TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU
Giới thiệu về cây Khoai lang Nhật
2.1.2 Nguồn gốc và phân bố
Khoai lang có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Châu Mỹ, với các bằng chứng khảo cổ học, ngôn ngữ học và sử học cho thấy rằng Trung hoặc Nam Mỹ là nơi khởi nguyên của cây khoai lang.
Các nhà khảo cổ học đã phát hiện bằng chứng về cây khoai lang tại thung lũng Casma, Peru, có niên đại khoảng 2000 năm trước công nguyên (Ugent và Poroski 1983).
Khoai lang được khám phá bởi Christophe Columbus trong cuộc thám hiểm châu Mỹ năm 1492 và được đưa về Tây Ban Nha, nơi nó được gọi là khoai tây Tây Ban Nha hay khoai tây ngọt Tại Việt Nam, theo các tài liệu như “thực vật bản thảo”, “lĩnh nam tạp ký” và “Quảng Đông tân ngữ” của Lê Quý Đôn, khoai lang đã được du nhập từ Philippines vào khoảng cuối thời Minh.
Ngày nay, khoai lang được trồng nhiều nhất là ở các quốc gia Châu Á như
Việt Nam, Trung Quốc và Ấn Độ là những quốc gia nơi cây trồng này phát triển mạnh mẽ, được trồng rộng rãi ở các khu vực nhiệt đới và ôn đới ấm, nơi có đủ lượng nước để hỗ trợ sự phát triển của nó.
Đặc điểm thực vật học, sinh trưởng và phát triển của cây khoai lang
2.2.1 Đặc điểm thực vật học
Trong điều kiện trồng bằng hạt, khi gặp điều kiện thuận lợi, hạt sẽ nảy mầm sau 3 - 5 ngày và phát triển rễ chính Sau 5 - 7 ngày, rễ con bắt đầu xuất hiện, và sau 20 - 25 ngày, lá đầu tiên sẽ xuất hiện cùng với sự phát triển mạnh mẽ của rễ con.
Trong phương pháp trồng bằng dây (sinh sản vô tính), thời gian từ khi đặt dây đến khi rễ ra là khoảng 5 - 7 ngày Rễ hình thành từ các mắt đốt thân, với mỗi mắt có khả năng phát triển 10 - 15 rễ, nhưng thực tế chỉ đạt 5 - 7 rễ, trong đó 2 - 3 rễ có khả năng phân hóa thành rễ củ Rễ khoai lang được chia thành ba loại: rễ con, rễ đực và rễ củ.
Thân khoai lang có hình dạng chủ yếu là thân bò, nhưng cũng tồn tại những giống với thân đứng hoặc thân leo, chiều dài thân có thể đạt từ 2 đến 4 mét, trung bình khoảng 1 đến 2 mét Mỗi đốt trên thân mang một lá, với chiều dài đốt trung bình từ 3 đến 7 cm Tiết diện của thân thường là hình tròn hoặc có cạnh, và một số giống có thể có lông Sự phát triển chiều dài của thân không chỉ phụ thuộc vào giống mà còn chịu ảnh hưởng lớn từ chế độ mưa, loại đất và phân bón Màu sắc của thân cũng khác nhau tùy thuộc vào giống, có thể là trắng vàng, xanh đậm hoặc xanh nhạt.
Khoai lang có lá đơn mọc cách, mỗi mắt có một lá với cuống dài khoảng 10 cm và phiến lá Cuống lá dài giúp lá khoai lang xoay ra ngoài ánh sáng mặt trời Màu sắc cuống lá phụ thuộc vào giống, trong đó đa số giống khoai lang có cuống màu xanh, trong khi một số giống khác có cuống màu tím nhạt hoặc tím.
Khoai lang, thuộc họ bìm bìm, có hoa hình chuông với cuống dài, tương tự như hoa rau muống Hoa thường xuất hiện ở nách lá hoặc đầu ngọn thân, mọc đơn lẻ hoặc thành chùm từ 3 đến 7 bông, nở vào buổi sáng và héo vào giữa trưa Tràng hoa có hình phễu, màu hồng tím hoặc phớt hồng, bên trong có nhiều lông tơ và tuyến mật thu hút côn trùng Mỗi bông hoa gồm 5 nhị đực thấp hơn nhụy cái.
2.2.2 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của cây khoai lang
Sinh trưởng và phát triển của cây khoai lang được chia thành 4 thời kỳ chính: mọc mầm và ra rễ, phân cành và kết củ, phát triển thân lá, và phát triển củ, dựa vào các đặc điểm chủ yếu và yêu cầu ngoại cảnh.
2.2.2.1 Thời kỳ mọc mầm và ra rễ cây khoai lang
Sau 5-7 ngày trồng, khoai lang bắt đầu ra rễ từ các mắt đốt trên thân, trong khi mầm phát triển chậm hơn, cần từ 15-25 ngày Thời gian phát triển này phụ thuộc vào chất lượng giống và điều kiện sinh thái của từng vùng.
2.2.2.2 Thời kỳ phân cành và kết củ cây khoai lang Đặc điểm chủ yếu của thời kỳ này là rễ con tiếp tục phát triển và đạt đến mức tối đa vào cuối thời kỳ này, rễ củ tiếp tục phân hoá hình thành Từ khi trồng đến khi hoàn thành giai đoạn này khoảng 40 – 50 ngày Các nhánh trên thân bắt đầu phát triển và trải dần trên mặt luống Củ hình thành khoảng 1 – 1,5 tháng sau khi trồng và tùy thuộc vào giống, điều kiện tự nhiên Đây là thời kỳ quyết định số củ của cây, bắt đầu có sự hoạt động của các bó mạch gỗ, hình thành các loại tượng tầng sơ cấp và tượng tầng thứ cấp để tạo củ
2.2.2.3 Thời kỳ phát triển thân lá cây khoai lang
Thời gian từ lúc trồng đến hoàn thành thời kỳ phát triển thân là khoảng 75 –
Trong 85 ngày, thời kỳ này nổi bật với sự gia tăng nhanh chóng về tốc độ phát triển của thân lá trên mặt đất Mặc dù sự hình thành rễ củ mới không đáng kể, nhưng các củ đã hình thành trước đó phát triển nhanh về chiều dài.
2.2.2.4 Thời kỳ phát triển củ khoai lang Đặc điểm chủ yếu của thời kỳ này là khối lượng củ tăng lên rất nhanh, nhất là vào giai đoạn cuối khi thân lá phát triển chậm dần và đi đến giảm sút Từ khi trồng đến khi hình thành giai đoạn này khoảng 90 – 105 ngày đối với các giống khoai lang hiện trồng phổ biến ở Việt Nam Điều kiện thuận lợi cho quá trình phình to của củ là sự chênh lệch nhiệt độ ngày và đêm lớn Nhu cầu nước ở thời kỳ này cũng tăng lên, độ ẩm đất thích hợp là 70 - 80% độ ẩm tối đa đồng ruộng Nhu cầu dinh dưỡng (nhất là kali) cũng tăng lên rất nhanh; đất cũng phải thoáng khí Do đó nhiệt độ chênh lệch giữa ngày và đêm vào giai đoạn cuối càng lớn thì năng suất củ khoai lang càng cao.
Một số giống khoai lang được trồng ở Việt Nam
2.3.1 Giống khoai lang Hoàng Long Được chọn lọc từ một giống nhập nội của Trung Quốc vào nước ta năm
Vào năm 1969, giống khoai tây này đã trải qua quá trình chọn lọc và hiện đang được trồng phổ biến ở nhiều vùng sản xuất, đặc biệt là tại đồng bằng trung du Bắc Bộ và Bắc Trung Bộ Giống khoai tây này có đặc điểm thân dài với đốt dài trung bình và màu tím Lá của cây có màu xanh tím, với mặt dưới lá màu tím và lá ngọn màu xanh, có hình dạng giống như hình tim Vỏ củ có màu hồng nhạt, trong khi ruột củ có màu vàng đậm.
Giống khoai lang HL4, phổ biến ở vùng Đông Nam Bộ và có nguồn gốc từ Việt Nam, là giống lai giữa khoai Gạo x Bí Đà Lạt và Tai Nung 57 Thời gian sinh trưởng của HL4 kéo dài từ 85 đến 95 ngày, với năng suất củ tươi đạt từ 18 đến 33 tấn/ha Giống này có tỷ lệ chất khô từ 27-30%, chất lượng củ luộc khá, vỏ củ màu đỏ và thịt củ màu cam đậm, hình dáng củ đẹp mắt Dây cây xanh phủ luống gọn gàng, đồng thời mức độ nhiễm sùng trung bình và nhiễm nhẹ sâu đục dây.
Giống khoai lang HL518 (Nhật đỏ) là một giống khoai lang ưu tú của Việt Nam, được phát triển từ tổ hợp lai Kokey 14 Nhật Bản Hiện nay, giống khoai lang này được trồng phổ biến và bán rộng rãi tại các siêu thị.
Giống khoai lang này có thời gian sinh trưởng từ 95 đến 110 ngày, với năng suất củ tươi đạt từ 17-32 tấn/ha và tỷ lệ chất khô từ 27-30% Củ luộc có chất lượng rất ngon, với vỏ màu đỏ đậm và thịt màu cam đậm Hình dáng củ đều đẹp, dây xanh tím, tuy nhiên có nhiễm nhẹ sùng, hà và sâu đục dây.
2.3.4 Giống khoai lang Nhật dòng DJF
Khoai lang Beniazuma có hình dạng bò lan rộng với thân to mập, ít phân cành và màu tím đặc trưng Lá hình tim màu xanh, trong khi ngọn và lá non có màu xanh vàng Củ thuôn dài, nhẵn với vỏ màu tím và ruột vàng đậm, hàm lượng chất khô đạt 27-33% Đặc biệt, khoai lang này có độ đường và chất lượng cao, rất phù hợp để ăn tươi (luộc, nướng), chế biến và xuất khẩu Giống khoai này có khả năng sinh trưởng phát triển mạnh mẽ, với thời gian sinh trưởng khoảng 120 ngày.
Khoai lang Nhật dòng DJF, do công ty DJF nhập khẩu và cung cấp độc quyền, đang được trồng phổ biến tại Lâm Đồng, Đăk Nông và một số tỉnh phía Nam với năng suất cao từ 15-16 tấn/ha, thậm chí có nơi đạt trên 20 tấn/ha Chất lượng củ khoai lang dòng DJF được đánh giá tốt và đã được xuất khẩu sang nhiều thị trường như Nhật Bản, Hàn Quốc, Singapore và Đài Loan, mang lại giá trị kinh tế cao và được người tiêu dùng ưa chuộng cả trong và ngoài nước.
Tình hình nghiên cứu cây khoai lang trong nước và thế giới
Sự tái sinh chồi khoai lang in vitro từ rễ đã được Hwang và các cộng sự công bố vào năm 1983 Nghiên cứu này cho thấy, các đoạn rễ có kích thước 2 – 3 cm được nuôi cấy trên môi trường MS đã được biến đổi, với việc bổ sung nồng độ muối khoáng cao và myo-inositol.
Nghiên cứu đã sử dụng môi trường nuôi cấy với thành phần gồm 100 mg/l hormone BA, 2 mg/l NAA, 0,1 mg/l đường, và 10 g/l agar để kích thích sự phát triển mô sẹo và mô phân sinh từ các nốt rễ Mười năm sau, Berlamino (1993) đã tái thực hiện quá trình tái sinh chồi từ nốt rễ khoai lang giống Benni Azuma thông qua nuôi cấy mô lá trên môi trường MS có bổ sung.
2,4 – D 0,5 mg/l và BA 0,1 mg/l và thu được tần số tái sinh là 60% với 9 chồi/rễ
Nguyễn Mỹ Uyên và các thành viên (2006), khảo sát sự tăng trưởng in vitro
Cây khoai lang Ipomoea batatas L phát triển tốt dưới điều kiện chiếu sáng tự nhiên, với kết quả thí nghiệm cho thấy rằng nhiệt độ cao và cường độ ánh sáng thay đổi trong ngày không ảnh hưởng tiêu cực đến sự tăng trưởng của cây in vitro Cây nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên có sự phát triển hoàn chỉnh và khỏe mạnh, đồng thời thích ứng tốt và tăng trưởng mạnh khi được chuyển ra vườn ươm.
Nghiên cứu của Lương Thị Ngọc Tú và các thành viên (2019) về nhân giống khoai lang Nhật bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào cho thấy, phương pháp khử trùng tối ưu cho vật liệu khởi đầu là xử lý mẫu với dung dịch cồn 70% trong 40 giây và HgCl2 0,1% trong 10 phút, đạt tỷ lệ mẫu sạch 72,04% và mẫu bật chồi 67,12% Chồi tái sinh từ đỉnh sinh trưởng được sàng lọc virus SPFMV bằng phương pháp PCR Môi trường nhân nhanh phù hợp cho mẫu chồi sạch bệnh là MS + 3% Saccarose + 8 g/l agar + 1 ppm BAP, với hệ số nhân chồi đạt 4,59 chồi/mẫu cấy và chiều cao trung bình 3,6 cm Đối với giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh, nền môi trường nước dừa 10% + Saccarose 30 g/l + agar 8 g/l + 1 ppm GA3 có bổ sung 1,5 ppm IAA cho hiệu quả tốt nhất, với số rễ trung bình đạt 8,12 rễ, chiều dài trung bình rễ 7,77 cm và chiều cao trung bình của thân 7,60 cm.
Quy trình tái sinh cây trực tiếp, theo nghiên cứu của Prakash và cộng sự (1996), bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn đầu sử dụng mô cuống lá trong môi trường MS có bổ sung 2,4-D, và giai đoạn thứ hai sử dụng TDZ Kết quả cho thấy khả năng tái sinh cây phụ thuộc vào kiểu di truyền, giai đoạn phát triển và hướng đặt mô cuống lá trên môi trường nuôi cấy Đối với giống khoai lang Nhật dòng DJF, do là giống mới nhập nội, hiện chưa có quy trình nghiên cứu nào được thực hiện cho giống này.
Tình hình sản xuất cây khoai lang và tiêu thụ trong nước và thế giới
Theo số liệu thống kê của FAOSTAT năm 2004 thì sản lượng khoai lang
Toàn thế giới sản xuất 127 triệu tấn với diện tích trồng là 9,01 triệu ha, trong đó Trung Quốc chiếm phần lớn với sản lượng 105 triệu tấn và diện tích trồng đạt 49.000 km².
Năm 2007, có 111 quốc gia trên toàn thế giới trồng khoai lang trên diện tích 8,81 triệu ha, với 95% diện tích nằm ở các nước đang phát triển Năng suất trung bình đạt 14,0 tấn/ha, tổng sản lượng lên tới 122,03 triệu tấn (FAOSTAT, 2007).
Nơi dùng nhiều khoai lang làm lương thực cho người là quần đảo Solomon
Mỗi người tiêu thụ trung bình 160 kg khoai lang mỗi năm tại một số quốc gia, trong khi Burundi tiêu thụ khoảng 130 kg/người/năm Bang Bắc Carolina ở Mỹ đóng góp 40% sản lượng khoai lang hàng năm của toàn quốc Bên cạnh đó, tại Đông Nam Mỹ, một lượng lớn khoai lang được lên men để sản xuất ethanol.
Mỹ là hai nước hiện có chất lượng khoai lang cao nhất
Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc, sản xuất khoai lang toàn cầu đang gia tăng, với 111,5 triệu tấn vào năm 2016 và 112,8 triệu tấn vào năm 2017 Châu Á dẫn đầu về diện tích sản xuất khoai lang, chiếm 71,8% tổng sản lượng toàn thế giới (FAOSTAT, 2019).
Năm 2004, ở nước ta khoai lang là 1 trong 4 loại cây lương thực chính sau lúa, ngô, săn, nhưng năng suất khoai lang còn thấp với 1,65 triệu tấn (FAO 2004) Năm
Năm 2007, diện tích trồng khoai lang tại Việt Nam đạt 205 nghìn ha với năng suất bình quân khoảng 7,56 tấn/ha, tổng sản lượng đạt 1,55 triệu tấn Vùng Bắc Trung Bộ là khu vực trồng khoai lang nhiều nhất, chiếm 31,8% diện tích, tiếp theo là vùng Đông Bắc (22,4%), đồng bằng sông Hồng (19,8%) và đồng bằng sông Cửu Long (6,37%) Về sản lượng, vùng Bắc Trung Bộ cũng dẫn đầu với 25,3%, sau đó là đồng bằng sông Hồng (23,5%), vùng Đông Bắc (18,3%) và đồng bằng sông Cửu Long (15,5%).
Từ năm 2015 đến năm 2017, năng suất khoai lang nước ta ngày càng tăng lên Năm 2016 năng suất khoai lang tăng lên 1,3 tạ/ha so với năm 2015, năm
2017 năng suất đạt 110,9 tạ/ha - tăng 5,3 tạ/ha so với năm 2016 (Viện Nghiên cứu Chiến lược Thương hiệu và Cạnh tranh, 2017)
Quy trình nhân giống In vitro
2.6.1 Khử trùng mẫu cấy Đây là giai đoạn quan trọng quyết định đến toàn bộ quá trình nhân giống in vitro Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro
Mục đích của các giai đoạn tái sinh mô nuôi cấy là để đạt được sự phát triển định hướng Quá trình này chủ yếu phụ thuộc vào tỷ lệ các hợp chất auxin và cytokinin được bổ sung vào môi trường nuôi cấy Ngoài ra, cần lưu ý đến tuổi sinh lý của mẫu cấy để đảm bảo hiệu quả của quá trình.
2.6.3 Nhân nhanh mẫu cấy Để tăng hệ số nhân, ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hoà sinh trưởng (Auxin, Cytokynin, Gibberellin,…), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men,… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp Tuỳ thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành qua các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính
Sau khi nhân nhanh, các chồi đạt kích thước nhất định sẽ được chuyển sang môi trường tạo rễ Chỉ sau 2 – 3 tuần, những chồi này sẽ phát triển rễ và hình thành cây hoàn chỉnh Trong giai đoạn này, người ta thường bổ sung auxin, một nhóm hormon thực vật quan trọng, vào môi trường nuôi cấy để kích thích sự phát triển rễ phụ từ mô nuôi cấy.
2.6.5 Đưa cây ra ngoài vườn ươm
Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng trong quá trình nhân giống in vitro, quyết định khả năng ứng dụng trong sản xuất thực tiễn Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng, vì vậy cần đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ.
11 ánh sáng, ẩm độ, giá thể,…) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm.
Thành phần hóa học của môi trường nuôi cấy tế bào thực vật
Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau:
Các nguyên tố đa lượng, bao gồm nitrogen, potassium, calcium, phosphorus, magnesium và sulfur, là sáu yếu tố chính thiết yếu cho sự sinh trưởng của thực vật bậc cao.
Các nguyên tố vi lượng, bao gồm các loại muối của sắt, kẽm, mangan, boron, copper, molybdenum và cobalt ở dạng vết
Các phụ gia hữu cơ bao gồm một lượng nhỏ vitamin như myo-inositol, thiamine, nicotinic acid, pyridoxine và riboflavin, cùng với các amino acid có thể được bỏ qua, nhưng trong một số trường hợp đặc biệt có thể sử dụng Ngoài ra, còn có các phụ gia hữu cơ không xác định khác như malt, dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein và nước dừa.
Nguồn carbon trong nuôi cấy tế bào thực vật thường sử dụng sucrose thay vì carbon từ khí quyển do quang hợp, vì tế bào thực vật thường mất khả năng này Glucose cũng được sử dụng trong môi trường nuôi cấy với hiệu quả tương đương sucrose, trong khi fructose cho hiệu quả thấp hơn.
Các tác nhân tạo gel môi trường thường được sử dụng bao gồm agar, một polysaccharide chiết xuất từ một số loài tảo đỏ (Rhodophyta) Ngoài ra, một số hợp chất khác như alginate, phytagel, methacel và gel-rite cũng đã được thử nghiệm thành công.
Auxin là một nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật quan trọng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật Chúng kết hợp với các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự phát triển của mô sẹo và huyền phù tế bào Đặc biệt, auxin có tác dụng điều hòa sự phát sinh hình thái khi được sử dụng kết hợp với cytokinin.
Auxin là một hợp chất có cấu trúc nhân indole với công thức hóa học C10H9O2N Có hai loại auxin: loại nội sinh do thực vật tự sản xuất (IAA) và loại tổng hợp do con người tạo ra (IBA, NAA, 2,4-D).
Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, và hoạt động của nó phụ thuộc vào nồng độ cũng như sự tương tác với các chất điều hòa tăng trưởng khác.
Auxin ảnh hưởng đến quá trình kéo dài của tế bào bằng cách tăng cường tính đàn hồi của thành tế bào Sự gia tăng này cho phép nước xâm nhập vào tế bào, làm giảm sức căng của thành tế bào và dẫn đến sự kéo dài tự nhiên của tế bào.
Auxin làm thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào, dẫn đến sự phóng thích ion H+ Ion H+ này kích thích hoạt tính acid, làm giảm tính đề kháng của thành tế bào thông qua việc hấp thu ion K+.
Auxin tác động lên các quá trình chuyển hóa, đặc biệt nhất là trên sự tổng hợp ARN ribosome
Auxin đóng vai trò quan trọng trong việc kích thích phân chia tế bào, đặc biệt là trong quá trình hình thành mô sẹo và rễ bất định Ngoài ra, auxin còn có tác dụng ức chế sự phát triển của chồi nách và sự hình thành phôi sinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy mô sẹo.
Tất cả cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo giai đoạn phát triển, chủ yếu ở lá non, chồi hoạt động, phát hoa và quả non Auxin di chuyển từ đỉnh xuống dưới với sự phân cực rõ ràng, nhưng trong quá trình này, chúng bị oxy hóa bởi enzyme auxin-oxidase, dẫn đến nồng độ auxin cao hơn ở các vùng tổng hợp Đặc biệt, auxin cần thiết cho sự hình thành rễ của các cành giâm ở một số loài cây.
Cytokinin là một loại hormone thực vật quan trọng trong việc điều hòa sinh trưởng Mặc dù ảnh hưởng của cytokinin trên thực vật nguyên vẹn là hạn chế, nhưng nó có khả năng kích thích mạnh mẽ quá trình tổng hợp protein.
Cytokinin, được phát hiện sau auxin và gibberellin, đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự phân chia tế bào và hình thành chồi trong môi trường nuôi cấy Các hợp chất adenin này bao gồm hai nhóm cytokinin nội sinh chính là zeatin và IPA, cùng với hai nhóm cytokinin tổng hợp phổ biến là Kinetin và BAP Mặc dù zeatin và IPA là cytokinin tự nhiên, nhưng chúng ít được sử dụng trong thí nghiệm do chi phí cao, trong khi Kinetin và BAP thường được ưa chuộng hơn trong nuôi cấy mô thực vật.
Trong nuôi cấy mô, sự thiếu hụt cytokinin dẫn đến việc ngăn chặn phân chia nhân tế bào ở một giai đoạn trong chu trình tế bào Khi chuyển mô sang môi trường mới có chứa cytokinin, tế bào sẽ bắt đầu phân chia liên tục sau giai đoạn nghỉ Đặc biệt, sự phân chia tế bào trong mô sẹo có thể xảy ra mà không cần cytokinin trong môi trường nuôi cấy, nhờ vào khả năng tự tổng hợp cytokinin của tế bào.
Cytokinin đóng vai trò quan trọng trong việc kích thích sự tạo chồi ở thực vật, cả trong điều kiện tự nhiên lẫn trong nuôi cấy mô in vitro Tác dụng của cytokinin thường được tăng cường khi kết hợp với auxin Việc sử dụng tỉ lệ hợp lý giữa auxin và cytokinin có thể ảnh hưởng tích cực đến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng khử trùng của viên Presept trong việc tạo nguồn vật liệu khoai lang Nhật DJF in vitro sạch ban đầu
Chọn đoạn thân mang chồi ngủ từ cây khoai lang khỏe mạnh, không sâu bệnh, sau đó cắt và rửa sạch dưới vòi nước trong 15 phút Tiến hành lắc mẫu với xà bông trong 15 phút trên máy Voltex với tốc độ 180 vòng/phút, rồi rửa lại bằng nước cất vô trùng 2-3 lần Đưa mẫu vào tủ cấy và thực hiện khử trùng trong điều kiện vô trùng, chuyển mẫu vào bình tam giác sạch đã vô trùng, tráng với cồn 70% trong 30 giây và rửa lại bằng nước cất vô trùng 2-3 lần Khử trùng mẫu bằng dung dịch Presept nồng độ 15g/lít trong 25 phút, chia thành 2 lần khử trùng 15 phút và 10 phút, sau đó rửa lại bằng nước cất khử trùng 2-3 lần Cuối cùng, cắt đoạn thân có 1-2 mắt ngủ để cấy vào ống nghiệm chứa môi trường MS và đặt trong điều kiện tối hoàn toàn trong 3 ngày trước khi đưa ra ngoài sáng và theo dõi sau 2 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm gồm có 1 nghiệm thức, mẫu sau khử trùng được cấy trong ống nghiệm Mỗi ống nghiệm cấy 1 mẫu cấy
Bảng 3.1: Tổ hợp phương thức khử trùng đoạn thân khoai lang
Nghiệm thức Cồn 70% (giây) Presept 15g/l
Tỷ lệ mẫu sống vô trùng (%) = 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑚ẫ𝑢 𝑠ố𝑛𝑔
Mẫu đoạn thân sau khi cấy vào ống nghiệm được theo dõi trong 3 - 4 tuần.
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của các nồng độ BAP và nước dừa lên khả năng tạo chồi in vitro của cây khoai lang Nhật DJF
lên khả năng tạo chồi in vitro của cây khoai lang Nhật DJF
Sử dụng mẫu chồi tái sinh trong ống nghiệm, được 1 tháng tuổi ở thí nghiệm
Để tiến hành thí nghiệm, các chồi khoai lang Nhật in vitro được cắt khoảng 0,6 cm, bao gồm đỉnh và 1-2 lá thật, sau đó được cấy vào môi trường MS Môi trường này có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BAP, NAA và nước dừa theo bảng 3.2, với nồng độ đường là 30g/l và agar 6,5 g/l Trước khi hấp khử trùng ở 121 o C, 1 atm, pH của môi trường được điều chỉnh về 5,8 ± 0,02.
Thí nghiệm được thiết kế với 4 nghiệm thức, được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên và lặp lại 3 lần Mỗi lần lặp lại sẽ cấy trong 2 chai môi trường, với mỗi chai chứa 3 mẫu khác nhau.
Bảng 3.1: Thành phần môi trường trong các nghiệm thức khảo sát khả năng nhân nhanh chồi khoai lang DJF
Nghiệm thức BA (mg/l) -NAA (mg/l) Nước dừa (%)
- Số chồi (chồi/mẫu cấy): tính bằng cách đếm tất cả các chồi ở mỗi mẫu cấy
- Chiều cao chồi: tính từ gốc tới đỉnh ngọn
- Số lượng lá/mẫu cấy.
Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của hợp chất Auxin, nước dừa đến khả năng tạo rễ của chồi in vitro của cây khoai lang Nhật DJF
Chọn chồi khoai lang in vitro khỏe mạnh, cao từ 1-1,5cm, và cấy chuyển vào môi trường MS có bổ sung NAA, IBA, nước dừa và than hoạt tính theo nồng độ trong bảng 3.3 Theo dõi sự phát triển của mẫu cây trong vòng 4 tuần.
Thí nghiệm được thiết kế với 6 nghiệm thức, được sắp xếp hoàn toàn ngẫu nhiên Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, với mỗi lần lặp lại cấy trong 2 chai môi trường, và mỗi chai sẽ cấy 3 mẫu.
Bảng 3.3: Thành phần môi trường của các nghiệm thức khảo sát khả năng tạo rễ của chồi in vitro cây khoai lang Nhật DJF
Tỷ lệ mẫu ra rễ (%) = 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑟𝑎 𝑟ễ
Chiều dài rễ: tính từ gốc chồi tới đỉnh rễ
Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả các thí nghiệm trong nghiên cứu này được thực hiện theo thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố (CRD - Completely Randomized Design), đảm bảo tính ngẫu nhiên và độ tin cậy trong việc phân tích và xử lý thống kê.
Số liệu thu được từ các thí nghiệm được phân tích ANOVA và trắc nghiệm phân hạng Tukey bằng phần mềm SPSS
