Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm thượng hoàng (phellinus linteus)

Hoạt tính sinh học của dịch chiết cồn và nước nóng của sinh khối nấm Thượng hoàng PLUS nuôi cấy trên dòng tế bào ung thư vú BT474 và tế bào thận người HEK293.. Nấm Thượng hoàng là một lo

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

HOÀNG VÂN THANH

ĐỊNH DANH VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA NẤM THƯỢNG HOÀNG (PHELLINUS LINTEUS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2021

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

HOÀNG VÂN THANH

ĐỊNH DANH VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA NẤM THƯỢNG HOÀNG (PHELLINUS LINTEUS)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Minh Huyền

TS Hoàng Phú Hiệp

Thái Nguyên, năm 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những nội dung trong luận văn là kết quả nghiên cứu

của tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS Nguyễn Thị Minh Huyền và TS

Hoàng Phú Hiệp

Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết quả

sử dụng trong luận văn là trung thực và được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn

và nhóm nghiên cứu

XÁC NHẬN CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Tác giả

H Hoàng Vân Thanh

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS Nguyễn Thị Minh Huyền, cán bộ Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Cô đã luôn tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp

đỡ em, người đã chỉ bảo, dìu dắt em từ những ngày đầu cho đến khi hoàn thành luận văn

Em xin chân thành cảm ơn TS Hoàng Phú Hiệp, người thầy đã chỉ bảo cho em những kiến thức chuyên nghành, những kiến thức sâu rộng và ứng dụng thực tế để em ứng dụng vào quá trình thực hiện luận văn

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô và cán bộ trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm, Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ, truyền đạt cho

em những kinh nghiệm trong nghiên cứu và tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành tốt luận văn này

Em xin được cảm ơn đề tài cấp nhà nước mã số ĐT.04.18/CNSHCB đã cung cấp kinh phí thực hiện luận văn này Em xin gửi lòng biết ơn sâu nặng

và lớn lao nhất tới gia đình em, người thân của em, những người đã hy sinh cả vật chất và tinh thần cho em chỗ dựa vững chắc, sức mạnh và nguồn động viên to lớn

Thái Nguyên, tháng 9 năm 2021

Tác giả

Hoàng Vân Thanh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Nấm Thượng hoàng và giá trị dinh dưỡng của nấm Thượng hoàng 3

1.2 Thành phần hoá học và hoạt tính của nấm Thượng hoàng 5

1.3 Phân loại học phân tử nấm 9

Bảng 1.1 Trình tự các cặp mồi ITS phổ biến [4] 11

1.4 Những nghiên cứu về nấm Thượng hoàng hiện nay 12

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Vật liệu, địa điểm, thời gian nghiên cứu 16

2.1.1 Vật liệu 16

2.1.2 Hoá chất, thiết bị 16

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Thu thập và phân lập giống nấm Thượng hoàng 18

2.2.2 Cấy chuyển và nhân giống 18

2.2.3 Nghiên cứu phân loại nấm 19

2.2.4 Phương pháp xác định khả năng tiết enzyme ngoại bào của nấm Thượng hoàng 20

2.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến sự phát triển

của sợi nấm Thượng hoàng 21

2.2.6 Chiết bột sinh khối nấm Thượng hoàng 22

2.2.7 Thử nghiệm hoạt tính trên tế bào ung thư vú (BT474) và tế bào thận người (HEK293) 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Thu thập và định danh mẫu nấm Thượng hoàng bằng đoạn gen ITS 26

3.1.1 Thu thập mẫu nấm Thượng hoàng 26

3.1.2 Định danh mẫu nấm Thượng hoàng bằng đoạn gen ITS 28

3.2 Thu sinh khối nấm Thượng hoàng 30

3.2.1 Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng nấm Thượng hoàng PLUS 30

3.2.2 Xác định môi trường tối ưu cho nuôi cấy nấm Thượng hoàng 33

3.2.3 Tách chiết sinh khối nấm Thượng hoàng với cồn và nước nóng 38

3.3 Hoạt tính sinh học của dịch chiết cồn và nước nóng của sinh khối nấm Thượng hoàng PLUS nuôi cấy trên dòng tế bào ung thư vú BT474 và tế bào thận người HEK293 39

3.3.1 Ảnh hưởng của dịch chiết nấm Thượng hoàng đối với dòng tế bào ung thư vú BT474 39

3.3.2 Ảnh hưởng của dịch chiết nấm Thượng hoàng đối với dòng tế bào phôi thận người HEK 43

3.3.3 Đánh giá tác dụng của dịch chiết sinh khối nấm thượng hoàng lên tế bào BT 474 và HEK 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

Đối chứng Deoxyribonucleic acid Dullbecco Modified Eagle Medium Human embryonic kidney 293 Học liệu khoa học công nghệ Việt Nam Intelligent character recognition

Intergenic Spacer Internal Transcribed Spacer Mitogen – activated protein kinase Phellinus linteus

Peroxisome proliferator – activated receptors Ribonucleic acid

Reactive oxygen species Potato Dextrose Agar

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự phát triển sợi nấm 33

sinh khối nấm PL PLUS 33

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự phát triển sợi nấm 34

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của sợi nấm 35

trong môi trường lỏng 35

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của độ pH đến sự phát triển của sợi nấm 36

trong môi trường lỏng 36

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh khối nấm Thượng hoàng 38

Bảng 3.6 Kết quả chiết của quả thể nấm và sinh khối nấm bằng cồn và nước 39

Bảng 3.7 Kết quả đo độ hấp phụ của tế bào BT474 khi ủ với dịch chiết sinh khối nấm bằng cồn 40

Bảng 3.8 Kết quả đo độ hấp phụ của tế bào BT474 khi ủ với dịch chiết sinh khối nấm bằng nước nóng 42

Bảng 3.9 Kết quả đo độ hấp phụ của tế bào HEK293 khi ủ với dịch chiết sinh khối nấm bằng cồn 44

Bảng 3.10 Kết quả đo độ hấp phụ của tế bào HEK293 khi ủ với dịch chiết sinh khối nấm bằng nước nóng .46

Bảng 3.11 Kết quả đo độ hấp phụ của tế bào HEK293 và BT474 khi ủ với dịch chiết sinh khối nấm bằng cồn 48

Bảng 3.12 Kết quả đo độ hấp phụ của tế bào HEK293 và BT474 khi ủ với dịch chiết sinh khối nấm bằng nước nóng 50

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Nấm Phellinus linteus trong tự nhiên [55] 4

Hình 1.2 Cấu trúc của rDNA ở nấm Saccharomyces cerevisiae [10] 10

Hình 1.3 Các trình tự mồi thông thường để khuếch đại vùng gen ITS [4] 11

Hình 2.1: Lọc dịch nấm Thượng hoàng 22

Hình 2.2 Cấu trúc của MTS tetrazolium và sản phẩm formazan của nó [53] 24

Hình 2.3 Ảnh hưởng của số lượng tế bào đến độ hấp phụ tại bước sóng 490 nm được đo bằng CellTiter 96®Aqueous One Solution Assay [53] 25

Hình 3.1 Hình ảnh nấm tại địa điểm thu mẫu 26

Hình 3.2 Hình ảnh nấm khi nuôi trên môi trường khoai tây (10 ngày) 27

Hình 3.3 Sản phẩm PCR đoạn gen ITS 28

Hình 3.4 Trình tự đoạn gen ITS của chủng Phellinus linteus thu tại vùng Madagui, huyện Đạ Huoai, tỉnh Lâm Đồng 30

Hình 3.5 Khả năng phân hủy cơ chất CMC và sinh enzyme cellulase ngoại bào của chủng nấm Thượng hoàng PLUS 31

Hình 3.6 Khả năng tiết amylase ngoại bào của chủng nấm PL PLUS 32

Hình 3.7 Khả năng phân hủy cơ chất skim milk và sinh enzyme protease ngoại bào của chủng nấm PL PLUS 32

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự phát triển 33

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự phát triển của sinh khối nấm PLUS 35

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển sinh khối nấm PLUS 36

Hình 3.11 Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự phát triển sinh khối nấm PLUS 37

Hình 3.12 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sự phát triển sinh khối nấm PL PLUS 38

Hình 3.13 Đồ thị mô tả độ hấp phụ của tế bào BT474 khi ủ với dịch chiết 40

sinh khối nấm bằng cồn 40

Hình 3.14 Hình ảnh tế bào BT474 khi được ủ dịch sinh khối nấm chiết cồn 41 Hình 3.15 Đồ thị mô tả độ hấp phụ của tế bào BT474 khi ủ với dịch chiết sinh khối nấm bằng nước nóng 42 Hình 3.16 Hình ảnh tế bào BT474 khi được ủ với dịch sinh khối nấm 43 chiết nước nóng 43 Hình 3.17 Đồ thị mô tả độ hấp phụ của tế bào HEK293 khi ủ với dịch chiết chiết sinh khối nấm bằng cồn 44 Hình 3.18 Hình ảnh tế bào HEK293 khi được ủ với dịch chiết 45 sinh khối nấm bằng cồn 45 Hình 3.19 Đồ thị mô tả độ hấp phụ của tế bào HEK293 khi ủ với dịch chiết quả thể nấm bằng nước nóng.48 h 47 Hình 3.20 Hình ảnh tế bào HEK293 khi ủ với dịch sinh khối nấm 47 chiết nước nóng 47 Hình 3.21 Đồ thị so sánh độ hấp phụ của tế bào BT474 và HEK293 khi ủ với dịch chiết sinh khối nấm bằng cồn 49 Hình 3.22 Đồ thị so sánh độ hấp phụ của tế bào BT474 và HEK293 khi ủ với dịch chiết sinh khối nấm bằng nước nóng 50

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Nấm Thượng hoàng hay còn gọi là Nấm Hoàng sơn (sang hwang) có tên

khoa học là Phellinus linteus, họ Hymenochaetaceae, chi Phellinus Nấm

Thượng hoàng có màu vàng, mọc tự nhiên trên cây dâu tằm, cây sồi, cây hạt dẻ, cây keo, hoặc thân cây sồi của cây lá rộng Nấm mọc nhiều năm, lớp thụ tầng năm sau chồng lên lớp thụ tầng năm trước Thường mọc ở những vùng rừng sâu, núi cao hiểm trở, các khu rừng nguyên sinh, tuổi nấm có khi đến vài chục năm Hiện nay, nguồn nấm Thượng hoàng có nguồn gốc chủ yếu từ bốn nước

là Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản và Thái Lan Tuy nhiên, sản lượng nấm không cao do việc nuôi trồng tương đối khó

Nấm Thượng hoàng là một loại nấm quý trong tự nhiên đã được người Nhật Bản, Hàn Quốc sử dụng rộng rãi trong việc điều trị, tăng cường khả năng của

hệ thống miễn dịch, giúp giảm lượng cholesterol và đường trong máu Hiện nay,

đã có nhiều nghiên cứu xác định các đặc tính quý của loại nấm này được áp dụng trong phòng và điều trị bệnh như: tác dụng điều hòa miễn dịch [18], [50], kháng viêm [35], [49], kháng ung thư [19], [32] và kháng oxy hóa [14] Ngoài ra, nấm Thượng hoàng còn được biết có nhiều tác dụng khác như: nâng cao trí nhớ ở người già, giảm viêm, giảm đau, giảm căng thẳng, mệt mỏi,

Tại Việt Nam, nấm Thượng hoàng được biết đến như một loại thảo dược quý được sử dụng để bổ sung dinh dưỡng nhằm nâng cao sức khỏe và điều trị bệnh Việt Nam đã được nhập nấm Thượng hoàng từ nhiều nước đặc biệt là Hàn Quốc với giá cao khoảng 4 triệu đến 10 triệu đồng/kg, cao hơn nấm Linh chi rất nhiều

Do được biết tới là loại thảo dược quý hiếm, được giới quý tộc sử dụng nhằm bổ sung dinh dưỡng và chữa bệnh, vì vậy nấm Thượng hoàng đang được

khai thác quá mức Tổng sản lượng của các loài Phellinus trên thế giới khoảng

30 tấn/năm

Hiện nay, nấm Thượng hoàng có nguồn gốc tự nhiên đã không còn nhiều Phần lớn các hợp chất được tìm thấy trong nấm đều có những tính chất tốt trong ngăn ngừa hoặc điều trị đối với một số loại bệnh của con người Tuy nhiên, việc tìm được nấm Thượng hoàng trong tự nhiên là rất hiếm do thời gian sinh trưởng để cho ra quả thể có giá trị trong y học rất dài Vì vậy, cần có các nghiên cứu nhân giống để trồng được nấm một cách nhân tạo, rút ngắn được thời gian đó và chủ động trong việc nhân rộng, nuôi trồng nấm đạt sản lượng mong muốn

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng

(Phellinus linteus)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Định danh loài và đánh giá hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư sinh

khối nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus)

3 Nội dung nghiên cứu

- Phân tích đặc điểm trình tự vùng gen ITS nấm Thượng hoàng

- Chiết và thu sinh khối nấm Thượng hoàng

- Thử nghiệm hoạt tính trên dòng tế bào ung thư vú (BT474) và tế bào thận người (HEK293)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm Thượng hoàng và giá trị dinh dưỡng của nấm Thượng hoàng

Nấm Thượng hoàng (tên khoa học là Phellinus linteus) là một loại nấm

dùng làm thuốc được sử dụng ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Trung Quốc trong nhiều thế kỷ để ngăn ngừa bệnh rối loạn chức năng dạ dày ruột, tiêu chảy, xuất huyết và ung thư [49]

Phân loại khoa học

Nấm Thượng hoàng hay còn gọi là Hoàng linh chi có tên khoa học

Phellinus Linteus là một loại nấm thuộc họ Hymenochaetaceae Giống như các

thành viên khác của chi Phellinus, nấm Thượng hoàng sống hoại sinh trên thực vật, trong đó lignin và cellulose của cây chủ là giảm Đây cũng là một nguyên nhân gây ra mục trắng

Quả thể nấm thường mọc trên gốc cây đã chết hoặc phần thân, vỏ cây bị khô có hình móng ngựa hoặc hình đĩa, có màu vàng đến vàng sẫm Ngoài tự nhiên các cây hay có nấm Thượng hoàng mọc là các cây lá rộng, nhiều nhất là liễu và bạch dương Nấm Thượng hoàng giống như các họ hàng gần của nó thuộc họ Linh chi có một quả thể rất cứng và có thể tồn tại trong nhiều năm, tạo

ra một lớp bề mặt mới mỗi năm Ở Alaska, người dân địa phương đốt nấm Thượng hoàng và trộn với thuốc lá nhai để tăng cường tác dụng của nicotine trong thuốc lá Nấm Thượng hoàng là một loài đa bội, với các lỗ ở mặt dưới mang các bào tử đáy

Hình 1.1 Nấm Phellinus linteus trong tự nhiên [55]

Quả nấm thường có đường kính 5 - 20 cm, một số trường hợp đặc biệt có thể lên tới 40 cm Độ dày của quả nấm thay đổi từ 2 - 12 cm, thậm chí dày 20 cm Nấm có các lỗ nhỏ, màu nâu xám Các ống của nó có chiều dài khoảng 2 - 7 mm Quả nấm trở nên cứng hơn theo tuổi và khô, với độ ẩm, nấm sẽ mềm đi Mỗi năm, nấm tạo thành một lớp ống mới chồng lên các lớp cũ Các bào tử già chưa được giải phóng thường bị bịt kín bởi sự phát triển sau đó làm tắc nghẽn các ống và chúng xuất hiện trên mặt cắt ngang dưới dạng các đốm màu nâu Mùi của quả nấm

có đặc tính nấm rõ rệt, có vị đắng Khi tiếp xúc với kali hydroxide, nấm sẽ bị nhuộm đen Bào tử của nấm Thượng hoàng tạo thành một đám màu trắng

Chiết xuất của nấm này đã được sử dụng trong nhiều thế kỷ trong y học Phương Đông và nấm Thượng hoàng được coi là loài nấm thần dược, có sức

mạnh trẻ hóa và kéo dài tuổi thọ Ở Trung Quốc, nấm được gọi là Song-gen; ở Hàn Quốc, nấm được gọi là Sang-hwang và ở Nhật Bản nấm được gọi là

Meshimakobu Loại nấm này có màu vàng cam, sinh trưởng trên các cây họ dâu

tằm, là một loại nấm rất nổi tiếng trong chi Phellinus thuộc họ Hymenochaetaceae Chi Phellinus gồm một số loài đã được sử dụng trong điều trị ung thư, tiểu đường, nhiễm khuẩn, virus và loét như P linteus, P ribis, và P

igniarius [18], [19]

Phellinus linteus là các loài nấm mọc nhiều năm, lớp thụ tầng năm sau

chồng lên lớp thụ tầng năm trước (Hình 1.1) Nấm Thượng hoàng mọc ở những

vùng rừng sâu, núi cao hiểm trở, các khu rừng nguyên sinh, tuổi nấm có khi đến vài chục năm

Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu chú trọng đến các chất có hoạt tính sinh học [18], [35] và xác định cũng như phân lập các thành phần có hoạt tính sinh học, chức năng kháng u và các cơ chế dược lý của nấm Thượng hoàng [15], [32], [49] Ngoài ra, nấm Thượng hoàng còn được chứng minh có các hoạt tính như: chống thoái hóa thần kinh, chống tiểu đường, kháng viêm, kháng

u, chống dị ứng, điều hòa miễn dịch, bảo vệ gan và các hoạt tính dược lý khác

1.2 Thành phần hoá học và hoạt tính của nấm Thượng hoàng

Trong nhiều thập kỷ qua một số lượng lớn các thành phần hóa học đã được phân lập từ nấm Thượng hoàng Trong đó, polysaccharide là thành phần hóa học chính và cũng là thành phần mang hoạt tính sinh học chính trong việc phòng chống ung thư của PL Ngoài ra, còn có một số nhóm chất khác bao gồm flavone, coumarin, ergosterol, axit agaricic, axit béo, triterpen, axit thơm, axit amin, xyloza oxyase, urease, catalase, este, sucse, enzyme cellulase [12], [33]

PL ký sinh ở các cây khác nhau thì sẽ cho thành phần và nồng độ của các hợp chất khác nhau Mặt khác thành phần hóa học trong thể quả và sợi nấm cũng có

sự khác biệt [7]

Trong y học cổ truyền Trung Quốc, Phellinus linteus thường được dùng

kết hợp với các loại nấm thuốc khác (như Linh chi và nấm Maitake) Trong nấm Thượng hoàn chứa một số hợp chất được cho là rất tốt đến sức khỏe, bao gồm axit ellagic và axit caffeic - hai loại hợp chất tự nhiên có tác dụng chống oxy hóa Nấm Thượng hoàng có chứa nhiều dưỡng chất quý, giúp hỗ trợ sức khỏe cho cơ thể như: Giúp bảo vệ tốt các cơ quan cơ thể trong quá trình điều trị

xạ trị hóa học khi điều trị ung thư, có tác dụng tốt trong hoạt động chống ung thư vú, kích thích chức năng nội tiết và miễn dịch, ngăn ngừa các phản ứng phụ nhờ ức chế sự tăng trưởng khối u và di căn, rất tốt với bệnh tim, huyết áp cao, tiểu đường… Ngoài ra, nấm Thượng hoàng được cho là có tác dụng giảm viêm

và giảm đau Thành phần cụ thể như sau:

Terpenes được xem là thành phần chủ yếu của nấm giúp kiểm soát huyết

áp và cholesterol, đồng thời giúp đẩy mạnh sự hấp thụ oxy và làm tăng sự hoạt động của gan Theo một số báo cáo gần đây, một số terpen bao gồm Sesquiterpenes, ditepenes và triterpenes là tách khỏi thể quả của PL Trong năm

2009, bốn loại lanostane-triterpenoids gilvsins A-D cùng với hai hợp chất đã biết 24-methylenelanost-8-ene-3β, 22-diol và 5α-ergosta-7, 22-diene-3-one đã

được tìm thấy trong thể quả của Phellinus gilvus [44] Ngoài ra, ba

Sesquiterpenes mới bao gồm phellilins A - C được phân lập từ chiết xuất ethanol của sợi nấm nuôi cấy PL [37]…

Polysaccharide đại diện cho một trong những thành phần phong phú nhất trong loại nấm này Một nhóm chính các thành phần hoạt tính sinh học đã được

chiết xuất và phân lập từ quả thể, sợi nấm nuôi cấy và dịch lên men của P

linteus, là những phân tử sinh học đa dạng về cấu trúc với các hoạt tính sinh

học tuyệt vời và đáng chú ý, bao gồm điều hòa miễn dịch bao gồm tăng cường miễn dịch không đặc hiệu và miễn dịch trung gian dịch thể và tế bào Hoạt động kích thích quan trọng trong việc ức chế khối u, kháng u, chống viêm, chống dị ứng, kháng sinh và chống oxy hóa Polysaccharicdes có tác dụng: Giúp

ức chế sự di chuyển và di căn của khối u, tăng cường chống ung thư [40] Ngoài ra Polysaccharicde còn có tác dụng chống cao huyết áp

Protein liên kết với polysaccharide từ nấm ức chế sự phát triển khối u, và

sự hình thành mạch và làm thay đổi Wnt/β-catenin trong SW480 tế bào ung thư ruột kết Theo một báo cáo được công bố năm 2008, Sliva D và cs đã nghiên cứu khả năng kháng ung thư của nấm Thượng hoàng [39] Tác giả đã chứng minh rằng nấm Thượng hoàng ức chế sự tăng sinh, sự di căn cũng như sự hình thành khối u của các tế bào ung thư vú ở người

Trong thể quả, polysaccharide là thành phần chính và hầu hết trong số chúng là heteropolysaccharide Mannose, galactose, glucose, fructose, xylose là các monosaccharide chính có trong thể quả [8] Song và cs [41] chiết xuất sợi nấm bằng nước nóng và sau đó phân lập polysacaride, dịch chiết này có thể

kích thích tế bào lympho B Trong dịch chiết chứa 82,5% polysacarit và 13,2% polypeptide Phân tích sâu hơn cho thấy proteoglycan bao gồm 72,2% polysacaride và 22,3% protein và phần polysacaride chủ yếu bao gồm mannose, galactose, glucose, arabinose cũng như xylose và phần protein chứa nhiều axit glutamic, axit aspartic glycine và serine

Hợp chất Phenolic có hoạt tính sinh học mang lại các đặc tính y học và chất lượng của nấm Phenolic có liên quan đến việc ức chế xơ vữa động mạch, ung thư và được coi như hợp chất loại bỏ các chất cặn bã trong cơ thể Ngoài ra phenolic có thể ngăn ngừa ảnh hưởng của các gốc oxy hoá như superoxide dismutase (-SOD là enzyme quan trọng giúp bảo vệ, chống lại các tác hại của superoxide, là một trong những gốc tự do phổ biến trong cơ thể) Tuy nhiên, các hợp chất phenol và hoạt tính giống SOD của nấm Thượng hoàng vẫn chưa rõ ràng

Có tổng cộng có 35 flavones, pyranones và furan đã được tách ra từ nấm Thượng hoàng Trong số đó, bốn flavones (phellectrins A và B cũng như meshimakobnol A và B), 15 pyranones (phellectridimer A, phellectridin A - J, baumin, phellinin C cũng như phellinin B1 và B2 ) và 5 furan (phellinusfrans A

và B, phellifuropyranone A, phellinstatin cũng như phelliusin A) được phân lập từ nấm Thượng hoàng

Bên cạnh đó nấm Thượng hoàng còn Adenosine cấu tạo gồm nucleoside

và purine Giúp tăng cường sự trao đổi chất và năng lượng, ngăn ngừa sự phân mảnh của tiểu cầu có thể gây ra tắc nghẽn trong hệ tuần hoàn

Acid ganoderic giúp kiểm soát chất béo và duy trì cân nặng, là một trong những thành phần chủ yếu có hoạt tính dược lý mạnh, có tác dụng duy trì sự trẻ trung và góp phần cải thiện sức sống

Ganoderma có tác dụng điều hòa huyết áp, làm loãng máu, cải thiện chức năng của não và dây thần kinh

Hispidin b điều tpidin b điều hòa huyết áp, oxy hóa do hydrogen peroxide gây ra

Cũng như nấm Linh chi, nấm Thượng hoàng có tác dụng hố trợ với những người mắc bệnh, đặc biệt là các bệnh liên quan đến khối u, ngoài ra nấm Thượng hoàng còn có tác dụng thải độc, tăng cường hỗ trợ các cơ quan quan trọng trong cơ thể như tim, gan, mạch máu Nấm Thượng hoàng được biết đến có một số tác dụng như sau [54]: Giúp tạo ra những phản ứng sinh học tự nhiên có lợi cho hỗ trợ điều trị các bệnh về khối u và ung thư; hạ đường huyết, hạ natri máu, hỗ trợ tiểu đường, làm giảm nhiễm trùng thứ, gia tăng sức đề kháng cho cơ thể, có khả năng giúp cho người bệnh ăn ngon miệng hơn

Các nhà khoa học đã chứng minh được rằng hợp chất exopolysaccaride được chiết xuất từ nấm Thượng hoàng được nuôi lên men trong môi trường lỏng có tác dụng hạ đường huyết cải thiện các tổn thương của gan Mặt khác,

họ cũng phát hiện ra rằng các polysaccaride của nấm Thượng hoàng ức chế biểu hiện của các cytokine viêm Polysaccaride từ sợi nấm và dịch chiết nước nóng của thể quả nấm Thượng hoàng rất hữu ích trong việc điều trị bệnh tiểu đường bằng cách giảm tổn thương do sự oxy hóa của các tế bào đảo tụy, thúc đẩy bài tiết insulin [48]

Polysaccaride được phân lập từ P linteus kéo dài đáng kể thời gian

sống sót của chuột có các tế bào u ác tính B16F10 được cấy ghép Hơn nữa, polysaccaride ức chế sự phát triển khối u và giảm tần suất di căn phổi

Đáng chú ý P.linteus không tác động trực tiếp lên các tế bào ung thư mà cơ

chế tác động của nó là thông qua sự kích thích đáp ứng miễn dịch Do đó,

P.linteus được khuyến cáo sử dụng cho bệnh nhân như một tác nhân trị liệu

miễn dịch tự nhiên mà không có độc tính Tác dụng điều hòa miễn dịch của

axit polysaccharide phân lập từ P linteus có sự tương quan với sự gia tăng

sản xuất nitric oxide và hoạt động của khối u ở đại thực bào phúc mạc chuột Phức hợp protein polysaccaride được chiết xuất từ nấm Thượng hoàng đã chứng minh tác dụng điều hòa miễn dịch thông qua việc kích thích tăng sinh tế bào B trong tế bào lách murine, sản xuất interleukin (IL) -

1β, IL - 6 và yếu tố hoại tử khối u-α (TNF - α) trong đại thực bào phúc mạc Bên cạnh đó, polysaccaride gắn với protein được phân lập từ nấm Thượng hoàng đã chứng minh tác dụng trực tiếp lên các tế bào ung thư Phức hợp này đã ngăn chặn sự tăng sinh và hình thành khuẩn lạc của tế bào ung thư ruột kết SW480 [40]

1.3 Phân loại học phân tử nấm

Phân loại học phân tử là phương pháp phân loại dựa vào sinh học phân tử

có nghĩa là sử dụng các phân tử lớn như DNA, RNA, protein để làm dấu hiệu nhận biết và phân loại sinh vật DNA barcode là một đoạn trình tự nucleotide ngắn, từ một phần của hệ gen và được dùng giống như cách một máy quét nhận diện các loài sinh vật Phương pháp này có nhiều ưu điểm như lượng mẫu phân tích ít, thời gian ngắn, chính xác, có thể áp dụng cho tất cả các giai đoạn và giữa các loài giống nhau về kiểu hình

Sử dụng phương pháp sinh học phân tử có thể giám định được ngay cả khi các mẫu không còn nguyên vẹn Việc kết hợp giữa chỉ thị phân tử DNA và chỉ thị hình thái sẽ nhanh chóng xác định được sự khác biệt giữa sinh vật này với sinh vật khác một cách chính xác [52] Để đảm bảo là một mã vạch DNA điển hình cần 3 yếu tố Thứ nhất: Phải có hiệu suất nhân bản cao và trình tự có tính đặc hiệu Thứ hai: Phải có tính phổ biến Thứ ba: Có khả năng phân biệt được nhiều loài một cách đồng thời [51]

Một vấn đề cơ bản trong phân loại nấm là trong chu kỳ sống của nấm

có nhiều giai đoạn biến hình Những giai đoạn này khác nhau về hình dạng

cả khi ở trạng thái vô tính và hữu tính Các loài nấm có thể bao gồm nhiều chủng khác nhau về hình thái cũng đặc điểm sử dụng các chất hữu cơ, dẫn tới có thể định loại sai giữa các loài Mã vạch DNA có thể giúp xác định chính xác các loài nấm kể cả khi kiểu hình trong các giai đoạn phát triển có khác nhau

Hình 1.2 Cấu trúc của rDNA ở nấm Saccharomyces cerevisiae [10]

(A) Cấu trúc của một đơn vị lặp (B) Nhiều đơn vị lặp lại

Đối với các sinh vật nhân chuẩn, các gen mã hoá cho RNA ribosome được sử dụng như những công cụ phân loại phân tử Các rDNA gồm nhiều đơn

vị lặp lại, mỗi đơn vị bao gồm các vùng như: LSU (ribosomal large subunit, 28S), vùng gen 18S, ITS (Internal Transcribed Spacer), 5,8S, 5S RNA và vùng IGS (Intergenic Spacer) (hình 1.2) Các gen thường sử dụng để phân loại nấm bao gồm: ITS (Internal Transcribed Spacer), TEF1α (Translational elongation factor 1α), IGS (Intergenic Spacer), Ở nấm, đoạn gen ITS dài khoảng 600 bp trong vùng gen lặp lại song song của ribosome của gen nhân Vùng gen nằm giữa 2 gen mã hoá cho tiểu đơn vị nhỏ 18S (ở đầu 5’) và gen mã hoá cho tiểu đơn vị lớn 28S (đầu 3’) Gen ITS chia gồm 2 phần là ITS1 và ITS2 cách nhau bởi gen mã hoá cho tiểu đơn vị 5,8S, đây là trình tự có tính bảo thủ cao Trình

25-tự này mã hoá cho cấu trúc của ribosome- một trong những cấu trúc quan trọng

để tổng hợp protein nội bào Họ gen rDNA chứa các vùng bảo tồn cao như 18S, 26S có thể sử dụng để suy luận quan hệ phát sinh ở các mức độ phân loại cao Các đoạn tiến hóa nhanh như các vùng ITS có thể là thích hợp nhất trong so sánh các loài và những chi gần nhau, thậm chí là so ở mức độ các quần thể Do

có nhiều ưu điểm và một khối lượng dữ liệu trình tự lớn, Begerow D đã đề

xuất vùng ITS làm vùng mã vạch DNA chính để xác định di truyền của nấm [3]

Hình 1.3 Các trình tự mồi thông thường để khuếch đại vùng gen ITS [4]

Một ưu điểm khi sử dụng vùng gen ITS làm mã vạch DNA của nấm là vùng gen này lặp lại nhiều trong genome (có khoảng 250 bản sao)

Do đó, chỉ cần một lượng nhỏ mẫu vật để khuếch đại và giải trình tự vùng gen này Hiện nay, đã có hơn 100.000 trình tự ITS của nấm được xác định

và lưu giữ trong Cơ sở dữ liệu nucleotide quốc tế và các trung tâm khác để cung cấp một lượng lớn trình tự tham khảo cho phân loại nấm [30] Có nhiều cặp mồi được sử dụng để khuếch đại toàn bộ hoặc một phần của gen ITS (hình 1.2) Các đoạn mồi được sử dụng phổ biến nhất như bảng 1.1

Bảng 1.1 Trình tự các cặp mồi ITS phổ biến [4]

1.4 Những nghiên cứu về nấm Thượng hoàng hiện nay

Các nghiên cứu trước đây đã phân lập polysaccharides, proteoglycans,

các dẫn xuất furan, cũng như styrylpyrones… từ Phellinus linteus và xác minh

hoạt tính sinh học của chúng [18], [19], [49]

Hispidin là một styrylpyrone được tìm thấy từ môi trường dùng nuôi cấy

sợi nấm Phellinus linteus và đây là một chất ức chế β-secretase không cạnh

tranh [32] Hispidin cũng đóng vai trò như một chất trị đái tháo đường bằng cách ức chế cái chết đã được lập trình gây ra bởi H2O2 và tăng bài tiết insulin trong tế bào đã được xử lý H2O2 Hơn nữa, hispidin với vai trò như một chất chống oxy hoá có thể dọn dẹp các gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl và gốc ion dương 2,2-azino-bis (axit 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic), cũng như

ức chế sự hình thành superoxide do ức chế xanthine oxidase [15]

Trong năm 2006, các dẫn xuất furan anticomplement, phellinusfurans

A và B đã được phân lập từ thể quả của Phellinus linteus Cả hai đều có tác

dụng ức chế đáng kể đến hoạt động tán huyết trên huyết thanh người với hồng cầu [27]

Từ thể quả của Phellinus linteus, hispidin và các dẫn xuất của hispidin

được phân lập và xác định có hoạt tính chống lại bệnh tiểu đường Trong số đó, các dẫn xuất của hispidin và acid ellagic có tác dụng ức chế mạnh trên aldose reductase của thủy tinh thể chuột và aldose reductase tái tổ hợp của con người [21] Vào giai đoạn đầu của sự đường hóa protein, các dẫn xuất của hispidin và interfungins A thể hiện hoạt động ức chế sự hình thành hemoglobin A1C; ở giai đoạn giữa, interfungins A, và protocatechualdehyde có tác dụng ức chế đáng kể đến sự biến đổi protein methylglyoxalmedicated

Interfungins A cũng có khả năng ức chế giai đoạn cuối cùng của sự đường hóa Do đó, interfungins A có tiềm năng nhất trong việc ức chế sự đường hóa protein [22] và điều trị bệnh tiểu đường

Acid protocatechuic là một loại acid phenolic Đây là một chất chuyển hóa chính của các polyphenol chống oxi hóa được tìm thấy trong chè xanh và

cũng được tìm thấy trong Phellinus linteus Đây là một chất chống oxi hóa và

kháng viêm Xét nghiệm invitro đã chứng minh hoạt tính chống oxi hóa và kháng viêm của Acid protocatechuic; thí nghiệm bảo vệ gan invivo của chất này cũng được đo bằng các chỉ thị hóa học và đánh giá mô học [23]

Protocatechualdehyde là một aldehyde phenolic Phân tử này có thể được

sử dụng như một tiền chất để tổng hợp vanillin [36] là một hương liệu sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, dược phẩm cũng như mỹ phẩm Protocatechualdehyde cũng được tìm thấy trong nấm Phellinus linteus [22]

Axit caffeic là một hợp chất hữu cơ được phân loại như axit hydroxycinnamic Chất màu vàng này gồm có các nhóm chức năng phenolic và

acrylic; được tìm thấy trong tất cả các loại thực vật và trong Phellinus linteus vì

axit caffeic là chìa khóa trung gian trong sinh tổng hợp lignin [5] Axit caffeic

có nhiều tác dụng dược lý tiềm năng trong nghiên cứu in vitro và trên mô hình

động vật Axit caffeic có tác dụng ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư bằng cơ chế oxy hóa trên dòng tế bào người fibrosarcoma HT-1080 [34] và cũng là một

chất chống oxy hóa in vitro và in vivo[31] Axit caffeic cũng có hoạt tính điều

hòa miễn dịch và hoạt tính kháng viêm, vượt trội so với các chất chống oxy hóa

khác, làm giảm sự hình thành aflatoxin hơn 95%[45]

Axit ellagic là một chất chống oxy hóa phenol tự nhiên được tìm thấy

trong nhiều loại trái cây và rau quả và cũng được tìm thấy trong Phellinus

linteus Các tính chất chống sự tăng sinh và chống oxy hóa của axit ellagic đã

được chứng minh trong một số mô hình invitro và động vật nhỏ [29], [38] Tính

chất chống sự tăng sinh của các axit ellagic có thể là do khả năng trực tiếp ức chế DNA liên kết với các chất gây ung thư nhất định, bao gồm cả chất

nitrosamine [25], [26] và polycyclic aromatic hydrocarbons [43] Cũng giống như với chất chống oxy hóa polyphenol khác axit ellagic có tác dụng bảo vệ hóa học trong các mô hình tế bào bằng cách giảm stress oxy hóa [42]

Meshimakibnol A, meshimakibnol B, phellifuropyranone A, và

phelligridin G từ quả thể Phellinus linteus hoang dã được đánh giá có khả năng

chống di căn ở năm dòng tế bào u da ác tính của chuột B16 (hoang dã, BL6, F1, F10, và C2M) và các tế bào ung thư phổi ở người (A549, EBC-1, và SBC-3) [17], [28] Một dẫn xuất của acid retinolic, (2E, 4E) -γ-ionylideneaceticacid, đảo ngược bệnh xơ gan ở giai đoạn đầu thông qua ức chế sự hình thành các phân tử oxy hoạt hóa (reactive oxygen species - ROS) và dòng canxi trong tế

bào HSC-T16, được phân lập từ các sợi nấm của Phellinus linteus[46]

Ngoài ra, một kháng sinh mới là dẫn xuất của furanone, phellinone, được

phân lập từ môi trường làm bằng gạo nấu của Phellinus linteus Hợp chất này có hoạt động kháng khuẩn chọn lọc đối với Bacillus subtilis ở nồng độ 10µg/ml [47]

Cerebroside B, protocatechualdehyde, 5-hydroxymethyl-2-furaldehyde,

acid succinic, và axit fumaric, được phân lập từ thể quả của Phellinus linteus

bởi Kang et al năm 2004 [16] Các hợp chất protocatechualdehyde và hydroxymethyl-2-furaldehyde ức chế hoạt động tyrosinase [16]

5-Tế bào ung thư với hoạt động kinase 1/2(ERK1/2) điều tiết tín hiệu ngoại

bào cao hơn nhạy cảm hơn với hispolon, chất tương tự hispidin từ Phellinus

linteus được chứng minh là có khả năng giảm bớt biểu hiện MDM2 để ức chế

tăng trưởng tế bào ung thư vú và bàng quang [24] Tương tự như vậy, hispolon giảm biểu hiện của metalloproteinase-2 và -9, và chất hoạt hóa Urokinase plasminogen, trong khi ức chế sự phosphoryl hóa ERK 1/2, phosphatidylinositol-3-kinase / serine / threonin protein kinase, và kinase đầu dính trong tế bào SK-Hep1 [11] Ngược lại, chuột điều trị ICR (vùng kiểm soát đánh dấu) với hispolon ức chế rõ không chỉ đáp ứng quằn quại gây bởi acetic acid mà còn đau gây ra bởi formalin Hơn nữa, hispolon giảm malondialdehyde trong phù nề chân thông qua các hoạt động làm tăng superoxide dismutase,

glutathion (GSH) reductase, và GSH peroxidase trong mô gan [6] Do đó hispolon hoạt động như một nhân tố chống di căn và chống viêm Một dẫn xuất trimeric hispidin mới, phellinstatin, cùng với hispidin dimer là hypholomine B,

phân lập từ dịch môi trường của Phellinus linteus Cả hai thể hiện ảnh hưởng

ức chế trên Staphylococcus aureus enoyl-ACP reductase Tuy nhiên, chỉ phellinstatin có hoạt tính kháng khuẩn, khi chống lại S aureus kháng

methicillin [9]

Dược tính, công dụng của nấm Thượng hoàng đã được chứng minh qua các nghiên cứu khoa học được công bố trong các tạp chí chuyên ngành có giá trị trên thế giới Phần lớn các hợp chất được tìm thấy trong nấm đều có những tính chất tốt trong ngăn ngừa hoặc điều trị đối với một số loại bệnh của con người Tuy nhiên, như đã phân tích ở trên, việc tìm được nấm Thượng hoàng trong tự nhiên là rất hiếm do thời gian sinh trưởng để cho ra quả thể có giá trị trong y học rất dài Vì vậy, người ta đã tìm các cách để trồng được nấm một cách nhân tạo để rút ngắn được thời gian đó và chủ động trong việc nhân rộng việc nuôi trồng nấm để có sản lượng mong muốn Việc trồng nấm dưới dạng quả thể tuy nhiên cũng còn rất khó khăn do đây là một loại nấm nhạy cảm với khí hậu, thời tiết Do đó, tìm được điều kiện môi trường phù hợp để trồng nấm này là một việc rất quan trọng và cần thiết Ở Việt Nam cũng có một số loài

thuộc chi Phellinus, tuy nhiên các công trình nghiên cứu về phân loại, nuôi cấy,

các hoạt tính sinh học còn ít

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, địa điểm, thời gian nghiên cứu

Môi trường phân lập và nhân giống:

- Môi trường sử dụng để phân lập và nhân giống là môi trường thạch khoai tây (Potato Dextrose Agar- PDA) bao gồm các thành phần như sau:

Môi trường lên men chìm:

- Môi trường lỏng ban đầu có thể dùng môi trường khoai tây lỏng (PD), các thành phần gồm như đối với môi trường thạch ngoại trừ không bổ sung thạch agar Môi trường lên men lỏng cho các thí nghiệm tiếp theo gồm:

- Môi trường lỏng ban đầu được chuẩn bị dựa trên tham khảo của Lee và

2.1.2.2 Thiết bị

Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm đều mới, hiện đại và có độ chính xác cao như: Nồi hấp khử trùng Hariyama HV50- 220 (Nhật Bản), Box cấy ESCO class II (Indonesia), tủ sấy (Đức), bình tam giác 250ml (Đức), pipet Eppendorf (Đức), siêu điện (Trung Quốc), cân điện tử AND GH 200 (Nhật Bản), Ngoài ra, còn một số dụng cụ như: Bình tam giác 250ml, đĩa petri, đèn cồn, dao cấy, pipet eppendorf, đầu côn,

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Công nghệ gen, Khoa Sinh học, Trường ĐHSP Thái Nguyên

- Phòng thí nghiệm trọng điểm, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thu thập và phân lập giống nấm Thượng hoàng

- Phương pháp thu thập mẫu:

Mẫu nấm được thu thập bằng cách quan sát đặc điểm hình thái của nấm Thượng hoàng Nấm thường mọc ở các thân gỗ mục, có màu vàng sẫm hoặc đen bóng và trong rừng rậm Cắt một miếng nấm và bảo quản trong túi nilong kín trong thời gian ngắn (1 - 3 ngày) hoặc trong cồn 70o trong thời gian dài hơn (1 tuần)

- Phương pháp phân lập nấm Thượng hoàng:

loại bỏ bào tử và các bụi bẩn trên quả thể, cắt sạch chân nấm Sau đó, dùng bông thấm cồn 70o lau bề mặt quả thể nấm

Cách tiến hành: Khử trùng dao cấy trên ngọn lửa đèn cồn Dùng lưỡi dao

rạch nhẹ mặt dưới quả thể nấm tách quả thể làm hai Tiến hành lấy dao cấy lấy mẫu mô bên trong và cấy lên môi trường PDA trong đĩa petri có kích thước 90

x 15 mm Sau đó, mang đĩa giống để vào phòng tối, nhiệt độ phòng từ 25oC –

32oC Sau 15 ngày đĩa phân lập không bị lẫn tạp, tơ mọc khỏe, tơ nấm lan sát mặt thạch, tơ lan đều, tơ có màu vàng nhạt

2.2.2 Cấy chuyển và nhân giống

Chủng nấm sau khi phân lập được cấy chuyển và nhân giống trong môi trường thạch khoai tây (PDA) Các đĩa thạch được cấy với một miếng thạch vuông có chứa giống với kích thước khoảng 0,7 cm mỗi chiều Tương tự, giống được giữ trong ống thạch nghiêng với cách làm như trên Sau khi cấy giống, đĩa thạch hoặc ống thạch nghiêng được giữ trong tủ ấm ổn nhiệt ở nhiệt độ 28oC Sau 7 đến 10 ngày, đĩa thạch hoặc được lấy ra khỏi tủ ấm và giữ ở nhiệt độ 4oC

để sử dụng cho các mục đích tiếp theo

- Cấy chuyển từ môi trường thạch sang môi trường lỏng:

Môi trường lỏng dùng để cấy chuyển sợi nấm được dùng là môi trường khoai tây (môi trường khoai tây lỏng được chuẩn bị như trên, tuy nhiên không

bổ sung agar) Sau khi khử trùng, môi trường được để nguội và cấy giống Giống nấm được lấy từ giống đã cấy chuyển trên môi trường thạch agar sau đó cắt nhỏ, mỗi miếng thạch có kích thước khoảng 1 ~ 2 mm2 và chuyển sang môi trường khoai tây lỏng đã chuẩn bị trước Sau khi cấy giống, các bình môi trường lỏng có chứa sợi nấm được nuôi lắc trong tủ ấm ở 28oC, 100 vòng/phút trong 14 ngày và sau đó sợi nấm được tiếp tục cấy chuyển hoặc làm khô để xác

định lượng sinh khối thu được

2.2.3 Nghiên cứu phân loại nấm

- Tách chiết DNA tổng số nấm:

Nấm nuôi lắc trong 7 ngày trong 50 ml môi trường lỏng ở bình tam giác

250 ml Ly tâm thu sinh khối với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó sinh khối nấm được nghiền mịn trong nitơ lỏng Hòa tan sinh khối

đã nghiền mịn trong 800 µl đệm TE, vortex trong 5 phút để trộn đều sinh khối với đệm TE Bổ sung 30 µl lysozyme 100mg/ml, ủ ở 37°C trong 1h Bổ sung 80 µl SDS 10%, trộn đều Bổ sung 16 µl proteinaise K (20 mg/ml), trộn đều, ủ ở 56°C trong 30 phút Tiếp tục bổ sung thêm 200 µl CTAB/NaCl, trộn đều Bổ sung 200

µl NaCl 5M, trộn đều, ủ ở 65°C trong 10 phút Bổ sung 800µl hỗn hợp Phenol/Cloroform/Isoamylalcohol (25 : 24 : 1), đảo nhẹ nhàng, sau đó ly tâm

12000 vòng/phút trong 10 phút Hút và chuyển dịch nổi ở trên sang một ống mới Lặp lại bước này 2 lần Bổ sung 500 µl isopropanol để kết tủa DNA, đảo ống và ủ

ở - 20°C trong 1giờ Sau đó ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4ºC Rửa tủa bằng 500 µl ethanol 70% và ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong

15 phút ở 4ºC Loại bỏ dịch nổi phía trên và để khô Hòa tan lại DNA trong 200 µl đệm TE và tiếp tục tách chiết lần thứ 2 sử dụng GeneJET Genomic DNA purification KIT (Thermo scientific) theo hướng dẫn sử dụng của KIT

TGA TAT GC) Thành phần phản ứng PCR gồm: 1x PCR buffer 22,5 µl, 10 pmol primer 0,5 µl mỗi loại, DNA khuôn 0,5 µl, nước khử ion đã khử trùng vừa

đủ 25 µl (EZ PCR mix, Phusa Biochem) Phản ứng PCR nhân bản gene ITS

được thực hiện trên máy chu trình nhiệt Applied Bioscience Veriti 96 giếng theo chương trình như sau: 1, Tiền biến tính 95oC trong 3 phút; 2, biến tính 95oC trong 30 giây; 3, gắn mồi ở 58oC trong 50 giây; và 4, kéo dài chuỗi ở 72oC trong

40 giây; lặp lại các bước 2 đến bước 4 cho 30 đến 35 chu kỳ; và bước kéo dài chuỗi cuối cùng là 72oC trong 5 phút Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên 1% agarose gel ở điện thế 100V trong thời gian 30 phút và kiểm tra kết quả bằng cách soi với đèn UV visualizer

- Đọc trình tự:

Sản phẩm PCR được đọc trình tự theo phương pháp Sanger trên máy đọc trình tự ABI PRISM 3100 tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm công nghệ gene, Viện Công nghệ sinh học, Viện HLKHCNVN Kết quả trình tự được xử lý bằng phần mềm BioEdit Sử dụng công cụ BLAST của NCBI để đánh giá mức

độ tương đồng của chủng Phellinus linteus thu được với các trình tự gene trong

cơ sở dữ liệu của ngân hàng gene thế giới

2.2.4 Phương pháp xác định khả năng tiết enzyme ngoại bào của nấm Thượng hoàng

Phương pháp xác định vòng thủy phân (khuếch tán trên đĩa thạch):Nguyên tắc: Sử dụng dịch chứa enzyme tác dụng với cơ chất có trong môi trường thach, cơ chất bị phân hủy dưới tác của enzyme làm cho độ đục của môi trường giảm, môi trường trở nên trong suốt Độ lớn đường kính của phần trong suốt trên đĩa thạch phản ánh hoạt độ của enzyme Phương pháp này xác định, định tính enzyme

Phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch

Cách tiến hành: Nấm TH được nuôi lắc với tốc độ 150 vòng trên phút trong môi trường lỏng và thu dịch môi trường nuôi sau 7 ngày Thu 50 ml dịch môi trường bằng cách ly tâm và hút dịch trong phía trên

Chuẩn bị đĩa thạch gồm có agar 15 g/l, và một trong các thành phần như: CMC (carboxymethyl cellulose), tinh bột (10 g/l); khử trùng môi trương thạch ở 121oC, áp suất 1 atm, trong 20 phút Chờ thạch nguội bớt thì đổ đĩa ( ~

25 ml/đĩa, đường kính 10 cm) Với skim milk (10g/l) thì hòa tan skim milk trong nước cất ấm đã khử trùng và trộn cùng dung dịch agar 3% ấm đã khử trùng theo tỉ lệ 1:1 Để đĩa nguội cho đông cứng

Sử dụng đầu tip 1 ml vô trùng đục lỗ trên đĩa thạch (đường kính d = 8 mm) Dùng pipet vô trùng nhỏ 100 µl dich ly tâm trên vào lỗ thạch đã đục Đối chứng là nước cất vô trùng Để đĩa petri ở tủ lạnh 4 oC trong 2 h cho môi trường

đủ thời gian thẩm thấu trong thạch Sau đó ủ đĩa thạch trong tủ ấm 30 oC trong

24 h 24 h tráng đĩa thạch với thuốc thử lugol 1% (đĩa chứa tinh bột), 3% (đĩa chứa CMC) và quan sát trực tiếp với đĩa chứa skim milk Quan sát kết quả và

đo đường kính vòng phân giải enzyme với thước đo chia kích thước mm

2.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến sự phát triển của sợi nấm Thượng hoàng

Môi trường lỏng ban đầu được chuẩn bị dựa trên tham khảo của Lee và cộng sự [18] như trong phần nguyên vật liệu Các điều kiện tối ưu được thay đổi như ở dưới Sợi nấm được nuôi trong bình tam giác 250 ml với 50 ml môi trường đã hấp khử trùng ở 121°C trong thời gian 15 - 20 phút, để nguội và cấy giống nấm theo tỉ lệ 10% giống Mọi thao tác đổ đĩa, cấy giống được thực hiện trong tủ cấy vi sinh đã được khử trùng bằng đèn tím Các thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3, kết quả là giá trị trung bình giữa các lần thí nghiệm

Ảnh hưởng của nguồn carbon: Nấm Thượng hoàng được nuôi cấy lắc

trong môi trường, lần lượt thay thế glucose bằng fructose, maltose, dextrose với hàm lượng 4%; pH 6; 28°C; 150 vòng/phút; thời gian nuôi cấy 15 ngày Thu và đánh giá lượng sinh khối sợi nấm

Ảnh hưởng của nguồn nitơ: Môi trường và điều kiện khác như trên, lần

lượt thay thế cao nấm men bằng tryptone, peptone, cao thịt bò, dịch chiết ngô với hàm lượng 2%

Ảnh hưởng của nhiệt độ: Môi trường được giữ nguyên với nguồn các bon

là glucose, nguồn nitơ là cao nấm men Nhiệt độ được thay đổi từ 26°C 27°C , 28°C, 30°C , và 33°C Các điều kiện khác cũng được giữ nguyên Đánh giá sinh khối của sợi nấm sau 15 ngày nuôi cấy

Ảnh hưởng của vòng lắc: Nấm Thượng hoàng được nuôi cấy trong môi

trường dịch thể trên máy lắc tốc độ lần lượt là 100, 120, 150, 200 vòng/phút trong thời gian 15 ngày Đánh giá sinh khối của sợi nấm ở chế độ lắc khác nhau

Ảnh hưởng của pH: Nấm Thượng hoàng được nuôi cấy trên môi trường

có pH là 4,0; 5,0; 5,5; 6,0; 7,0 sử dụng NaOH hoặc H2SO4 1N để chỉnh pH môi trường Đánh giá sinh khối của sợi nấm sau 15 ngày nuôi cấy

Xác định sinh khối sợi nấm khô: Xác định sinh khối sợi nấm khô: Từ 50

ml dịch nuôi cấy nấm, ly tâm 4.000 vòng/phút trong thời gian 30 phút, loại bỏ nước Sinh khối sợi nấm được sấy ở 70°C tới khối lượng không đổi

2.2.6 Chiết bột sinh khối nấm Thượng hoàng

Ngâm 10 g bột sinh khối hoặc bột quả thể nấm trong 300 ml cồn (2 - 3 ngày), thu dịch bằng cách lọc với giấy lọc 3M Dịch sau khi lọc được cô đặc với máy cô quay chân không đến khi khối lượng không thay đổi Xác định khối lượng bình trước và sau khi cô sau đó hòa lại các chất còn trong bình cô quay với 2 ml DMSO Hàm lượng các chất được tính theo mg/ml

Hình 2.1: Lọc dịch nấm Thượng hoàng

Dịch nấm chiết cồn Dịch nấm chiết nước nóng

Ngâm 10g bột sinh khối hoặc bột nấm quả thể trong 200 - 300 ml nước nóng ~90oC trong 2 - 3 giờ (h) Thu dịch cách lọc với giấy lọc 3M, cô quay đến khi khối lượng không đổi và hòa lại trong 2 ml nước Cách tính hàm lượng các chất trong dịch chiết tương tự như với chiết cồn (mg/ml)

2.2.7 Thử nghiệm hoạt tính trên tế bào ung thư vú (BT474) và tế bào thận người (HEK293)

2.2.6.1 Hoạt hóa tế bào

Chuẩn bị: Môi trường DMEM low glucose bổ sung 10 % FBS, 1% Pen/strep; được làm ấm trước khi sử dụng ở 37oC Lấy ống tế bào được bảo quản trong nitơ lỏng ra và đưa nhanh vào bể ổn nhiệt 37oC, lắc nhẹ đến khi dung dịch trong ống tan hết Hút 4 ml môi trường mới đã được làm ấm vào ống falcon 15ml, sau đó hút tế bào trong ống giống vào ống falcon đã có sẵn môi trường, đảo nhẹ nhàng bằng cách hút lên và nhả ra nhẹ nhàng với pipet, tránh tạo bọt khí Ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút Loại bỏ môi trường phía trên nhẹ nhàng để không tạo bọt khí Hòa lại tế bào trong 10 ml môi trường mới và đưa vào đĩa petri dành riêng cho nuôi cấy tế bào động vật Đặt tế bào vào tủ ấm

37oC với 5% CO2 và theo dõi quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào

2.2.6.2 Tiến hành thí nghiệm

Tế bào được cấy chuyển sang đĩa mới khi mật độ tế bào đạt 80 - 90 % đĩa Thực hiện thí nghiệm ở lần cấy chuyển thứ 2 hoặc 3 khi tế bào đã đạt độ ổn định trong sinh trưởng Tế bào được duy trì trong môi trường DMEM low glucose bổ sung 10 % FBS, 1% Pen/strep Đếm tế bào sử dụng Trypan blue và chia ra đĩa 96 giếng ở nồng độ 104 tế bào/giếng/100 µl Ủ qua đêm để tế bào bám chắc vào bề mặt đĩa Bổ sung dịch chiết nước nóng của nấm Thượng hoàng ở các nồng độ 0,425 mg/ml, 0,85 mg/ml, 1,7 mg/ml, 3,4 mg/ml; dịch chiết cồn của nấm Thượng hoàng ở các nồng độ: 0,15 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,6 mg/ml, 1,2 mg/ml trên tổng 10 µl vào mỗi giếng và tiếp tục theo dõi sau khi ủ 24h, 48h Ảnh hưởng của dịch chiết nấm Thượng hoàng đến các tế bào được đánh giá theo phương pháp MTS sử dụng Kit CellTiter 96® AQueous One

Solution Cell Proliferation Assay (MTS) của hãng Promega Mỗi mẫu thí nghiệm được lặp lại 2 lần

Phương pháp MTS: Xét nghiệm tăng sinh tế bào CellTiter 96® AQueous

One Solution là phương pháp so màu để xác định số lượng của các tế bào sống trong xét nghiệm tăng sinh hoặc xét nghiệm độc tế bào Thuốc thử CellTiter 96® AQueous One Solution chứa một hợp chất tetrazolium mới Hợp chất tetrazolium MTS (thuốc thử Owen) khi ủ với tế bào được các tế bào sinh ra thành một sản phẩm formazan có màu hòa tan trong môi trường nuôi cấy mô (Hình 2.2) Các xét nghiệm được thực hiện bằng cách thêm một lượng nhỏ thuốc thử CellTiter 96® AQueous One Solution trực tiếp vào giếng nuôi cấy, ủ trong 2 giờ và sau đó ghi lại độ hấp phụ ở bước sóng 490 nm với đầu đọc đĩa 96 giếng Số lượng sản phẩm formazan được đo bằng độ hấp phụ ở bước sóng 490 nm tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống trong các giếng nuôi cấy (Hình 2.3)

Hình 2.2 Cấu trúc của MTS tetrazolium và sản phẩm formazan của nó [53]