Tuyển chọn chủng vi khuẩn bacillus subtilis có khả năng đối kháng nấm fusarium oxysporum

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM FUSARIUM OXYSPORUM

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG

⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS

CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM FUSARIUM OXYSPORUM

LÊ CHÍ QUỲNH ANH

Đà Nẵng, năm 2023

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG

⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS

CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM FUSARIUM OXYSPORUM

Ngành: Công nghệ sinh học Khóa: 2019-2023

Sinh viên: Lê Chí Quỳnh Anh Người hướng dẫn: TS Phạm Thị Mỹ

Đà Nẵng, năm 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan các dữ liệu trình bày trong khóa luận này hoàn toàn trung thực Đây

là kết quả nghiên cứu của tôi và giảng viên hướng dẫn chưa từng được công bố trong bất

kì công trình nào khác trước đây Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm nếu vi phạm bất kỳ quy định nào về đạo đức khoa học

Tên sinh viên

Lê Chí Quỳnh Anh

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp tại Khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng, tôi xin trân trọng trước sự quan tâm và tạo điều kiện giúp đỡ của các quý thầy cô Bộ môn Công nghệ sinh học đã hỗ trợ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài khóa luận của mình

Để hoàn thành được khoá luận tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc trước sự tâm huyết tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi và định hướng cho tôi là cô TS Phạm Thị Mỹ và cô ThS

Lê Thị Mai trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Cảm ơn các bạn 19CNSH và anh Bùi Đức Thắng đã luôn đồng hành cùng tôi, luôn

hỗ trợ và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Cuối cùng, tôi gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn động viên, khích lệ về vật chất lẫn tinh thần để tôi đạt được kết quả tốt nhất

Xin chân thành cảm ơn!

DANH MỤC BẢNG BIỂU

3.1 Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập được 19 3.2 Kết quả thử nghiệm sinh hóa của 5 chủng Bacillius spp 21 3.3 Khả năng đối kháng của Bacillus spp đối với nấm Fusarium

oxysporum

23 3.4 Đường kính vòng phân giải enzyme của Bacillus subtilis BS5 27

DANH MỤC HÌNH ẢNH

1.1 Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis dưới kính hiển vi (Wiki) 4

3.1 Hình thái khuẩn lạc và tế bào các các chủng Bacillus spp đã phân lập

được

20

3.7 Các chủng Bacillus spp đối kháng nấm Fusarium oxysporum 24

3.9 Kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng chủng vi khuẩn BS5 26

3.11 Vòng phân giải enzyem của Bacillus subtilis BS5 28

TÓM TẮT

Bệnh thối quả do nấm Fusarium oxysporum là một trong những bệnh gây thiệt hại

đến năng suất dẫn đến thiệt hại kinh tế và gặp nhiều khó khăn cho sản xuất và bảo quản xoài Biện pháp sử dụng vi sinh vật đối kháng để phòng trừ bệnh hại đang là xu hướng hiện nay do tính an toàn và hiệu quả của nó Trong số nhiều vi sinh vật đối kháng, các

chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis đã được nghiên cứu rất nhiều về khả năng

đối kháng với nấm gây bệnh Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu tuyển

chọn được chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh tại Việt Nam Phân lập và tuyển chọn được 5 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus spp có khả năng đối kháng với nấm Fusarium oxysporum, hiệu lực ức chế dao động từ

29,72% đến 57% Trong đó có chủng BS5 có khả năng kháng mạnh nhất với nấm

Fusarium oxysporum, đạt 57 % Kết quả định danh BS5 bằng việc giải trình tự gen 16S

rRNA cho thấy chủng này là Bacillus subtilis và chủng BS5 có khả năng sinh enzyme

protease và chitinase lần lượt là 36,67mm và 26,66mm

Từ khóa: Bacillus subtilis, Fusarium oxysporum, thối quả, đối kháng, định danh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN 1

LỜI CẢM ƠN 2

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 3

DANH MỤC BẢNG BIỂU 4

DANH MỤC HÌNH ẢNH 5

TÓM TẮT 6

MỤC LỤC 7

MỞ ĐẦU 9

1 Tính cấp thiết của đề tài 9

2 Mục tiêu đề tài 10

3 Ý nghĩa của đề tài 10

3.1 Ý nghĩa khoa học 10

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 10

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11

1.1 Khái quát chung về Bacillus Subtilis 11

1.1.1 Đặc điểm phân loại 11

1.1.2 Đặc điểm phân bố 11

1.1.3 Đặc điểm hình thái 12

1.2 Khái quát chung về Fusarium oxysporum 13

1.2.1 Đặc điểm phân loại 13

1.2.2 Đặc điểm hình thái 13

1.2.3 Đặc điểm sinh học nấm Fusarium oxysporum 14

1.3 Tình hình nghiên cứu đối kháng nấm Fusarium spp 16

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 16

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 18

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 20

2.2 Nội dung nghiên cứu 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu 20

2.3.2 Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus spp bản địa 21

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của Bacillus spp 21

2.3.4 Phương pháp tuyển chọn các chủng Bacillus spp có khả năng đối kháng mạnh với Fusarium oxysporum 23

2.3.5 Định danh chủng vi khuẩn Bacillus spp được tuyển chọn bằng kỹ thuật sinh học phân tử 23

2.3.6 Xây dựng đường cong sinh trưởng 24

2.3.7 Phương pháp xác định khả năng sinh enzyme protease và chitinase của Bacillus subtilis BS5 25

2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu 26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Phân lập vi khuẩn từ đất vùng rễ cây ăn quả 27

3.2 Xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn Bacillus spp phân lập được 28

3.3 Tuyển chọn các chủng Bacillus spp có khả năng đối kháng mạnh với Fusarium oxysporum 31

3.4 Định danh chủng vi khuẩn Bacillus spp được tuyển chọn bằng kỹ thuật sinh học phân tử 33

3.5 Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis BS5 34

3.6 Khảo sát khả năng sinh enzyme protease và chitinase của vi khuẩn Bacillus subtilis BS5 35

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

1 Kết luận 37

2 Kiến nghị 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC a

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Hiện nay, sản phẩm cây ăn quả nước ta được xuất khẩu hơn 60 quốc gia vùng lãnh thổ, trong đó 10 thị trường xuất khẩu chính là Trung Quốc, Nhật Bản, Mỹ, Nga, Hàn Quốc Do điều kiện sinh thái đa dạng cho nên trồng được nhiều loại khác nhau, qua thống kê cho thấy rằng hiện nay diện tích cây ăn quả cả nước ta ước tính có hơn 1,1 triệu

ha, năng suất bình quân ước đạt hơn 10 tấn/ha và tổng sản lượng đạt 11 triệu tấn/năm (Nguyên Phúc,2022) Với tiềm năng xuất khẩu các loại trái cây chủ lực của Việt Nam, việc đảm bảo chất lượng nông sản cần được ưu tiên hàng đầu Chính vì thế việc chăm sóc phòng trừ bệnh hại đối với các cây ăn quả là điều luôn cần phải quan tâm Tuy nhiên, việc trồng, sẩn xuất cây ăn quả ở nước ta vẫn còn gặp nhiều khó khăn, trở ngại do tính thời vụ cao, thời gian thu hoạch ngắn khiến sản phẩm cây ăn quả khó bảo quản, vận chuyển, dễ hư hỏng, tổn thương và dễ bị nhiễm các bệnh về nấm đặc biệt là nhiễm

Fusarium oxysporum gây nên hiện tượng thối quả ảnh hưởng đến năng suất cây trồng

Bệnh thối quả do nấm Fusarium oxysporum ảnh hưởng đến năng suất có thể dẫn

đến thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho người trồng Tại Pakistan, đã phân lập và xác định

mầm bệnh F oxysporum và Fusarium solani chịu trách nhiệm gây thối xoài sau thu hoạch Ngoài ra, các độc tố nấm mốc chính do nấm Fusarium spp sinh ra như

fumonisins, zearalenone và trichothecenes gây ảnh hưởng tới sức khỏe của con người

(Bakker, Matthew G,2018)

Với nền nông nghiệp sạch hiện nay, người dân luôn tiên sử dụng các chế phẩm sinh

học do tính đặc hiệu và an toàn của nó Và một trong những chủng tiềm năng đó, Bacillus

subtilis với những đặc điểm nổi bật về khả năng kháng khuẩn, kháng nấm bệnh cao đang

được quan tâm Với mong muốn tìm ra được các chủng Bacillus subtilis bản địa có hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh và tạo màng sinh học bảo quản nông sản

sau thu hoạch, để kéo dài thời gian bảo quản đồng thời duy trì chất lượng quả sau thu

hoạch chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng đối kháng nấm Fusarium oxysporum ”

Kết quả của nghiên cứu từ đề tài này cung cấp dẫn liệu khoa học mới về vi khuẩn

Bacillus subtilis phân lập được từ đất của các vườn tại tỉnh Quảng Nam, tạo cơ sở khoa

học cho các nghiên cứu tiếp theo

Cung cấp thêm một số thông tin, tài liệu cho quá trình học tập và nghiên cứu về lĩnh vực sinh học, công nghệ sinh học

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học cho việc ứng dụng sản xuất các màng

bioflim để kiểm soát nấm bệnh Fusarium oxysporum gây bệnh trên quả sau thu hoạch

nhằm góp phần nâng cao năng suất cây trồng, xây dựng một nền nông nghiệp sạch và bền vững

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát chung về Bacillus Subtilis

Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi Tổ chức y

học Nazi của Đức Lúc đầu, chủ yếu được sử dụng để phòng bệnh lý cho các bệnh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi

Việc sử dụng để điều trị bệnh phải đợi đến những năm 1949 - 1957 khi Henry,

Albot và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis Từ đó,

“subtilistherapie” có nghĩa là thuốc subtilin ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hoá

Ngày nay, vi khuẩn Bacillus subtilis trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi

trong chăn nuôi, y học, thực phẩm

1.1.1 Đặc điểm phân loại

Theo khóa phân loại của Bergey, vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc

Giới: Bacteria

Ngành: Fimicutes

Lớp: Bacilli Bộ: Bacilliales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Loài:Bacillus subtilis

1.1.2 Đặc điểm phân bố

Bacillus subtilis còn được gọi là trực khuẩn cỏ hoặc trực khuẩn rơm vì hay được tìm

thấy trong cỏ, rơm và cả đất Tuy nhiên chúng phát triển nhiều trong ống tiêu hóa của người và nhiều loài gia súc, nhất là động vật nhai lại, có lợi cho người nên cũng gọi là lợi

khuẩn subtilis Loài này được chú ý nhiều vì có lợi và là sinh vật mô hình trong nhiều

nghiên cứu khoa học, nhất là trong di truyền học, đồng thời cũng là đối tượng thuận lợi

để sản xuất một số loại protein cho con người trong công nghệ sinh học, giống như E

coli đã được dùng làm "công xưởng" sản xuất ra insulin và somatostatin trong kỹ thuật di

truyền

1.1.3 Đặc điểm hình thái

Bacillus subtilis là vi khuẩn nhỏ, hai đầu tròn , Gram dương, kích thước 0,5-0,8µm

x 1,8-3µm đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động 8-12 lông Sinh bào tử nhỏ hơn vi khuẩn và nằm giữa tế bào , kích thước 0,8 -1,8 µm Phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt bảo tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ (Tô Minh Châu, 2000)

Theo Bùi Thị Phi, 2007 thì một trong những đặc điểm quan trong nhất của Bacillus subtilis là khả năng sinh bào tử trong những điều kiện bất lợi như nhiệt độ tăng cao, môi trường dinh dưỡng cạn kiệt, khô hạn để vượt qua điều kiện bất lợi, nếu gặp điều kiện

thuận lợi bào tử Bacillus subtilis sẽ nảy mầm và phát triển như một tế bào mới với chu kỳ sống mới Bào tử Bacillus subtilis có hình bầu dục, phân bố không theo quy tắc chặt chẽ

nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm

Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis dưới kính hiển vi (Wiki)

Bào tử ở Bacillus subtilis không phải là hình thức sinh sản như ở nấm mà chúng là

dạng cấu trúc đặc biệt có tính kháng chuyên biệt giúp cho chủng loài lưu tồn tốt trong những điều kiện khó khăn của môi trường sống mà chúng còn có khả năng sống rất lâu

Nhiệt độ 100ºC bào tử của một số loài Bacillus spp có thể chịu đựng được từ 2,5 – 20

giờ Ngoài việc chịu đựng được nhiệt độ khô cao, bào tử có thể chịu được khô hạn cũng

như tác đọng của nhiều loại hóa chất cũng như các loại tia sáng (Phạm Hồng Sơn, Giáo trình vi sinh đại cương)

1.2 Khái quát chung về Fusarium oxysporum

1.2.1 Đặc điểm phân loại

Theo khóa phân loại của Bergey, nấm F oxysporum thuộc

Giới : Fungi

Chi: Fusarium,

Họ: Nectriaceae, Bộ: Hypocreales, Lớp: Ascomycetes, Ngành: Ascomycotina,

Loài: Fusarium oxysporum

1.2.2 Đặc điểm hình thái

Nấm Fusarium oxysporum có dạng bào tử lớn trong suốt, có nhiều vách ngăn, bào

tử có hình trăng khuyết, một đầu thắt lại hình bàn chân Dạng bào tử nhỏ, đơn hoặc đa

bào hình cầu hoặc hình bầu dục Một số loài Fusarium oxysporum có bào tử nhỏ, bào tử

hậu và quả thể hoặc không có bào tử hậu

Hình 1.1 Fusarium Oxysporum ( Trần Ngọc Hùng, 2020)

C.Booth năm 1977 – 1979 đã chú ý vào bản chất tế bào phân sinh mà tử đó sinh ra bào tử nhỏ, là trong những chỉ tiêu đầu tiên để phân loại nấm trên cơ sở đó ông cho rằng

nấm Fusarium oxysporum có số lượng 90 loài Sau này Burgess và công sự (1993) đã đưa ra cơ sở phân loại nấm Fusarium oxysporum gồm 7 chỉ tiêu như sau: Hình thành bào

tử lớn; hình thành bào tử nhỏ; hình dạng và kiểu bào tử nhỏ; kích thước của bào tử nhỏ;

sự có mặt hay không có mặt của bào tử hậu trên môi trường PGA; đường kính tản nấm trên môi trường PGA; hình thái tản nấm

Nấm Fusarium oxysporum ban đầu gồm hơn 100 loài được mô tả dựa trên kiểm

nghiệm về cấu trúc của ổ sinh bào tử lớn là thực vật Theo phân loại của WellenneperReikinh (1935), số loài sống còn 65 loài, 55 giống và 22 dạng Bằng phương pháp cấy truyền đơn bào tử dùng trong hệ thống phân loại của Snyder và Hanser đã bổ

sung về sự giống và khác nhau giữa các loài Fusarium oxysporum, Snyder và Hanser đã

đề nghị giảm số lượng xuống còn 9 loài

1.2.3 Đặc điểm sinh học nấm Fusarium oxysporum

Nấm Fusarium sp là một trong những loại nấm gây thiệt hại về kinh tế quan trọng nhất Nấm Fusarium sp thuộc lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes), giai đoạn sinh sản hữu tính là Gibberella thuộc lớp nấm nang (Ascomycetes) Sợi nấm phát triển mạnh, màu sắc

biển đổi từ màu trắng đến màu tím violet, tán nấm thường sinh sắc tố màu hồng đến màu tím đậm Bào tử lớn hình thành có kích thước ngắn trung bình hoặc dài, phần lớn có 3 vách ngăn mỏng, một đầu nhọn hoặc thon nhọn, một đầu hình bàn chân, bào tử nhỏ hình thành trên cành bào tử phân sinh đơn nhánh ngắn thường không có ngăn ngang, đôi khi

có một ngăn Hình dạng bào tử thay đổi từ hình ovan, hình elip hoặc hình quả thận Hậu bào tử thường hình thành hầu hết trên mẫu phân lập sau 3 - 6 tuần nuôi cấy trên bề mặt thạch của môi trường PGA (Burgess, Sazanne, Bullock, Gott, Backhouse, 1994)

Fusarium spp gồm nhiều loài khác nhau, có khả năng gây nhiều loại bệnh trên những

cây trồng khác nhau Có nhiều loài sản sinh ra độc tố có độc tính cao, có ảnh hưởng đến động vật sống hoang dã, thú nuôi và con người ( Marasas và ctv, 1984) Tuy nhiên, có

nhiều loài nấm Fusarium spp là nấm hoại sinh sống phổ biến trong đất (Burgess và

ctv,1994)

- Sự phân bố và gây hại

Các yếu tố khách quan làm tăng sự phát triển của nấm Fusarium spp là : bón phân

đạm quá nhiều, các yếu tố về hệ VSV có trong đất, ẩm độ của đất, nhiệt độ tối ưu cho

nấm Fusarium spp phát triển là 27 - 30° C, tối đa là 36 - 40° C và tối thiểu là 7-8 °C

nhưng nhiệt độ thích hợp cho sự xâm nhiễm là 35 °C ( Ou, 1985)

Nấm Fusarium spp gây nhiều bệnh trên cây trồng: Bệnh nghẽn mạch (héo), thối rễ, thối thân, thối hạt, thối trái Nấm Fusarium spp sống phổ biến trong đất, lưu tồn dưới

dạng bào tử áo hoặc khuẩn ty sống trên xác bã thực vật dư thừa hay những chất hữu cơ Một số loại tạo bào tử đính bay trong không khí đây là nguyên nhân gây ra những bệnh

trên thân, lá và bông ( Burgess và ctv, 1994) Các loài Fusarium spp sản sinh độc tố nấm

mốc đã được phân lập từ bệnh thối quả chuối và dứa, đây là báo cáo duy nhất về độc tố nấm mốc liên quan đến các loại cây ăn quả nhiệt đới chính Một số loài gây bệnh ảnh

hưởng đến cây ăn quả, bao gồm F proliferatum, F verticillioides, F ananatum và F

oxysporum, đã được tìm thấy để sản xuất fumonisins, moniliformin và beauvericin Độc

tố nấm mốc cũng đã được phát hiện trong quả dứa bị nhiễm bệnh tự nhiên Những phát hiện này cho thấy độc tố nấm mốc có thể đóng một vai trò trong sinh bệnh học thực vật, đặc biệt là trong quá trình nhiễm trùng và xâm chiếm vật chủ Ngoài ra còn có khả năng nhiễm độc tố nấm mốc trong mô trái cây Ô nhiễm trái cây do nấm mycotoxigenic có thể xảy ra trên đồng ruộng, trong hoặc sau khi thu hoạch, trong quá trình bảo quản, vận chuyển và tại điểm bán Theo nghiên cứu của Abdul Salam Mengal và ctv, 2016 điều tra

cho thấy hầu hết các vườn ươm xoài đều bị một số bệnh nặng như thối trái, héo Fusarium spp., dị tật, thán thư, đốm lá và cháy lá Trong số tất cả chúng, bệnh thối Fusarium spp

được tìm thấy là bệnh chiếm ưu thế nhất trong tất cả các vườn ươm

Fusarium spp gây bệnh thực vật có mặt rộng rãi trong môi trường và có thể gây

nhiễm trùng ở những người bị suy giảm miễn dịch (Nucci , 2018), điều này cho thấy cây

ăn quả bị nhiễm bệnh cũng có thể lây nhiễm cơ hội cho người nhạy cảm Triest và

Hendrickx, 2016 đưa ra giả thuyết rằng chuối bán trên thị trường bị nhiễm F musae có

nhiều khả năng lây nhiễm sang người nhạy cảm nhất Do đó, có khả năng các loại cây ăn

quả bị nhiễm Fusarium spp khác cũng có thể lây nhiễm sang người nhạy cảm Khả năng phân lập lâm sàng của Fusarium spp lây nhiễm ngô và Arabidopsis đã được chứng minh bởi Meza-Menchaca et al 2020, người đã chứng minh nhiễm Fusarium spp từ người

sang thực vật Nghiên cứu của Meza-Menchaca et al đã cung cấp thông tin liên quan đến

sự lây nhiễm của Fusarium spp giữa thực vật và con người

1.3 Tình hình nghiên cứu đối kháng nấm Fusarium spp

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Vào năm 2021 Yujing Jia và cộng sự đã nghiên cứu phân lập được chủng vi khuẩn

kháng F oxysporum phòng trừ bệnh đậu tương bằng phương pháp đối đầu mảng Một

trong những chủng phân lập được của chúng tôi có tên là chủng BS06 có hoạt tính cao

nhất, được xác định là Bacillus subtilis Nghiên cứu của họ cho thấy chủng BS06 có thể kiểm soát hiệu quả bệnh F oxysporum đậu tương và giảm đáng kể F oxysporum nhiễm

vào rễ cây đậu tương So với nghiệm thức đối chứng và carbendazim, nghiệm thức BS06

có sinh khối rễ, chiều cao cây, hàm lượng diệp lục lá, đường kính gốc và hiệu quả phòng trừ cao hơn Kết quả của họ đã chỉ ra rằng BS06 có thể bảo vệ rễ đậu tương một cách

hiệu quả (chủng BS06 có thể tạo ra các chất ức chế F oxysporum ), có khả năng hữu ích

cho việc trồng đậu tương

Theo nghiên cứu của A Russi và cộng sự (2022) mục tiêu của nghiên cứu này là

đánh giá khả năng đối kháng của chủng Bacillus subtilis F62 với F oxysporum in vitro

và in vivo, cũng như khả năng thúc đẩy tăng trưởng ở gốc ghép nho SO4 Trong thử

nghiệm in vitro, sự đối kháng bởi các hợp chất dễ bay hơi và khuếch tán của B subtilis F62 và sự ức chế sự nảy mầm của hạt trần của bốn loài Fusarium spp phân lập đã được

đánh giá Trong thử nghiệm in vivo, cành giâm và cây vi nhân giống SO4 được đưa vào

bốn nghiệm thức: đối chứng, Bac (cấy B subtilis F62), Fus (cấy F oxysporum) và Bac +

Fus Họ đã quan sát thấy rằng sự ức chế sự phát triển của sợi nấm xảy ra chủ yếu bởi các

hợp chất khuếch tán B subtilis F62 có tác động tích cực đến việc thúc đẩy tăng trưởng và kiểm soát sinh học đối với F oxysporum, làm giảm tần suất tái phân lập mầm bệnh ở

cành giâm (18,1%) và ở cây vi nhân giống (52,4%) Những kết quả này cho thấy khả

năng của B subtilis F62 trong việc nâng cấp sự phát triển của cây và hỗ trợ kiểm soát bệnh héo Fusarium ở gốc ghép nho SO4

Nghiên cứu của OM Adedire (2023) các chủng F oxysporum và Bacillus spp được

phân lập từ cây cà chua được thu thập từ 21 trang trại Khả năng ức chế của vi khuẩn nội sinh được xác định thông qua một thử nghiệm nuôi cấy kép, liên quan đến sáu vi khuẩn

nội sinh và carbendazim (thuốc diệt nấm), được thiết lập theo một thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên Sử dụng thang đánh giá từ 0–9, mức độ héo rũ nghiêm trọng nhất (6,67) và tỷ lệ mắc bệnh (39,30%) được quan sát thấy ở trang trại Akinware trong vùng nông nghiệp

Ibadan/Ibarapa của Bang Oyo Fusarium oxysporum IB3q gây ra các triệu chứng héo rũ,

thối quả nghiêm trọng, bao gồm nhiễm úa lá, hoại tử, đổi màu mạch máu và héo rũ trên các giống cà chua địa phương Alausa và Ibadan bị nhiễm bệnh Ba mươi chín

chủng Bacillus spp đã được phân lập từ các mô của cây cà chua khỏe mạnh Trong đó

có sáu vi khuẩn Bacillus spp được phân lập đã ức chế F oxysporum Trong đó chủng B

subtilis Og04 có vùng ức chế 19,43 mm đối với F oxysporum mạnh nhất so với các

chủng khác và gây ra sự phân hủy sợi nấm của mầm bệnh Chúng tạo ra các enzym phân hủy thành tế bào, với các hoạt động tương đối nằm trong khoảng từ 0,87 đến 5,04 Dựa

trên tiềm năng ức chế in vitro của chúng , B subtilis Og04 nên được triển khai như các biện pháp kiểm soát sinh học trong tương lai chống lại mầm bệnh Fusarium spp truyền qua hạt và bệnh héo rũ, thối quả Fusarium spp trên cà chua

B Yassir và cộng sự 2022, mục tiêu chính của nghiên cứu này là đánh giá khả năng

kháng nấm của ba chủng Bacillus subtilis (S2DSP-B2C-BM14) được phân lập từ đất nông nghiệp và được xác định bằng PCR 16S chống lại hai loại nấm Fusarium

oxysporum và Fusarium solani được phân lập từ cà chua bằng ba phương pháp khác nhau

trong ống nghiệm Trong cả hai chế độ đối đầu, ba vi khuẩn Bacillus subtilis

(S2DSP-B2C-BM14) thể hiện xu hướng đối kháng với hai loại nấm thực vật gây bệnh, trong đó

Fusarium oxysporum là hiệu quả nhất Chúng làm giảm đáng kể sự phát triển sợi nấm của

hai loại nấm được điều trị, với tỷ lệ ức chế đáng kể khác biệt đáng kể tùy thuộc vào thời

gian ủ, trong đó tỷ lệ ức chế đáng kể nhất đối với Fusarium oxysporium lần lượt là 85,43

± 00,62%, 84,42 ± 00,76% và 83,92 ± 1,60% sau 04 ngày ủ đối kháng gián tiếp Điều này chứng tỏ rằng cả ba loại vi khuẩn đều có thể tạo ra và thải ra các hợp chất dễ chống nấm Tỷ lệ ức chế sự phát triển sợi nấm của hai loại nấm gây bệnh thực vật thu được sau khi xử lý dựa trên chất nổi trên bề mặt tế bào của các môi trường nuôi cấy ở các độ tuổi khác nhau của từng loại vi khuẩn đối kháng, dao động từ 44,45 ± 6,31% và 70,15 ± 4,78%, đã khẳng định rằng các loại nấm đối kháng các hoạt động của vi khuẩn được sử dụng trong nghiên cứu này, như được tiết lộ trong các thử nghiệm đồng nuôi cấy, chủ yếu bắt nguồn từ các chất chuyển hóa thứ cấp có thể khuếch tán được Phân tích kính hiển vi

quang học đã tiết lộ rằng các phương pháp điều trị này, đặc biệt là phương pháp liên quan đến chủng S2DSP, gây ra những thay đổi đáng kể về hình thái tế bào của hai loại nấm được nghiên cứu, bao gồm cả sự phá vỡ thành tế bào sợi nấm Ba chủng vi khuẩn nghiên cứu đều có đặc tính đối kháng mạnh, cho thấy chúng có thể là tác nhân kiểm soát sinh học

hữu ích đối với bệnh héo rũ Fusarium spp cà chua trên đồng ruộng và sau thu hoạch

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Đặng Thanh Tuấn và cộng sự, 2019 , chủng Bacillus subtilis được sử dụng như là

một tác nhân sinh học phòng trừ nấm bệnh trên cây ớt rất hữu hiệu tại nhiều nước trên thế giới Trong nghiên cứu này, bằng phương pháp đối kháng trực tiếp trên đĩa thạch với ba

chủng nấm bệnh Fusarium oxysporum NB01, NB02 và NB03 (gây bệnh thối trái ớt) Kết quả cho thấy hai chủng Bacillus subtilis Ba02 và Ba36 cho hiệu quả đối kháng tốt với

NB01, NB02 và NB03 khi cấy đối kháng đồng thời Trong đó, chủng Ba02 được nuôi cấy lỏng và lắc 180-200 vòng/phút trong 48 giờ với môi trường chứa lactose 20 g/l, bột trùn Quế thủy phân 10 g/l KH2PO4 0,4 g/l và MgSO4.7H2O 0,2 g/l ở pH 7,5 và chủng Ba36 được nuôi cấy lỏng và lắc 180-200 vòng/phút trong 36 giờ với môi trường gồm glucose 45 g/l, pepton 12,5 g/l, và NH4H2PO4 1,5 g/l Chế phẩm thu được sau khi trộn canh trường với bột năng theo tỷ lệ 1:1,5 và sấy ở 45oC có tác dụng kích thích sự nảy mầm của hạt giống, hỗ trợ khả năng nảy mầm của hạt giống khi có sự hiện diện của nấm bệnh, giảm tỷ lệ chết của cây con, làm tăng sức sống và sức đề kháng cây trồng Quá

trình thử nghiệm bước đầu cho thấy có thể sản xuất được chế phẩm dạng bột từ Bacillus

subtilis để phòng trừ nấm bệnh

Nguyễn Thị Kim Cúc, 2014 Hiện nay, có khoảng hơn 80.000 loài nấm được biết có

khả năng gây bệnh cho cây trồng, trong đó F.oxysporum, F.solani, Phytophthora sp là

những loài gây thiệt hại lớn nhất, chúng có thể phá hủy toàn bộ vụ thu hoạch của các cây trồng quan trọng như: tiêu, cà phê, cà chua Cùng với sự phát triển nhanh chóng của khoa học và công nghệ, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu ứng dụng biện pháp sinh học để phòng chống dịch hại, sử dụng khả năng đối kháng của một số loại nấm,

vi khuẩn, xạ khuẩn để trừ bệnh hại cây trồng Trong nghiên cứu này, 37 chủng vi khuẩn

và 10 chủng xạ khuẩn được phân lập từ đất và rễ tiêu bị bệnh ở Quảng Trị và được đánh giá hoạt tính ức chế sinh trưởng một số nguồn bệnh nấm thực vật bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch Kết quả nhận được cho thấy 31 chủng vi khuẩn và 5 chủng xạ

khuẩn phân lập đối kháng nấm F.oxysporum, tất cả 37 chủng vi khuẩn và 2 chủng xạ khuẩn ức chế sinh trưởng của F.sonali, 10 chủng vi khuẩn và 6 chủng xạ khuẩn đối kháng với Phytophthora sp Đã định danh 5 chủng vi khuẩn và 2 chủng xạ khuẩn phân

lập có hoạt tính đối kháng cao nhất bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA hoặc

bằng KIT API đến các loài: Paenibacillus sp; Paenibacillus xylanilyticus; Bacillus

subtilis; Burkholderia cepacia; Pseudomonas luteola; Streptomyces diastatochromogenes; Streptomyces antimycoticus Đã tiến hành xác định hoạt tính đối kháng F.oxysporum in

vivo trong điều kiện phòng thí nghiệm trên mô hình cây cà chua của một số chủng tuyển chọn Kết quả nhận được cho thấy các chủng tuyển chọn không những có khả năng ức

chế sinh trưởng của F.oxysporum, mà còn kích thích sinh trưởng của cây cà chua trong

điều kiện phòng thí nghiệm

Trần Ngọc Hùng, 2021 đã nghiên cứu phân lập được ba chủng nấm Fusarium spp

có hoạt lực gây bệnh cao từ rễ cây rau cảo, cây dưa lưới và cà chua Trong đó, chủng nấm

Fusarium F03 gây bệnh thối dưa lưới bị ức chế mạnh bởi dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus vezelensis Dịch nuôi cấy trên môi trường PG sau 5 ngày có đường kính vòng kháng nấm

đạt 9mm và hiệu quả ổn định trong 6 tháng Làm giảm 66,7% tỷ lệ cây quả chết héo so với đối chứng ở thử nghiệm Hoạt chất kháng nấm thu được ở phương pháp tủa với ethanol 50% và thời gian kết tủa 60 phút cho hiệu quả kháng nấm không thay đổi so với dịch nuôi cấy gốc

Từ những nghiên cứu đã nêu trên cho thấy rằng chủng Bacillus subtilis có khả năng đối kháng hiệu quả nấm Fusarium oxysporum Các chất đối kháng và chiết xuất của nó

đều có hiệu quả trong việc kiểm soát mầm bệnh trên các loại cây và trái cây Trong số các biện pháp kiểm soát sinh học thay thế cho thuốc trừ sâu, diệt nấm được sử dụng để giảm thiểu tỷ lệ mắc bệnh và mức độ bệnh nghiêm trọng của thực vật, việc áp dụng các vi khuẩn đặc biệt là probiotic để giảm thiểu các tình trạng trên, an toàn với người sử dụng là điều rất hứa hẹn

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ các mẫu đất vùng rễ cây ăn quả

- Chủng nấm mốc Fusarium oxysporum được cung cấp bởi Viện công nghệ sinh

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus spp từ các mẫu đất vùng rễ cây ăn quả trên

địa bàn xã Điện Thọ, thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam

- Tuyển chọn các chủng Bacillus spp có khả năng đối kháng mạnh với Fusarium

oxysporum

- Nghiên cứu định danh chủng đã phân lập bằng phương pháp PCR và giải trình tự

- Khảo sát khả năng sinh enzyme protease và chitinase của chủng Bacillus subtilis

tuyển chọn được

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu

Mẫu đất xung quanh vùng rễ được thu thập ở độ sâu tối đa 20 cm (Lamsal et at.,

2012) từ thôn Phong Thử, xã Điện Thọ, thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam Mỗi vườn thu

7 điểm, trộn đều lại thành 1 mẫu chứa trong túi nilon vô trùng, bảo quản trong thùng mát

4oC và được vận chuyển về phòng thí nghiệm cho các thí nghiệm tiếp theo (Sun et al.,

2017)

2.3.2 Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus spp bản địa

Tiến hành phân lập:

- Cân 10g mẫu đất pha trong bình tam giác chứa 90ml nước cất vô trùng và được đồng nhất hóa trên máy lắc trong 10 phút Gia nhiệt 80oC trong 15 phút ở bể ủ nhiệt để loại trừ các tế bào sinh dưỡng và các tế bào không sinh bào tử

- Sau đó pha loãng đến các nồng độ khảo sát từ 106 ,107, 108 Hút 100uL dung dịch mẫu trải trên đĩa petri chứa môi trường LB và ủ ở 37oC Trong 24 đến 48 giờ, quan sát những khuẩn lạc có dạng tròn, rìa răng cưa không đều, trắng sữa có thể là chủng vi khuẩn

Bacillus subtilis

Tiến hành cấy thuần khiết giống

Các dạng khuẩn lạc vừa phân lập trên sẽ tiếp tục được làm thuần:

- Chọn các khuẩn lạc đặc trưng và tiếp tục cấy ria trên môi trường LB cho đến khi trên môi trường chỉ có một dạng khuẩn lạc đồng nhất Để xác định giống thuần khiết và

có thêm cơ sở khẳng định là vi khuẩn Bacillus spp Tiến hành quan sát dưới kính hiển

vi, nhuộm Gram và xác định các phản ứng test sinh - hóa

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của Bacillus spp

* Phương pháp nhuộm Gram

Các bước nhuộm Gram được tiến hành như sau:

- Làm tiêu bản vệt bôi mẫu cần nhuộm

- Cố định mẫu bằng ngọn lửa đèn cồn

- Nhuộm dung dịch crystal violet trong 30 giây, rửa nước, thấm khô

- Thêm dung dịch lugol 30 giây, rửa nhẹ nhàng với nước và rửa bằng cồn 3-5 giây, rửa lại bằng nước, thấm khô

- Nhuộm bổ sung fuchsin trong 30 giây, rửa lại bằng nước, thấm khô rồi mang đi quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính dầu 100x Ghi nhận khả năng bắt màu thuốc nhuộm, mô tả hình dạng tế bào Sau khi quan sát dưới kính hiển vi nếu thấy tiêu