Chế tạo bộ kít xác định nhanh peroxit trong dầu ăn và một số thực phẩm chế biến

Đề tài này đã sử dụng phương pháp chiết-trắc quang để xác định peroxid trong dầu mỡ và thực phẩm chế biến dựa trên nguyên tắc là dùng Fe2+ khử peroxidtrong môi trường acid, lượng Fe3+ s

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN TP HỒ CHÍ MINH

CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KH-CN TRẺ

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu ngày 24 /06/ 2011)

CHẾ TẠO BỘ KIT XÁC ĐỊNH NHANH PEROXIT TRONG DẦU ĂN VÀ MỘT SỐ

THỰC PHẨM CHẾ BIẾN

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: NGUYỄN THỊ THANH MAI

CƠ QUAN CHỦ TRÌ: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

THÁNG 10/ 2011

BÁO CÁO NGHIỆM THU

Tên đề tài: CHẾ TẠO BỘ KIT XÁC ĐỊNH NHANH PEROXIT TRONG DẦU ĂN VÀ

MỘT SỐ THỰC PHẨM CHẾ BIẾN

Chủ nhiệm đề tài: NGUYỄN THỊ THANH MAI

Cơ quan chủ trì : TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ

Thời gian thực hiện đề tài: 11/2008 – 6/2010

an toàn vệ sinh thực phẩm tại các cơ sở sản xuất, giúp các đơn vị chế biến thực phẩm,

nhà hàng, quán ăn và cả người tiêu dùng kiểm tra được chất lượng của các sản phẩm mà

họ cung cấp hay tiêu thụ, nhằm đảm bảo sức khỏe của người tiêu dùng

Nội dung:

 Xây dựng và tối ưu hóa qui trình xác định hàm lượng peroxit với đối tượng mẫu

là dầu ăn và các loại thực phẩm trong phòng thí nghiệm

 Nghiên cứu chế tạo hai bộ kit xác định nhanh hàm lượng peroxit: Bộ kit so màu bằng mắt sử dụng cho đối tượng mẫu là dầu ăn; bộ kit đo màu bằng máy sử dụng cho đối tượng mẫu là dầu ăn và một số thực phẩm chế biến

 Kiểm tra đối chứng kết quả xác định giữa bộ kít với phương pháp trọng tài AOAC

Tóm tắt

Peroxid là sản phẩm sơ cấp của quá trình oxy hóa lipid, thường được xác định bằng phương pháp chuẩn độ iod của AOCS Tuy nhiên phương pháp này bị ảnh hưởng bởi chất nền, oxy không khí, điểm cuối chuẩn độ khó nhận biết Đề tài này đã sử dụng phương pháp chiết-trắc quang để xác định peroxid trong dầu mỡ và thực phẩm chế biến dựa trên nguyên tắc là dùng Fe2+ khử peroxidtrong môi trường acid, lượng Fe3+

sinh ra

sẽ tạo phức với SCN-, phức Fe(SCN)63- sẽ ghép cặp với CTMA (cetyltrimethylammonium bromide) và được chiết bằng etylacetate Kết quả cho thấy, phương pháp này có độ nhạy cao, phản ứng xảy ra nhanh, có độ tương quan cao so với phương pháp AOCS (r=0,991; SDD=0,34meq/kg) Trên cơ sở phương pháp đề nghị đã phát triển hai bộ kit: so màu bằng mắt và đo màu bằng máy quang tự chế, trong đó bộ kit so màu bằng mắt có khả năng bán định lượng tốt, có màu thay đổi trong 3 khoảng giới hạn của chỉ số PV; còn bộ kit đo màu bằng máy tự chế thì có độ tương quan cao so với phương pháp AOCS

Từ khóa: Peroxid, AOCS, Bộ kit

Abstract

The primary products of lipid oxidation are peroxides, which are usually determined using official iodometric method (AOCS), although some interference and difficulty in determine the titration endpoint can lead to imprecise results This study was based on

an extraction spectrophotometric method for determination peroxide through ion-pair formation between cetyltrimethylammonium (CTMA) and iron thiocyanate complex in ethylacetate The result showed that this method had LOD and LOQ smaller than that

of method without CTMA and high correlation with AOCS official method (r = 0,991; SDD = 0.34meq/kg) Basing on the suggested method, we developed 2 test kits: visual and using colorimeter, in which the colour change of the visual kit in 3 peroxide value ranges is clearly, while the colorimeter kit has high correlation with AOCS method

Keyword: Peroxide, AOCS, test kit

I.2.1 Các chỉ tiêu thông dụng đánh giá mức độ oxy hóa của dầu và mỡ 15

I.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tự oxy hóa của dầu mỡ 18

1.3.1 Phương pháp chuẩn độ bằng iod (phương pháp AOCS Cd 8-53,

1.3.2 Phương pháp tạo phức màu giữa Fe3+ với SCN- (phương pháp

1.3.3 Phương pháp tạo phức màu Fe3+ với xylenol cam (XO) 20

1.3.4 Phương pháp đề nghị: Tạo phức màu giữa Fe3+

với SCN- sử dụng

1.3.4.3 Phương pháp tạo phức màu giữa Fe3+ với SCN- sử dụng phương

II.1 NỘI DUNG 1: TỐI ƯU QUI TRÌNH XÁC ĐỊNH PEROXID

II.1.2.2 Xác định peroxid bằng phương pháp trắc quang cải tiến 27

II.1.2.3.2 Khảo sát bước sóng hấp thu cực đại của phức

II.1.2.3.6 Khảo sát thời gian lắc trong quá trình chiết 33

II.1.2.7.1 Công thức xác định chỉ số peroxid theo phương pháp trắc quang 39 II.1.2.7.2 Công thức xác định chỉ số peroxid theo phương pháp AOAC 39 II.1.2.8 So sánh kết quả phân tích peroxid trên mẫu thật giữa phương

II.2.6 Kết quả phân tích trên một số mẫu thật 47

II.3

NỘI DUNG 3: CHẾ TẠO BỘ KIT KÈM MÁY ĐO XÁC ĐỊNH

NHANH PEROXID TRONG DẦU, MỠ VÀ THỰC PHẨM

CHẾ BIẾN

51

II.3.4.7 So sánh với kết quả theo phương pháp AOAC, AOCS 61

III.1 NỘI DUNG 1: Tối ưu qui trình xác định peroxid bằng phương

III.2 NỘI DUNG 2: Chế tạo bộ kit so màu bằng mắt để xác định nhanh

III.3 NỘI DUNG 3: Chế tạo bộ kit kèm máy đo để xác định nhanh

peroxid trong dầu, mỡ và các thực phẩm chế biến 68

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PV: Peroxide Value

CTMA: Cetyltrimetylamonium bromur

AOM: Active Oxygen Method

OSI: Oxidative Stability Index

FFA: Free Fatty Acid

TBA: Thiobarbituric Acid

AOAC: Association of Official Analytical Chemists

AOCS: American Oil Chemists' Society

TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam

IDF: International Dairy Federation

XO: Xylenol Orange

LOD: Limit Of Detection

LOQ: Limit Of Quantitation

RSD: Relative Standard Deviation

DANH SÁCH BẢNG

5 Kết quả so sánh PV theo phương pháp AOAC và trắc quang cải tiến 41

7 So sánh kết quả xác định PV giữa phương pháp đo quang và phương

8 Kết quả xác định LOD & LOQ trên máy đo quang tự chế 59

9 Kết quả kiểm tra độ lặp lại trên máy đo quang tự chế 59

11 Kết quả đo mẫu thật bằng phương pháp dùng bộ kit đo quang bằng

DANH SÁCH ĐỒ THỊ

3 Sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ thuốc thử SCN- 31

4 Sự phụ thuộc mật độ quang vào lượng CTMA thêm vào 32

8 Sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ Fe3+( g/mL) 34

9 Đường chuẩn của phức [Fe(SCN)6][CTMA]3 trong dung môi

10 Đồ thị phân bố giá trị PV theo AOAC và PP trắc quang 42

11 Đường chuẩn của phức [Fe(SCN)6][CTMA]3 đo bằng máy cầm tay 60

12 Đồ thị phân bố giá trị PV theo AOAC và PP dùng bộ kít đo quang 61

DANH SÁCH SƠ ĐỒ

4 Qui trình xác định peroxid theo phương pháp trắc quang ghép cặp ion 64

5 Qui trình xác định peroxid theo bộ kit so màu bằng mắt 67

6 Qui trình xác định peroxid theo bộ kit kèm máy đo cầm tay 69

DANH SÁCH HÌNH

1 Mô hình bộ dụng cụ và hóa chất của bộ kit so màu bằng mắt 46

11 Mô hình bộ dụng cụ và hóa chất của bộ kit kèm máy đo cầm tay 57

I TỔNG QUAN

I.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ DẦU MỠ

Mỡ và dầu là những triester của acid triglyceric ở dạng lỏng hoặc rắn, luôn luôn tồn tại trong thức ăn của người và gia súc, gọi chung là các chất béo Không những đóng vai trò là một phần của thực phẩm mà chất béo còn ảnh hưởng sâu sắc đến sức khỏe con người và vật nuôi Các chất béo này rất dễ bị oxi hóa dẫn đến bị ôi, hư Ở nhiệt độ không quá 102oC, các chất béo này không có biến đổi đáng kể ngoài việc hóa lỏng Các loại dầu, mỡ có giá trị dinh dưỡng rất cao đối với cơ thể, tuy nhiên việc sử dụng dầu, mỡ không đúng cách lại trở thành có hại cho cơ thể [1]

I.1.1 Về mặt hóa học

- Chất béo là triester của acid béo với Glycerol

Trong đó R, R’, R’’ là các nhóm thế no hay không no, có số carbon từ 12-20

- Các mỡ tự nhiên là hỗn hợp của các Triacylglycerol

- Triacylglycerol là dạng đơn giản của lipid - một trong ba nguồn cung cấp năng

lượng cho cơ thể (bên cạnh hai nguồn khác là carbohydrate và protein) - Với 9 cal/gram (38kJ/g), lipid là thực phẩm giàu năng lượng nhất trong cả 3 loại kể trên (hai loại còn lại có 4 cal/gram)

- Dầu mỡ có thể chia ra thành bão hòa và không bão hòa dựa theo bản chất của

acid béo hiện diện Bản thân các acid béo cũng được chia thành bão hòa, đơn bão hòa, đa bão hòa dựa vào sự hiện diện của liên kết đôi C=C

I.1.2 Về mặt vật lý

Dầu no có điểm sôi cao hơn dầu không no Điều đó có thể được giải thích do sự

‘cô đặc’ của phân tử Mạch hydrocarbon dài trong phân tử gần nhau làm tăng lực Van

der Waals, dầu mỡ không no có chứa một hoặc nhiều liên kết C=C, hầu như lúc nào

cũng vậy liên kết C=C có cấu hình cis Sự hiện diện của ‘nút thắt’ trong cấu hình cis

làm hạn chế sự quay làm cho các phân tử khó gần nhau hơn dẫn đến lực liên kết liên

phân tử giảm, do đó có nhiệt độ nóng chảy thấp hơn dầu mỡ bảo hòa Cấu hình Trans

của các acid béo không no dể dàng tiến gần đến nhau hơn do đó có nhiệt độ nóng chảy

cao hơn cấu hình cis

I.1.3 Về mặt sinh học

Lipid bao gồm: mỡ, dầu, phospholipids, và steroid Sự khác biệt cơ bản giữa dầu

và mỡ là trạng nhiệt độ sôi Mỡ thường dạng rắn trong khi dầu thường là dạng lỏng ở nhiệt độ thường (dầu cọ và dầu dừa nằm ngoài quy luật trên)

Ngoài lượng triacylglycerol có sẵn trong thức ăn, cơ thể cũng có khả năng tự tổng hợp triacylglycerol từ đường và tinh bột Phần lớn lượng triacylglycerol này tích tụ trong mô mỡ, nếu chúng ta ăn quá nhiều dầu và đường có thể gây béo phì Các triacylglycerol này sẽ phân hủy tạo thành acid béo khi cơ thể cần: sửa chữa tế bào, màng tế bào… thiếu những acid béo này làm màng tế bào trở nên cứng và dính thay vì mềm dẻo và trơn trượt Các triacylglycerol bão hòa tuần hoàn trong cơ thể cho đến khi tìm được ‘nhà’ thường đó là các mô mỡ Việc tích tụ này gây nguy cơ nhồi máu cơ tim

và sơ vữa động mạch đồng thời làm lượng triacylglycerol trong máu cao dẫn đến độ nhớt của máu tăng, làm các tiểu cầu có khuynh hướng dính lại với nhau, việc tích tụ tricylglycerol là một bước trong chuỗi gây béo phì

I.1.4 Chức năng chính của dầu mỡ trong cơ thể

- Tích trữ năng lượng: dầu mỡ có thể bị đốt cháy để giải phóng năng lượng khi

lượng carbohydrat trong khẩu phần ăn không cung cấp đủ

- Là dung môi hòa tan của các vitamin thiết yếu như vitamin A, D, E và K là

những vitamin không tan trong nước

- Là lớp bảo vệ và cách nhiệt: Mô mỡ bao bọc xung quanh các cơ quan bên

trong cơ thể bảo vệ chúng khỏi những tổn thương và sự thay đổi nhiệt độ bằng cách

bao bọc có tác dụng như một lớp đệm và cách ly Não bộ của mỗi người được bao bọc bởi một lớp giàu lipid gọi là vỏ myelin

- Chức năng thông tin: có vai trò quan trọng như là chất thông tin nội phân tử

hoặc điều chỉnh hormone nội bộ Tất cả sinh vật đều sử dụng chất chuyển thông tin để gửi thông tin đến các tế bào khác, các chất chuyển thông tin này thường là phân tử kỵ nước kích thước nhỏ, triacylglycerol được xem ứng viên xuất sắc Ở dạng ester hóa, chúng dễ dàng xâm nhập qua màng tế bào Trong quá trình vận chuyển chúng thường gắn kết với protein vì vậy hàm lượng biểu kiến của chúng rất thấp và được xem như thụ động đến khi chạm đến tế bào nhận phù hợp

I.1.5 Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng dầu, mỡ

Để đánh giá chất lượng dầu mỡ, người ta dựa trên các chỉ số sau:

Chỉ số acid: là số miligam KOH dùng để trung hòa acid béo tự do có trong 1g chất

béo Chỉ số acid cao chứng tỏ chất béo không tươi, đã bị thủy phân một phần

Chỉ số xà phòng: là số miligam KOH dùng để xà phòng hóa 1g chất béo và trung

hòa acid béo tự do có trong 1g chất béo này

Chỉ số Ester: là số miligam KOH cần dùng để trung hòa chất béo liên kết với

glycerin, được giải phóng khi xà phòng hóa 1g chất béo Do đó chỉ số ester bằng hiệu

số giữa chỉ số xà phòng và chỉ số acid

Chỉ số Iod: là số gam iod kết hợp với 100g chất béo Chỉ số này dùng để xác định

mức độ chưa bảo hòa của acid béo vì iod sẽ kết hợp vào các nối đôi trong phân tử acid

Và một số chỉ số khác như chỉ số peroxid (PV), TBA, FFA…

I.2 SỰ OXI HÓA CỦA DẦU MỠ

Dầu mỡ bị oxy hóa trong suốt quá trình sản xuất, vận chuyển, lưu trữ và trong quá trình chế biến thức ăn qua quá trình tự oxy hóa cũng như oxy hóa cảm quang Hydroperoxid là sản phẩm đầu tiên của quá trình oxy hóa chất béo và được coi là dạng tổng quát của các peroxid Sau đó peroxid bị phân giải để tạo thành aldehyd và ceton Các aldehyd và ceton này là những chất có mùi và vị khó chịu [2]

Quá trình ôi thiu tăng nhanh ở điều kiện ẩm, nhiệt độ cao và có ánh sáng Một số ion kim loại như đồng, sắt cũng xúc tác cho quá trình này

Điều kiện thích hợp cho quá trình peroxid hóa là phân tử acid béo chưa bão hòa, được cung cấp nhiều oxygen, có ion kim loại chuyển tiếp làm xúc tác

I.2.1 Các chỉ tiêu thông dụng đánh giá mức độ oxy hóa của dầu và mỡ [3]

Có 2 loại chỉ tiêu để đáng giá mức độ oxy hóa của dầu và mỡ: các chỉ tiêu dự đoán và các chỉ tiêu chỉ thị

- Các chỉ tiêu dự đoán: sử dụng những điều kiện để thúc đẩy quá trình oxy hóa của dầu mỡ và mỡ hoặc các sản phẩm chế biến (sử dụng dầu mỡ hoặc có chứa dầu mỡ) qua đó đánh giá chất lượng của nguyên liệu, hiệu quả của chất bảo quản hoặc dự đoán hạn sử dụng của sản phẩm

- Các chỉ tiêu chỉ thị: sử dụng để đánh giá chất lượng của dầu mỡ hoặc sản phẩm chế biến tại thời điểm đánh giá

I.2.1.1 Các chỉ tiêu dự đoán

 Phương pháp oxy hoạt tính - AOM (Active Oxygen Method)

Phương pháp này dự đoán mức độ ổn định của dầu mỡ bằng cách thổi không khí qua dung dịch dầu mỡ tại tốc độ thổi, nhiệt độ và nồng độ nhất định Sau đó, peroxid

và hydroperoxid sinh ra trong quá trình trên được chuẩn độ bằng iod AOM được định nghĩa là khoảng thời gian cần thiết để hàm lượng peroxide trong mẫu đạt 100meq/kg Dầu càng tốt, thời gian đạt được giá trị trên càng lâu (AOM càng lớn) Đối với các loại mẫu khác cần phải tiến hành bước chiết dầu mỡ ra rồi tiến hành thổi khí

Phương pháp này tốn thời gian vì cần một khoảng thời gian dài để thổi khí, có thể lên đến 48 giờ hoặc hơn để lượng peroxid đạt 100meq/kg Phương pháp này nằm trong bảng tóm tắt được ban hành bởi AOAC, AACC và AOCS

 Chỉ số ổn định oxy hóa - OSI (Oxidative Stability Index)

Về nguyên tắc phương pháp này tương tự như phương pháp AOM, nhưng nhanh hơn và mang tính tự động hơn Không khí được thổi qua buồng chứa mẫu tại nhiệt độ

nhất định, sau đó được dẫn qua bể chứa nước DI Acid bay hơi tạo thành trong quá trình oxi hoá lipid làm tăng độ dẫn diện của nước, độ dẫn được theo dõi liên tục OSI được định nghĩa là thời gian cần thiết để đạt đến một giá trị độ dẫn định trước

 Chỉ số iod

Chỉ số iod dùng để đo lường số nối đôi của acid béo không bão hòa Dầu mỡ có chỉ số iod cao sẽ dễ bị oxi hóa Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chỉ số iod, do đó chỉ số này một mình nó không phản ánh hết độ bền của dầu mỡ

I.2.1.2 Các chỉ tiêu chỉ thị

 Chỉ số peroxid - Peroxide Value (PV: Peroxide Value)

Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để đánh giá mức độ ôi thiu, PV

là hàm lượng của peroxid và hydroperoxid có trong mẫu và được định nghĩa là số meq

O2/kg mẫu Giá trị PV thay đổi không cố định do đó phải thận trọng trong quá trình lưu trữ và kiểm tra mẫu Thật khó đễ đưa ra chỉ dẫn cụ thể nào về mối liên quan giữa giá trị

PV với sự oxy hóa của dầu mỡ Giá trị PV cao chắc chắn chỉ ra rằng dầu mỡ đã bị oxy hóa, nhưng giá trị trung bình của PV có thể là kết quả của sự suy kiệt sau khi đạt đến giá trị cực đại Một cách tương đối, theo Warner [4] có thể phân chia sự oxy hóa theo các khoảng PV như sau: 3-5 mới bị oxy hóa, 10-12 bị oxy hóa trung bình, 16-18 bị oxy hóa nhiều, việc phân chia này dựa trên việc gây mùi khó chịu do sự oxy hóa dầu mỡ tại các mức oxy hóa hơn là ý nghĩa như là định nghĩa khoảng chấp nhận giá trị PV của dầu

mỡ

Đồ thị 1: Sự thay đổi nồng độ peroxid theo thời gian

 Chỉ tiêu TBA - TBA test

Aldehyd bão hòa, 2-enal và 2-dienanl là những sản phẩm sinh ra trong giai đoạn dập tắt của phản ứng oxy hóa dầu mỡ có thể phát hiện được bằng acid 2-thiobarbituric Phản ứng tạo thành có màu đỏ có thể đo màu được Phản ứng này phát triển đầu tiên để xác định malonaldehyd, ngoài ra TBA cũng phản ứng với các aldehyd khác, cũng như

bị ảnh hưởng nhiễu nền ví dụ như Phenol trong khói Cũng như PV, giá trị TBA không hoàn toàn phản ánh chất lượng của dầu mỡ Có thể do aldehyd không được sinh ra trong giai đoạn dập tắt hoặc những aldehyd bay hơi trong quá trình chế biến cũng như trong quá trình lưu trữ

 Acid béo tự do (FFA: Free fatty acid)

Acid béo tự do có trong dầu mỡ (hoặc phần chiết dầu mỡ) có thể xác định bằng phương pháp chuẩn độ FFA được biểu diễn là % của lượng acid có trong mẫu thử (% acid oleic cho mẫu mỡ động vật hoặc dầu nành, % acid lauric cho dầu dừa hoặc dầu chứa acid béo mạch ngắn) FFA biểu thị cho sự thủy phân của dầu, mỡ Trong giai đoạn oxy hóa dầu mỡ cũng sinh ra acid Phương pháp này cũng dùng để xác định thành phần, nguồn gốc của dầu mỡ sử dụng

I.2.2 Sản phẩm của quá trình oxy hóa dầu mỡ [2]

Sản phẩm sơ cấp của quá trình oxy hóa dầu mỡ là lipid hydroperoxid, tương đối bền tại nhiệt độ phòng và không có sự hiện diện của ion kim loại chuyển tiếp như sắt, đồng Khi có sự hiện diện của ion kim loại cũng như nhiệt độ cao chúng lặp tức bị phân hủy tạo thành gốc alkoxy sau đó tạo thành aldehyd, ceton, acid, ester, rượu và các hydrocacbon mạch ngắn Các sản phẩm tiếp theo của quá trình oxy hóa được trình bày

trong bảng 1.

Bảng 1: Các sản phẩm của quá trình oxy hóa dầu mỡ

I.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tự oxy hóa của dầu mỡ [2]

Sự tự oxy hóa của dầu mỡ bị ảnh hưởng bởi thành phần acid béo của dầu mỡ, quá trình sản xuất, năng lượng nhiệt hoặc ánh sáng, nồng độ và loại oxy, acid béo tự do, mono và diacylglycerol, ion kim loại chuyển tiếp, peroxit, các hợp chất đã bị oxy hóa nhiệt, bột màu và chất chống oxy hóa Các hợp chất này tác động qua lại lên sự oxy hóa của dầu mỡ và không dễ định lượng được sự ảnh hưởng của từng yếu tố

I.2.4 Tác hại của việc sử dụng dầu mỡ đã bị oxi hóa [5]

Trong cơ thể, quá trình oxy hóa lipid là một quá trình chuyển hóa bình thường, tham gia điều hòa hoạt động của các enzyme liên kết với màng tế bào và lưới nội bào Tuy nhiên, khi quá trình này xảy ra mạnh và kéo dài, ở màng tế bào xuất hiện những đám phân tử lipoperoxid, đó chính là những đường dẫn nước qua màng, làm thay đổi tính thấm của màng Các lipoperoxid phản ứng với các nhóm – SH của enzym làm ức chế các hoạt động của enzym, làm thay đổi quá trình phosphoryl hóa Hậu quả là các bơm canxi, natri, kali không hoạt động và dẫn đến sự tích tụ canxi ở bào tương

Hiện nay người ta thấy quá trình oxy hóa lipid là nguyên nhân của nhiều bệnh: nhồi máu cơ tim, xơ vữa động mạch, stress, thiểu năng động mạch vành…

I.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ PEROXID

Như đã trình bày ở trên, dầu mỡ và thực phẩm bị oxy hóa gây nên tác hại nghiêm trọng đối với cơ thể con người Do đó để đánh giá chất lượng của dầu mỡ, người ta dựa vào nhiều chỉ tiêu khác nhau – trong đó để đánh giá độ oxy hóa của dầu mỡ ta dựa vào chỉ số PV

Hiện nay có rất nhiều phương pháp xác định hàm lượng peroxid trong dầu mỡ, dầu sau chế biến, và các loại thực phẩm Phương pháp cổ điển cũng là phương pháp trọng tài theo AOAC, AOCS là xác định peroxid bằng phương pháp chuẩn độ thể tích dựa trên lượng I3- sinh ra bằng Na2S2O3 khi cho lượng dư KI vào mẫu với chỉ thị hồ tinh bột Ngoài ra còn có các phương pháp so màu, trong đó các peroxid là các chất oxi hóa, khi có mặt một ion kim loại có tính khử sẽ oxi hóa ion kim loại về số oxi hóa cao hơn Lượng ion kim loại mới sinh ra sẽ tạo phức màu với một thuốc thử hữu cơ Dựa trên màu sắc của hợp chất màu tạo thành ta sẽ xác định được hàm lượng peroxid có trong mẫu

I.3.1 Phương pháp chuẩn độ bằng iod (phương pháp AOCS Cd 8-53, TCVN 6121:2007) [6], [7]

I.3.1.2 Nhược điểm của phương pháp

Phương pháp này không thích hợp khi cần đo nhiều mẫu, yêu cầu lượng mẫu

phân tích nhiều, sử dụng dung môi độc hại (dung môi halogen – cloroform, hiện nay

một số phòng lab đã hạn chế sử dụng dung môi chứa halogen trong đó có chloroform)

Ngoài ra còn bị ảnh hưởng bởi chất nền: I- tự do bị oxy hóa bởi không khí tạo ra I2 và

phản ứng của I2 với các thành phần lipid khác, nhất là phản ứng cộng vào nối đôi, làm

sai lệch kết quả

I.3.2 Phương pháp tạo phức màu giữa Fe 3+ với SCN - (phương pháp IDF - International Dairy Federation) [8], [9], [10]

I.3.2.1 Nguyên tắc

Fe2+ sẽ bị oxi hóa thành Fe3+ bởi peroxid Lượng Fe3+ sinh ra sẽ cho phản ứng

tạo phức màu với SCN-

Thiocyanat (SCN-) là thuốc thử nhạy với ion Fe3+, nó được sử dụng rộng rãi

trong phân tích định tính và định lượng sắt theo phương trình sau:

6

Phức thu được có màu đỏ và hấp thu cực đại tại bước sóng 500nm Thông qua

mối quan hệ về tỉ lệ phản ứng giữa Fe2+ và peroxid, ta xác định được chỉ số peroxid

I.3.2.2 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp

Phương pháp này có nhiều ưu điểm so với phương pháp chuẩn độ: lượng mẫu

phân tích nhỏ, nhanh và đang được ứng dụng rất rộng rãi Tuy nhiên, phức giữa Fe3+ và

SCN- trong nước không được bền

I.3.3 Phương pháp tạo phức màu Fe 3+ với xylenol cam (XO) [11], [12]

I.3.3.1 Nguyên tắc

Trong môi trường acid, Fe2+

bị peroxid oxi hóa thành Fe3+, Fe3+ vừa được sinh

ra kết hợp với thuốc thử xylenol da cam tạo thành phức màu đỏ chàm

Phương trình phản ứng:

I.3.3.2 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp

Phương pháp này có độ nhạy cao, phức giữa Fe3+ và XO bền Tuy nhiên, do bản thân thuốc thử xylenol cam đã có màu (λmax = 430 nm) Do đó màu thuốc thử dư sẽ ảnh hưởng phép xác định

I.3.4 Phương pháp đề nghị: Tạo phức màu giữa Fe 3+ với SCN - sử dụng phương pháp ghép cặp ion

I 3.4.1 Mục tiêu của đề tài

Trên cơ sở các phương pháp được sử dụng để xác định peroxid, chúng tôi nhận thấy phương pháp so màu tiện lợi hơn các phương pháp khác vì có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu và lượng mẫu tiêu tốn nhỏ Chính vì vậy trong đề tài này, chúng tôi mong muốn cải tiến quy trình phân tích peroxid trong dầu mỡ và thực phẩm bằng phương pháp trắc quang với nhiều ưu điểm hơn các phương pháp hiện có, từ đó chế tạo

bộ kit xác định nhanh peroxid trong các đối tượng dầu mỡ và các thực phẩm chế biến

I 3.4.2 Cách lựa chọn thuốc thử

Vì xylenol cam là thuốc thử có màu (λ= 430 nm), do đó lượng thuốc thử dư sẽ ảnh hưởng đến phương pháp xác định Ngoài ra, khi khảo sát các loại thuốc thử XO của Trung Quốc và Merck cho thấy thuốc thử xylenol cam mới bị nhiễm bẩn, khi tiến hành quét sóng thuốc thử không chỉ thấy bước sóng cực đại của thuốc thử mà còn có bước sóng cực đại của phức Fe3+ với XO

I.3.4.3 Phương pháp tạo phức màu giữa Fe 3+ với SCN - sử dụng phương

pháp ghép cặp ion

Vì phức [Fe(SCN)6]3- trong nước kém bền (β = 103.23), chỉ tan tốt trong nước,

mà peroxid nằm trong pha dầu do đó để tăng sự tiếp xúc giữa Fe2+ trong nước và peroxid trong dầu ta phải sử dụng một dung môi để chiết phức [Fe(SCN)6]3- Ngoài ra,

để tăng độ bền phức cũng như có thể chiết được hết lượng phức hình thành thì chúng tôi sử dụng một muối amin bậc 4 để ghép cặp ion với phức [Fe(SCN)6]3- và sử dụng một dung môi hữu cơ để chiết [8]

I.3.4.4 Nguyên tắc

Peroxid oxi hóa Fe2+ về Fe3+ Lượng Fe3+

sinh ra sẽ tham gia phản ứng tạo phức màu với SCN- Tiến hành ghép cặp với cetyltrimethylammonium bromide (CTMA - muối ammoni tứ cấp) và chiết bằng dung môi hữu cơ Sau đó đo quang phức màu thu được và xác định hàm lượng peroxid có trong mẫu

Công thức của CTMA:

Phản ứng giữa Fe2+ và peroxid là phản ứng oxi hóa khử Gồm hai bán phản ứng:

* *

Phản ứng (4) hầu nhƣ không xảy ra vì lƣợng LOOH thấp đo đó trong phản ứng (1) đã phản ứng hoàn toàn Bản chất của phản ứng (3) còn phụ thuộc vào dung môi sử dụng

Nếu dung môi sử dụng là CHCl3:

Nhận thấy lƣợng Fe3+ xác định không chỉ từ phản ứng (1), mà còn phụ thuộc

vào sự cạnh tranh giữa các phản ứng (2), (3), (5) ,(6) Chính vì vậy các yếu tố nhƣ pH, dung môi chiết,….cần phải đƣợc khảo sát để tối ƣu quy trình phân tích

II NỘI DUNG & PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

II.1 NỘI DUNG 1:

TỐI ƯU QUI TRÌNH XÁC ĐỊNH PEROXID BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRẮC QUANG

GHÉP CẶP ION

- Máy quang phổ SHIMADZU UV-1800

- Phễu chiết 250mL (ISO)

II.1.2 QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM

II.1.2.1 Chuẩn bị hóa chất

 Dung dịch natri thiosunfat 0.1M: Cân khoảng chính xác 24,817g muối

Na2S2O3.5H2O Hòa tan trong nước cất, và định mức thành 1L dung dịch Nồng độ chính xác của dung dịch được xác định lại trước khi sử dụng

 Dung dịch KI bão hòa: Hòa tan một lượng dư KI vào nước cất đến khi xuất hiện pha rắn không thể không đổi Bảo quản dung dịch trong chai tối

 Dung dịch bicromat 0.100N: Cân một lượng chính xác 2,4515g K2Cr2O7 Hòa tan trong nước cất, định mức đến vạch mức 500mL

II.1.2.2 Xác định peroxid bằng phương pháp trắc quang cải tiến

Như đã trình bày, phức [Fe(SCN)6]3- kém bền và chỉ tan tốt trong nước, còn peroxid trong dầu khó phản ứng với Fe2+ trong nước Do đó, để tăng sự tiếp xúc giữa Fe2+ trong nước và peroxid trong dầu và tăng độ bền phức cũng như có thể chiết được hết lượng phức hình thành thì chúng tôi sử dụng CTMA, một muối amin bậc 4 để ghép cặp ion với phức [Fe(SCN)6]3-, từ đó chiết bằng một dung môi hữu cơ

II.1.2.2.1 Nguyên tắc

Quy trình dựa trên nguyên tắc tương tự như phương pháp IDF, sử dụng phản ứng oxi hóa Fe2+ thành Fe3+ bằng peroxid Lượng Fe3+ sinh ra tham gia phản ứng tạo màu với SCN-

Tiến hành chiết phức màu bằng CTMA trong dung môi hữu cơ Đo quang tại bước sóng hấp thu cực đại của phức thu được

II.1.2.2.2 Quy trình phân tích

Quy trình phân tích được thực hiện theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 1: Quy trình thực nghiệm tóm tắt

Để tối ưu qui trình phân tích, các yếu tố sau sẽ được khảo sát:

Dung môi chiết

Bước sóng hấp thu cực đại của phức tạo thành [Fe(SCN)6][CTMA]3

Nồng độ thuốc thử SCN- đến phản ứng lên màu

Lượng CTMA

Ảnh hưởng của pH

Thời gian lắc trong quá trình chiết

Thời gian ổn định màu

II.1.2.3 Khảo sát các điều kiện tối ưu

Chất chuẩn được dùng trong các khảo sát là benzoylperoxid

Dung môi hữu cơ CTMA Nước Lắc đều

Mẫu phân tích 5 mL hỗn hợp thuốc thử

Mẫu phân tích Mẫu phân tích 5 mL hỗn hợp thuốc thử

(Fe 2+ , SCN - , H 2 SO 4 )

5 mL hỗn hợp thuốc thử (Fe 2+ , SCN - , H 2 SO 4 )

Phểu chiết Phểu chiết

Lớp dung môi hữu cơ Lớp dung môi hữu cơ

Đo quang

+

II.1.2.3.1 Khảo sát dung môi chiết

 Mục đích:

Chiết phức [Fe(SCN)6]3- ra khỏi pha nước để làm tăng độ nhạy, giảm nhiễu Dung môi được chọn phải có độ phân cực thấp đến trung bình, chiết tốt [Fe(SCN)6]3- và không phải là CHCl3 (vì CHCl3 tham gia vào các phản ứng gốc tự do) [12] Phần chiết xong phải trong, không tạo nhũ

n-Butylacetat 10 lần (15 mL dung môi/lần) Tốt

Bảng 2: Kết quả khảo sát các dung môi chiết

 Nhận xét:

Khi chiết bằng dung môi n-butylacetat, sự tách lớp diễn ra tốt nhưng hiệu suất chiết rất thấp Tiến hành chiết 10 lần (mỗi lần 15 mL dung môi) thì quá trình chiết mới được xem

là hoàn toàn Ngược lại, dung môi iso-amylic thì hiệu suất chiết tốt hơn, chiết 3 lần (mỗi lần

15 mL dung môi), nhưng sự tách lớp diễn ra không tốt, bị tạo nhũ So với hai dung môi trên, etylacetat đạt được hiệu quả cao cả về hiệu suất chiết lẫn sự tách lớp Tuy vậy, thể tích dung môi dùng trong quá trình chiết vẫn nhiều và phải chiết nhiều lần Để cân bằng chiết thiết lập nhanh và hoàn toàn, chúng tôi sử dụng phương pháp ghép cặp ion liên hợp

Theo Astrid và Biserka [8] khi xác định Fe3+ bằng phương pháp trắc quang với thuốc thử SCN-, để tăng độ nhạy người ta dùng CTMA (muối amoni tứ cấp) để ghép cặp với phức [Fe(SCN)6]3- và chiết bằng CHCl3 Tuy nhiên, trong phương pháp này đối tượng xác định là peroxid và do CHCl3 có các phản ứng phức tạp với các gốc tự do, do đó không thể sử dụng CHCl3 Nhận thấy, etylacetat có khả năng chiết [Fe(SCN)6]3- tốt, do đó chúng tôi muốn sử dụng dung môi này để chiết phức [Fe(SCN)6][CTMA]3 Tuy nhiên, vì CTMA tan không tốt trong etylacetat, để cải thiện độ tan của CTMA trong etylacetat, theo tài liệu [3], chúng tôi thêm một ít CH3COOH băng (nước: CH3COOH = 10:1) vào để giúp CTMA tan hoàn toàn

Kết quả cho thấy, chỉ một lần chiết ta có thể chiết hoàn toàn phức [Fe(SCN)6][CTMA]3 lên pha hữu cơ, khả năng tách lớp cũng rất tốt và màu của phức thu được cũng bền hơn rất nhiều so với phức [Fe(SCN)6]3- trong nước

II.1.2.3.2 Khảo sát bước sóng hấp thu cực đại của phức [Fe(SCN) 6 ][CTMA] 3

 Kết quả:

Chọn bước sóng λ = 491 nm để đo độ hấp thu của phức trong quy trình thực nghiệm

II.1.2.3.3 Khảo sát nồng độ thuốc thử SCN

- Tiến hành thực nghiệm:

Các mẫu khảo sát được giữ nguyên nồng độ của Fe3+ là 6 μg mL-1 Lần lượt thay đổi nồng độ của SCN-

Kết quả được trình bày trong đồ thị :

Đồ thị 3: Sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ thuốc thử SCN

Cho vào phễu chiết 1,5mL Fe3+ (100μg mL-1) và 1,0mL SCN- (30%) Thêm khoảng

20 mL nước cất Tiến hành chiết với các lượng CTMA khác nhau

Kết quả được trình bày trong đồ thị:

Đồ thị 4: Sự phụ thuộc mật độ quang vào lƣợng CTMA thêm vào

-Đồ thị 5: Sự phụ thuộc mật độ quang vào pH của dung dịch

Cho vào phễu chiết 1 mL Fe3+(100 μg mL-1

), với 1 mL SCN-(30%) Thêm khoảng 20

mL nước cất Tiến hành chiết tương tự quy trình với những thời gian lắc khác nhau

Kết quả được trình bày trong đồ thị:

Đồ thị 6: Sự ảnh hưởng của thời gian lắc lên mật độ quang

 Nhận xét:

Quá trình phân bố của phức [Fe(SCN)6][CTMA]3 lên dung môi etylacetat diễn ra

nhanh, vì vậy thời gian lắc không ảnh hưởng nhiều đến kết quả đo được

II.1.2.3.7 Khảo sát ảnh hưởng thời gian ổn định màu

Đồ thị 7: Độ bền màu của phức theo thời gian

Kết quả cho thấy sau 5 phút lên màu thì mật độ quang ổn định Do đó, sau khi lên màu 5 phút thì tiến hành đo mẫu

II.1.2.4 Khoảng tuyến tính, dựng đường chuẩn

Chuẩn bị các thí nghiệm với nồng độ Fe3+ thay đổi từ 0,5 →10 μg mL-1 Tiến hành theo quy trình, đo quang tại bước sóng 491 nm Ta thu được kết quả sau:

Đồ thị 8: Sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ Fe3+

( g/mL)

Trong khảo sát này chúng tôi chọn dựng đường chuẩn trong khoảng nồng độ từ 0,5→7 μg mL-1

b = 2 2

)

i i

i i

C Ci

n

A C

A C n

= 0,3303

a =

2 2

2

) ( i

i i i i

i

C Ci

n

A C C A

= 6,285*10-4

 Tính độ lệch chuẩn cho các hệ số hồi quy:

2 2

2

) ( i

i

i re

a

C C

n

C S

2 2

)( i

i re

b

C C

n

n S

 Khoảng tin cậy: Với bậc tự do f = n – 2 = 6, = 2,45

= 0,015

= 0,0035 Phương trình hồi quy:

 A = (a a) + (b b) C

A = (0,0059 ± 0,015) + (0,3303 ± 0,0035)C

II.1.2.5 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

Có nhiều phương pháp để đánh giá LOD, LOQ của quy trình phân tích Ở đây chúng tôi chọn phương pháp xác định LOD, LOQ dựa vào phương trình hồi quy và mẫu trắng [13]