn ethanol

8 Cuối cùng rửa trôi DNA bằng 50l elution buffer Ly tâm một phút để thu dung dịch có chứa sản phẩm tinh sạch

2.2.1.2.Phương pháp nối kết plasmid gốc pCAMBIA3301 và cassette gen gna để tạo plasmid tái tổ hợp

Các sản phẩm sau khi tinh sạch sẽ được đưa vào phản ứng kết nối bằng T4 DNA ligase Trong phản ứng này, cassette gen nguyên vẹn trên sẽ được

chèn vào vị trí lacZ alpha tại đoạn T-DNA của pCAMBIA3301.

Thành phần phản ứng nối như sau:

Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ 14oC trong thời gian 3-4 giờ

2.2.2 Biến nạp vào vi khuẩn E coli và khảo sát sự hiện diện của plasmid mới

Để cảm ứng khả năng biến nạp của E.coli, chúng tôi tiến hành xử lý tế

bào bằng CaCl2ở nhiệt độ thấp 0-4o

C, bổ sung DNA plasmid tái tổ hợp rồi sốc nhiệt tới 42oC Sốc nhiệt giúp tính thấm của màng vi khuẩn bị thay đổi cho phép DNA xâm nhập vào

Môi trường LB được bổ sung các kháng sinh thích hợp để chọn lọc cá thể biến nạp Trong thí nghiệm chúng tôi sử dụng kháng sinh Kanamycin nồng

độ 50mg/l Các hợp chất hóa sinh như IPTG (Isopropyl -D-thiogalatoseside)50mg/l và X-gal (5-Bromo 4-chloro 3-indolyl -D-galactopyranoside) 40mg/lđược bổ sung vào môi trường nuôi cấy các thể biến nạp nhằm hoạt hoá enzyme-galactosidase, cho phép chọn lọc các khuẩn lạc xanh/trắng

2.2.2.1 Phương pháp tạo E coli có khả năng biến nạp

1 Cấy một khúm riêng lẻ vi khuẩn E.coli dòng DH5 vào trong 10ml môitrường LB và ủ lắc qua đêm (16 giờ) ở 37oC

2 Pha loãng dịch nuôi cấy để qua đêm trên theo tỉ lệ 1:100 trong dung dịch

LB (0,5ml cho 50ml) và tiếp tục ủ lắc ở 37oC khoảng 3-4 giờ

3 Ly tâm lạnh 2500 vòng/phút trong 10 phút để làm lắng tế bào vi khuẩn.

4 Đổ bỏ phần môi trường và hòa cặn vi khuẩn nhẹ nhàng trong dung dịch CaCl20.1M đặt trong đá lạnh Ủ lạnh ít nhất 30 phút

5 Ly tâm lạnh 2500 vòng/ phút trong 10 phút để làm lắng vi khuẩn

6 Hòa tan vi khuẩn rất nhẹ nhàng vào 5ml dung dịch CaCl2/ glycerol0.1M/10% v/v, rồi phân ra thành 200l vào các tube eppendorf 1.5ml đãđược ủ lạnh trước Có thể dùng ngay hoặc giữ ở -80o

C

2.2.2.2 Phương pháp biến nạp plasmid mới vào vi khuẩn E coli

1 Đặt khoảng 0,1-0,5g plasmid vào 200 l của dịch competent cell, ủ trong

đá khoảng 20 phút

2 Tác động nhiệt ở 42 oC khoảng 90 giây

3 Đặt lại trong đá khoảng 2 phút

4 Cho 1ml môi trường LB không có kháng sinh Nuôi lắc ở 37oC trong 1giờ

5 Ly tâm vi khuẩn trong 1 phút và loại bỏ nứơc trong (chỉ chừa lại một ít dịch phía dưới)

6 Trải dịch vi khuẩn trong môi trừơng LB có agar với kháng sinh Kanamycin 50mg/l, giữ qua đêm ở 37oC

2.2.2.3 Chọn khuẩn lạc và kiểm tra plasmid mới

a Sơ chọn khuẩn lạc

Kết quả biến nạp thể hiện qua màu các khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trường sau hai ngày nuôi cấy So sánh với các đĩa đối chứng Chọn những khuẩn lạc

màu trắng, to và mọc rời rạc trên các đĩa biến nạp Đó là những dòng E.coli

tăng trưởng mạnh và có mang plasmid mới

Sau khi sơ chọn dòng E.coli mang plasmid mong muốn, cấy lại vào môi

trường LB bổ sung Kanamycin 100mg/l để giữ giống, đồng thời tiến hànhkiểm tra plasmid mới Cấy dòng vi khuẩn này vào môi trường LB lỏng có bổ sung chất chọn lọc Kanamycin 100mg/ml Lắc qua đêm ở 37oC Tách chiết

và kiểm tra plasmid từ những dòng này

b Phương pháp tách chiết plasmid: tương tự phần trên.

c Kiểm tra sự hiện diện của plasmid mới trong E.coli bằng phản ứng cắt bởi SacI và KpnI

Hỗn hợp plasmid mới sau tách chiết được xử lý với hai enzyme cắt

giới hạn là SacI và KpnI Điện di sản phẩm sau phản ứng cắt để khẳng định

sự thành công của thí nghiệm kết nối và biến nạp Kết quả đúng khi thấy được trên bản gel hai vạch DNA tương ứng với kích thước lần lượt là:11,3Kb tương ứng với plasmid gốc pCAMBIA3301 và đoạn khoảng trên 3

Kb tương ứng với đoạn cassette chứa gen gna.

2.2.3.1 Quy trình tạo Agrobacterium tumefaciens khả biến

1 Nuôi cấy chủng Agrobacterium tumefaciens trong 5 ml môi trường LB có

chứa kháng sinh Kanamycin tương ứng Lắc qua đêm (12-14 giờ) ở 280Ckhoảng 250 vòng/phút

2 Cho 2 ml dịch nuôi cấy qua đêm vào 50 ml môi trường LB có kháng sinh tương ứng lắc khoảng 4 giờ

3 Ủ lạnh 50 ml dịch nuôi cấy 4oC trong 20 phút sau đó ly tâm trong 15 phút

ở 5000 vòng/phút Loại bỏ nước trong phía trên

4 Hòa tan vi khuẩn trong 2 ml CaCl2/ glycerol 0.1M/10% v/v, rồi phân ra thành 200l vào các tube eppendorf 1.5ml đã được ủ lạnh trước Có thể dùngngay hoặc giữ ở -80oC.

2.2.3.2 Quy trình chuyển plasmid vào Agrobacterium tumefaciens khả biến

1 Đặt khoảng 0,5 g plasmid vào 100 l của dịch competent cell

2 Tác động nhiệt bằng cách cho eppendorf chứa dịch vi khuẩn vào trongnitơ lỏng khoảng 90 giây

3 Đặt lại dịch vi khuẩn trong bồn nước 37oC khoảng 5 phút

4 Cho 1ml môi trường LB không có kháng sinh và nuôi lắc (khoảng 50 rpm) ở 28oC trong 2-4 giờ

5 Ly tâm vi khuẩn trong 2 phút và loại bỏ nước trong, hòa tan dịch trong 100l môi trường LB mới

6 Trải dịch vi khuẩn trong môi trường LB thạch có kháng sinh tương ứng, giữ ở 28oC trong 2 ngày

2.2.3.3 Sơ chọn khuẩn lạc để kiểm tra plasmid

Các khuẩn lạc to và rời rạc được chọn và nuôi cấy trên môi trường có

bổ sung kháng sinh Kanamycin 50mg/l Cấy chuyền để giữ giống dùng chothí nghiệm chuyển gen, đồng thời chuẩn bị tách chiết plasmid kiểm tra sự

hiện diện của gen gna.

2.2.3.4 Phân tích PCR để xác định sự hiện diện của gen gna trong plasmid mới

- Sự tích hợp cassette gen gna vào trong đoạn T-DNA của plasmid

pCAMBIA3301 cũng được kiểm tra qua phản ứng PCR dịch plasmid tách

chiết từ Agrobacterium tumefaciens đã biến nạp

Trình tự mồi cho khuyếch đại đoạn gen gna như sau

- Mồi 1: 5’- ATGGC.TAAGG.CAAGT.CTCCT.C - 3’

- Mồi 2: 5’- TCATT.ACTTT.GCCGT.CACAA.G - 3’

Chu kỳ cho gen gna cho phản ứng PCR như sau:

Nhiệt độ bảo quản: 40C.

Heat Lid (Nhiệt độ nắp): 1050C

Hỗn hợp các thành phần của phản ứng PCR như sau:

Thí nghiệm được tiến hành cùng với mẫu đối chứng dương (pBluescript SK+

-GNA) Kích thước đoạn ADN của gen gna khuyếch đại của phản ứng PCR

được mong đợi là 0,47 Kp có cùng kích thước với mẫu đối chứng dương (kýhiệu: PC)

2.2.4 Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Môi trường nuôi cấy cây

- Môi trường dinh dưỡng MS (Murashige và Skoog, 1962)

- Môi trường tái sinh cây từ mảnh lá: môi trường MS bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng BA 1mg/l, NAA 0,1mg/l

- Môi trường chọn lọc chồi chuyển gen: môi trường tái sinh cây bổ sung chất chọn lọc Phosphinothricin ( PPT) và Cefotaxim diệt khuẩn

Điều kiện nuôi: nhiệt độ 26-28o

C, cường độ ánh sáng khoảng 3000 lux

2.2.4.1 Xác định nồng độ chọn lọc tối ưu chuẩn bị cho các thí nghiệm chuyển gen

Trước khi tiến hành các thao tác chuyển gen, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của chất chọn lọc với các nồng độ khác nhau lên sự tái sinh chồi của mẫu lá và cây thuốc lá không chuyển gen Từ đó nhằm xác định ngưỡng tối thiểu gây chết hoàn toàn mẫu cấy

Các mẫu lá thuốc lá với kích thước tương đương nhau, khoảng 1cm2được đặt trong môi trường tái sinh chồi bổ sung chất chọn lọc Phosphinothricin với các nồng độ 5, 10, 15 và 20 mg/ml mỗi nồng độ được xử lý gồm ba bình với

5 mẫu lá mỗi bình Tiến hành song song với nghiệm thức đối chứng không

Theo dõi khoảng 2-4 tuần So sánh và kết luận nồng độ chọn lọc nàothích hợp nhất Nồng độ này sẽ được sử dụng cho thí nghiệm chuyển gen trênmẫu lá và kiểm tra cây chuyển gen trong bình nuôi cây

2.2.4.2 Chuyển gen vào thuốc lá nhờ Agrobacteriu tumefaciens

a Chuẩn bị dịch vi khuẩn

Nuôi cấy trước vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 trong

10 ml môi trường AB lỏng có bổ sung kháng sinh Kanamycin 50mg/ml