Nghiên cứu tạo chế phẩm kháng thể đa dòng igy nhận biết đặc hiệu kháng nguyên nang f1 của vi khuẩn dịch hạch yersinia pestis và ứng dụng tạo que thử phát hiện nhanh

Bệnh dịch hạch và nguyên nhân gây bệnh dịch hạch

Bệnh dịch hạch

Dịch hạch, một bệnh truyền nhiễm cấp tính và nguy hiểm do vi khuẩn Yersinia pestis gây ra, thuộc diện kiểm dịch quốc tế Bệnh này chủ yếu lưu hành trong quần thể động vật gặm nhấm như chuột và lây lan qua bọ chét ký sinh Lịch sử đã ghi nhận ba đại dịch dịch hạch vào các thế kỷ VI, XIV và XIX, gây ra hàng trăm triệu ca tử vong, biến dịch hạch thành nỗi ám ảnh của nhân loại.

Bệnh dịch hạch đã tồn tại từ lâu, và trong thời kỳ đầu, việc xác định chính xác thông tin để phân biệt hay chứng minh bệnh này do vi khuẩn hay virus gây ra là rất khó khăn.

Trong suốt hai ngàn năm qua, dịch hạch đã lan rộng ra nhiều quốc gia trên thế giới Đại dịch đầu tiên xảy ra vào thế kỷ VI, từ năm 542 đến 546, bắt đầu ở Đế quốc La Mã phương Đông dưới triều đại Vua Justinian 1 tại Ai Cập, làm chết khoảng 100 triệu người ở Châu Á, Châu Phi và Châu Âu Đại dịch thứ hai, được biết đến với tên gọi “Bệnh chết đen - Black Death”, diễn ra vào thế kỷ XIV, từ năm 1347 đến 1350, khiến khoảng 50 triệu người thiệt mạng, trong đó một nửa số nạn nhân là ở Châu Âu, tương đương một phần ba dân số Châu Âu thời điểm đó, với tỷ lệ tử vong lên tới 70 - 80%.

Cuối thế kỷ XIX, đại dịch thứ ba bắt đầu ở Canton và Hồng Kông vào năm

Vào năm 1894, dịch hạch đã nhanh chóng lan rộng ra toàn cầu, ảnh hưởng đến 77 thành phố cảng trên 5 châu lục trong vòng 10 năm (1894-1903) Cụ thể, dịch đã xuất hiện tại 31 thành phố ở Châu Á, 12 ở Châu Âu, 8 ở Châu Phi, 4 ở Bắc Mỹ, 15 ở Nam Mỹ và 7 ở Châu Úc Tại Ấn Độ, dịch hạch bùng phát mạnh mẽ, đặc biệt ở Bombay, nơi đã ghi nhận khoảng 13 triệu ca tử vong.

Tình hình dịch hạch trên thế giới và Việt Nam

I.2.1 Tình hình dịch hạch trên thế giới

Các vùng dịch hạch không cố định và luôn thay đổi do ảnh hưởng của nhiều yếu tố tự nhiên và xã hội như khí hậu, động đất, sự di chuyển của quần thể gặm nhấm và di dân Hiện nay, dịch hạch tồn tại ở Bắc và Nam Mỹ, Châu Phi, Châu Á và Đông Nam Châu Âu, trải dài từ vĩ độ 55 Bắc đến 40 Nam Tuy nhiên, trong khu vực này có những nơi không có ổ dịch hạch, như các hoang mạc với ít hoặc không có loài gặm nhấm, vùng chí tuyến hoặc những dãy núi cao băng giá quanh năm.

Từ năm 1954 đến 2001, Tổ chức Y tế Thế giới ghi nhận 38 quốc gia có bệnh dịch hạch, với tổng cộng 89.651 trường hợp mắc và 7.715 ca tử vong Năm 1967 là năm có số ca mắc cao nhất với 6.014 trường hợp, trong khi năm 1981 ghi nhận số ca thấp nhất với 200 trường hợp Trong gần nửa thế kỷ qua, bảy quốc gia xảy ra dịch bệnh hàng năm bao gồm Brazil, Cộng hòa Dân chủ Congo, Madagascar, Myanmar, Peru, Hoa Kỳ và Việt Nam.

Hình 1.1: Tình hình dịch hạch trên thế giới từ năm 1954 – 2001[1]

Tình hình dịch hạch toàn cầu hiện vẫn phức tạp và khó có thể dự đoán việc loại trừ hoàn toàn bệnh dịch này trong tương lai gần Việc chủ quan với dịch hạch là điều không nên.

Vào năm 1995, Madagascar đã khởi động nghiên cứu toàn diện về phòng chống dịch hạch và thiết lập mạng lưới nghiên cứu tại các Viện Pasteur Mặc dù tình hình dịch hạch tại Trung Quốc đã được kiểm soát tốt, nhưng hệ thống giám sát và phòng chống bệnh dịch này vẫn được tăng cường Trong những năm gần đây, các hội nghị quốc tế về nghiên cứu và phòng chống dịch hạch do Tổ chức Y tế Thế giới tổ chức đã thu hút sự tham gia của nhiều nhà khoa học trên toàn cầu Một hội nghị quốc tế về giám sát và phòng chống dịch hạch đã diễn ra tại Bangalore, Ấn Độ từ ngày 15 đến 17 tháng 7 năm 2002, theo thông tin từ chuyên gia Tikhomirov E của Tổ chức.

Tổ chức Y tế Thế giới xác định 6 tiêu chuẩn để đánh giá tính ưu tiên trong nghiên cứu và phòng chống bệnh, bao gồm tác động của bệnh, nguy cơ dịch, hiệu quả phòng ngừa và điều trị, tầm quan trọng quốc tế, ảnh hưởng kinh tế và nguy cơ sử dụng có mục đích Dịch hạch đáp ứng đầy đủ cả 6 yếu tố này, do đó, nó được xem là bệnh cần được ưu tiên trong nghiên cứu và phòng chống.

I.2.2 Tình hình dịch hạch tại Việt Nam

Hơn 1 thế kỷ trước, bệnh dịch hạch đã có mặt ở Việt Nam, có khả năng từ Hồng Kông xâm nhập vào năm 1898 trong bối cảnh của đại dịch lần thứ ba Mầm bệnh vẫn được duy trì, lưu hành có thời kỳ bùng phát xen kẽ với những thời kỳ lắng dịu nhưng thực sự chưa bao giờ được loại trừ

Dịch hạch lần đầu tiên được ghi nhận ở Việt Nam vào năm 1898 tại Nha Trang, trong bối cảnh đại dịch hạch thế giới lần thứ 3 Dịch bệnh chủ yếu xâm nhập qua hàng hóa từ Trung Quốc và nhanh chóng lây lan đến nhiều địa phương như Bắc Ninh, Hòn Gai, Phan Thiết, Phan Rang, và Sóc Trăng Mặc dù dịch tại một số nơi chỉ mang tính tạm thời, Sài Gòn và Phan Thiết lại trở thành những vùng dịch lưu hành dai dẳng Đặc biệt, vào năm 1911, một vụ dịch lớn xảy ra tại Châu Đốc, Long Xuyên, và Thủ Dầu Một, với nhiều bệnh nhân mắc dịch hạch thể phổi.

Hình1.2: Số mắc/chết dịch hạch ở Việt Nam từ năm 1976-2002

Từ 1961 đến 1975: dịch bùng phát lan tràn ở Miền Nam Sau đó tiếp tục lây lan trên diện rộng ở các tỉnh ven biển Miền Trung, Tây Nguyên, Miền Đông Nam

Dưới sự hỗ trợ của Mỹ, chính quyền miền Nam đã triển khai chương trình quốc gia phòng chống dịch hạch, góp phần kiểm soát một phần dịch bệnh Tuy nhiên, dịch hạch vẫn tồn tại với quy mô lớn, và trong giai đoạn này, phần lớn số bệnh nhân mắc phải dịch hạch trên toàn cầu đều là người Việt Nam.

Hình 1.3: Số bệnh nhân dịch hạch ở Việt Nam so với thế giới, 1954-2001

Từ năm 1975 đến 1990, dịch bệnh bùng phát mạnh mẽ, với số ca mắc và tử vong tăng cao tại các tỉnh ven biển miền Trung, Tây Nguyên và miền Đông Nam Bộ Trong giai đoạn này, dịch hạch xuất hiện tại 9 tỉnh/thành phố phía Bắc do sự giao lưu hàng hóa và phương tiện giao thông, đặc biệt là chuột mang tác nhân gây bệnh Y pestis theo lương thực từ miền Nam Tuy nhiên, từ năm 1991 đến 2002, số ca mắc và tử vong có xu hướng giảm, dịch bệnh thu hẹp chủ yếu ở miền Trung và Tây Nguyên Từ năm 1999 đến 2002, dịch chỉ còn ghi nhận tại một số địa phương ở tỉnh Đắk Lắk và Gia Lai, với ổ dịch tập trung tại các xã thuộc huyện Đắc Đoa và EaH’leo.

Kể từ tháng 3/2003, không có trường hợp bệnh dịch hạch nào được ghi nhận trên người, với ca mắc gần nhất xảy ra vào tháng 8/2002 tại tỉnh Đắk Lắk Giám sát dịch động vật tại các khu vực trọng điểm cho thấy từ tháng 4/2004, không còn phân lập được vi khuẩn Y pestis từ vật chủ và trung gian truyền bệnh Ngoài ra, từ năm 2005, các xét nghiệm huyết thanh động vật tìm kháng thể kháng F1 của vi khuẩn Y pestis đều cho kết quả âm tính.

Biểu hiện của bệnh dịch hạch

Tùy thuộc vào vị trí thương tổn giải phẫu bệnh lý, có nhiều thể lâm sàng với tỷ lệ khác nhau, trong đó thể hạch là phổ biến nhất Các thể nhiễm khuẩn huyết và phổi tiên phát hiếm gặp hơn, trong khi nhiễm khuẩn huyết và viêm phổi thứ phát thường là biến chứng của thể hạch nếu không được điều trị kịp thời Ngoài ra, còn có các biểu hiện khác như viêm màng não mủ, viêm họng, thể xuất huyết và thể da, nhưng những biểu hiện này thường xảy ra trong bối cảnh hoặc là biến chứng thứ phát của thể hạch.

Bệnh dịch hạch có nhiều thể lâm sàng không đồng nhất, với sự khác biệt về tỷ lệ xuất hiện tùy thuộc vào từng vùng và vụ dịch Tuy nhiên, thể hạch vẫn là dạng phổ biến nhất của bệnh này.

Thống kê từ một số bệnh viện tại Việt Nam cho thấy Bệnh viện Chợ Quán ghi nhận tỷ lệ mắc bệnh từ 94-98% trong giai đoạn 1977-1986, Bệnh viện Đắc Lắc đạt 97% trong khoảng thời gian 1976-1986, và Bệnh viện Phú Khánh có tỷ lệ 98% từ năm 1982 đến 1986 Tại New Mexico, số liệu cũng cho thấy tình hình tương tự.

Từ năm 1980 đến 1984, tỷ lệ mắc bệnh hạch đạt 74,7% Theo quy định của Tổ chức Y tế Thế giới, thời gian ủ bệnh kéo dài trong vòng 6 ngày, và thời kỳ này thường lâu hơn ở những người đã được tiêm vắc xin Trong giai đoạn ủ bệnh, bệnh nhân không có triệu chứng rõ ràng, sau đó bệnh thường khởi phát đột ngột với hai nhóm dấu hiệu đặc trưng là nhiễm khuẩn - nhiễm độc và viêm hạch.

* Hội chứng nhiễm trùng - nhiễm độc

Sốt cao đột ngột là triệu chứng thường gặp trước khi viêm hạch xuất hiện Nếu được điều trị bằng kháng sinh phù hợp, nhiệt độ có thể giảm từ 1,5 đến 2 độ C trong vòng 18 - 24 giờ, và sau đó có thể hết sốt hoàn toàn hoặc chỉ sốt nhẹ trong 2 - 3 ngày tiếp theo.

Các dấu hiệu nhiễm trùng và nhiễm độc thần kinh rất quan trọng trong việc đánh giá mức độ nặng nhẹ của bệnh và tiên lượng bệnh Cần chú ý đến những triệu chứng xuất hiện trong 24 giờ đầu Ở thể nhẹ, bệnh nhân có thể cảm thấy mệt mỏi và biếng ăn nhưng vẫn giữ được sự tỉnh táo Khi bệnh trở nặng, các triệu chứng nhiễm độc trở nên rõ rệt hơn, với mặt đỏ, kết mạc mắt xung huyết, môi khô, lưỡi bẩn, và đau nhức nhiều nơi Bệnh nhân có thể cảm thấy bứt rứt, lo âu, hoặc hốt hoảng, đi kèm với các triệu chứng như nói nhảm, mắt đờ đẫn, và nằm yên không cử động Một số trường hợp có thể gặp ảo giác, trả lời chậm, hoặc có tiếng nói không rõ ràng Hiếm hơn, bệnh nhân có thể gặp các động tác bất thường, co giật, ra nhiều mồ hôi, và thậm chí nôn mửa hoặc tiêu chảy, cùng với khó thở nhanh mà không có tổn thương phổi.

Viêm hạch thường xuất hiện trong khoảng thời gian từ vài giờ đến 24 giờ sau khi sốt, mặc dù một số ít trường hợp có thể nổi hạch trước khi sốt Đây là một loại viêm cấp tính, với triệu chứng đau là đặc trưng nổi bật Đau thường là triệu chứng đầu tiên và xuất hiện trước khi nổi hạch ở 87% bệnh nhân Cảm giác đau tăng lên khi bệnh nhân cử động hoặc chạm vào vùng bị ảnh hưởng, khiến họ thường tìm cách giảm áp lực lên khu vực đó Thuốc giảm đau thường không hiệu quả, và cơn đau có xu hướng gia tăng tự nhiên.

Sốt cao kèm theo 18 sớm thường chỉ ra tiên lượng nặng hơn cho bệnh nhân Tuy nhiên, đau sẽ giảm rõ rệt và nhanh chóng trong vòng 24 đến 48 giờ sau khi được điều trị bằng kháng sinh đặc hiệu.

Bọ chét thường liên quan đến sự xuất hiện của hạch ở một số vị trí, đặc biệt là vùng đùi bẹn với tỷ lệ 62-80% Các vị trí khác bao gồm hạch nách (14-20%) và hạch cổ, hạch dưới hàm (15-18%) Có thể thấy hai hoặc nhiều hạch xuất hiện đồng thời hoặc lần lượt, đặc biệt là ở các vùng hạch cao như cổ, nách và thượng đòn.

… ) thường là một biểu hiện nặng cần được chú ý

Hình 1.4: Bệnh nhân mắc bệnh dịch hạch

Hạch viêm có triệu chứng sưng tấy, nóng, đỏ và đau đớn, với kích thước thay đổi từ nhỏ, di động đến lớn lên đến 10 cm trong vòng 1-2 ngày, nhưng thường dưới 3 cm Tổ chức xung quanh hạch bị viêm và phù nề, tạo thành một khối không di động, với màu da bên ngoài đỏ tía Nếu được điều trị sớm và đúng cách, hạch sẽ giảm đau nhanh chóng, teo nhỏ và có thể “mất đi” trong 2-3 tuần hoặc trở nên xơ hóa, để lại một khối rắn trong thời gian dài sau khi hồi phục.

I.3.2 Dịch hạch thể nhiễm trùng huyết

Quan niệm về thể nhiễm khuẩn huyết có nhiều ý kiến khác nhau Theo Pollitzer, thể nhiễm khuẩn huyết tiên phát do sự xâm nhập trực tiếp của một lượng lớn vi khuẩn dịch hạch vào máu mà không qua giai đoạn khu trú ở hạch Trong khi đó, một số tác giả như Girard, Dujardin, Beaumetz và Joltrain lại có quan điểm khác về thể nhiễm khuẩn huyết này.

19 huyết chỉ thứ phát sau thể hạch nằm trong sâu, thăm khám bên ngoài không sờ thấy được Các tổ chức hạch này vẫn chứa nhiều vi khuẩn[1]

Dịch hạch thể nhiễm trùng huyết tiên phát là tình trạng nhiễm khuẩn huyết do Y pestis gây ra mà không có triệu chứng viêm hạch rõ ràng Vì không có dấu hiệu viêm hạch đặc hiệu, thể bệnh này thường bị bỏ sót, dẫn đến nguy cơ tử vong cao.

Bệnh nhân xuất hiện triệu chứng sốt cao từ 40 - 41 độ C, kèm theo rét run, đau đầu nghiêm trọng, tiêu chảy và nôn mửa liên tục Tình trạng hốt hoảng, vật vã, kích động, nói sảng, da tím tái và thở nhanh nông khiến người bệnh cần được cấp cứu kịp thời.

Nhiễm trùng nhiễm độc có thể dẫn đến sốc, và khi soi tươi các bệnh phẩm, vi khuẩn dạng dịch hạch sẽ được phát hiện Nếu không được điều trị sớm và hồi sức tích cực trong những giờ đầu, bệnh nhân có thể tử vong nhanh chóng chỉ trong vài ngày.

Bệnh dịch hạch phổi là thể nguy hiểm nhất do tiến triển nhanh và tỷ lệ tử vong cao Thể tiền phát xảy ra khi vi khuẩn tác động trực tiếp lên phổi qua đường hô hấp, dẫn đến viêm phổi cấp tính Thời gian ủ bệnh thường ngắn, chỉ vài ngày hoặc thậm chí vài giờ, với triệu chứng khởi phát đột ngột như sốt cao, rét run, đau đầu, và khó thở Trong 24 giờ, bệnh nhân có thể gặp rối loạn chức năng hô hấp với ho có đờm nhầy, sau đó chuyển sang đờm đặc có máu Triệu chứng thực thể ở phổi thường nghèo nàn, với dấu hiệu gõ bình thường hoặc đục một vài nơi X-quang phổi có thể cho thấy hình ảnh đông đặc hoặc bóng mờ, phản ánh tình trạng bệnh lý nghiêm trọng Ngoài các thể phổ biến, còn có các thể ít gặp như thể màng não, thể xuất huyết, và thể hầu học.

Cơ chế lây lan bệnh dịch hạch và vi khuẩn Y pestis

I.4.1 Cơ chế lây truyền bệnh dịch hạch

Dịch hạch là một bệnh truyền nhiễm lây lan chủ yếu qua quần thể gặm nhấm, với sự duy trì trong các ổ dịch tự nhiên Bệnh này lây truyền qua bọ chét sống ký sinh trên các loài gặm nhấm Mặc dù nhiều loài động vật hoang dã có thể nhiễm vi khuẩn dịch hạch, nhưng chúng thường có tính đề kháng cao, không đóng vai trò quan trọng trong việc phát tán bệnh.

Trên toàn cầu, bộ gặm nhấm (Rodentia) có khoảng 6.000 loài, trong đó họ chuột (Muridae) bao gồm 150 loài Tại Việt Nam, có 56 loài gặm nhấm, trong đó họ chuột chiếm 43 loài phân bố rộng rãi trên toàn lãnh thổ.

Dịch hạch là bệnh chủ yếu ảnh hưởng đến động vật, đặc biệt là các loài gặm nhấm và chuột, trong khi con người chỉ đóng vai trò là vật chủ ngẫu nhiên Bọ chét là yếu tố quan trọng trong việc lan truyền bệnh, vì chúng cần phải nhiễm vi khuẩn dịch hạch qua việc hút máu Thời gian sống của bọ chét cũng cần đủ dài để vi khuẩn nhân lên và lây truyền sang vật chủ khác Ngoài ra, số lượng và thành phần của bọ chét cùng với quần thể vật chủ cũng là yếu tố cần thiết để gây ra nhiễm trùng và lây lan dịch bệnh Trong tự nhiên, bệnh dịch hạch có thể lan truyền qua nhiều con đường khác nhau.

Bệnh dịch hạch thường lây truyền qua bọ chét, với cơ chế lây nhiễm xảy ra từ vài ngày đến vài tuần sau khi vật chủ bị nhiễm bệnh Bọ chét hút máu từ vật chủ mang vi khuẩn dịch hạch, dẫn đến sự phát triển của vi khuẩn và tạo thành nút nghẽn ở tiền dạ dày Khi vật chủ chết, bọ chét không còn nguồn thức ăn và tìm kiếm ký chủ mới Tuy nhiên, do ống tiêu hóa bị tắc nghẽn, mỗi lần hút máu, vi khuẩn dịch hạch bị đẩy ra ngoài và xâm nhập vào cơ thể ký chủ mới qua vết đốt, gây ra sự lây truyền bệnh.

* Lan truyền trực tiếp từ vật chủ bệnh sang vật chủ lành không qua trung gian của bọ chét như:

Vi khuẩn Y.pestis có thể xâm nhập qua da, thông qua tiếp xúc trực tiếp với động vật nhiễm bệnh, hoặc do cắn và cào từ động vật nuôi trong nhà Nhân viên tại các phòng xét nghiệm cũng có nguy cơ tiếp xúc với vi khuẩn này.

Vi khuẩn Y.pestis có thể lây lan qua việc hít phải không khí chứa vi khuẩn này từ vật chủ mắc bệnh hoặc đã chết do dịch hạch, đặc biệt là trong trường hợp dịch hạch thể phổi Phương thức lây truyền này rất nguy hiểm vì nó xảy ra nhanh chóng đối với những người tiếp xúc.

Vi khuẩn dịch hạch xâm nhập qua da tại vị trí bọ chét đốt, sau đó di chuyển theo đường bạch huyết đến hạch khu vực, nơi chúng phát triển mạnh mẽ gây nên dịch hạch thể hạch Nếu không được điều trị kịp thời, vi khuẩn có thể xâm nhập vào máu, dẫn đến thể nhiễm khuẩn thứ phát Đối với thể nhiễm khuẩn huyết, cả bọ chét và yếu tố độc lực của vi khuẩn cùng sức đề kháng của cơ thể vật chủ đều đóng vai trò quan trọng trong việc truyền bệnh.

Hình 1.5: Sơ đồ lây lan bệnh dịch hạch

I.4.2 Vi khuẩn gây bệnh dịch hạch Y pestis

Dịch hạch là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, nguy hiểm, do vi khuẩn Y pestis gây ra, thuộc diện kiểm dịch và khai báo quốc tế Bệnh này chủ yếu lưu hành trong quần thể động vật gặm nhấm, đặc biệt là chuột và bọ chét ký sinh trên chúng, từ đó lây lan sang các loài động vật khác và con người.

Vi khuẩn dịch hạch, ban đầu được gọi là Bacterium pestis, đã trải qua nhiều tên gọi khác nhau, bao gồm Bacillus pestis vào năm 1900 và Pasteurella pestis từ năm 1923 Tên gọi này đã được xác nhận tại Hội nghị Sinh vật học Quốc tế lần thứ nhất.

10 vào năm 1970 mới có danh pháp như hiện nay là Y pestis

Yersinia pestis do Alexandre Yersin phát hiện ra tại Hồng Kông vào ngày 20 tháng 6 năm 1894, trong thời gian đại địch lần thứ 3 đang hoành hành ở đây

Yersinia pestis, trước đây thuộc họ Pasteurellaceae, đã được phân loại lại vào họ mới dựa trên nghiên cứu so sánh mã di truyền qua lai tạo DNA-DNA và RNA ribosom 16S/5S, cho thấy sự tương đồng với Escherichia coli.

Enterobacteriaceae Chi Yersinia có 11 loài nhưng chỉ có 3 loài được quan tâm vì có khả năng gây bệnh cho người là Y pestis, Y.pseudotuberculosis và Y enterocolitica

Yersinia pestis là vi khuẩn hình cầu trực khuẩn, kích thước 0,5 x 1-2 µm, bắt màu Gram âm và nhuộm Wayson cho màu xanh tím ở hai đầu, với phần giữa trong suốt, được gọi là “bắt màu lưỡng cực” Vi khuẩn này không di động, không hình thành nha bào và không sinh axít Là vi khuẩn hiếu khí, Y pestis dễ dàng phát triển trên các môi trường nuôi cấy thông thường, tối ưu ở nhiệt độ 28 - 30°C và pH từ 7,2 đến 7,6 Trên môi trường canh thang, khuẩn lạc không làm đục môi trường, trong khi trên môi trường thạch, khuẩn lạc có dạng R điển hình với hình dạng lồi ở giữa, xung quanh sáng và mép viền không đều kiểu đăng ten Vi khuẩn này lên men đường glucose và mannitol, nhưng không lên men đường rhamnose, lactose và sucrose.

Hình1.6: Hình ảnh Y pestis bắt màu đậm 2 đầu khi nhuộm Wayson

Yersinia pestis được phân loại thành ba type sinh học: Orientalis, Antiqua và Medievalis, dựa trên khả năng khử hóa nitrat thành axít nitric và lên men glycerin Mặc dù ba type này không khác biệt về độc lực và bệnh học đối với con người và động vật, nhưng chúng có sự khác biệt rõ rệt về phân bố địa lý và tính chọn lọc vật chủ, điều này tạo ra vai trò quan trọng trong nghiên cứu dịch tễ học.

Yersinia pestis là vi khuẩn có sức đề kháng yếu với môi trường bên ngoài, dễ bị tiêu diệt bởi ánh sáng, nhiệt độ cao và quá trình sấy khô Ngoài ra, các chất sát trùng và tẩy uế như Lysol và các sản phẩm chứa Chlorin có khả năng tiêu diệt vi khuẩn này trong thời gian ngắn.

Yersinia pestis có cấu trúc kháng nguyên phức tạp với khả năng gây bệnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó các chủng có độc lực cao sở hữu từ 16 đến 18 kháng nguyên Các kháng nguyên quan trọng bao gồm F1, V, W, cùng với hai yếu tố P và Pu Kháng nguyên nang F1 có độc lực cao và là yếu tố kháng nguyên mạnh, giúp bảo vệ vi khuẩn khỏi sự thực bào Kháng nguyên thân V là một phần của nội độc tố, trong khi kháng nguyên W liên quan đến khả năng chống lại hiện tượng thực bào.

Burrows và Bacon đã xác định tính kháng thực bào của Y pestis thông qua hai kháng nguyên V và W, có khả năng hoạt động độc lập hoặc liên kết với kháng nguyên F1.

Kháng nguyên nang F1

Kháng nguyên F1 của vi khuẩn Y pestis có tính đặc hiệu loài cao, chỉ có ở chủng này, và được sử dụng trong chẩn đoán dịch hạch Nghiên cứu của William và cộng sự trên 300 chủng Y pestis cho thấy tất cả đều mang kháng nguyên F1 Quá trình tổng hợp và tiết kháng nguyên F1 được mã hóa bởi operon F1 trên plasmid pMT1, bao gồm các gen caf1, caf1M, caf1A và caf1R, trong đó caf1 mã hóa kháng nguyên F1, còn caf1M và caf1A tham gia cấu trúc và tiết protein ra ngoài tế bào, và caf1R điều hòa phiên mã Kháng nguyên F1 có cấu trúc là chuỗi polypeptide, kích thước 17 - 17,6 kDa, với điểm đẳng điện 4,1 - 4,4, là protein kị nước với cấu trúc bậc hai gấp nếp β Khi nuôi cấy ở 37 độ C, kháng nguyên F1 được hình thành nhiều nhất trên bề mặt tế bào và dễ dàng hòa tan trong môi trường nuôi cấy.

Protein F1 có cấu trúc bậc 4 và tương tác kị nước, với cấu trúc bên trong dạng hàng rào không gian 3 nhịp và các lỗ thấm giống như màng sinh học hỗ trợ cho thành phần tế bào Kháng nguyên F1 có thành phần hóa học và cấu trúc đặc biệt, ít bị ảnh hưởng bởi các yếu tố hóa lý, bền với nhiệt độ lên đến 80-100 °C trong 15 phút, và chỉ bị phân hủy hoàn toàn khi nung ở 100 °C trong 1 giờ Nó có tính sinh miễn dịch, có khả năng chống lại thực bào của bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân, đồng thời kích thích sản xuất kháng thể chống nhiễm trùng ở động vật.

25 tính chất quan trọng khác nữa đã được Janssen và Sunrgalla nhấn mạnh là kháng nguyên F1 trợ giúp cho Y pestis trốn được thực bào [8]

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng kháng nguyên F1 có mặt trong mô động vật và huyết thanh của bệnh nhân dương tính với dịch hạch Kỹ thuật miễn dịch được áp dụng để phát hiện kháng nguyên F1 ở bệnh nhân nghi ngờ mắc dịch hạch, cho kết quả xác định 100% các ca nhiễm bệnh thông qua mẫu hạch, huyết thanh và nước tiểu Vì vậy, kháng nguyên F1 đã trở thành công cụ quan trọng trong chẩn đoán huyết thanh bệnh dịch hạch.

I.5.2 Tính chất của kháng nguyên nang F1

Kháng nguyên F1 được nghiên cứu trong các thí nghiệm tiếp theo là kháng nguyên F1 tái tổ hợp kết hợp với MBP và kháng nguyên F1 tinh sạch từ chủng Y.pestis tự nhiên.

Các phương pháp phân tích chẩn đoán kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn Y.pestis

Để phát hiện kháng nguyên F1, các phương pháp chính thường được áp dụng bao gồm phương pháp sinh học phân tử và phương pháp miễn dịch, trong đó ELISA và sắc ký miễn dịch kẹp đôi là những kỹ thuật phổ biến nhất.

I.6.1.1 Phương pháp ELISA kẹp đôi (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Sandwich)

Phương pháp này dựa trên sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể bắt cặp có thể là đơn dòng hoặc đa dòng, còn kháng thể phát hiện thường là đơn dòng Nguyên lý của phương pháp bao gồm hai bước chính: đầu tiên, gắn kháng thể bắt cặp lên giếng; tiếp theo, bổ sung mẫu để kháng nguyên liên kết với kháng thể bắt cặp.

(3) bổ sung kháng thể phát hiện (kháng thể phát hiện sẽ liên kết với kháng nguyên);

Bổ sung kháng thể cấp hai liên kết với enzym giúp phát hiện kháng thể một cách hiệu quả hơn Đồng thời, việc bổ sung cơ chất cũng rất quan trọng, vì nó chuyển hóa thành dạng có thể phát hiện nhờ vào enzym.

Phương pháp ELISA kẹp đôi được sử dụng phổ biến để phát hiện kháng thể kháng F1 trong huyết thanh và các dịch tiết như nước bọt, nước tiểu, nhờ vào sự xuất hiện màu sắc cho thấy phản ứng giữa kháng thể và kháng nguyên Phương pháp này có độ nhạy cao, với khả năng phát hiện nồng độ kháng thể tối thiểu là 4 ng/ml, đạt 90,1% đối với huyết thanh và 100% với dịch tiết ELISA kẹp đôi rất hiệu quả cho việc chẩn đoán sớm bệnh dịch hạch Tuy nhiên, phương pháp này yêu cầu trang thiết bị và kỹ thuật cao, dẫn đến việc chỉ phù hợp cho phân tích trong phòng thí nghiệm, không thể áp dụng tại hiện trường.

I.6.1.2 Sắc ký miễn dịch kẹp đôi

Phương pháp sắc ký miễn dịch (immunochromatographic assay - ICA) dựa trên nguyên lý kết hợp kháng nguyên - kháng thể, trong đó một trong hai thành phần được gắn cộng hợp để phát hiện thành phần kia Phương pháp này, phát triển từ năm 1956, đã trở nên nhanh chóng và dễ thực hiện Trong 20 năm qua, nhờ ứng dụng công nghệ kháng thể đơn dòng và cải tiến nguyên liệu, như việc sử dụng hạt nano kim loại, ICA đã được ứng dụng để chế tạo nhiều sinh phẩm chẩn đoán các tác nhân gây bệnh khác nhau, bao gồm độc tố và vi sinh vật gây bệnh Sắc ký miễn dịch nổi bật với tính đơn giản, thời gian thực hiện nhanh, kết quả chính xác, giá thành rẻ, và khả năng sử dụng như một phương tiện lưu động mà không cần thiết bị phức tạp.

27 nguyên hoặc kháng thể Nguyên lý ứng dụng ICT sử dụng kháng thể phát hiện kháng nguyên được trình bày ở Hình 1.7

Hình 1.7 Mô hình lắp ráp các thành phần của bộ kit ICT(I) và đánh giá kết quả (II)

(Nguồn: Cortez Diagnostics, Inc.tại: http://www.rapidtest.com/) (Theo Nguyễn Đình Phúc và Lê Thanh Hòa, 2008) + Về thứ tự sắp xếp lắp ráp

Bộ sinh phẩm bao gồm các thành phần chính như tấm nhận mẫu, tấm cộng hợp, vạch phát hiện T, vạch đối chứng C, tấm hút mẫu, màng nitrocellulose và khung đỡ bao bọc Màng nitrocellulose kết nối tấm cộng hợp với tấm hút mẫu, cho phép các phân tử vật chất di chuyển theo nguyên lý mao dẫn Trên màng này có vạch phát hiện T và vạch đối chứng C Cuối bộ kit có tấm hút để thu thập huyễn dịch khi hoạt động Tất cả được bao bọc trong một khung nhựa, với giếng tra mẫu và cửa sổ hình chữ nhật để đánh giá kết quả tại vạch T và C.

+ Về thành phần tham gia

Có 3 loại kháng thể: 1) Kháng thể 1 (KT1) là kháng thể đơn dòng kháng lại với một epitopecủa kháng nguyên cần phát hiện, sản xuất trên chuột; 2) Kháng thể

2 (KT2) là kháng thể với một epitope khác của cùng kháng nguyên cần phát hiện;

3) Kháng thể 3 (KT3) là kháng thể kháng lại IgG của loài sinh KT1, có khả năng kết hợp với bất kỳ kháng thể nào có bản chất cấu trúc là immunoglobulin IgG Ngoài ra, thành phần tham gia kit còn có vật chất cộng hợp (conjugate), đó là hạt vàng (colloidal gold particle), được gắn vào với cấu trúc KT1 Tấm nhận mẫu được xếp gối lên trên tấm cộng hợp, rồi tấm cộng hợp được xếp chồng dính với màng nitrocellulose, tại tấm cộng hợp bố trí một lượng KT1 gắn cộng hợp với hạt vàng ở dạng khô; tại vạch T bố trí cố định KT2 ở dạng khô; và tại vạch C cũng được bố trí cố định KT3 cũng ở dạng khô, bình thường cả hai vạch này đều không nhìn thấy được (Hình 1.7-I)

+ Về nguyên tắc hoạt động của phép thử và đánh giá kết quả

Mẫu phân tích được xử lý bằng dịch chiết phù hợp và được nhỏ vào giếng S trên tấm nhận mẫu Huyễn dịch sẽ di chuyển theo mao dẫn qua tấm cộng hợp đến vạch T và vạch C, hướng về tấm hút mẫu Có hai trường hợp kết quả xảy ra: Nếu mẫu bệnh phẩm có kháng nguyên tương ứng, huyễn dịch sẽ tạo môi trường cho KT1 kết hợp với hạt vàng (KT1(Au)), hình thành phức hợp KT1(Au)+KN Phức hợp này sẽ tiếp tục di chuyển đến vạch T, nơi nó kết hợp với KT2 để tạo thành phức hợp KT1(Au)+KN+KT2 KT2 tại vạch T sẽ bắt giữ kháng nguyên, dẫn đến sự tích tụ của hạt vàng cộng hợp với KT1 và hiển thị kết quả Các phân tử KT1(Au) còn lại sẽ tiếp tục di chuyển đến vạch.

C, tại đây, phức hợp KT3+KT1(Au) được hình thành do sự kết hợp giữa KT3 là kháng thể kháng lại IgG của chuột với KT1 có bản chất là IgG của chuột Hạt vàng cộng hợp với KT1 cũng được tích tụ lại và hiển thị, về nguyên tắc, sự hiển thị này

Trong quá trình xét nghiệm, dù mẫu bệnh phẩm có chứa kháng nguyên hay không, huyễn dịch dung môi vẫn kích hoạt kháng thể KT1 cộng hợp vàng (KT1(Au)) Nếu không có kháng nguyên tương ứng, phức hợp KN+KT1(Au) sẽ không hình thành, dẫn đến KT1(Au) di chuyển qua vạch T mà không bị KT2 bắt giữ, tiếp tục đến vạch C Tại đây, phức hợp KT3+KT1(Au) được hình thành nhờ sự kết hợp giữa KT3, kháng thể chống IgG chuột, và KT1, đóng vai trò như kháng nguyên Kết quả là hạt vàng cộng hợp với KT1 sẽ tích tụ lại và hiển thị rõ ràng.

Khi cả hai vạch T và C hiển thị, kết quả đánh giá là dương tính, cho thấy kháng nguyên có mặt trong mẫu bệnh phẩm Nếu chỉ có vạch C hiển thị, kết quả là âm tính, nghĩa là không có kháng nguyên trong mẫu Trong trường hợp không có vạch nào hiển thị, phản ứng không được đánh giá và cần thực hiện lại Cần lưu ý không để phản ứng quá 30 phút trước khi đánh giá, vì điều này có thể dẫn đến phản ứng phụ và làm sai lệch kết quả.

Thời gian thực hiện phản tích với bộ sinh phẩm ICT chỉ mất từ 5-30 phút, đảm bảo độ chính xác trong việc phát hiện cả kháng nguyên hòa tan (polypeptide) và kháng nguyên bề mặt của vi sinh vật Vì vậy, bộ sinh phẩm ICT được xem là công cụ hiệu quả cho chẩn đoán sàng lọc các bệnh truyền nhiễm cũng như phát hiện độc tố hóa chất và hóa dược.

Phương pháp sắc ký miễn dịch nổi bật với thời gian phân tích ngắn, chi phí thấp và quy trình thử nghiệm đơn giản, không yêu cầu kỹ thuật cao và thể tích mẫu lớn, làm cho nó trở thành công cụ hữu hiệu cho phân tích nhanh tại hiện trường hoặc sàng lọc số lượng mẫu lớn Tuy nhiên, phương pháp này vẫn có nhược điểm như độ nhạy thấp hơn so với các phương pháp sắc ký dụng cụ hay ELISA, khả năng phản ứng chéo với các độc tố tương tự và có thể xảy ra hiện tượng âm tính hoặc dương tính giả.

Nghiên cứu đầu tiên về que thử nhanh phát hiện kháng nguyên F1 được công bố trên tạp chí Lancet vào năm 2003, sử dụng hai kháng thể đơn dòng từ chuột, cho phép phát hiện F1 với ngưỡng thấp 0,5 ng/ml trong 15 phút Năm 2015, Tsui và đồng tác giả đã áp dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch kẹp đôi với hai kháng thể đa dòng từ thỏ, nhưng ngưỡng phát hiện F1 chỉ đạt 50 ng/ml tương ứng với 10^5 CFU/ml của Y pestis Hiện nay, trên thị trường có các sinh phẩm như BADD Plague (Y pestis) Biowarfare Detection Test Kit của AdVnt Biotechnologies, với ngưỡng phát hiện 10^5 CFU/ml.

Các bộ sinh phẩm phát hiện tác nhân vũ khí sinh học hiện có trên thị trường như Plague BioDetect™ Test Strips của Alexeter Technologies (257 USD/10 test), IMASS của BBI (1200 USD/10 test, ngưỡng phát hiện 10^8 CFU/ml), và BioThreat Alert® Test Strips của Tetracore (605 USD/25 test, ngưỡng phát hiện 10^5-6 CFU/ml) đều có giá thành cao và ngưỡng phát hiện trung bình so với nghiên cứu của Chanteau và đồng tác giả (2003).

I.6.2 Phương pháp sinh học phân tử

Sản xuất kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng

Kháng thể IgY, hay còn gọi là Yolk Immunoglobulin, là loại kháng thể chủ yếu trong máu của chim, bò sát và cá có mang, đồng thời có hàm lượng cao trong lòng đỏ trứng gà Giống như các loại kháng thể khác, IgY là một lớp protein được hình thành bởi hệ miễn dịch để phản ứng với các yếu tố bên ngoài và có tính đặc hiệu với những yếu tố đó.

I.7.2 Sự hình thành kháng thể IgY ở gà

Kháng thể IgY được chuyển từ máu gà mẹ vào lòng đỏ trứng, tạo thành cơ chế miễn dịch thụ động để bảo vệ phôi và gà con Quá trình này diễn ra qua hai bước: đầu tiên, IgY được vận chuyển từ máu gà mái vào lòng đỏ trứng, tương tự như IgG ở động vật có vú; sau đó, IgY được chuyển từ lòng đỏ sang phôi trong quá trình phát triển của phôi gà.

Hình 1.8: Quá trình chuyển IgY vào lòng đỏ trứng

I.7.3 Cấu trúc của kháng thể IgY

Kháng thể IgY có cấu trúc tương tự như kháng thể IgG ở động vật có vú, bao gồm hai chuỗi nặng H và hai chuỗi nhẹ L được kết nối bằng cầu nối disulfua (-S-S-) Sự khác biệt chính giữa hai loại kháng thể này nằm ở chuỗi nặng, trong đó kháng thể IgY có khối lượng phân tử khoảng 65 kDa, lớn hơn đáng kể so với IgG Chuỗi nhẹ của IgY có khối lượng mole khoảng 25 kDa, dẫn đến trọng lượng phân tử tổng thể của IgY.

Kháng thể IgY có trọng lượng phân tử 180 kDa, lớn hơn so với IgG của động vật có vú (150 kDa), nhờ vào sự hiện diện của một tiểu phần cố định và chuỗi carbohydrate Vùng bản lề của IgY ít linh hoạt hơn so với IgG, và cấu trúc protein của IgY chứa nhiều thành phần kị nước hơn Điểm đẳng điện của IgY nằm trong khoảng pH 5,7 – 7,6, trong khi IgG là 6,1 – 8,5 IgY không tương tác với bổ thể và không gắn kết với các vùng cố định của kháng thể động vật cũng như các thụ thể bổ thể, đồng thời không phản ứng với protein A, protein G hay yếu tố thấp khớp, do đó tránh được kết quả phản ứng giả thường gặp với kháng thể IgG.

Hình 1.9: Cấu tạo kháng thể IgG và IgY

Sản xuất kháng thể đơn dòng từ chuột thuần chủng BALB/c

I.8.1 Khái niệm, ứng dụng của kháng thể đơn dòng

Kháng thể đơn dòng là loại kháng thể được sản xuất từ một dòng tế bào lympho B, có tính đặc hiệu và đồng nhất về cấu trúc cũng như tính chất Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng sử dụng sự kết hợp giữa tế bào ung thư myeloma và tế bào lympho B của hệ miễn dịch Kháng thể đơn dòng có nhiều ứng dụng quan trọng trong y học và nghiên cứu.

Kháng thể đơn dòng đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu y sinh học cơ bản, chẩn đoán bệnh và điều trị các bệnh lý như nhiễm trùng và ung thư.

+ Ưu điểm của kháng thể đơn dòng (KTĐD):

- Là những chế phẩm tinh khiết có tính đặc hiệu cao đối với một yếu tố quyết định duy nhất của kháng nguyên

- Khả năng nhanh, nhạy cảm trong chẩn đoán bệnh

+ Nhược điểm của kháng thể đơn dòng (KTĐD):

Hệ thống miễn dịch của con người nhận diện kháng thể đơn dòng (KTĐD) được sản xuất từ tế bào B của chuột như là protein lạ, từ đó tạo ra các kháng thể chống lại chúng và làm giảm hiệu quả của KTĐD Thêm vào đó, một số KTĐD khi tiếp xúc và bám vào các kháng nguyên không có khả năng trung hòa hoặc tiêu diệt các kháng nguyên gây bệnh.

Thành phần kết hợp với KTĐD có thể bị tách ra và lan rộng trong cơ thể, dẫn đến các phản ứng phụ khó lường Hơn nữa, một số khối u được bao bọc bởi lớp mạch máu dày đặc, khiến cho KTĐD gặp khó khăn trong việc thâm nhập và tiêu diệt chúng.

Giá thành sản phẩm cao đã thúc đẩy các nhà khoa học nghiên cứu phương pháp đưa tế bào lympho B của người vào cơ thể chuột, nhằm tạo ra các kháng thể đơn dòng (KTĐD) hiệu quả hơn.

Hệ thống miễn dịch của bệnh nhân sẽ chấp nhận các kháng thể đơn dòng (KTĐD) như là của chính mình Nghiên cứu gần đây đã ứng dụng công nghệ gene và thay thế chuột bằng vi khuẩn để phát triển các KTĐD nhỏ hơn, hiệu quả hơn, có khả năng gắn kết chắc chắn với vật mang và thâm nhập vào khối u dễ dàng hơn, đồng thời giảm chi phí.

I.8.2 Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng

Năm 1975, hai nhà khoa học Kohler và Milstein đã phát triển kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng ngoài cơ thể người thông qua việc lai tế bào u tủy (Myeloma) với tế bào lympho B đã hoạt hóa Vào năm 1985, kỹ thuật này đã được cải biên bởi các tác giả Karsten và Rudolph, dẫn đến quy trình và công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng hiện đại.

Hình 1.10: Qui trình sản xuất kháng thể đơn dòng

Nguyên lý sản xuất kháng thể đơn dòng (mAb) theo Kohler – Milstein (1975) bao gồm hai bước chính: đầu tiên, tạo dòng tế bào hybridoma bằng cách kết hợp tế bào lympho B với tế bào u tủy myeloma; sau đó, nhân các tế bào lai để phát triển thành dòng tế bào có khả năng sản xuất kháng thể đơn dòng mong muốn.

Tạo dòng tế bào lại hybridoma thực hiện qua các bước sau:

Bước 1: Gây kích ứng miễn dịch cho thú, thường là chuột BALB/c thuần chủng 3 tuần tuổi

Bước 2: Sàng lọc chuột để sản xuất kháng thể

Sau vài tuần gây miễn dịch, kháng thể trong huyết thanh của chuột được định lượng bằng các kỹ thuật như ELISA hoặc đếm dòng tế bào Nếu hiệu giá kháng thể cao, có thể tiến hành dung hợp tế bào; nếu thấp, cần thực hiện các phản ứng mạnh để nâng cao hiệu giá, chẳng hạn như lấy mẫu máu nhiều lần Khi đạt hiệu giá đủ cao, chuột sẽ được tiêm kháng nguyên mà không có chất bổ trợ hoặc tiêm vào tĩnh mạch đuôi 3 ngày trước khi dung hợp, sau 2 tuần từ lần gây miễn dịch trước Cuối cùng, chuột sẽ được gây chết để tách lá lách, từ đó sản xuất tế bào hybridoma trong ống nghiệm.

Bước 3: Chuẩn bị các tế bào myeloma

Tế bào lá lách sản xuất các tế bào dung hợp có tuổi thọ hạn chế, trong khi các tế bào myeloma bất tử từ khối u lympho (u tủy) tạo ra hybridoma với khả năng tăng trưởng không giới hạn Các tế bào myeloma được nuôi cấy với 8-azaguanine để đảm bảo độ nhạy với môi trường HAT, nơi chỉ các tế bào dung hợp mới tồn tại Sau một tuần sau khi dung hợp, tế bào myeloma cần có tính khả thi cao và tăng trưởng nhanh chóng trong môi trường này.

Bước 4: Dung hợp tế bào myeloma với tế bào lá lách (tế bào lympho B)

Tế bào lá lách đơn thu được từ chuột gây miễn dịch được dung hợp với tế bào myeloma thông qua quá trình đồng ly tâm trong polyethylene glycol, chất có khả năng làm dung hợp màng tế bào Chỉ các tế bào dung hợp mới phát triển trong môi trường chọn lọc đặc biệt Sau đó, các tế bào này được chia vào 96 giếng với các feeder cell từ màng bụng chuột, cung cấp yếu tố cần thiết cho sự phát triển của tế bào hybridoma Các chế phẩm thương mại thu được từ việc sưu tầm môi trường hỗ trợ nuôi cấy tế bào, chứa các yếu tố tăng trưởng cần thiết.

36 trưởng có thể thay thế cho các tế bào nguồn gốc từ chuột Bên cạnh đó, tủy xương chuột tách từ tiểu thực bào cũng có thể được sử dụng làm tế bào hỗ trợ.

Bước 5: Tạo dòng tế bào hybridoma thông qua "dung dịch pha loãng" hoặc nhân rộng và ổn định sản phẩm Trong bước này, các cụm tế bào hybridoma từ 96 giếng có thể phát triển trong nuôi cấy mô tế bào bằng kháng nguyên hoặc qua phương pháp cổ chướng ở chuột, với việc nhân dòng sau đó Việc sử dụng "dung dịch pha loãng" đảm bảo mỗi giếng chứa ít nhất một dòng đơn Tuy nhiên, một số kháng thể có thể tiết ra chất độc hại cho tế bào yếu trong ống nghiệm Tối ưu hóa phương pháp cổ chướng ở chuột trong giai đoạn này giúp cứu sống tế bào Kinh nghiệm cho thấy giai đoạn đầu phát triển tế bào theo phương pháp chuột cổ chướng, sau đó chuyển sang điều kiện cơ thể hoặc phòng thí nghiệm, sẽ cải thiện khả năng chịu đựng và tối ưu hóa quy trình sản xuất kháng thể.

Nhân các tế bào lai phát triển để tạo thành dòng tế bàolai hybridoma:

Có hai phương pháp chính để phát triển các tế bào lai: Thứ nhất, tiêm tế bào hybridoma vào khoang màng bụng của chuột, cho phép chúng nhân lên và sản xuất dịch lỏng chứa nồng độ cao kháng thể Phương pháp này rẻ tiền, dễ thực hiện nhưng có thể gây đau đớn cho chuột nếu tích tụ quá nhiều dịch hoặc nếu hybridoma là bệnh ung thư độc Thứ hai, sử dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào in vitro, đây là giải pháp thay thế giúp gia tăng số lượng tế bào hybridoma trong môi trường nuôi cấy, mặc dù yêu cầu kiến thức chuyên môn và thiết bị đặc biệt, có thể tốn kém và mất thời gian Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây cho thấy kỹ thuật nuôi cấy tế bào in vitro có thể tiết kiệm chi phí, nhanh hơn và sản xuất kháng thể với nồng độ cao hơn so với các phương pháp truyền thống.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu nghiên cứu

II.1.1 Động vật thí nghiệm

Gà siêu trứng Ai Cập được cung cấp bởi Trang trại Gà giống Thụy Phương tại Long Biên, Hà Nội, cùng với chuột BALB/c thuần chủng và tế bào Myeloma Sp2/0 do Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam cung cấp.

II.1.2 Hóa chất và vật tư tiêu hao

BSA (bovine serum albumin) từ Sigma được sử dụng cùng với các loại độc tố F1 gắn MBP, bao gồm F1 tự nhiên và F1 thương mại Các hóa chất cần thiết để tạo cộng hợp bao gồm kháng thể đơn dòng G20 và 3YP8, cùng với nano vàng 40 nm từ Cytodiagnostics Các dung dịch đệm sử dụng là NaHCO3 0,1M pH 9,6, Borat 0,1M pH 8,5 và PBS 0,01M pH 7,5 Trong các thí nghiệm ELISA, các loại kháng thể và hóa chất quan trọng bao gồm kháng thể phát hiện kháng IgY gắn HRP từ Santa Cruz Biotechnology, cơ chất tetramethylbenzidine (TMB) từ Promega, và kháng thể phát hiện Ig Ngoài ra, tá dược tiêm FCA (Freund’s complete adjuvant) và FIA (Freund’s incomplete adjuvant) cũng được cung cấp bởi Sigma.

Essential laboratory tools and consumables include 0.5ml 10 kDa dialysis membranes from Thermo Scientific, 100 kDa ultrafiltration columns from Ultracell by Millipore, high-binding ELISA microplates from Costa, nitrocellulose membranes from Whatman, plastic vinyl backing sheets from Whatman, Whatman blotting paper, and gold nanoparticles from Cytodiagnostics.

Trung tâm nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội sử dụng nhiều thiết bị hiện đại phục vụ cho nghiên cứu, bao gồm: cân kỹ thuật, cân phân tích CPA 324S, máy Vortex Delta Mixer, máy ly tâm C1301B-230V, micropipet các loại, máy đo pH, hệ thống in phun que thử CAMAG-AUTOKUN, máy hút ẩm, máy đo nanodrop, lò lai phân tử, hệ thống đọc khay vi thể, tủ lạnh sâu -20°C, tủ lạnh Heracus 4°C và máy ly tâm Solval.

Phương pháp nghiên cứu

II.2.1 Sản xuất kháng thể đa dòng IgY kháng F1

II.2.1.1 Tiêm Protein F1 tự nhiên gây đáp ứng miễn dịch trên gà

Gà được nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm ổn định trong khoảng 2 tuần trước khi tiêm để kích thích đáp ứng miễn dịch Trong thời gian này, các quả trứng thu được là trứng âm tính, không có khả năng đáp ứng miễn dịch với F1 Sau đó, gà đang trong thời kỳ đẻ trứng sẽ được tiêm F1 tại hai vị trí trên ức với liều 0,2 mg trong tổng thể tích 1 ml chứa 50% tá dược FCA Tỉ lệ thể tích dịch trong PBS và FCA là 3:1 Sau 20 ngày, gà được tiêm nhắc lại lần thứ nhất với liều 0,1 mg F1 trong tổng thể tích 1 ml chứa 50% tá dược FIA Tiếp tục, sau 15 ngày, gà sẽ được tiêm nhắc lại lần thứ hai với liều lượng tương tự Trứng gà không tiêm và trứng gà tiêm PBS cùng với tá dược FCA/FIA sẽ được thu thập và bảo quản ở điều kiện 4°C.

II.2.1.2 Tinh sạch IgY bằng phương pháp tủa PEG

Kháng thể IgY trong trứng gà được tách theo phương pháp kết tủa PEG

Lòng đỏ trứng sau khi tách khỏi lòng trắng được trộn với PBS và 3,5% PEG 6000, ủ ở 37°C trong 10 phút, sau đó ly tâm ở 8000×g trong 20 phút để loại bỏ cặn chất béo Dịch nổi được lọc qua giấy thấm, bổ sung 8,5% PEG 6000, ủ và ly tâm tương tự để kết tủa IgY Kết tủa IgY sau đó hòa tan trong PBS với 12% PEG 6000, ủ và ly tâm lại để thu được IgY Cuối cùng, kết tủa được hòa tan trong PBS và siêu lọc ba lần bằng cột 100 kDa để thu nhận chế phẩm IgY tinh sạch.

39 được định lượng bằng cách đo OD ở bước sóng 280 nm và được kiểm tra độ tinh sạch bằng điện di SDS-PAGE (12%) theo phương pháp của Laemmli

II.2.1.3 Đánh giá hiệu giá kháng thể của chế phẩm IgY từ lòng đỏ trứng

A, Tạo kháng nguyên nang F1-MBP (Maltose binding protein)

Kháng nguyên F1-MBP, được tạo ra từ gene Caf1 thông qua phương pháp tái tổ hợp, được sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng ELISA nhằm đánh giá hiệu giá kháng thể của chế phẩm IgY Protein F1 được nối với vectơ pET22 để tạo thành protein dung hợp MBP-F1-(His)10, với đuôi ái lực (His)10 giúp tinh sạch qua sắc ký ái lực gắn Ni Nghiên cứu này được thực hiện trong đồ án tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Văn Khanh, người đã thành công trong việc sản xuất kháng nguyên này Trước khi tiêm cho gà, chúng tôi kiểm tra độ tinh sạch của kháng nguyên bằng phương pháp điện di biến tính protein SDS-PAGE trên gel polyacrylamide nồng độ 12%.

Phương pháp điện di protein Đổ gel: Lắp 2 phần bản kính vào giá đỡ, bổ sung nước vào giữa 2 bản kính để kiểm tra độ dò nước

Nếu phát hiện nước bị dò ra từ hai phần bản kính, hãy điều chỉnh lại cho đến khi không còn hiện tượng dò nước Khi không còn dò nước, hãy loại bỏ nước và tiến hành đổ gel.

Sau khi hòa trộn các hóa chất của gel tách bằng pipet một cách nhẹ nhàng, hãy nhả dung dịch gel vào giữa hai phần bản kính với khoảng cách 1cm so với lược Tiếp theo, bổ sung nước deion vào phần trống của bản kính và chờ cho gel tách khô Sau khi gel khô, loại bỏ nước deion và tiến hành đổ gel cô, sau đó đặt lược thích hợp vào giữa hai phần bản kính với khe hở để nhả dung dịch vào.

Để tạo gel cô, cần hòa trộn các hóa chất thành phần một cách đồng nhất, sau đó đổ gel tương tự như khi đổ gel tách, cần chú ý tránh tạo bọt khí trong quá trình này Tiếp theo, đẩy lược sao cho khít với bản kính và chờ cho gel khô hoàn toàn.

Để thực hiện chạy điện di, đầu tiên lắp bản kính chứa gel đã đông vào khung điện di và gắn vào bể theo đúng chiều dòng điện Tiếp theo, đổ đầy Tank buffer vào giữa khung để kiểm tra xem có bị dò nước hay không; nếu có, cần điều chỉnh lại bản kính Cuối cùng, bổ sung Tank buffer vào bể điện di đến mức đã ghi chú trên thành bể.

Rỳt lược trên bản kớnh, bổ sung 15 mẫu đã được xử lý và 4 marker vào các giếng thích hợp Đậy nắp đúng chiều và tiến hành chạy điện di ở mức 15 mA (chạy 2 bản ở 25 mA) Để bắt đầu, bấm nút A để chạy bằng Ampe, điều chỉnh bằng nút mũi tên lên xuống, sau đó bấm nút RUN để tiến hành chạy điện di.

Sau khi mẫu được chạy qua gel cô và marker bắt đầu tách băng, tăng cường độ dòng điện lên 25 mA (với 2 bản ở 45 mA) cho đến khi băng màu xanh di chuyển xuống đáy bản gel Khi đó, bấm STOP và tắt máy để kết thúc quá trình điện di.

Tách bản gel khỏi bản kính và nhuộm bằng Staining buffer với lượng vừa đủ, tránh ánh sáng, lắc trong 12 phút Sau đó, đổ dịch nhuộm đã sử dụng vào chai chứa dịch nhuộm đã dùng.

Rửa bớt dịch nhuộm trên gel bằng nước máy, loại bỏ hết nước, bổ sung lượng Destaining vừa đủ, tránh sáng, lắc 20 phút

Loại bỏ dịch tẩy cũ và thay thế bằng dịch tẩy mới, sau đó tiếp tục lắc cho đến khi gel trở nên trong suốt và các băng protein trở nên rõ ràng.

Tiến hành phân tích và chụp lại hình ảnh kết quả

B, Phương pháp ELISA Xác định độ pha loãng kháng thể kháng IgY gắn enzym Horseradish peroxidase (HRP)

Chế phẩm IgY được cố định trên vi giếng, sau đó kháng thể phát hiện kháng IgY gắn enzym HRP được thêm vào để tạo phức hợp (IgY)-(Anti IgY gắn Enzym HRP) Cuối cùng, cơ chất TMB được đưa vào giếng, dẫn đến sự hình thành sản phẩm có màu Nguyên lý này cho thấy kháng thể IgY được cố định trên đĩa vi giếng một cách hiệu quả.

NaHCO3 0,1 M được ủ ở các nồng độ 10, 30, 100 àg/ml tại 37 oC trong 2 giờ với pH 9,5 Quá trình khử giếng được thực hiện tương tự như mục C Sau đó, mẫu được rửa 3 lần với 300 àl đệm rửa mỗi lần, và bổ sung 100 àl hợp chất không thể phát hiện kháng IgY gắn HRP với các nồng độ khảo sát là 1; 0,3; 0,1; 0,03 àg/100 àl, tương ứng với hệ số pha loãng 100 X.

300 X, 1000 X, 3000 X trong PBS có bổ sung BSA) và ủ trong 1 giờ ở 37 o C Tiếp theo, đĩa được rửa 5 lần với dung dịch rửa, và quá trình hiện màu được thực hiện như ở mục C

C, Phương pháp ELISA Xác định độ pha loãng kháng chế phẩm IgY

Kháng nguyên F1 được cố định trên giếng, sau đó IgY được đưa vào và phản ứng với kháng nguyên này Kháng thể phát hiện IgY gắn enzym HRP (Horseradish peroxidase) được thêm vào, và cơ chất TMB (Tetramethylbenzidine) được chuyển hóa bởi enzym HRP tạo ra sản phẩm có màu, phản ánh sự hiện diện của IgY đối với F1 Đĩa vi giếng (Costa) được phủ bằng 100 µl kháng nguyên F1-MBP trong đệm NaHCO3 0,1 M (10 µg/ml) và ủ ở 4°C, pH 9,5 Sau đó, các vị trí chưa liên kết được phủ bằng 300 µl dung dịch PBS chứa 2% BSA trong 2 giờ ở 37°C Giếng được rửa ba lần bằng 300 µl đệm rửa (PBS có 0,05% Tween 20) Để đánh giá hiệu giá của kháng thể IgY, 100 µl IgY ở các nồng độ pha loãng khác nhau được thêm vào mỗi giếng và ủ.

Sau khi rửa 5 lần với 300 µl đệm rửa và 100 µl hợp chất, không thể phát hiện kháng thể IgY gắn HRP (Santa Cruz Biotechnology) đã được pha loãng đến nồng độ thích hợp trong PBS có bổ sung BSA Dung dịch này được thêm vào mỗi giếng và ủ ở nhiệt độ 37 độ C trong 1 giờ.