Áp dụng phương pháp phân tích dna để xác định nguồn gốc của các dược liệu và sản phẩm thuốc từ sâm sâm bố chính và nghệ

BÁO CÁO NGHIỆM THU ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA ĐỂ XÁC ĐỊNH NGUỒN GỐC CỦA CÁC DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM THUỐC TỪ SÂM, SÂM BỐ CHÍNH VÀ NGHỆ TRẦN THU HOA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 7

BÁO CÁO NGHIỆM THU

ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA ĐỂ XÁC ĐỊNH NGUỒN GỐC CỦA CÁC DƯỢC LIỆU

VÀ SẢN PHẨM THUỐC TỪ SÂM, SÂM BỐ CHÍNH VÀ NGHỆ

TRẦN THU HOA

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 7/ 2010

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO NGHIỆM THU

ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA ĐỂ XÁC ĐỊNH NGUỒN GỐC CỦA CÁC DƯỢC LIỆU

VÀ SẢN PHẨM THUỐC TỪ SÂM, SÂM BỐ CHÍNH VÀ NGHỆ

Chủ nhiệm dề tài: TRẦN THU HOA

Những người tham gia:

CN Nguyễn Thanh Tố Nhi

CN Nguyễn Lê Huyền Thanh

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 7/ 2010

TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Tên đề tài: ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA ĐỂ XÁC ĐỊNH

NGUỒN GỐC CỦA CÁC DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM THUỐC TỪ SÂM, SÂM BỐ CHÍNH VÀ NGHỆ

Mở đầu: Các tác dụng dược lý quý giá của Sâm (Panax spp), Sâm bố chính -

Abelmoschus sagittifolius (Kurz) Merr., và Nghệ (Curcuma sp.) từ lâu đã được biết

và sử dụng quen thuộc, rộng rãi ở nhiều nước trong khu vực châu Á Tuỳ theo loài

và tùy nơi phân bố của các loài mà các dược liệu có thành phần, tỷ lệ hoạt chất khác nhau, dẫn đến sự khác nhau ít nhiều về tác dụng dược lý, công dụng Chính vì sự đa dạng về nguồn gốc, chủng loài của các dược liệu này trên thị trường hay trong tự nhiên nên chúng ta cần thành lập, triển khai phương pháp kỹ thuật phân tử để giúp việc định danh thuận tiện và chính xác

Các kỹ thuật mới dựa vào DNA cho phép tìm hiểu, quản lý và sử dụng sự đa dạng

di truyền của cây trồng và các họ hàng hoang dại của chúng tốt hơn Chúng có ưu điểm là không bị ảnh hưởng bởi giai đoạn tăng trưởng và điều kiện môi trường của thực vật và cung cấp phương pháp thực hiện hứa hẹn hơn so với dựa vào kiểu hình Các kỹ thuật này gồm có: giải trình tự (sequencing), phức hợp liên kết mô chính (MHC, major histocompatibility complex), minisatellite, microsatellite, đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP, Restriction fragment length polymorphisms)

và một số kỹ thuật mới đây dựa vào PCR như đa hình các đoạn DNA khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD, random amplified polymorphic DNA), đa hình chiều dài các đoạn DNA nhân bản chọn lọc (AFLP, amplified fragment length polymorphisms), hay đa hình các trình tự lặp lại đơn giản (ISSR, intersimple sequence repeat polymorphisms) giúp phân tích tinh vi hơn cấu trúc di truyền của quần thể và các sự kiện khác trong quá trình sinh học tiến hóa của chúng

Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi áp dụng các phương pháp phân tích DNA là RAPD và MARMS hoặc PCR-RFLP trên cpDNA để định danh phân biệt sâm, nghệ

và sâm bố chính

Mục tiêu: Xác định nguồn gốc của dược liệu và sản phẩm thuốc từ sâm Panax,

nghệ và sâm bố chính là các dược liệu làm thuốc rất quý và rất phong phú về chủng loại

Phương pháp: Thu thập mẫu dược liệu và sản phẩm thuốc Chiết DNA, phân tích

RAPD hoặc MARMS

Kết quả:

1- Năm loài sâm Panax phổ biến (P ginseng, P quinquefolius, P notoginseng,

P japonicus và P vietnamensis) đã được tiến hành mô tả đặc điểm hình thái, định

tính saponin của sâm theo các phương pháp truyền thống để làm cơ sở cho nhận định Phân tích MARMS trên các mẫu chuẩn này và 29 mẫu sản phẩm của P

Ginseng , P quinquefolius và P notoginseng Kết quả đề tài đã cho thấy sự thành

công trong việc:

- Tìm được quy trình thích hợp để chiết DNA từ các mẫu sâm Panax

- Áp dụng MARMS hiệu quả trong việc xác định các loài sâm Xác định đúng nhãn hiệu các loại sâm trên thị trường, phòng sản phẩm giả mạo Quy trình kiểm định được kiểm tra độ đặc hiệu cũng như độ lặp lại

2- Chín mẫu sâm bố chính đã được mô tả đặc điểm hình thái, xác định hàm lượng

chất nhầy trong mẫu sâm bố chính Lộc Ninh, và phân tích RAPD Kết quả đã cho thấy sự thành công trong việc:

- Phân tích được tương quan di truyền giữa các mẫu sâm bố chính thu thập từ các địa phương khác nhau

- Dựng sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các mẫu sâm bố chính khảo sát

3- Mười mẫu nghệ Curcuma longa và ba mẫu nghệ khác (C aromatica Salisb, C

xanthorrhiza Roxb, C zedoaria (Berg.) Roscoe) đã được tiến hành mô tả đặc điểm

hình thái, định lượng curcumin (thành phần hóa học tác dụng chính của nghệ), phân tích RAPD và MARMS Các kết quả chính như sau:

- Phân tích RAPD: (1) Sàng lọc được 18 mồi ngẫu nhiên có thể dùng phân tích đa dạng di truyền trên nghệ và (2) Mối tương quan di truyền giữa các mẫu nghệ khá cao (48% – 82%), khoảng cách di truyền thấp và có sự tương quan giữa khoảng cách địa lý với khoảng cách di truyền

- Từ kết quả phân tích RAPD, sơ đồ mối quan hệ di truyền và phân tích cây sinh loài đã được thiết lập

- Có thể áp dụng MARMS với hai cặp mồi là I - CT23F và CT177; II - CT23F và CT531 trên khuôn là tinh chế của sản phẩm PCR với mồi CT23F và CT911R để phân biệt một vài loài nghệ

4- Tám mẫu ngải (họ Gừng Zingiberaceae) thu hái từ miền Tây Nam Bộ đã được

tiến hành mô tả đặc điểm hình thái, và sử dụng để đánh giá khả năng phân biệt giữa các dược liệu nghệ và ngải bằng RAPD marker

- Kết quả RAPD với mồi OPE7 có thể phân biệt các mẫu nghệ và ngải

- Mối tương quan di truyền giữa nghệ và ngải khá cao Mẫu ngải vàng chanh có tỉ

lệ tương đồng lần lượt là 55% và 59% với nghệ C longa thu hái từ Đồng Tháp

và Cần Thơ trong khi mẫu ngải vàng có tỉ lệ tương đồng lần lượt là 80% và 70%

v

SUMMARY OF RESEARCH CONTENT

Project title: APPLICATION OF ANALYSING DNA TO DETERMINE ORIGIN

OF PHARMACEUTICAL PRODUCTS AND MEDICINES FROM GINSENG,

ABELMOSCHUS, AND CURCUMIN

Introduction: The valuable pharmaceutical effects of ginseng (Panax spp), ginseng

derived medicine, abelmoschus - Abelmoschus sagittifolius (Kurz) Merr., and

Curcuma sp have long been known and used broadly in many countries in Asia

Depending on species distributions and locations, these medicinal herbs have

different ingredients and percentage of active compounds leading to their variances

in pharmacological effects and utilities Due to the diversity of origin and species of

these medicinal herbs on the market or in nature, scientists need to establish and

implement molecular techniques to facilitate their identification more accurately

New techniques based on the DNA allow to study, manage and use genetic diversity

of plants and their wild relatives better They have an advantage of not being

affected by growth phase and environmental conditions of plants and provide

promising methods comparing to old techniques based on phenotype These new

techniques include: sequencing, Major Histocompatibility Complex (MHC),

minisatellite, Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP) and some new

techniques based on PCR, such as Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD),

Amplified Fragment Length Polymorphisms (AFLP), or InterSimple Sequence

Repeat polymorphisms (ISSR) provide sophisticated analysis of genetic structure of

populations and other events in the process of biological evolution

In this research, we apply RAPD and MARMS to analyse DNA from Panax,

Abelmoschus , and Curcuma

Objective: Determine the source of medicinal products and drugs

Method: Applying the methods of DNA analysis, such as RAPD and MARMS

Results:

1- Five popular Panax samples (P ginseng, P quinquefolius, P notoginseng,

P japonicus and P vietnamensis) were described morphological characteristics,

analysed quantitatively saponin and were used as reference samples Results

showed that project was successful in:

- Find and establish a suitable process for extracting DNA from samples of Panax

ginseng

Deleted:

vi

- Apply MARMS effectively in identifying ginseng species Identification properly ginseng products and their labels on the market preventing fraud products The process of verification was test for specificity and reproducibility

2- Nine forms of Abelmoschus were described morphological characteristics,

determined the mucus concentration of the dark Albelmoschus Loc Ninh, and

analysed RAPD Results showed success in:

- Analysis of the genetic correlation among Abelmoschus forms collected from

different areas

- Generate a tree dendogram shows the genetic relationship among surveyed

Abelmoschus forms

3- Ten samples of Curcuma longa and other Curcuma samples (C aromatica

Salisb, C xanthorrhiza Roxb, C zedoaria (Berg.) Roscoe) were described

morphological characteristics, determined curcumin concentration (the main composition of Turmeric), and analysed by RAPD and MARMS From result of MARMS, a diagram of genetic relationship and phylogenetic analysis were generated In addition, the DNA analysis showed:

- RAPD analysis: (1) Selected 18 random primers to analyse genetic diversity of

Curcuma samples and (2) genetic correlation among Curcuma samples was

quite high (48% - 82%) implying their short genetic distance There is a correlation between geographical distance and genetic distance

- Can apply MARMS with two pairs of primers I - CT23F and CT177; II - CT23F and CT531 to the purified PCR product with primers CT23F and CT911R to

differentiate several species of Curcuma.

- 4 - Eight samples, which have local name “ngai” belong Zingiberaceae family,

harvested from the Mekong Delta were carried out to describe morphological

characteristics, and used to measure the ability to distinguish between Curcuma

and “ngai” by RAPD marker

- RAPD results with primer OPE7 can distinguish curcuma and ngai forms

- Genetic correlations between Curcuma and “ngai” were quite high, from 55% to

80%

vii

Mục lục TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU i

Mục lục vii

CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix

DANH MỤC BẢNG x

DANH MỤC HÌNH xi

Thông tin chung 1

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan 4

1.1.1 Kỹ thuật RAPD 5

1.1.2 Kỹ thuật ARMS/MARMS 6

1.1.3 PCR-RFLP trên cpDNA 6

1.1.4 Sơ lược về các đối tượng nghiên cứu 7

1.1.4.1 Sâm 7

1.1.4.2 Sâm bố chính 7

1.1.4.3 Nghệ 8

1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 9

1.3 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 9

1.3.1 Phân tích DNA trong nghiên cứu phân loại chi Panax 9

1.3.2 Phân tích DNA trong nghiên cứu phân loại chi Dâm bụt (Abelmoschus, Hibiscus) 10

1.3.3 Phân tích DNA trong nghiên cứu phân loại chi Curcuma 10

Chương II NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 11

2.1 Nội dung 1: Thu thập mẫu dược liệu 11

2.1.1 Các mẫu sâm Panax 11

2.1.2 Các mẫu sâm bố chính 11

2.1.3 Các mẫu nghệ (Curcuma) 11

2.1.4 Các mẫu dược liệu khác 11

2.2 Nội dung 2: Khảo sát định lượng thành phần hóa học tác dụng chính 11

2.2.1 Curcumin trong nghệ 11

2.2.2 Saponin trong sâm 12

2.2.3 Chất nhầy trong Sâm bố chính 13

2.3 Nội dung 3: Chiết DNA bộ gen các mẫu 13

2.3.1 Nguyên tắc 13

2.3.2 Nguyên vật liệu 14

2.3.3 Quy trình 1 chiết DNA 14

2.3.4 Quy trình 2 chiết DNA 15

2.3.5 Quy trình 3 chiết DNA 15

2.3.6 Đo mật độ quang kiểm tra DNA 19

2.3.7 Điện di 19

2.4 Nội dung 4: Phân tích RAPD để phân biệt các loại sâm bố chính, nghệ và một số dược liệu khác 21

2.4.1 Nguyên tắc 21

2.4.2 Nguyên vật liệu 21

2.4.3 Tiến hành 23

viii

2.5 Nội dung 5: Phân tích MARMS các mẫu sâm, nghệ khảo sát 23

2.5.1 Nguyên tắc 23

2.5.2 Nguyên vật liệu 23

2.5.3 Tiến hành 25

2.5.3.1 MARMS trên gen trnK họ Gừng 25

2.5.3.2 MARMS trên sâm Panax 27

2.5.4 Gradient PCR 27

2.6 Nội dung 6: Dựng sơ đồ mối quan hệ di truyền và phân tích cây sinh loài các mẫu nghệ và sâm bố chính 27

Chương III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Nội dung 1: Thu thập mẫu dược liệu 28

3.1.1 Các mẫu sâm Panax 28

3.1.2 Các mẫu sâm bố chính 31

3.1.3 Các mẫu nghệ (Curcuma) 34

3.1.4 Các mẫu dược liệu khác 35

3.2 Nội dung 2: Khảo sát định lượng thành phần hóa học tác dụng chính 36

3.2.1 Saponin trong sâm 36

3.2.2 Chất nhầy trong sâm bố chính 37

3.2.3 Curcumin trong nghệ 37

3.3 Nội dung 3: Chiết DNA bộ gen các mẫu 39

3.3.1 DNA từ sâm 41

3.3.2 DNA từ sâm bố chính 42

3.3.3 DNA từ nghệ 43

3.3.4 DNA từ một số dược liệu họ Gừng khác 44

3.4 Nội dung 4: Phân tích RAPD để phân biệt các loại sâm bố chính, nghệ và một số dược liệu khác 45

3.4.1 Kết quả RAPD phân tích đa hình ở các loài nghệ 45

3.4.2 Kết quả RAPD phân tích đa hình ở các mẫu sâm bố chính 49

3.4.3 Kết quả RAPD phân tích đa hình ở một số dược liệu họ Gừng khác 53

3.5 Nội dung 5: Phân tích MARMS các mẫu nghệ, sâm khảo sát 54

3.5.1 MARMS trên sâm Panax 54

3.5.1.1 Áp dụng MARMS phân biệt năm loại sâm 55

3.5.1.2 Độ đặc hiệu của phương pháp 57

3.5.1.3 Độ lặp lại của phương pháp 58

3.5.1.4 Kiểm chứng loại sâm của các mẫu trên thị trường 59

3.5.2 Kết quả MARMS (ARMS) trên nghệ 62

3.6 Nội dung 6: Dựng sơ đồ mối quan hệ di truyền và phân tích cây sinh loài các mẫu nghệ và sâm bố chính 65

3.6.1 Mối quan hệ di truyền và phân tích cây sinh loài các mẫu nghệ 65

3.6.2 Sự đa dạng di truyền của các loài nghệ 66

3.6.3 Sự đa dạng di truyền của các mẫu ngải (họ Gừng) 67

3.6.4 Mối quan hệ di truyền và phân tích cây sinh loài các mẫu sâm bố chính 68

Chương IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 71

4.1 Kết luận 71

4.2 Đề nghị 73

Tài liệu tham khảo 74

CTAB Cetyltrimethylamonium bromide

DNA Desoxyribonucleic acid

MARMS Multiplex Amplification Refractory Mutation System

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA, sự đa hình của DNA khuếch

đại ngẫu nhiên RFLP Restriction fragment length polymorphisms, sự đa hình độ dài đoạn

x

DANH MỤC BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG Bảng 2.1 Thành phần gel polyacrylamide 10% 20

Bảng 2.2 Các mồi sử dụng trong kỹ thuật RAPD 21

Bảng 2.3 Chu trình luân nhiệt cho kỹ thuật RAPD 23

Bảng 2.4 Các loại mồi sử dụng trong MARMS trên sâm Panax 23

Bảng 2.5 Thành phần mồi cho từng loại sâm 24

Bảng 2.6 Các mồi sử dụng trong MARMS trên gen trnK họ Gừng và chi Curcuma 24 Bảng 2.7 Thành phần của phản ứng khuếch đại gen trnK 25

Bảng 2.8 Thành phần phản ứng MARMS trên nghệ 25

Bảng 2.9 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng khuếch đại gen trnK 26

Bảng 2.10 Chu trình luân nhiệt phản ứng MARMS trên nghệ 26

Bảng 3.1 Nguồn gốc các mẫu sản phẩm sâm Panax chuẩn 28

Bảng 3.2 Các mẫu sản phẩm sâm từ thị trường 29

Bảng 3.3 Các mẫu sâm bố chính 31

Bảng 3.4 Các mẫu nghệ khảo sát và nơi thu hái 34

Bảng 3.5 Các mẫu ngải khảo sát 35

Bảng 3.6 Hàm lượng chất nhầy trong sâm bố chính 37

Bảng 3.7 Curcumin trong dược liệu nghệ 38

Bảng 3.8 Sự khác nhau của ba quy trình chiết DNA 39

Bảng 3.9 Kết quả đo mật độ quang các mẫu DNA chiết từ sâm Panax 40

Bảng 3.10 Kết quả đo mật độ quang các mẫu DNA chiết từ sâm bố chính 42

Bảng 3.11 Kết quả đo mật độ quang các mẫu DNA chiết từ nghệ 43

Bảng 3.12 Kết quả RAPD của các mẫu nghệ trên gel agarose 45

Bảng 3.13 Kiểu mẫu băng của nghệ vàng, nghệ đen và nghệ xà cừ 46

Bảng 3.14 Kết quả RAPD của 7 loại SBC đợt 1 trên gel agarose 49

Bảng 3.15 Kết quả RAPD của 7 loại SBC đợt 2 trên gel polyacrylamide 50

Bảng 3.16 Kết quả RAPD của 7 loại SBC đợt 3 trên gel agarose 52

Bảng 3.17 Sự khác biệt về nucleotide trên đoạn gen trnK giữa các loại sâm 54

Bảng 3.18 Sự khác biệt về nucleotide trên đoạn gen matK giữa các loại sâm 55

Bảng 3.19 Sự khác biệt về nucleotide trên đoạn gen 18S rRNA 55

Bảng 3.20 Tổng hợp kiểm chứng các mẫu Sâm trên thị trường 60

Bảng 3.21 Tỉ lệ tương đồng giữa các loài Curcuma 68

Bảng 3.22 Hệ số tương đồng di truyền của các mẫu Sâm Bố Chính 70

xi

DANH MỤC HÌNH TÊN HÌNH ẢNH TRANG Hình 2.1 Sơ đồ chiết chất nhầy từ SBC 13

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình 1 chiết DNA 16

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình 2 chiết DNA 17

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình 3 chiết DNA 18

Hình 3.1 Hình dạng các mẫu sâm chuẩn 28

Hình 3.2 Hình dạng các mẫu Sâm Triều Tiên 30

Hình 3.3 Hình dạng các mẫu sâm Mỹ 30

Hình 3.4 Hình dạng các mẫu Tam thất 31

Hình 3.5 Hình dạng thân rễ của các loài Curcuma longa nghiên cứu 35

Hình 3.6 Hình dạng thân rễ của các mẫu ngải 36

Hình 3.7 Sắc ký đồ saponin toàn phần của các dịch chiết sâm 37

Hình 3.8 Xây dựng đường cong chuẩn định lượng curcumin 38

Hình 3.9 Kết quả phân tích điện di DNA chiết từ sâm Panax theo qui trình 1 và 2 41 Hình 3.10 Kết quả phân tích điện di DNA chiết từ sâm Panax theo qui trình 3 42

Hình 3.11 Kết quả điện di sản phẩm chiết DNA từ Sâm Bố Chính 43

Hình 3.12 Kết quả điện di DNA chiết từ các mẫu nghệ 44

Hình 3.13 Kết quả điện di DNA chiết từ các mẫu ngải 44

Hình 3.14 Kết quả đa hình trên nghệ A- mồi OPC 11, B- mồi OPE 07 45

Hình 3.15 Các mồi cho một kiểu mẫu băng với cả ba mẫu dược liệu 46

Hình 3.16 Các mồi cho hai kiểu mẫu băng với ba mẫu dược liệu 47

Hình 3.17 Các mồi cho ba kiểu mẫu băng với ba mẫu dược liệu 48

Hình 3.18 Kết quả DNA đa hình trên Sâm Bố Chính 49

Hình 3.19 Các chỉ thị DNA dùng để nhận diện các mẫu Sâm Bố Chính 51

Hình 3.20 Kết quả đa hình của 7 loại SBC đợt 3 trên gel agarose 52

Hình 3.21 Kết quả đa hình trên các mẫu ngải và nghệ .53

Hình 3.22 MARMS trên sâm Panax chuẩn 56

Hình 3.23 Gradient PCR cho MARMS trên ba loại sâm 56

xii

Hình 3.24 Độ đặc hiệu của MARMS trên sâm Panax 57

Hình 3.25 Độ lặp lại của MARMS trên các mẫu PG- A: lần 1, B: lần 2, C: lần3 58

Hình 3.26 Độ lặp lại của MARMS trên các mẫu PQ- A: lần 1, B: lần 2, C: lần3 58

Hình 3.27 Độ lặp lại của MARMS trên mẫu PV- A: lần 1, B: lần 2, C: lần 3 59

Hình 3.28 Độ lặp lại của MARMS trên các mẫu PN- A: lần 1, B: lần 2, C: lần 3 59

Hình 3.29 MARMS trên các mẫu sâm Triều Tiên và sâm Mỹ 60

Hình 3.30 MARMS trên các mẫu sâm Trung Quốc 60

Hình 3.31 Chiến lược PCR tổ cho gen trnK của thuốctừ Curcuma 62

Hình 3.32 Vị trí các mồi cho phương pháp MARMS trên nghệ 62

Hình 3.33 Kết quả MARMS trên nghệ 63

Hình 3.34 Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR của đoạn vùng 1 gen trnK của các mẫu nghệ E5-E9 63

Hình 3.35 Điện di trên gel polyacrylamide sản phẩm ARMS của các mẫu nghệ E5-E9 64

Hình 3.36 Điện di trên gel polyacrylamide sản phẩm PCR với các cặp mồi riêng rẽ trên sản phẩm PCR của đoạn vùng 1 gen trnK của E5 - E9 64

Hình 3.37 Sơ đồ thể hịện mối tương quan giữa các dòng Curcuma longa 66

Hình 3.38 Sơ đồ thể hịện mối tương quan giữa các loài Curcuma nghiên cứu 66

Hình 3.39 Sơ đồ mối tương quan giữa cây nghệ và ngải nghiên cứu 68

Hình 3.40 Mối quan hệ di truyền của các mẫu Sâm Bố Chính 69

2 Chủ nhiệm đề tài: Trần Thu Hoa

3 Cơ quan chủ trì: Trung tâm khoa học và Công nghệ Dược SAPHARCEN

4 Thời gian thực hiện: 12 tháng (Từ tháng 6/2008 đến tháng 6/2009)

5 Kinh phí được duyệt: 465.000.000 đồng

6 Kinh phí đã cấp đợt 1: 290.000.000 đồng theo thông báo số 81/TB-SKHCN

ngày 04/06/2008 Kinh phí đã cấp đợt 2: 129.000 đồng theo thông báo số

7 Nội dung đăng ký thực hiện:

7.1 Thu thập mẫu dược liệu:

- 4 loài sâm (P ginseng, P quinquefolius, P notoginseng và P vietnamensis)

7.3 Chiết DNA bộ gen các mẫu

7.4 Phân tích RAPD để phân biệt các loại sâm bố chính, nghệ và một số dược liệu khác

7.5 Phân tích MARMS các mẫu sâm, nghệ khảo sát

7.6 Phân tích PCR-RFLP trên vùng trnL-F và trnS-Q của chloroplast trên một số đối

tượng nghiên cứu

7.7 Dựng sơ đồ mối quan hệ di truyền và phân tích cây sinh loài

7.8 Viết báo cáo tổng kết và nghiệm thu

2

8 Sản phẩm của đề tài:

Các sản phẩm dự kiến của đề tài:

1 Báo cáo tổng kết (toàn văn và tóm tắt) Tài liệu, đĩa CD

2 Phương pháp và dữ liệu phân tích DNA dựa vào kỹ thuật

nhân bản ngẫu nhiên DNA đa hình (RAPD) trên sâm bố

chính và nghệ

1 Tài liệu

3 Phương pháp và dữ liệu phân tích DNA dựa vào kỹ thuật hệ

thống đa nhân bản đột biến đoạn (MARMS) trên cây và

thuốc từ sâm và nghệ

1 Tài liệu

4 Phương pháp và dữ liệu phân tích PCR-RFLP của

chloroplast trên một số đối tượng nghiên cứu

1 Tài liệu

5 Tài liệu phân tích dự báo khả năng áp dụng 1 Tài liệu

7 Đào tạo 02 khóa luận tốt nghiệp đại học, 01 luận văn thạc sĩ 3 người

thực hiện

1 Thu được các mẫu dược liệu và xác định một số

đặc điểm của chúng, bao gồm:

- 5 mẫu nguyên liệu của 5 loài sâm (P.ginseng,

P quinquefolius , P notoginseng, P.japonicus

và P vietnamensis) và 11 mẫu chế phẩm từ

sâm

- 9 mẫu sâm bố chính từ các vùng khác nhau ở

Việt Nam

- 8 mẫu nghệ C longa và 3 mẫu nghệ khác từ

các vùng khác nhau ở Việt Nam

- 8 mẫu ngải họ Gừng từ Tịnh Biên, An Giang

Tháng 6 8/2008 Hoàn thành 100%

-2 Khảo sát định lượng thành phần hóa học tác

dụng chính của dược liệu

- Xác định hàm lượng curcumin trong 8 mẫu

nghệ

- Định tính saponin trong 5 mẫu sâm chuẩn

Tháng 6 8/2008 Hoàn thành 80%

- 13 mồi RAPD trên nghệ

- 17 mồi RAPD trên sâm bố chính

- 13 mồi RAPD trên ngải

Tháng 7 9/2008

-Hoàn thành 100%

5 Phân tích MARMS các mẫu sâm, nghệ khảo sát

Dấu hiệu phân tích MARMS trên gen trnK và

gen 18S rRNA nhận định được nguồn gốc của

các mẫu khảo sát

Tháng 10/08-3/09 Hoàn thành 100%

6 Phân tích PCR-RFLP trên vùng trnL-F và

trnS-Q của chloroplast trên một số đối tượng nghiên

cứu Dấu hiệu phân tích PCR-RFLP vùng trnL-F

và trnS-Q của chloroplast trên một số dược liệu

Tháng 10/08-3/09

Không thực hiện

7 Dựng sơ đồ mối quan hệ di truyền và phân tích

cây sinh loài Mối quan hệ di truyền của các loại

SBC, nghệ Rút ra biomarker để phân tích các

đối tượng khảo sát

Tháng 5/09

4-Hoàn thành 100%

8 Viết báo cáo tổng kết và nghiệm thu Tháng

6/2009

4/2010

Việc xác định dược liệu ở mức độ phân vùng địa lí cũng rất quan trọng cho việc đảm bảo hiệu quả điều trị cao nhất Dược liệu được trồng ở các vùng khác nhau sẽ khác nhau về hàm lượng hoạt chất cũng như thành phần các chất trong dược liệu dẫn đến khác nhau trong hiệu quả điều trị Hơn nữa, việc xác định các mẫu ở cùng một vùng sẽ giúp cho việc lựa chọn chủng dược liệu cùng loài tốt nhất

Một trong những phương pháp đáng tin cậy dùng để xác định nguồn gốc dược liệu

là phân tích DNA Phương pháp phân tích DNA phù hợp để xác định nguồn gốc dược liệu vì vật liệu di truyền là thống nhất cho mỗi cá thể, không phụ thuộc vào dạng mẫu, không chịu ảnh hưởng của tuổi mẫu, điều kiện sinh lí, yếu tố môi trường, thu hái, bảo quản, chế biến DNA được thu nhận từ lá, thân hay rễ đều mang cùng thông tin di truyền DNA sau khi li trích có thể trữ ở -20°C trong một thời gian dài (từ 3-5 năm), vì vậy thời gian phân tích không bị hạn chế Một lượng nhỏ mẫu cũng

đủ để thực hiện phân tích, rất liện lợi khi tiến hành phân tích các mẫu dược liệu đắt tiền và hiếm

Trong những năm gần đây, nhiều marker di truyền dựa trên DNA được phát triển để tìm hiểu cấu trúc, chức năng và tiến hóa của bộ gen Các marker phân tử mở ra tiềm năng mới trong nghiên cứu di truyền phân tử ở thực vật Chúng không bị hạn chế bởi có ít locus của các isozyme Mỗi kiểu marker DNA xác định kiểu hình đồng trội hoặc trội và thường được dùng lấy dấu vân tay, bản đồ gen, xác định mối liên hệ di truyền và/hoặc sự phát sinh loài và sự tiến hóa Marker DNA đầu tiên là sự đa hình

độ dài đoạn cắt giới hạn (Restriction fragment length polymorphisms – RFLP, Botstein và cộng sự năm 1980), tiếp theo là sự đa hình của DNA khuếch đại ngẫu nhiên (RAPDs, Williams và cộng sự năm 1990), và một số marker khác sau đó (Neale và cộng sự năm 1992; Neale, 1998; Echt và cộng sự năm 1999; Szmidt &

5

Wang, 2000) RFLP từ cpDNA hoặc DNA bộ gen là các marker đồng trội và chúng thường được áp dụng để lập bản đồ gen, di truyền của quần thể, phân loại và tiến hóa Trong khi đó, RAPD là các marker trội và rất hay được áp dụng làm dấu vân tay DNA, cây di truyền hoặc bản đồ gen của họ cây

Tuy phương pháp DNA có nhiều ưu điểm trong việc xác định nguồn gốc dược liệu

từ các bộ phận khác nhau, nhưng còn có một số tồn tại cần phải giải quyết Thứ nhất, vì các vật liệu này thường được xử lí nhiệt bằng cách sấy, phơi nắng, nghiền, tẩm hóa chất… và trữ lâu dài trong điều kiện bảo quản khác nhau do đó DNA thường sẽ bị gãy Do đó để giải quyết vấn đề này chúng ta cần sử dụng các phương pháp phân tích trên các vùng gen ít bị gãy là các vùng multi-copy gene (như các gen

ở ribosome, ty thể, lục lạp…) để làm tăng khả năng thu được các đoạn gen dài nguyên vẹn hay sử dụng các phương pháp phân tích đoạn DNA ngắn như phương pháp SSR Thứ hai, là các yếu tố hiện diện làm ức chế phản ứng PCR Các loài thực vật dược liệu thường là các chứa nhiều hợp chất phenol, acidic polysaccharide và chất màu Do đó cần lựa chọn phương pháp li trích DNA thích hợp để hạn chế các chất ức chế; hoặc sử dụng các chất tăng cường hiệu quả phản ứng PCR Thứ ba, sự nhiễm các DNA ngoại lai từ vi khuẩn, nấm hoặc côn trùng trong quá trình bảo quản hoặc bị trộn lẫn với dược liệu khác Các DNA nhiễm này sẽ được khuếch đại cùng với DNA mẫu Để giải quyết vấn đề này chúng ta cần sử dụng các phương pháp đặc biệt như ARMS (Amplification refractory mutation system) và SCAR (Sequence characterized amplified regions) Do đó, việc áp dụng các phương pháp phù hợp trên các vùng gen thích hợp sẽ giải quyết được các vấn đề trên

Khoảng vài năm trở lại đây, từ thành tựu phân tích trình tự DNA gen trnK và gen

18S rRNA cho thấy có những trình tự đặc hiệu cho loài, có giá trị để nhận định các

thuốc từ dược liệu, MARMS (Multiplex amplification refractory mutation system,

hệ thống đa nhân bản đột biến đoạn) đã được phát triển trên các gen này cho phép phát hiện đồng thời nhiều vị trí khác biệt nucleotid của dược liệu Bên cạnh đó, DNA PCR-RFLP cũng được dùng để phân tích các marker trên chloroplast (cpDNA) của các chi (giống) để phát hiện rõ các biến đổi giữa các loài, giữa các quần thể

Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi áp dụng các phương pháp phân tích DNA là

RAPD hoặc MARMS/PCR-RFLP trên cpDNA để định danh phân biệt sâm Panax, nghệ Curcuma và sâm bố chính

1.1.1 Kỹ thuật RAPD (Random amplified polymorphic DNA)

Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer Theo nguyên tắc, khi 2

cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD ở điều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tương ứng bằng nhau Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên

sẽ tạo ra số lượng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ

Kỹ thuật RAPD được phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời, mặc

dù cho kết quả có độ tin cậy không cao nhưng vẫn còn được sử dụng do ưu điểm dễ thực hiện và chi phí thấp Đã được áp dụng đánh giá đa dạng di truyền trên các đối tượng: cúc lai, cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, lúa mạch, dâu tây, khoai tây, cà chua,…

1.1.2 Kỹ thuật ARMS/MARMS (Amplification refractory mutation system/ Multiplex amplification refractory mutation system)

Kỹ thuật ARMS (Amplification refractory mutation system ) được ứng dụng để khuyếch đại PCR sử dụng các mồi có đầu 3’ khác nhau để phân biệt các mẫu có liên qun với nhau Phương pháp này dựa trên sự bắt cặp không hoàn toàn của base cuối cùng của đầu 3’ của mồi dẫn đến phản ứng PCR không thể tiến hành được Chúng

đã từng được sử dụng để xác định các loài Sâm và Nghệ; sử dụng các mồi trên gen

trnK chloroplast và gen 18S rRNA

Phương pháp MARMS là phương pháp khuếch đại đa thành phần chọn lọc các alelle bình thường và đột biến nên còn được gọi là MASPCR (Multiplex allele-specific PCR) MARMS thực chất là ARMS sử dụng cùng lúc hai cặp mồi đặc hiệu

(áp dụng trên sâm và nghệ là hai cặp mồi đặc hiệu cho cả hai đoạn gen matK/trnK

và 18S rRNA) Theo nguyên tắc, số lượng đoạn và chiều dài các đoạn đúng mong đợi chỉ có khi đích DNA là đúng

Ưu điểm của phương pháp này là nhanh, đơn giản, có độ tin cậy cao Tuy nhiên vì

sự không xuất hiện của băng cũng được coi là một kết quả dương tính do đó cần thực hiện mẫu chứng dương để đảm bảo kết quả PCR không ra không phải là do quá trình PCR có vấn đề

1.1.3 PCR-RFLP (Restriction fragment length polymorphisms) trên cpDNA

Kỹ thuật RFLP-PCR là kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình DNA bằng cách kết hợp kỹ thuật PCR và phản ứng cắt của enzyme cắt giới hạn Đoạn gen nằm giữa các điểm cắt của enzym cắt giới hạn thay đổi giữa các cá thể, phụ thuộc vào sự thêm, mất nucleotide, chuyển đoạn… Điều đó làm cho độ dài của các đoạn gen được cắt thay đổi theo từng cá thể Vì vậy kỹ thuật này có thể dùng để khảo sát mối quan hệ di truyền giữa các cá thể, mối quan hệ loài và tính đa hình trong quần thể

7

Các bước tiến hành tương tự RAPD nhưng các sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme cắt giới hạn rồi mới phân tích điện di các sản phẩm cắt trên gel agarose hoặc polyacrylamide

Kỹ thuật RFLP-PCR đã được dùng để nhận dạng sâm Triều Tiên trồng ở những vùng khác nhau

1.1.4 Sơ lược về các đối tượng nghiên cứu

1.1.4.1 Sâm Panax

Sâm (Panax spp) là một trong những thuốc dược liệu giá trị nhất ở Trung Hoa và nó

đã được dùng từ hàng ngàn năm nay Công dụng chính của sâm là để tăng cường sức chịu đựng, thuốc bổ chống lại ung thư, ngăn chặn các rối loạn hệ thần kinh trung ương, hạ nhiệt, tăng chuyển hóa carbohydrat và lipid, kích thích hoạt động miễn dịch, hệ thống tim mạch và phòng vệ phóng xạ Chính vì nhân sâm và các thuốc từ sâm là nhóm thuốc quan trọng ở các nước châu Á, chúng là mục tiêu hàng đầu để thành lập, triển khai phương pháp kỹ thuật phân tử định danh thuận tiện

Các hoạt chất chính của sâm là các ginsenosid chủ yếu là các dẫn xuất dammaran Các báo cáo về sâm hay bị mâu thuẫn bởi vì hàm lượng ginsenosid trong các củ sâm hoặc cao củ có thể khác nhau, hàm lượng này tùy thuộc vào phương pháp chiết,

xử lý sau đó hoặc ngay cả mùa thu hái Do đó việc tiêu chuẩn hóa, định danh củ sâm trong nghiên cứu và bởi người tiêu thụ phải được thống nhất Các loài thông

thường trong chi Panax là Panax ginseng C.A Meyer – Sâm Triều tiên, P

quinquefolius – Sâm Mỹ, P japonicus C.A Meyer –Sâm Nhật P notoginseng – Sâm tam thất và P vietnamensis – Sâm Việt Nam

Các tác dụng theo hướng bổ tăng lực, tăng sinh thích nghi chống stress, hiệu quả tác dụng cũng như giá thành của các loại sâm khá khác nhau Ví dụ như Sâm Triều tiên

và Sâm Mỹ là hai loại sâm được đánh giá là quý nhất có giá từ vài chục ngàn đồng Việt Nam cho một kilogam cho đến vài ngàn đô-la Mỹ cho một củ sâm tùy vùng trồng, độ tuổi, điều kiện thu hái hoang dại hay nuôi trồng Ở thị trường Hồng Kông, trong năm 1998, có 4 triệu kilogam củ sâm được bán với tổng trị giá 10 tỉ đô-la Mỹ

Vì sâm trồng Mỹ được ưa chuộng và bán đắt hơn sâm trồng Triều tiên từ 5-10 lần người ta hay trộn giả loại sau vào loại trước

Một lý do cấp thiết nữa cho việc áp dụng các kỹ thuật phân tích DNA trên sâm là gần đây Trung quốc có công bố Sâm Việt Nam có ở 7 vùng, mà núi Ngọc Linh (QNĐN) là một, còn sáu vùng còn lại thuộc địa phận Trung quốc, Sâm Việt Nam ở núi Ngọc Linh đã được nghiên cứu và khẳng định trên thị trường, có giá khoảng 20 triệu đồng Việt Nam cho một kilogam sâm tươi (~1.300 USD/kg)

8

làm thuốc bổ, thông tiểu tiện, điều kinh, chữa nóng sốt, bệnh phổi và bệnh bạch đới;

lá và hoa dùng ngoài xát chữa ghẻ ngứa SBC ở Thanh Hoá (thường gọi là Sâm Báo) đã được trồng khá phổ biến và bán với giá 200.000 đồng/ kg dược liệu khô Một số tỉnh khác đã có phát hiện SBC và được nhân dân dùng làm thuốc bổ như Nghệ An, Quảng Bình, Phú Yên Đặc biệt, gần đây tỉnh Bình Phước đang tiến hành khảo sát đánh giá trữ lượng, thành phần hoá học và tác dụng của loài SBC ở khu vực để phát triển SBC thành nguồn nguyên liệu làm thuốc ở quy mô thương mại

Điều tra ban đầu của Trung Tâm Sâm và Dược Liệu TP HCM cho thấy hiện nay ở Việt Nam có ít nhất 8 loại mang tên SBC khác nhau về hình thái: hoa có màu đỏ, hồng hay vàng với màu sắc đậm nhạt khác nhau ở cánh hoa, lá trưởng thành xẻ thùy năm hoặc hình mũi mác hoặc nguyên Kết quả phân tích DNA sẽ góp phần trả lời mối quan hệ di truyền giữa chúng, chọn ra các marker DNA để phân biệt nhận diện, kết hợp với kết quả nghiên cứu về thành phần hoạt chất và tác dụng dược lý để chọn đúng giống SBC có giá trị kinh tế phát triển tại các địa phương

(C longa L.) màu vàng cam, còn có nghệ ten đồng (C aeruginosa) màu xanh ten

đồng, nghệ trắng hay nghệ sùi (C aromatica Salisb), nghệ đen hay nga truật hay

nghệ xanh hay nghệ tím (C zedoaria (Berg.) Roscoe), và nghệ rễ vàng hay nghệ cà

ri (C xanthorrhiza Roxb) Khoảng hai thập niên gần đây, với sự phát triển của

ngành y dược học, các nhà khoa học đã nghiên cứu và chứng minh được các tác dụng dược lý quý giá của cây nghệ như hoạt tính kháng viêm, kháng ung thư, kháng dị ứng, khả năng chống oxi hoá, hạ cholesterol huyết, làm lành sẹo, bảo vệ thần kinh…Tuy nhiên tuỳ theo loài và tùy nơi phân bố mà các loài, dòng nghệ có thành phần, tỷ lệ hoạt chất khác nhau, dẫn đến sự khác nhau ít nhiều về tác dụng dược lý, công dụng Thực tế do các loài nghệ nói riêng, họ gừng nói chung rất phong phú, lại có đặc điểm hình thái khá giống nhau, được phân bố ở các vùng khác nhau với tên gọi khác nhau Nên nếu chỉ dựa vào đặc điểm hình thái thực vật, vi phẫu, hoá học nghĩa là dựa vào kiểu hình thì chưa đủ để xác định

Hoạt chất chính của nghệ Curcumin - là tên gọi chung của các chất có màu vàng trong nghệ, đã được nghiên cứu rất nhiều Curcumin có các tác dụng dược lý sau: kháng khuẩn; ức chế ung thư vú; chống xơ vữa động mạch; kháng virus và ức chế protease của HIV-1 và HIV-2 (tác dụng này của curcumin còn đang được tranh cãi); chống oxy hoá; làm giảm nồng độ cholesterol trong máu; chống viêm; làm tăng lưu

lượng mật; ức chế sự tạo khí in vitro và in vivo; kích thích hoạt tính men

arylhydroxylase, là men phụ thuộc vào cytochrom P450 của ty thể gan, trong hệ thống men oxygenase gan; ức chế sự tăng hồng cầu gây bởi hydrogen peroxid ở

9

nồng độ thấp; chữa viêm loét dạ dày tá tràng Ngoài ra curcumin còn được dùng để làm chất nhuộm màu để bao viên, có màu vàng chanh sáng đẹp, màu bền vững; nhuộm vàng thực phẩm, nhuộm len, tơ, nhuộm da, giấy Hàm lượng curcumin thay đổi khác nhau giữa các loài nghệ khác nhau, hay giữa các cây nghệ trồng ở những vùng đất khác nhau Theo khảo sát sơ bộ cho thấy ở cùng thời điểm thu hái, nghệ Phù Mỹ (Qui Nhơn) có 4,9 % curcumin, trong khi nghệ Vĩnh Phúc chỉ có 0,73 % Như vậy việc phân tích xác định nguồn gốc dược liệu là rất cần thiết

1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Từ năm 2000 trở lại đây, đã có một số công bố của các tác giả trong nước về áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử, chủ yếu là phân tích sự đa hình của DNA khuếch đại ngẫu nhiên trên thực vật, cây trồng tại Việt Nam Một số công trình gần đây mà chúng tôi đã tham khảo:

- Nghiên cứu khả năng phân loại chi Ganoderma bằng kỹ thuật phân tử

RAPD-PCR và mồi đặc hiệu laccase Nguyễn Hoài Giang, Nguyễn Xuân Hùng, Trịnh Tam Kiệt, Lê Đình Lương, Tạp chí Di truyền học và Ứng dụng, 9/2005

- Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của các loài sâm bố chính bằng kỹ thuật nhân bản ngẫu nhiên ADN đa hình (RAPD), Phạm Ngọc Oanh, và cs Dược học 362, 6-2006, 32-35

- Ứng dụng chỉ thị phân tử (RAPD và ADN lục lạp) trong nghiên cứu đa dạng di truyền và xây dựng vườn giống cây Cóc hành Nguyễn Việt Cường (Trung tâm công nghệ sinh học lâm nghiệp) và Phạm Đức Tuấn, TC NN&PTNT, số 19/2007

- Đánh giá sự đa hình ADN một số giống khoai tây (Solanum tuberosuml.) bằng

kỹ thuật RAPD Trương Quang Vinh, Nguyễn Thị Tâm, Đỗ Tiến Phát, Nguyễn Thành Danh, TC NN&PTNT, số 1/2008

- Khảo sát mối quan hệ di truyền và hàm lượng 10-DAB của một số cây thông đỏ

(Taxus wallichiana Zucc.) tại Lâm Đồng Nguyễn Thị Ngọc Tuyết và cs., Y học

TP HCM 12 (4) 2008, 112-116

1.3 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

1.3.1 Phân tích DNA trong nghiên cứu phân loại chi Panax

Đã có nhiều báo cáo về các kỹ thuật sinh học phân tử như RAPD, AP-PCR (Arbitrary primer-PCR), AFLP ( Amplified fragment length polymorphisms)… để nhận dạng sâm, tuy nhiên hầu hết các báo cáo này chỉ tập trung nhận dạng hai loại

sâm là sâm Mỹ (P quinquefolius) và sâm Triều Tiên (P ginseng) Trong khi đó, kỹ

thuật MARMS đã được Shim và cộng sự (2004) sử dụng để nhận dạng 5 loại sâm

(P ginseng , P quinquefolius , P vietnamensis , P notoginseng , P japonicus)

10

Các nhà khoa học đã khám phá mối quan hệ loài của 13 loại sâm dựa trên trình tự

chuỗi của hai gen là gen trnK của diệp lục và gen 18S của rRNA Trình tự của hai

gen này, được xem là đặc hiệu cho loài, đã cung cấp những thông tin rất có giá trị cho việc xây dựng mối quan hệ phát sinh loài Việc ứng dụng kỹ thuật MARMS trên hai đoạn gen này, cho phép phát hiện cùng lúc sự khác biệt về nucleotide ở nhiều vị trí trên hai đoạn gen đã giúp cho việc nhận dạng chính xác 5 loại sâm thông dụng và các sản phẩm làm từ chúng Điều đó đóng một vai trò quan trọng trong việc xây dựng một phương pháp nhận dạng bằng kỹ thuật sinh học phân tử thuận tiện và khách quan hơn

1.3.2 Phân tích DNA trong nghiên cứu phân loại chi Dâm bụt (Râm bụt, Phù dung) (Abelmoschus, Hibiscus)

Jenderek MM et al., Development of Randomly Amplified Polymorphic DNA Marker Chracteristic of Hibiscus rosa-sinensis and H syriacus California

agricultural technology institute – Cati (1997)

Pfeil và cs (2002) đã giải hai trình tự cpDNA (vùng mã hóa ndhF và vùng không

mã hóa rpl16) và thiết lập được cây sinh loài của Hibiscus (họ Hibisceae)

1.3.3 Phân tích DNA trong nghiên cứu phân loại chi Curcuma

- Apavatjrut và cs (1999) nghiên cứu sự đa hình của isozyme để nhận định các

loài Curcuma trước khi ra hoa đã kết luận là chỉ có bảy loài

- Chen và cs (1999) tiến hành phân tích RAPD để khảo sát các biến đổi di truyền

của hai loài Curcuma Trung quốc là C wenyujin và C sichuanensis và cho rằng

hai loài này không phân biệt về mặt di truyền và do đó nên hợp lại thành một loài

- Cao và Komatsu (2003) đã dùng giải trình tự nucleotid trnK để thiết lập phương pháp nhận định sáu loài C longa, C phaeocaulis, C sichuanensis, C

chuanyujin, C chuanhuagjiang và C chuanezhu ở tỉnh Sichuan nhanh và đơn

giản, họ cho rằng dữ liệu trình tự là thông tin hữu hiệu để nhận định sáu loài này

ở mức DNA Cao và cs (2001) phân tích phân tử Curcuma dùng làm thuốc ở

Trung quốc và Nhật dựa vào trình tự gen 18S rRNA và gen trnK cho thấy các

dữ liệu phân tử có thể dùng để khẳng định các loài Curcuma và các thuốc dẫn

xuất từ chúng

- Sasaki và cs (2004) khảo sát trình tự đơn của gen trnK để nhận định các loài

Curcuma là C longa, C phaeocaulis, C zedoria và C aromatica Trước đó,

năm 2002 nghiên cứu của họ cho thấy là các thuốc dẫn xuất từ các loài này có

thể nhận định bằng cách dữ liệu trình tự của gen trnK

- Phunchaisri và cs (1998) đã dùng RAPD để phân tích 17 loài Curcuma ở Thái

lan và kết quả phù hợp với dữ liệu từ isozyme và số lượng chromosom Theo kết

quả của họ, 17 loài Curcuma ở Thái lan chia thành hai nhóm khác nhau

11

Chương II NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

     2.1 Nội dung 1: Thu thập mẫu dược liệu

2.1.1 Các mẫu sâm Panax

Các mẫu sâm Panax có nguồn gốc rõ ràng của năm loại sâm được cung cấp bởi TT

Sâm và Dược Liệu TPHCM Tất cả các sản phẩm sâm, không kể các sản phẩm chiết hay đã đun nấu, ngâm rượu, được người bán ở các quầy bán trên địa bàn thành phố

Hồ Chí Minh giới thiệu tên sâm và hãng cung cấp đều được thu thập để khảo sát

2.1.2 Các mẫu sâm bố chính

Các mẫu sâm bố chính (SBC) được thu thập từ Thanh Hóa trở vào các vùng phía Nam – Việt Nam đã được dùng để khảo sát Tên mẫu SBC được lấy theo tên nguồn gốc địa phương

2.1.3 Các mẫu nghệ (Curcuma)

Các mẫu nghệ (Curcuma longa) được thu thập ở các tỉnh đại diện cho 3 vùng của

Việt Nam: miền Bắc (Vĩnh Phúc), miền Trung (Phù Mỹ, Quy Nhơn), miền Đông

(Long Khánh, Bình Dương), miền Tây (Cần Thơ, Đồng Tháp) Các loài Nghệ: C

aromatica , C xanthorrhiza, C zedoaria được thu vào khoảng tháng Tư Mẫu lấy từ

các công ty dược liệu hoặc chợ địa phương là thân rễ tươi, rửa sạch, bảo quản tươi ở

40C hoặc cắt mỏng, sấy khô ở 450C Riêng C zedoaria được lấy tại vườn dược liệu

thuộc Khoa Dược – Đại học Y Dược TP HCM

2.1.4 Các mẫu dược liệu khác

Các mẫu ngải thuộc họ Gừng ở Tịnh Biên, An Giang được dùng trong dân gian cũng được thu thập để khảo sát (cung cấp bởi Công ty CP Xuất Nhập Khẩu Y Tế DOMESCO) Cách lấy các mẫu này tương tự nghệ

2.2 Nội dung 2: Khảo sát định lượng thành phần hóa học tác dụng chính của dược liệu

2.2.1 Curcumin trong nghệ

Xây dựng đường cong chuẩn độ curcumin

Cân chính xác 5,6 mg curcumin chuẩn, hòa vào 25 ml methanol trong bình định mức 25 ml (dung dịch A) Tiến hành xác định độ hấp thu cực đại λmax

Lần lượt hút: 60 µl, 80 µl, 100 µl, 120 µl, 140 µl, 160 µl, 180 µl, 200 µl dung dịch

A cho vào bình định mức 10 ml, thêm methanol tới vạch

12

Sau đó tiến hành đo độ hấp thu của tất cả những mẫu trên ở bước sóng λmax đó

Lập đường thẳng biểu thị sự tương quan giữa độ hấp thu và hàm lượng curcumin dựa vào các số liệu trên

Định lượng curcumin bằng phương pháp đo quang

Cân 0,25 g bột nghệ (đã xác định độ ẩm), cho vào bình soxhlet Thêm vào bình khoảng 150 ml methanol, cấp nhiệt cho hệ thống soxhlet, khoảng 60-70 0C

Tiến hành chiết đến khi dung dịch trong soxhlet không còn curcumin, nghĩa là không còn màu vàng Ta có thể kiểm tra bằng cách lấy một ít dung dịch nhỏ lên giấy lọc, soi dưới bước sóng 366 nm Dung dịch hết curcumin khi không còn thấy ánh sáng phát quang ở bước sóng 366 nm

Chuyển dịch chiết trong bình cầu vào bình định mức 50 ml, thêm methanol tới vạch Hút 100 µl (150 µl, 200 µl, 400 µl, 1000 µl tùy mẫu) dung dịch curcumin từ bình trên vào bình định mức 10 ml, điền methanol tới vạch Đem dung dịch này đo độ hấp thu ở bước sóng λmax vừa được xác định, tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình

Mỗi mẫu bột nghệ được tiến hành chiết 3 lần, lấy kết quả trung bình

2.2.2 Saponin trong sâm

Định tính saponin của sâm nhằm xác định loài sâm theo phương pháp kinh điển qua các bước như sau

Chiết hoạt chất từ dược liệu:

- Cho dịch chiết nước vào bình lắng, thêm 10 ml ete, lắc kỹ, bỏ lớp ete (3 lần)

- Thêm 10 ml butanol, lắc kỹ, lấy lớp butanol (tiến hành đến khi lớp butanol trong, không có màu)

n Cô dịch nn butanol trên bếp cách thuỷ đến cắn

- Hoà cắn vào khoảng 1 ml metanol, lấy dịch metanol này đi chấm sắc ký

Hệ dung môi khai triển sắc ký:

- (CHCl3: metanol: nước) = (65:35:10, lớp dưới)

- (n-butanol: acid acetic: nước) = (4:1:5, lớp trên)

Thuốc thử hiện màu: acid sulfuric 10% trong cồn (pha khi dùng), sấy vài phút ở

110 0C

13

2.2.3 Chất nhầy trong Sâm bố chính

- Nguyên tắc: theo Dược điển Việt Nam III [1]

Dùng cồn thấp độ để lấy hết chất nhầy trong bột SBC theo phương pháp ngấm kiệt Kết tủa bằng chì acetat Sau đó định lượng bằng phương pháp cân

- Tiến hành:

Cân chính xác khoảng 2 g bột dược liệu đã qua rây có kích thước mắt rây 2

mm, cho vào bình ngấm kiệt Chiết bằng ethanol 25% cho đến hết chất nhầy (kiểm tra bằng chì acetat 20%) Lấy 1 ml dịch chiết cuối cùng, thêm vào vài giọt dung dịch chì acetat, không còn kết tủa là được Gộp các dịch chiết lại, bốc hơi dịch chiết trên bếp cách thủy đến dạng cao lỏng Kết tủa chất nhầy bằng dung dịch chì acetat 20% (dùng khoảng 15 – 20 ml) Lọc qua giấy lọc đã cân bì trước Rửa tủa trên giấy lọc đến khi rửa hết phản ứng của chì (kiểm tra bằng dung dịch Natri sulphate 10%) Lấy 1 ml dịch lọc thêm vài giọt dung dịch Natri sulphate 10% khi không còn tủa trắng là được Sấy khô ở 110 0C đến khối lượng không đổi và cân để tính ra lượng chất nhầy

Hình 2.1 Sơ đồ chiết chất nhầy từ SBC

2.3 Nội dung 3: Chiết DNA bộ gen các mẫu

2.3.1 Nguyên tắc

Áp dụng ba quy trình chiết qua ba bước như sau:

- Phá màng tế bào, màng nhân bằng cách phối hợp tác nhân vật lý là nghiền mẫu bằng nitơ lỏng với tác nhân hóa học là 2-mercaptoethanol để bộc lộ vật chất di truyền

Bột Sâm Bố Chính (2 g)

- EDTA 0,5 M pH 8,0: hòa tan Na2EDTA trong nước, điều chỉnh pH đến 8,0 bằng NaOH, thêm nước vừa đủ 1 lít

- Nuclei l ysis buffer (NLB): 1,4 M NaCl; 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0); 20 mM EDTA; 2% PVP-40; 1% 2-mercaptoethanol

- TE nồng độ muối cao: 10 mM Tris-HCl pH 8,0; 0,1 mM EDTA; 1 M NaCl

- Chloroform-isoamylalcohol (24:1) (C-I) hoặc Phenol-chloroform-isoamylacohol (25:24:1) (P-C-I)

- Cồn tuyệt đối và cồn 70%

- TE0,1: (10 mM Tris-HCl, pH 7,4 và 0,1 mM EDTA) : Phối hợp 0,5 ml Tris-HCl 2M; pH 7,4 và 20 ml EDTA 0,5 M (pH 8,0); thêm 99,48 ml nước Tiệt trùng bằng lò hấp, bảo quản ở nhiệt độ phòng

- RNase 10 mg/ml: Hòa tan 10 mg/ml RNase trong TE, đun sôi 10 phút để diệt DNase Chia thành các phần nhỏ và bảo quản ở -20 oC

2.3.3 Quy trình 1 chiết DNA [2]

1 Nghiền dược liệu với nitơ lỏng bằng cối chày thành bột mịn

2 Lấy khoảng 100 mg mẫu cho vào tuýp 2 ml, thêm 0,5 ml đệm chiết (đã ủ trước

đó ở 65 °C /10 phút), ủ tiếp ở 65 °C trong 1 giờ

15

3 Thêm đồng lượng C-I, lắc đều, ly tâm 13.000 vòng/10 phút /4 °C, lấy dịch nổi

4 Thêm 2 lần thể tích CTAB tủa, ủ 24 – 27oC trong 1 giờ Ly tâm 13.000 vòng/30 phút/4 oC

5 Thêm 350 µl TE nồng độ muối cao để hòa tan cắn, nếu cắn khó tan thì ủ ở 37 oC cho đến tan

6 Cho đồng thể tích C-I, lắc đều, ly tâm 13.000 vòng/10 phút/4 °C, lấy dịch nổi

7 Thêm 0,6 thể tích isopropanol, ủ ở -20 oC trong một giờ, ly tâm 13.000 vòng/10 phút/4 °C, lấy cắn

8 Rửa cắn bằng cồn 70%, để khô cồn

9 Hòa tan cắn trong đệm TE0,1, thêm 3 µl RNase 10 mg/ml ủ ở 37 oC trong 30 phút, bảo quản ở -20 oC đến khi dùng

2.3.4 Quy trình 2 chiết DNA [18]

1 Nghiền dược liệu với nitơ lỏng bằng cối chày thành bột mịn

2 Lấy khoảng 100 mg mẫu vào tuýp 2 ml, thêm vào 0,6 ml dung dịch đệm chiết, lắc đều, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 °C, lấy cắn

3 Ủ dược liệu với 0,6 ml dung dịch NLB (đã ủ ở 65 °C/10 phút trước đó) trong 1 giờ ở 65 °C

4 Thêm đồng lượng C-I, lắc đều, ly tâm 10.000 vòng/10 phút/4 °C, lấy dịch nổi Các bước tiếp theo thực hiện như từ bước 7 đến 9 của quy trình chiết 1

2.3.5 Quy trình 3 chiết DNA [12]

1 Nghiền dược liệu với nitơ lỏng bằng cối chày thành bột mịn

2 Lấy khoảng 100 mg mẫu vào tuýp 2 ml, thêm vào 0,6 ml dung dịch đệm chiết, lắc liên tục trong đá khoảng 5 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng 10 phút, lấy cắn

3 Ủ dược liệu với 0,6 ml dung dịch NLB (đã ủ ở 65 °C /10 phút trước đó) và 3µl RNase trong 1 giờ ở 65 °C

4 Thêm đồng lượng C-I, lắc mạnh 1 phút, sau đó để yên ở nhiệt độ phòng 5 phút,

ly tâm 10.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng 10 phút, lấy dịch nổi

5 Thêm 0,6 thể tích isopropanol, ủ ở -20 oC trong một giờ, ly tâm 10.000 vòng/10 phút/RT, lấy cắn

16

9 Rửa cắn bằng cồn 70%, để khô cồn

10 Hòa tan cắn trong đệm TE0,1, bảo quản ở -20 oC đến khi dùng

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình 1 chiết DNA

Dược liệu 150 mg

Nghiền với nitơ lỏng

+ dung dịch CTAB chiết, 2%-mer, ủ ở 65 o C /10 phút

+ 1V C-I

Ly tâm 13.000 vòng/10 phút/4 o C Bột mịn

17

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình 2 chiết DNA

+ 600 µl dịch EB, lắc đều + Ly tâm 10.000 vòng/15 phút/4 °C

+ 600 µl dịch NLB ở 65 0 C trong 1 giờ

+ 1 V C-I + Ly tâm 10.000 vòng/10 phút/4 °C

+ 1 V C-I + Ly tâm 10.000 vòng/10 phút/4 °C

+ Rửa cắn với 1 ml ethanol 70%

+ Ly tâm 10.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 10 phút Cắn

+ Rửa cắn với 1 ml ethanol 70%

+ Ly tâm 10.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 1 phút

+ Hòa tan cắn trong 50 µl TE0,1 Dịch nổi lớp trên

Dịch nổi lớp trên

Dược liệu 150 mg

Nitơ lỏng Bột mịn

Cắn

+ 600 µl dịch EB, lắc liên tục trong đá khoảng trong 5 phút

+ Ly tâm 10.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 10 phút

+ 600 µl dịch NLB + 3 µl RNase ủ ở 65 °C trong 1 giờ

+ 1V Chloroform-isoamylacohol (24:1), lắc mạnh trong 1 phút, sau đó

để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

+ Ly tâm 10.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 10 phút

+ 1V Chloroform-isoamylacohol (24:1), lắc mạnh trong 1 phút, sau đó để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

+ Ly tâm 10.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 10 phút

Dịch nổi lớp trên

+ Hòa tan cắn trong 450 µl TE 0,1 + 450 µl Phenol-chloroform-isoamylacohol (25:24:1) + Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút

19

2.3.6 Đo mật độ quang kiểm tra DNA

2.3.6.1 Nguyên tắc

Dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purin

và pyrimidin Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (A260) cho phép xác định nồng độ acid nucleic có trong mẫu

Để kiểm tra độ tinh sạch của DNA cần đo thêm mật độ quang ở bước sóng 230 nm (A230) và 280 nm (A280) 280 nm là bước sóng ở đó các protein có mức hấp thu cao nhất, nhưng đồng thời protein cũng hấp thu ánh sáng ở bước sóng 260 nm Vì vậy, thường lấy tỉ lệ A260/A280 để đánh giá độ tạp nhiễm protein trong mẫu Một dung dịch nucleic acid được xem là không tạp nhiễm protein khi A260/A280 nằm trong khoảng 1,8 – 2 Còn ở bước sóng 230 nm, acid nucleic hấp thu thấp nhất nhưng các hợp chất hữu cơ thì lại hấp thu cao ở bước sóng này Vì vậy tỉ lệ A260/A230 có thể giúp đánh giá độ tạp nhiễm các chất hữu cơ

2.3.7.2 Điện di trên gel agarose

Nguyên vật liệu

- Dung dịch đệm TAE 1X: pha từ dung dịch mẹ TAE 50X (Tris base 242 g; Acid acetic băng 55,1 ml; Na2EDTA 37,2 g; Nước cất vừa đủ 1 lít)

20

- Agarose tinh khiết dùng cho điện di (Merck)

- Dung dịch ethidium bromide 5 mg/ml

- Dung dịch đệm nạp mẫu (loading buffer) 10X (glycerol 50% trong TE 1X, có 0,015% bromophenol blue, trộn và bảo quản ở -20oC trong từng phần nhỏ)

- Thang DNA chuẩn: 1 Kb plus Ladder hoặc 100 bp Ladder (Promega)

- Hộp đèn cực tím bước sóng 254 nm hoặc máy đọc gel

Tiến hành

- Đổ gel: cân 0,6 – 1,2 g (gel 1 – 2 %) agarose vào 60 ml đệm TAE 1X, đun đến khi tan hoàn toàn, lắc đều và làm nguội đến 50 oC, thêm ethidium bromide 1 µg/ml, trộn đều và đổ vào khuôn, gắn lược vào, để yên trong khoảng 30 phút cho gel cứng

- Đặt khuôn gel vào máng điện di có chứa TAE sao cho dung dịch đệm ngập trên gel khoảng 1 cm, giếng lược của bản thạch đặt về phía cực âm

- Pha các mẫu DNA với lượng thích hợp dung dịch đệm tải 10X và dùng micropipet cho các mẫu này vào các giếng, chạy song song với thang DNA chuẩn

- Chạy điện di ở dòng điện 100 Volt, 30 – 60 phút

- Quan sát các băng DNA

2.3.7.3 Điện di trên gel polyacrylamide

Nguyên vật liệu

Giống với điện di trên gel agarose, chỉ thêm:

- Dung dịch polyacrylamide 10%: pha từ acrylamide và bis-acrylamide

- AMPS (Ammonium persulfate)

- TMED (Tetramethylethylenediamine) được dùng chung với AMPS để xúc tác

21

Lưu ý: chỉ cho TMED vào hỗn hợp khi đã chuẩn bị xong khuôn đổ gel

- Lắp kính hai miếng kính tạo thành khuôn gel và chèn khuôn gel vào khuôn kẹp, cho hỗn hợp trên vào khuôn gel, gắn lược vào vị trí, đợi khoảng 30 – 60 phút gel đông

- Lắp khuôn gel vào buồng điện di và cho vào bể điện di, rót TAE 1X vào buồng điện di cho đến khi ngập qua tấm kính ngắn khoảng 0,5 cm và rót TAE 1X vào

bể điện di cho đến khi ngập qua chân gel 0,5 cm

- Pha các mẫu DNA với lượng thích hợp dung dịch đệm tải 10X và dùng pipet cho các mẫu này vào các giếng, chạy song song với thang DNA chuẩn

- Chạy điện di ở dòng điện 90 Volt, 130 – 150 phút

- Đọc gel: lấy gel ra khỏi khuôn và nhuộm trong dung dịch TAE 1X có chứa ethidium bromide trong khoảng 3 – 5 phút và quan sát các băng DNA trên hộp đèn cực tím bước sóng 254 nm hoặc đọc qua máy đọc gel

2.4 Nội dung 4: Phân tích RAPD để phân biệt các loại sâm bố chính, nghệ và một số dược liệu khác

2.4.1 Nguyên tắc

Tiến hành PCR với các mồi dài 10 nucleotide trên DNA bộ gen, thu được những sản phẩm khuếch đại thể hiện trên gel khi điện di

2.4.2 Nguyên vật liệu

- DNA chiết từ dược liệu

- 5X Go Taq Fleixi (Promega) hoặc iTaq DNA polymerase (Biorad) kèm đệm 10X Bốn loại dNTP 20 mM: dATP, dTTP, dCTP, dGTP (Invitrogen)

- 36 loại mồi ngẫu nhiên dài 10 nucleotide do IDT hoặc Viện Lúa ĐBSCL cung cấp Cơ sở chọn là một số mồi có sẵn trong phòng thí nghiệm và số khác được tham khảo từ tác giả liệt kê trong Bảng 2.2

Bảng 2.2 Các mồi sử dụng trong kỹ thuật RAPD [33],[35]

Áp dụng trên STT Tên mồi Trình tự mồi (5’ – 3’) Nghệ và cây

họ gừng Sâm Bố Chính

23

2.4.3 Tiến hành

- Pha hỗn hợp phản ứng: Dùng các mồi ngẫu nhiên (Bảng 2.2) với nồng độ 0,8

nM mỗi loại mồi và các thành phần khác bao gồm 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 50

mM KCl, 2,0 mM MgCl2, Taq (Promega) 0,5U, dNTP 0,16 mM, 25 ng DNA toàn phần, thể tích cuối 25 µl trong ống PCR 0,2 ml

- Đặt các ống phản ứng vô máy PCR và chạy theo chương trình Bảng 2.3

Bảng 2.3 Chu trình luân nhiệt cho kỹ thuật RAPD

Bước Nhiệt độ ( °C ) Thời gian Số chu kỳ

2.5 Nội dung 5: Phân tích MARMS các mẫu sâm, nghệ khảo sát

2.5.1 Nguyên tắc

Kỹ thuật MARMS là PCR sử dụng cùng lúc hai cặp mồi đặc hiệu, (áp dụng trên

sâm và nghệ là hai cặp mồi đặc hiệu cho cả hai đoạn gen matK/trnK và 18S rRNA)

Theo nguyên tắc, số lượng đoạn và chiều dài các đoạn đúng mong đợi chỉ có khi đích DNA là đúng

2.5.2 Nguyên vật liệu

- DNA chiết được từ các mẫu dược liệu

- Bảy cặp mồi đặc hiệu cho trnK và 18S rRNA các loại sâm Panax và chín mồi

đặc hiệu cho trnK họ Gừng dài 20 nucleotide do IDT hoặc Sigma-proligo cung cấp (Bảng 2.4 và Bảng 2.6)

- iTaq DNA polymerase hoặc Taq polymerase; Đệm 5X Go Taq Flexi; MgCl2 25 mM; 4 loại dNTP 10 mM: dATP, dTTP, dCTP, dGTP Nhà cung cấp Biorad, Promega hoặc Invitrogen

24

Bảng 2.4 Các mồi sử dụng trong phương pháp MARMS trên sâm Panax [23]

Mồi Trình tự của đoạn mồi (5’ – 3’)

Bảng 2.5 Thành phần mồi cho từng loại sâm [16], [17]

Mẫu Mồi cho gen matK Mồi cho gen 18S rRNA Kích thước sản phẩm PCR (bp)

Bảng 2.6 Các mồi sử dụng trong MARMS trên gen trnK họ Gừng và chi Curcuma

Mồi Trình tự của đoạn mồi

trnK-3914F 5’- TGG GTT GCT AAC TCA ATG G -3’

trnK-2R 5’- AAC TAG TCG GAT GGA GTA G -3’

25

trnK-1F 5’- CTC AAC GGT AGA GTA CTC G -3’

CT177AR 5’TTT CAA TGA AAA TAA AAT AAT AAA TCT ATT T 3’

CT531TR 5’ GTC TCT AAC CCA TAA TAA TA 3’

CT645AR 5’ GGT TTA TCT TCG TTA TAA TTA T 3’

CT30MER 5’ ATA TAC AAT AAT AAT AAA AAA CCT GTA TGT 3’

2.5.3 Tiến hành

2.5.3.1 MARMS trên gen trnK họ Gừng

- Pha thành phần phản ứng theo Bảng 2.7 hoặc Bảng 2.8

- Chạy chu trình luân nhiệt cho phản ứng khuếch đại gen matK với từng mồi theo

Bảng 2.9 hoặc Bảng 2.10

- Kiểm tra sản phẩm khuếch đại trên gel agarose 1% hoặc gel polyacrylamide 10%

Bảng 2.7 Thành phần của phản ứng khuếch đại gen trnK

Bảng 2.9 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng khuếch đại gen trnK

27

2.5.3.2 MARMS trên sâm Panax

- Pha hỗn hợp phản ứng: Dùng hai cặp mồi khuếch đại gen 18S rRNA và gen

matK (Bảng 2.5.) với nồng độ 0,05 µM mỗi loại mồi và các thành phần khác bao gồm 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 50 mM KCl, 2,0 mM MgCl2, Taq (Promega) 1U, 25 - 50 ng DNA toàn phần, thể tích cuối 20 µl

- Chu trình luân nhiệt được tiến hành 94 oC trong vòng 5 phút, lặp lại 40 lần hai bước tiếp theo (94 oC trong 30 giây, 66 oC trong 60 giây), 72 oC trong 5 phút; kết thúc chạy 72 oC trong 5 phút đối với PG, PJ và PN Riêng PQ và PV, giai

đoạn 66 oC kéo dài 80 giây

- Sản phẩm khuếch đại được kiểm tra trên gel agarose 2% - 2,5%, 100 Volt trong

45 phút Đọc kết quả phân tích băng DNA trên máy đọc gel

- Sản phẩm khuếch đại được kiểm tra trên gel agarose 2%, 100 V trong 45 phút

2.6 Nội dung 6: Dựng sơ đồ mối quan hệ di truyền và phân tích cây sinh loài các mẫu nghệ và sâm bố chính

Thiết lập ma trận nhị phân từ kết quả RAPD – PCR với nguyên tắc “1” nghĩa là có

sự xuất hiện vạch khuyếch đại, “0” là không có vạch khuyếch đại Chỉ các băng rõ,

ổn định, và lặp lại có kích thước 150 - 2.500 bp được dùng trong phân tích dữ liệu Các vạch mờ được loại bỏ

Để hiển thị mối quan hệ di truyền giữa các mẫu khảo sát, 1 sơ đồ hình cây được xây dựng dựa trên chỉ số tương ứng đơn giản SM (Simple matching coefficient) và xếp nhóm các mẫu theo phương pháp UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic mean) sử dụng phần mềm NTSYS-pc 2.1

Ma trận nhị phân được sử dụng để tính các tham số di truyền bằng chương trình POPGENE version 1.31 [43] Các tham số quan tâm là: tỉ lệ phần trăm băng đa hình trong từng quần thể

28

Chương III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

     3.1 Nội dung 1: Thu thập mẫu dược liệu

3.1.1 Các mẫu sâm Panax

Năm mẫu sâm nguyên liệu có nguồn gốc rõ ràng (Bảng 3.1) được dùng để đối chiếu với các nghiên cứu của các tác giả khác trước đây Các loại sâm này đều có hình thái đặc trưng là dạng rễ củ (Hình 3.1) Riêng sâm Việt Nam, do nguồn nguyên liệu này rất đắt tiền và khan hiếm, nên chúng tôi không thu thập được mẫu rễ củ trong thời gian làm đề tài Tuy nhiên, ngoài rễ củ thì lá và hoa sâm cũng là nguồn dược liệu nên chúng tôi đã chọn mẫu bột lá sâm Việt Nam để phân tích

Bảng 3.1 Nguồn gốc các mẫu sâm Panax chuẩn

1 Sâm Hàn Quốc Rễ củ PG Korea Ginseng Corp, Korean, 2003

3 Sâm Trung Quốc Rễ củ PNC Thu mua ở Sapa, Việt Nam, 2000

5 Sâm Việt Nam Bột lá PV Vườn sâm Ngọc Linh, 2001

Hình 3.1 Hình dạng các mẫu sâm chuẩn