NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian và nồng độ chất khử trùng đến khả năng tạo nguồn mẫu in vitro cây Sâm đá
Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến khả năng tạo mô sẹo của cây Sâm đá
Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến khả năng nảy chồi từ mẫu Sâm đá in vitro.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: Từ 01/2019 đến 12/2019 Địa điểm: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao Địa chỉ: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, Tp.HCM
Vật liệu nghiên cứu
Cây giống Sâm đá được cung cấp từ bộ sưu tập cây dược liệu của Trung tâm Sâm và dược liệu thảnh phố Hồ Chí Minh
Máy cất nước 1 lần, máy cất nước 2 lần, máy đo pH cầm tay Hanna 90993, cân phân tích – AUX-220g, cân ký thuật – CPA 3202S, tủ cấy vô trùng – SCBN
1200, nồi hấp tiệt trùng – HV 110, hóa chất và các dụng cụ sử dụng cho lĩnh vực Công nghệ Tế bào Thực vật.
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian và nồng độ chất khử trùng đến khả năng tạo nguồn mẫu in vitro cây Sâm đá
Thí nghiệm 1.1: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian và nồng độ dung dịch NaClO đến khả năng tạo nguồn mẫu in vitro cây Sâm đá
Nguồn mẫu: Củ Sâm đá, thân rễ và đỉnh thân rễ
Môi trường nuôi cấy khoáng cơ bản MS được bổ sung 20 g/L đường sucrose và 8,25 g/L agar với pH 5,8 Sau khi chuẩn bị, môi trường này được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C, 1 atm trong 20 phút.
Nghiên cứu được thực hiện thông qua phương pháp thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên với hai yếu tố (CRD), bao gồm ba lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức Mỗi nghiệm thức sử dụng 10 bình, mỗi bình chứa một mẫu trong môi trường nuôi cấy 250 mL, tổng số mẫu trong thí nghiệm là.
Bảng 2.1 Ảnh hưởng của thời gian và nồng độ dung dịch NaClO đến khả năng tạo nguồn mẫu in vitro cây Sâm đá
- Cường độ chiếu sáng: 2000 lux
- Thời gian chiếu sáng: 12h/ngày
Thời gian nuôi cấy: 2 tuần
Thí nghiệm 1.2: Khảo sát ảnh hưởng thời gian khử trùng của dung dịch HgCl 2 0,1% (w/v) đến khả năng tạo nguồn mẫu in vitro cây Sâm đá
Nguồn mẫu: Củ Sâm đá, thân rễ và đỉnh thân rễ
Môi trường nuôi cấy khoáng cơ bản MS được bổ sung đường sucrose 30 g/L và agar 8,25 g/L với pH 5,8 Sau khi chuẩn bị, môi trường này được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 oC, áp suất 1 atm trong 20 phút.
Phương pháp thí nghiệm được thực hiện theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố (CRD) với ba lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức Mỗi nghiệm thức bao gồm 10 bình, trong đó mỗi bình chứa một mẫu với dung tích nuôi cấy là 250 mL Tổng số mẫu trong thí nghiệm là.
Bảng 2.2 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng của dung dịch HgCl2 0,1% đến khả năng tạo nguồn mẫu in vitro cây Sâm đá
Tên nghiệm thức Thời gian (phút)
- Cường độ chiếu sáng: 2000 lux
- Thời gian chiếu sáng: 12h/ngày
Thời gian nuôi cấy: 2 tuần
2.4.2 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến khả năng tạo mô sẹo của cây Sâm đá
Thí nghiệm 2.1: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa trưởng thực vật 2,4D và TDZ đến khả năng tạo mô sẹo của cây Sâm đá
Nguồn mẫu: Mẫu Sâm đá in vitro ở nghiệm thức tốt nhất của nội dung 1 sau khi nuôi cấy 2 tuần
Môi trường nuôi cấy cơ bản MS được điều chỉnh với các thành phần như nước dừa 10%, đường sucrose 25 g/L, BAP 1,0 mg/L, agar 8,25 g/L, và 2,4D kết hợp TDZ Sau khi chuẩn bị, môi trường này được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 o C, áp suất 1 atm trong 20 phút.
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên với hai yếu tố (CRD), bao gồm ba lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức Mỗi nghiệm thức có 10 bình nuôi cấy, mỗi bình chứa 1 mẫu với dung tích 250 mL Tổng số mẫu trong thí nghiệm là
Bảng 2.3 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật
2,4D kết hợp TDZ đến khả năng tạo sẹo của cây Sâm đá
Nồng độ TDZ (mg/L) Nồng độ 2,4D (mg/L)
- Thời gian bắt đầu cảm ứng taok mô sẹo (NSC)
- Hình thái sẹo Điều kiện nuôi cấy:
- Cường độ chiếu sáng: 2000 lux
- Thời gian chiếu sáng: 12h/ngày
Thời gian nuôi cấy: 6 tuần
Thí nghiệm 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa trưởng thực vật NAA và BAP đến khả năng tạo mô sẹo của cây Sâm đá
Nguồn mẫu: Mẫu Sâm đá in vitro ở nghiệm thức tốt nhất của nội dung 1 sau khi nuôi cấy 2 tuần
Môi trường nuôi cấy được thiết lập với thành phần cơ bản gồm 10% nước dừa, 25 g/L đường sucrose, 8,25 g/L agar, và NAA kết hợp với BAP theo bảng 2.4 Sau khi chuẩn bị, môi trường này sẽ được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 oC.
Thí nghiệm được thiết kế theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên 2 yếu tố (CRD) với ba lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức Mỗi nghiệm thức bao gồm 10 bình, mỗi bình chứa 1 mẫu và có dung tích 250 mL Tổng số mẫu của thí nghiệm được bố trí để thu thập dữ liệu chính xác và đáng tin cậy.
Bảng 2.4 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật
NAA kết hợp BAP đến khả năng tạo sẹo của cây Sâm đá
Nồng độ BAP (mg/L) Nồng độ NAA (mg/L)
- Thời gian bắt đầu cảm ứng tạo mô sẹo (NSC)
- Hình thái sẹo Điều kiện nuôi cấy:
- Cường độ chiếu sáng: 2000 lux
- Thời gian chiếu sáng: 12h/ngày
Thời gian nuôi cấy: 6 tuần
2.4.3 Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến khả năng nảy chồi từ mẫu Sâm đá in vitro
Thí nghiệm 3.1: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến khả năng nảy chồi gián tiếp qua mô sẹo cây Sâm đá in vitro
Nguồn mẫu: Mẫu sẹo Sâm đá in vitro ở nghiệm thức tốt nhất của nội dung 2 sau khi nuôi cấy 6 tuần
Môi trường nuôi cấy tối ưu được xác định là không bổ sung 2,4D và TDZ, sử dụng agar 8,25 g/L kết hợp với Kin và BAP theo các nồng độ trong bảng 2.5 Sau khi chuẩn bị, môi trường này cần được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 o C, 1 atm trong 20 phút để đảm bảo tính vô trùng.
Thí nghiệm được thiết kế theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên với hai yếu tố (CRD) và được thực hiện với ba lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức Mỗi nghiệm thức bao gồm 10 bình, mỗi bình chứa một mẫu với thể tích nuôi cấy là 500 mL Tổng số mẫu trong thí nghiệm là
Bảng 2.5 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật
BAP và Kin đến khả năng nảy chồi gián tiếp qua mô sẹo cây Sâm đá
Nồng độ Kin (mg/L) Nồng độ BAP (mg/L)
- Thời gian bắt đầu cảm ứng nảy chồi (NSC)
- Số chồi/mô sẹo (đếm các chồi cao hơn 0,5 cm)
- Chiều cao chồi (cm) được đo từ gốc chồi đến ngọn lá cao nhất
- Cường độ chiếu sáng: 2000 lux
- Thời gian chiếu sáng: 12h/ngày
Thời gian nuôi cấy: 8 tuần
Thí nghiệm 3.2 nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA và BAP đến khả năng nảy chồi trực tiếp từ củ Sâm đá trong điều kiện in vitro Kết quả cho thấy sự kết hợp của NAA và BAP có tác động tích cực đến quá trình nảy chồi, mở ra hướng đi mới cho việc nhân giống Sâm đá hiệu quả.
Nguồn mẫu: Mẫu củ Sâm đá in vitro ở nghiệm thức tốt nhất ở nội dung 1 sau khi nuôi cấy 2 tuần
Môi trường nuôi cấy: Môi trường MS có bổ sung đường sucrose 25 g/L, agar
8,25 g/L, GA3 0,2 mg/L, BAP và NAA kết hợp theo bảng 2.6 Môi trường sau khi chuẩn bị, được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 o C, 1 atm trong 20 phút
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên với hai yếu tố (CRD), bao gồm ba lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức Mỗi nghiệm thức được bố trí 10 bình, trong đó mỗi bình chứa một mẫu và có dung tích nuôi cấy là 500 mL Tổng số mẫu trong thí nghiệm là
Bảng 2.6 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật
BAP và NAA đến khả năng nảy chồi trực tiếp từ củ Sâm đá in vitro
Nồng độ NAA (mg/L) Nồng độ BAP (mg/L)
- Thời gian bắt đầu cảm ứng nảy chồi (NSC)
- Số chồi/củ (đếm các chồi cao hơn 0,5 cm)
- Chiều cao chồi (cm) được đo từ gốc chồi đến ngọn lá cao nhất
- Cường độ chiếu sáng: 2000 lux
- Thời gian chiếu sáng: 12h/ngày
Thời gian nuôi cấy: 8 tuần.
Phương pháp tiến hảnh
2.5.1 Phương pháp tạo nguồn mẫu in vitro
Củ Sâm đá cần được rửa sạch dưới vòi nước chảy trong 10 phút để loại bỏ đất bám Sau đó, mẫu được lắc với xà phòng loãng trong 20 phút để giảm thiểu vi khuẩn, rồi rửa lại bằng nước sạch Tiếp theo, khử trùng bằng cồn 70 độ trong 30 giây và rửa lại với nước vô trùng Cuối cùng, mẫu được khử trùng bằng dung dịch theo bố trí thí nghiệm có thêm 3-4 giọt Tween 20, sau đó rửa lại bằng nước vô trùng.
2.5.2 Phương pháp tạo mô sẹo
Sau 2 tuần nuôi cấy, mẫu cấy Củ Sâm đá được cắt lát mỏng với kích thước 3 – 4 mm rộng, 8 – 10 mm dài và 1 – 2 mm dày, sau đó đặt vào môi trường thí nghiệm theo bố trí đã định Thí nghiệm được tiến hành dưới điều kiện nhiệt độ 25 ± 2 o C, cường độ chiếu sáng 2000 lux và thời gian chiếu sáng 12 giờ mỗi ngày.
2.5.3 Phương pháp nảy chồi gián tiếp qua mô sẹo
Sau 6 tuần nuôi cấy, mẫu mô sẹo có màu xanh đặc trưng sẽ được cấy chuyền sang môi trường nảy chồi với kích thước 5 x 5 mm theo bố trí thí nghiệm (bảng 2.5) Thí nghiệm được theo dõi trong điều kiện nhiệt độ 25 ± 2 o C, cường độ chiếu sáng 2000 lux và thời gian chiếu sáng 12 giờ mỗi ngày.
2.5.4 Phương pháp nảy chồi trực tiếp từ củ
Sau 2 tuần nuôi cấy, mẫu củ Sâm đá sẽ được cấy chuyền in vitro sang môi trường nảy chồi trực tiếp từ củ, theo bố trí thí nghiệm đã được xác định (bảng 2.6).
Tiến hảnh theo dõi thí nghiệm trong điều kiện nhiệt độ: 25 ± 2 o C, cường độ chiếu sáng: 2000 lux, thời gian chiếu sáng: 12h/ngày
Phương pháp phân tích số liệu
Các số liệu được xử lý theo chương trình Microsoft Excel 2010 và phần mềm thống kê SAS 9.1
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Ảnh hưởng của thời gian và nồng độ chất khử trùng đến khả năng tạo nguồn mẫu in vitro cây Sâm đá
Khử trùng nguồn mẫu in vitro là bước quan trọng quyết định thành công của quy trình nhân giống Các hóa chất khử trùng phải được lựa chọn phù hợp với từng loại nguồn mẫu ban đầu Đối với nguồn mẫu là củ, dung dịch NaClO hoặc HgCl2 0,1% là sự lựa chọn hiệu quả Phương pháp khử trùng cần đảm bảo tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tỷ lệ mẫu chết thấp và tỷ lệ mẫu sống có khả năng nảy chồi cao.
Sử dụng dung dịch NaClO có tỷ lệ khử trùng thấp, trong khi tỷ lệ mẫu chết lại cao ở nồng độ cao Mẫu dễ bị dập và ăn mòn trong quá trình khử trùng do tác động của NaClO, nhưng ngược lại, mẫu ít bị nhiễm độc từ chất khử trùng này.
Sử dụng dung dịch HgCl2 mang lại hiệu quả khử trùng cao với tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, đồng thời giảm thiểu tình trạng dập và ăn mòn trong quá trình khử trùng Tuy nhiên, khi áp dụng dung dịch HgCl2 0,1% trong thời gian dài, mẫu có nguy cơ bị nhiễm độc do tác động của dung dịch này.
3.1.1 Ảnh hưởng của thời gian và nồng độ dung dịch NaClO đến khả năng tạo nguồn mẫu in vitro cây Sâm đá
Tỷ lệ mẫu sống do ảnh hưởng của thời gian khử trùng và nồng độ dung dịch NaClO
Kết quả từ bảng 3.1 cho thấy nồng độ chất khử trùng và thời gian khử trùng có tác động đáng kể đến tỷ lệ mẫu sống của củ Sâm đá Cụ thể, với nồng độ NaClO 0,5%, tỷ lệ mẫu sống không khác biệt ở các thời gian khử trùng 8 phút, 12 phút và 16 phút (23,33%), nhưng khi thời gian khử trùng tăng lên 20 phút, tỷ lệ mẫu sống tăng lên 33,33% Đối với nồng độ NaClO 1,0%, tại thời gian khử trùng 8 phút và 12 phút, tỷ lệ mẫu sống cũng không có sự khác biệt (33,33%), tuy nhiên, khi thời gian khử trùng được kéo dài đến 16 phút, tỷ lệ mẫu sống có sự thay đổi.
