Mục tiêu nghiên cứu
(i) Tinh sạch và đánh giá được đặc tính của cellulase tự nhiên từ chủng nấm sợi tuyển chọn;
(ii) Tạo được endoglucanase tái tổ hợp không chứa peptide tín hiệu từ nguồn gen đã được phân lập từ chủng nấm sợi tuyển chọn tại Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu
3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp cellulase mạnh trong bộ sưu tập từ nhiều nguồn khác nhau;
Nghiên cứu tối ưu thành phần môi trường và điều kiện lên men trong quy mô phòng thí nghiệm là cần thiết để phát triển chủng nấm sợi được tuyển chọn, từ đó làm cơ sở cho việc sản xuất cellulase tự nhiên hiệu quả.
3.3 Tinh sạch và phân tích tính chất lý hóa của cellulase tinh sạch từ chủng nấm sợi chọn lọc tại Việt Nam;
3.4 Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa endoglucanase A không chứa peptide tín hiệu từ chủng nấm sợi Aspergillus niger VTCC-F021 trong Pichia pastoris
GS115 và tối ưu môi trường lên men phù hợp để sản xuất endoglucanase tái tổ hợp không chứa peptide tín hiệu;
3.5 Tinh sạch và phân tích tính chất lý hóa của endoglucanase A tái tổ hợp không chứa peptide tín hiệu.
Những đóng góp mới của luận án
Endoglucanase được chiết xuất từ chủng nấm sợi Peniophora sp NDVN01 tại Việt Nam có kích thước khoảng 32 kDa và cho thấy độ bền cao trong khoảng nhiệt độ 30-37°C và pH 4,0-7,0 Enzyme này cũng bền với các dung môi như acetone (1-20%), ethanol và n-butanol (1-5%), isopropanol (1-15%) và có khả năng chịu đựng tốt với các chất tẩy rửa như Tween 20, Tween 80, Triton X-100 và Triton X-114.
(ii) Gen mã hóa endoglucanase A không chứa peptide tín hiệu (meglA) từ chủng A niger VTCC-F021 đã đư ợc bi ểu hiện thành công trong P pastoris
GS115 Endoglucanase A tái tổ hợp (rmEglA) tinh sạch có kích thước khoảng
32 kDa Enzyme hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 50°C, pH 3,5, bền ở 30-37°C và rất bền trong khoảng pH 3,0-8,0 Enzyme có độ bền cao đối với chất tẩy rửa Tween
Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án
Ý nghĩa khoa học
Nghiên cứu này làm rõ đặc điểm hóa sinh của endoglucanase từ nấm sợi Peniophora, đồng thời chỉ ra ảnh hưởng của peptide tín hiệu đến tính chất của endoglucanase A trong chủng này.
A niger VTCC-F021 biểu hiện trong nấm men Pichia pastoris
Kết quả nghiên cứu về endoglucanase A tái tổ hợp không có peptide tín hiệu đã cung cấp thêm bằng chứng khoa học cho việc cải thiện hoạt tính và tính chất của enzyme tái tổ hợp thông qua việc loại bỏ peptide tín hiệu.
Các bài báo khoa học được công bố trên các tạp chí quốc tế và trong nước, cùng với trình tự gen được lưu trữ trong Ngân hàng gen Quốc tế, là nguồn tài liệu quý giá cho nghiên cứu và giảng dạy.
Ý nghĩa thực tiễn
Enzyme endoglucanase từ chủng nấm Peniophora sp NDVN01 và endoglucanase A tái tổ hợp không chứa peptide tín hiệu có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm bổ sung cho thức ăn chăn nuôi, giúp chuyển hóa glucan nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn và tăng trọng cho vật nuôi Ngoài ra, hai enzyme này còn có khả năng chuyển hóa sinh học nguyên liệu và chất thải nông nghiệp giàu cellulose thành đường, phục vụ cho ngành công nghiệp lên men.
Thành phần môi trường và điều kiện lên men tối ưu đối với chủng nấm sợi
Chủng Peniophora sp NDVN01 và nấm men P pastoris tái tổ hợp có tiềm năng lớn trong việc lên men quy mô lớn, phù hợp cho sản xuất endoglucanase tự nhiên và tái tổ hợp tại Việt Nam.
Cellulase
1.1.1 Nguồn gốc và phân loại
Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết -1,4-O- glycoside trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tương tự khác
Cellulase có thể được tổng hợp từ nhiều nguồn khác nhau, nhưng vi sinh vật nổi bật với những ưu điểm vượt trội so với enzyme từ động vật và thực vật Quá trình phân giải cellulose do vi sinh vật thực hiện là một trong những chu trình quan trọng nhất trong tự nhiên Nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm sợi và một số loại nấm men có khả năng sinh tổng hợp cellulase, đóng góp vào sự phong phú của enzyme này.
Nấm sợi là vi sinh vật nổi bật trong việc tổng hợp cellulase, với nhiều chủng thuộc các chi như Aspergillus, Trichoderma, Penicillium và Phanerochaete Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chủng nấm như A niger, A flavus, A fumigatus và A terreus có khả năng sinh tổng hợp cellulase mạnh mẽ.
[63], A oryzae [124], A awamori [126], T reesei [135], Penicillium sp DTQ- HK1 [13], Penicillium persicinum, P brasilianum [76], Phanerochaete chrysosporium [77]
Vi khuẩn, bên cạnh nấm sợi, được coi là nguồn tài nguyên phong phú cho việc sinh tổng hợp cellulase nhờ vào chu kỳ sinh trưởng ngắn Nhiều loài vi khuẩn hiếu khí, như Acidothermus cellulobuticus, đã được nghiên cứu và chứng minh khả năng sinh tổng hợp cellulase mạnh mẽ.
Bacillus pumilis, Cellulomonas flavigena, C udai, and Pseudomonas fluorescens are notable aerobic bacteria known for their cellulase production Additionally, certain anaerobic bacteria, such as Clostridium, also exhibit strong cellulase synthesis capabilities.
Nhiều chủng xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces và Streptomyces, như Actinomyces griseus và Streptomyces reticuli, có khả năng sinh tổng hợp cellulase mạnh Vào năm 1955, đã chứng minh rằng vi sinh vật sống cộng sinh trong dạ cỏ của động vật nhai lại có khả năng phân giải cellulose Đến năm 1971, một số loài vi sinh vật, đặc biệt là Ruminococus albus và R flavefaciens, đã được phân lập và nghiên cứu kỹ lưỡng về khả năng phân giải cellulose Bên cạnh đó, cellulase cũng được sinh tổng hợp ở thực vật Arabidopsis, động vật nguyên sinh, một số động vật không xương sống như mối, và động vật thân mềm như vẹm xanh Mytilus edulis.
Theo Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử Quốc tế, cellulase được phân loại vào lớp 3 (hydrolase), là các enzyme có khả năng xúc tác cho các phản ứng thủy phân.
2 (glycosidase): các enzyme thủy phân các liên kết glycoside; nhóm 1: các enzyme thủy phân liên kết O- và S-glycoside [189]
Cellulase là một phức hệ enzyme đa dạng, được phân loại theo nhiều cách khác nhau Truyền thống, cellulase được chia thành hai nhóm chính: enzyme C1 và enzyme Cx Enzyme C1 có khả năng thủy phân sợi cellulose tự nhiên nhưng với tính đặc hiệu không rõ ràng Trong khi đó, enzyme Cx được chia thành hai loại: exo β-1,4-glucanase (E.C.3.2.1.21), có tác dụng cắt đứt gốc glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose, và endo β-1,4-glucanase.
Enzyme cellulase hiện nay được phân loại thành ba dạng chính: Endo-β-(1,4)-glucanase (hay endocellulase) có khả năng thủy phân liên kết β-1,4-glycoside trong chuỗi cellulose và một số polysaccharide tương tự một cách ngẫu nhiên, tạo ra các oligosaccharide, cellodextrin và đường khử Enzyme này hoạt động hiệu quả ở vùng vô định hình của cellulose nhưng kém hiệu quả ở vùng kết tinh và không phân giải cellobiose Bên cạnh đó, Exo-β-(1,4)-glucanase (hay exocellulase) cắt cellulose từ đầu khử và đầu không khử, giải phóng oligosaccharide, cellobiose và glucose.
C1 có tính chất không đặc hiệu, giúp hấp thụ nước và làm trương nở cellulose, tạo điều kiện cho các enzyme khác hoạt động Tuy nhiên, khi C1 hoạt động độc lập, tác dụng của nó không rõ ràng Enzyme -(1,4)-glucosidase hay cellobiase (E.C.3.2.1.2) có khả năng thủy phân cellobiose và cellooligosacharide mạch ngắn thành glucose, nhưng không tác động đến cellulose và cellulose dextrin cao phân tử.
Cellulose là một polymer mạch thẳng không cuộn xoắn, được hình thành từ các đơn vị β-glucose thông qua liên kết β-1,4-O-glycoside Mức độ polymer hóa của cellulose được đánh giá dựa trên số lượng phân tử glucose trong chuỗi, với con số này dao động từ khoảng 10.000 đến 14.000 cho cellulose tự nhiên, dẫn đến khối lượng phân tử của toàn bộ chuỗi.
Các phân tử glucose trong chuỗi polymer có kích thước 1,5x10^6 Da và dài 5μm, với cấu trúc ghế bành Mỗi phân tử glucose quay 180° so với phân tử kế tiếp, và các nhóm β-OH glycoside đều nằm trên mặt phẳng ngang của các phân tử glucose.
Bằng phương pháp phân tích tia X, cấu trúc cellulose trong tế bào thực vật đã được xác định có dạng sợi Đơn vị nhỏ nhất của cellulose có đường kính khoảng 3 nm, các sợi sơ cấp kết hợp lại thành vi sợi hay còn gọi là micelle Mỗi micelle thường chứa khoảng 60 phân tử cellulose, có đường kính từ 10-40 nm và chiều dài từ 100-40.000 nm Các micelle này kết hợp thành những bó sợi lớn hơn, có thể quan sát được dưới kính hiển vi quang học Những bó sợi cellulose liên kết với lớp polysaccharide trong thành tế bào thực vật, tạo nên một phức hệ bền vững, đóng vai trò như lớp kết dính sinh học trong thành tế bào thực vật.
Hình 1.1 Hình ảnh mô hình sự sắp xếp các chuỗi cellulose trong thành tế bào thƣ̣c vật [120]
Cellulose có cấu trúc không đồng nhất gồm hai vùng:
- Vùng kết tinh có trật tự cao
Vùng vô định hình của cellulose có cấu trúc lỏng lẻo, các mạch liên kết với nhau nhờ lực Van der Waals và dễ bị tác động bởi yếu tố bên ngoài Khi tiếp xúc với nước, cellulose có khả năng hấp thu nước và trương phồng, tạo điều kiện thuận lợi cho enzyme cellulase hoạt động Ngược lại, vùng kết tinh của cellulose có cấu trúc chặt chẽ với các mạch liên kết qua liên kết hydrogen, ngăn cản sự trương phồng và làm cho enzyme cùng nhiều phân tử khác khó xâm nhập vào bên trong để phân hủy cellulose.
Cellulase từ các nguồn gốc khác nhau có cấu trúc và thành phần đa dạng, thể hiện qua khối lượng phân tử và trật tự amino acid trong chuỗi polypeptide Chủng A oryzae KBN616 sản sinh hai loại endoglucanase, CelA và CelB, trong đó CelA có 239 amino acid và khối lượng phân tử 31 kDa, thuộc họ cellulase H, còn CelB có 416 amino acid và khối lượng 53 kDa, thuộc họ cellulase C Endoglucanase từ A aculeatus có 410 amino acid và khối lượng 43,7 kDa, trong khi A niger Z10 có endoglucanase với khối lượng 83 kDa và 50 kDa.
Endoglucanases are enzymes with varying molecular weights, such as A terreus at 25 kDa, T reesei at 48 kDa and 55 kDa, and Bacillus sp D04 at 35 kDa Notably, the endoglucanase EglC from A niger has a size of 50.9 kDa and consists of 858 amino acids, while the enzyme from A aculeatus measures 45 kDa.
Hình 1.2 Hình ảnh cấu trúc phân tử của một số cellulase
A: Endoglucanase của A niger [102]; B: β-glucosidase của Trichoderma reesei
Sandgren và đtg (2003) đã có những nghiên cứu chi tiết về cấu trúc Cel12A thuộc họ 12 (GH 12) endoglucanase từ nấm sợi chịu nhiệt Humicola grisea
