Nghiên cứu tạo cây đậu xanh chuyển gen có khả năng kháng mọt

Những đóng góp mới của luận án Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống từ đánh giá và phân nhóm các giống đậu xanh có khả năng kháng mọt khác nhau; phân lập, tá

24

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1 Kết luận

1.1 Khả năng kháng mọt của 8 giống đậu xanh được đánh giá thông qua các

chỉ tiêu như khối lượng hạt hao hụt, tỷ lệ nhiễm mọt, hệ số gia tăng quần thể

Giống đậu xanh Tằm TH có khả năng kháng mọt tốt nhất, chỉ số mẫn cảm với

mọt C chinensis là 634,63; giống đậu xanh ĐX22 có khả năng kháng mọt

kém nhất, chỉ số mẫn cảm với mọt là 1058,72 và cao hơn ở giống Tằm TH

1,67 lần

1.2 Gen VrPDF1 phân lập từ cây đậu xanh gồm 356 bp, có cấu trúc phân

đoạn, gồm hai exon và một intron Đoạn mã hóa của gen VrPDF1 có kích

thước 228 bp, mã hóa 75 amino acid

1.3 Vector chuyển gen thực vật pBetaPhaso-VrPDF1 biểu hiện ở hạt đã được

thiết kế thành công và hoạt động tốt trên cây thuốc lá Gen chuyển VrPDF1 đã

hợp nhất vào hệ gen của cây thuốc lá chuyển gen và được di truyền từ thế hệ

T0 sang thế hệ T1 Protein tái tổ hợp VrPDF1 có kích thước khoảng 10 kDa

được biểu hiện ở hạt thuốc lá và có khả năng ức chế -amylase của ruột ấu

trùng mọt

1.4 Biến nạp thành công cấu trúc pBetaPhaso-VrPDF1 và tạo được dòng cây

đậu xanh chuyển gen ở thế hệ T1 từ giống đậu xanh ĐX22 Xác định được

protein tái tổ hợp VrPDF1 biểu hiện ở hai dòng cây đậu xanh chuyển gen thế

hệ T1 (DX1-3 và DX1-7) có kích thước khoảng 10 kDa Hiệu suất chuyển gen

ở giống đậu xanh ĐX22 đạt 0,32% Protein tái tổ hợp VrPDF1 biểu hiện ức

chế -amylase của ấu trùng mọt, hiệu suất ức chế -amylase ở hai dòng đậu

xanh chuyển gen DX1-3 và DX1-7 thế hệ T1 tăng 166,40 % và 178,19% so

với cây không chuyển gen

2 Đề nghị

Tiếp tục theo dõi, đánh giá hai dòng đậu xanh DX1-3 và DX1-7 ở các thế hệ tiếp theo, thử nghiệm khả năng kháng mọt thông qua lây nhiễm nhân

tạo nhằm chọn tạo dòng đậu xanh chuyển gen ổn định về khả năng kháng mọt

cao

1

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đậu xanh là một trong ba cây đậu đỗ chính trong nhóm các cây đậu

ăn hạt, đứng sau đậu tương và lạc Hạt đậu xanh là nguồn thực phẩm giàu đạm Hạt đậu xanh vừa cung cấp protein cho con người, vừa có giá trị trong

y học, và cũng là cây có giá trị trong cải tạo đất Việt Nam là quốc gia có điều kiện tốt để phát triển sản xuất nông nghiệp, tuy nhiên cũng là yếu tố thuận lợi cho sâu hại phát sinh, phát triển gây tổn thất nghiêm trọng tới năng suất và phẩm chất của nông sản Theo ước tính, tổn thất sau thu hoạch khoảng từ 10% - 30% sản lượng cây trồng nông nghiệp Điều này có nghĩa

là khoảng 10% - 30% lượng lương thực không bao giờ được sử dụng và cũng là tỷ lệ tổn thất của công sức và tài chính đầu tư trong sản xuất nông nghiệp Do đó, việc đánh giá và hạn chế tổn thất sau thu hoạch là công tác rất có ý nghĩa trong việc đảm bảo lương thực trong điều kiện hạn chế diện tích trồng trọt và dân số đang gia tăng hiện nay

Đối với nhóm nông sản là hạt thì một trong những nguyên nhân chính gây tổn thất đến số lượng và chất lượng hạt là côn trùng mà chủ yếu là một số thuộc Bộ cánh cứng (thường gọi là mọt) Các loài mọt gây hại chủ yếu cho

đậu đỗ là: mọt đậu xanh (Callosobruchus chinensis L.), mọt đậu đỏ (Callosobruchus maculatus F.), mọt đậu nành (Ancanthoscelides obtectus)… Trong đó, mọt đậu xanh Callosobruchus chinensis L thuộc họ Bruchid,

bộ Coleoptera là loài gây hại chủ yếu cho hạt đậu xanh Sự tổn hại do mọt gây

ra là rất lớn, do đó công tác phòng trừ mọt đậu nói chung và mọt đậu xanh nói riêng đang là một vấn đề cần được quan tâm nghiên cứu

Hiện nay, đã có một số nghiên cứu bước đầu đánh giá về khả năng kháng mọt, kháng nấm, kháng virus … trên một số loại cây trồng trong đó có đậu xanh Theo các nghiên cứu đã công bố, đặc tính kháng mọt hại hạt của cây trồng rất phức tạp và liên quan đến hoạt động của protein defensin Defensin thực vật là nhóm chuỗi peptide nhỏ đặc trưng bởi cấu trúc gấp cuộn

ba chiều qua 8 cầu nối disulfide của các cystein Defensin thực vật hoạt động mạnh sẽ tổng hợp protein ức chế, ảnh hưởng đến kênh trao đổi ion, tác động đến hoạt động của α-amylase và trypsin, làm suy yếu vi sinh vật… Cơ chế gây độc của defensin đối với mọt đậu xanh là sự cản trở hoạt động phân giải tinh

bột của -amylase trong ruột mọt và ngăn chặn sự tiêu hoá tinh bột của mọt,

ức chế sự sinh trưởng phát triển của mọt Defensin trong hạt đậu xanh có hàm

lượng thấp và khác nhau giữa các giống, vì thế để tăng hiệu quả ức chế α-amylase

của ruột ấu trùng mọt, việc ứng dụng công nghệ gen nhằm tăng cường biểu hiện,

nâng cao hàm lượng defensin trong hạt được quan tâm nghiên cứu Xuất phát từ

những cơ sở trên, chúng tôi lựa chọn đề tài cho luận án là: “Nghiên cứu tạo cây

đậu xanh chuyển gen có khả năng kháng mọt”

2 Mục tiêu nghiên cứu

(i) Phân tích được đặc điểm của gen defensin 1 (VrPDF1) phân lập từ các

giống đậu xanh Việt Nam có khả năng kháng mọt khác nhau

(ii) Biểu hiện được gen defensin 1 trên cây thuốc lá chuyển gen

(iii) Tạo được cây đậu xanh chuyển gen chứa gen liên quan đến tính kháng mọt

Callosobruchus chinensis L

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Nghiên cứu đánh giá khả năng kháng mọt của một số giống đậu xanh

trồng phổ biến ở miền Bắc Việt Nam

3.2 Nghiên cứu thông tin, tách dòng và xác định trình tự gen VrPDF1 phân

lập từ cây đậu xanh Phân tích đặc điểm trình tự nucleotide, trình tự amino

acid suy diễn của gen VrPDF1 phân lập từ giống đậu xanh có khả năng kháng

mọt tốt nhất và giống đậu xanh kháng mọt kém nhất

3.3 Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen VrPDF1 và phân tích hoạt

động của vector chuyển gen trên cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 và T1

3.4 Nghiên cứu chuyển cấu trúc chứa gen VrPDF1 và tạo cây đậu xanh

chuyển gen Phân tích biểu hiện protein tái tổ hợp rVrPDF1 ở cây đậu xanh

chuyển gen ở thế hệ T1

4 Những đóng góp mới của luận án

Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống từ

đánh giá và phân nhóm các giống đậu xanh có khả năng kháng mọt khác

nhau; phân lập, tách dòng gen VrPDF1 đến thiết kế vector chuyển gen, tạo

cây chuyển gen và phân tích sự biểu hiện gen chuyển VrPDF1, cụ thể là:

1) Đã phân lập được gen VrPDF1 từ DNA hệ gen của hai giống đậu xanh có

khả năng kháng mọt khác biệt nhau Gen VrPDF1 có kích thước 356 bp gồm

23

DX1-3, DX1-7 ở bảng 3.10 cho thấy hiệu suất hoạt động của -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh và dịch protein chiết từ cây chuyển gen giảm so với dịch protein chiết từ cây không chuyển gen, chỉ bằng 33,60% (DX1-3) và 21,81% (DX1-7) Như vậy có thể thấy trong nghiên cứu này, protein tái tổ hợp rVrPDF1 của hai dòng đậu xanh chuyển gen T1 đã ức chế hoạt động -amylase của ấu trùng mọt đậu xanh So với cây không chuyển gen, hiệu suất

ức chế -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh của rVrPDF1 ở dòng đậu xanh chuyển gen DX1-3 tăng 166,40% và 178,19% ở dòng DX1-7 (Hình 3.24)

Defensin ở hạt đậu xanh có khả năng ức chế -amylase của mọt đậu

xanh Gen VrPDF1 (gen nội tại) mã hóa protein defensin ở đậu xanh có kích

thước 356 bp, gen chuyển VrPDF1 có kích thước 228 bp cùng hoạt động phiên mã và dịch mã tổng hợp protein defensin VrPDF1 và protein VrPDF1 đều ức chế hoạt động -amylase của ấu trùng mọt đậu xanh Kết quả so sánh hiệu suất ức chế -amylase ở từ ấu trùng mọt đậu xanh của rVrPDF1 ở dòng đậu xanh chuyển gen DX1-3 tăng 166,40% và 178,19% ở dòng DX1-7 so với cây không chuyển gen đã chứng minh sự tăng cường biểu hiện defensin trong hạt bằng ứng ứng dụng kỹ thuật chuyển gen là biện pháp nâng cao khả năng kháng mọt hại hạt của cây đậu xanh

33,60

166,40

21,81

178,19

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0 180,0 200,0

Hiệu suất hoạt động của alpha-amylase của dòng cây chuyển gen giảm so với cây WT

Hiệu suất ức chế alpha-amylase của dòng cây chuyển gen tăng so với cây WT

WT ĐX1-3 ĐX1-7

Hình 3.24 Biểu đồ so sánh hiệu suất hoạt động -amylase và hiệu suất ức

chế -amylase của protein defensin trong hỗn hợp -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh và dịch protein chiết từ cây chuyển gen, cây không chuyển gen

Phân tích định tính hoạt độ của -amylase từ ấu trùng mọt phân giải

cơ chất tinh bột được thể hiện ở hình 3.23

Hình 3.23 Hình ảnh phân tích định tính khả năng ức chế α-amylase ấu trùng mọt

đậu xanh của protein tái tổ hợp rVrDEF1 từ hạt cây đậu xanh chuyển gen ĐX22

thế hệ T1 và hạt cây đậu xanh ĐX22 đối chứng không chuyển gen

3.3.5 Thảo luận kết quả tăng cường biểu hiện protein VrPDF1 ở cây đậu

xanh chuyển gen

Gen chuyển biểu hiện trong cây chuyển gen được kiểm tra dựa trên kết

quả phân tích hoạt động phiên mã và dịch mã của gen chuyển bằng sử dụng

các kỹ thuật RT-PCR, Real time RT-PCR, Western blot Tương tự các phân

tích biểu hiện gen của các nghiên cứu trước đây, trong kết quả nghiên cứu của

chúng tôi, protein tái tổ hợp VrPDF1 được biểu hiện ở cả cây mô hình và cây

chuyển gen với kích thước khoảng 10 kDa Khác với các nghiên cứu trên,

trong phân tích protein tái tổ hợp ở cây chuyển gen chúng tôi sử dụng kỹ thuật

ELISA để so sánh mức độ biểu hiện protein tái tổ hợp giữa các dòng cây

chuyển gen Theo đó, kết quả phân tích ELISA ở 2 dòng đậu xanh chuyển gen

DX1-3 và DX1-7 đã xác định được hàm lượng protein tái tổ hợp VrPDF1 ở

dòng DX1-7 cao hơn dòng DX1-3 (Hình 3.22) Như vậy, theo hướng tiếp cận

khả năng kháng mọt tương quan với hàm lượng protein defensin VrPDF1 thì

kết quả phân ELISA ở trên có thể dự đoán ở thế hệ đậu xanh chuyển gen T1

dòng DX1-7 có khả năng kháng mọt cao hơn dòng DX1-3 Tuy nhiên, điều

này cần được kiểm chứng bằng thực nghiệm phân tích hoạt động ức chế

-amylase của protein tái tổ hợp VrPDF1 và so sánh khả năng kháng mọt giữa

các dòng đậu xanh chuyển gen và giữa dòng chuyển gen và cây đối chứng

không chuyển gen Trong kết quả đánh giá hoạt động ức chế -amylase từ ấu

trùng mọt đậu xanh của protein tái tổ hợp rVrPDF1 của hai dòng đậu xanh

1 intron (128 bp) xen giữa 2 exon (228 bp); cDNA của gen VrPDF1 có

228bp, mã hóa 75 amino acid.

2) Protein tái tổ hợp rVrPDF1 được biểu hiện trên cây thuốc lá chuyển gen và dịch chiết chứa protein rVrPDF1 từ dòng thuốc lá chuyển gen T1 có khả năng

ức chế -amylase của ruột ấu trùng mọt

3) Tạo được cây đậu xanh của giống ĐX22 mang gen chuyển VrPDF1 ở thế

hệ T1 và biểu hiện thành công protein tái tổ hợp rVrPDF1 Chứng minh được dịch chiết chứa protein tái tổ hợp rVrPDF1 biểu hiện ức chế -amylase của ấu trùng mọt, hiệu suất ức chế -amylase ở hai dòng chuyển gen 3 và

DX1-7 tăng 166,40 % và 1DX1-78,19% so với cây không chuyển gen

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

5.1 Về mặt khoa học

Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của gen

VrPDF1 phân lập từ các giống đậu xanh Việt Nam có khả năng kháng mọt

khác nhau Sự tăng cường biểu hiện protein tái tổ hợp rVrPDF và biểu hiện khả năng ức chế -amylase của ruột ấu trùng mọt của protein này từ cây chuyển gen là những cơ sở khoa học để khẳng định hiệu quả của việc ứng dụng công nghệ gen nhằm nâng cao khả năng kháng mọt của đậu xanh nói riêng và cây trồng thu hạt nói chung

5.2 Về mặt thực tiễn

Các trình tự gen VrPDF1 phân lập được, cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen VrPDF1, các dòng cây chuyển gen ở T1, dịch chiết chứa

rVrPDF1 có khả năng ức chế -amylase của ruột ấu trùng mọt đã góp phần giải quyết những vấn đề cụ thể về việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng kháng mọt của cây đậu xanh, mở ra triển vọng ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại vào thực tiễn chọn giống cây trồng thu hạt ở Việt Nam

6 Cấu trúc của luận án: Luận án có 119 trang (kể cả tài liệu tham khảo)

được chia thành các chương, phần: Mở đầu (4 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (31 trang); Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (22 trang); Chương 3: Kết quả và thảo luận (42 trang); Kết luận và đề nghị (1 trang); Các công trình công bố liên quan đến luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (18 trang) Luận án có 21 bảng, 31 hình và tham khảo 158 tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Luận án đã tham khảo và tổng kết 158 tài liệu, trong đó có 27 tài liệu

tiếng Việt, 126 tài liệu tiếng Anh và 5 địa chỉ trang web về 3 vấn đề cơ bản

liên quan, như: (1) Đặc điểm của mọt hại đậu xanh và sự thiệt hại của mọt gây

ra cho đậu xanh; (2) Defensin thực vật; (3) Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen và

biểu hiện gen defensin thực vật ở một số loài thuộc chi Vigna

Đậu xanh là cây thực phẩm ngắn ngày giá trị kinh tế cao, dễ canh tác,

là nguồn thực phẩm chứa đầy thành phần dinh dưỡng cho con người và vật

nuôi Hiện nay, đậu xanh đóng vai trò quan trọng sau đậu tương và lạc, bởi

vậy là nhóm cây trồng được ưu tiên khuyến khích sản xuất Nhằm nâng cao

năng suất, sản lượng đậu xanh, nhiều công trình tập trung nghiên cứu, chọn

tạo và đưa ra các giống có chất lượng, chống chịu điều kiện bất lợi và phù

hợp với mọi vùng đất canh tác

Sâu bệnh là nguyên nhân trực tiếp ảnh hưởng tới năng suất và bảo quản

sau thu hoạch các loài cây lấy hạt như đậu xanh, đậu tương,…, làm giảm chất

lượng và giá trị thương phẩm của sản phẩm, trong đó có mọt hại đậu xanh

Mọt gây hại đậu xanh (Callosobruchus chinensis L.) không những gây hại

trong kho dự trữ mà chúng còn lan truyền và gây hại cả ở ngoài đồng ruộng

Mọt đậu xanh gây hại trên các loại đậu: đậu xanh, đậu tằm, đậu đũa, đậu Hà

Lan, đậu đen trong đó hại nặng nhất là đậu xanh với tỷ lệ hại 100% (Bùi Công

Hiển, 1995) Sự thiệt hại do chúng gây ra là rất lớn, do đó công tác phòng trừ

sâu mọt đậu nói chung và mọt đậu xanh nói riêng đang là một vấn đề cấp thiết

cần được quan tâm nghiên cứu Trong những năm qua có nhiều công trình

nghiên cứu chọn tạo các loại cây trồng có khả năng kháng các loại côn trùng,

nấm và virus Các nghiên cứu đều thống nhất rằng đặc tính kháng mọt hại hạt

của cây trồng rất phức tạp và liên quan đến hoạt động của protein defensin

Defensin thực vật là nhóm chuỗi peptide nhỏ đặc trưng bởi cấu trúc gấp

cuộn ba chiều qua tám cầu nối disulfide của các cystein Defensin thực vật

hoạt động mạnh sẽ tổng hợp protein ức chế, ảnh hưởng đến chức năng kênh

ion, tác động đến hoạt động của α-amylase và trypsin, làm suy yếu vi sinh vật

(Cavalho et al., 2011) Cơ chế gây độc của defensin đối với côn trùng ở hạt

đậu xanh được mô tả như là sự cản trở enzyme phân giải tinh bột, làm cho

21

3.3.4 Kiểm tra hoạt động ức chế -amylase từ ấu trùng mọt của protein tái tổ hợp rVrPDF1 ở thế hệ T1

Dịch chiết protein từ hạt đậu xanh của hai dòng chuyển gen DX1-3, DX1-7 ở thế hệ T1 đã kiểm tra sự biểu hiện protein defensin tái tổ hợp bằng Western blot và ELISA và dịch chiết protein từ hạt của cây không chuyển gen

WT được sử dụng thử nghiệm kiểm tra khả năng ức chế -amylase của ấu trùng mọt đậu xanh Kết quả được thể hiện ở bảng 3.10

Bảng 3.10 Hoạt độ của -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh trong các mẫu ủ

với dịch chiết protein từ hạt của các dòng đậu xanh chuyển gen T1 và từ hạt cây không chuyển gen

-amylase từ ấu trùng mọt

trùng mọt đậu xanh và dịch protein chiết từ các dòng cây chuyển gen

Hoạt độ α-amylase (ĐVHĐ/mg)

9,47 ± 0,29 6,19 ± 0,09 2,08 ± 0,06 1,35 ± 0,05

Bảng 3.10 cho thấy hoạt độ của amylase trong thí nghiệm chỉ có -amylase từ ấu trùng mọt và cơ chất tinh bột là 9,47 (ĐVHĐ/mg), trong khó đó hoạt độ của -amylase trong hỗn hợp -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh và

dịch protein chiết từ cây không chuyển gen là 6,19 (ĐVHĐ/mg) Đối với hai dòng cây chuyển gen, hoạt độ của -amylase trong hỗn hợp -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh và dịch protein chiết từ dòng cây chuyển gen DX1-3 là 2,08 (ĐVHĐ/mg), từ dòng DX1-7 là 1,35 (ĐVHĐ/mg) Như vậy có thể thấy,

dịch chiết protein từ cây chuyển gen và cây không chuyển gen đều có hiện

tượng làm giảm hoạt độ -amylase so với thí nghiệm chỉ có -amylase từ ấu

trùng mọt và cơ chất tinh bột Kêt quả phân tích cho thấy hỗn hợp -amylase

từ ấu trùng mọt đậu xanh và dịch protein chiết từ hai dòng cây chuyển gen (DX1-3 và DX1-7) có hoạt độ -amylase thấp hơn ở cây không chuyển gen Điều này cho thấy protein tái tổ hợp rVrPDF1 trong hai dòng đậu xanh

chuyển gen ở thế hệ T1 có khả năng ức chế -amylase từ ấu trùng mọt

và cây WT không xuất hiện băng protein Kết quả phân tích Western blot đã

chứng minh protein tái tổ hợp rVrPDF1 đã được biểu hiện thành công trên hai

dòng đậu xanh chuyển gen DX1-3 và DX1-7 có nguồn gốc từ giống đậu xanh

ĐX22 Như vậy có thể nhận xét rằng, gen chuyển VrPDF1 đã di truyền qua

sinh sản hữu tính từ thế hệ T0 sang T1, hoạt động ổn định và biểu hiện ở cả

hai thế hệ cây chuyển gen

Hình 3.21 Kết quả phân tích Western blot từ 3 dòng đậu xanh chuyển gen thế hệ T1

và cây đối chứng không chuyển gen

Hàm lượng protein tái tổ hợp rVrPDF1 trong hạt của hai dòng DX1-3

và DX1-7 ở thế hệ T1 được phân tích bằng ELISA, kết quả được thể hiện ở

hình 3.22 Biểu đồ cho thấy hai dòng đậu xanh chuyển gen tổng hợp rVrPDF1

với hàm lượng protein dao động từ 6,23 µg/mg đến 9,26 µg/mg Dòng DX1-7

là hàm lượng protein rVrPDF1 cao hơn protein rVrPDF1 của dòng DX1-3

Kết quả này đã chứng minh rằng ở hai dòng đậu xanh chuyển gen, protein

VrPDF1 được tăng cường biểu hiện

Hình 3.22 Kết quả phân tích ELISA xác định hàm lượng protein tái tổ hợp

VrPDF1 của ba dòng đậu xanh chuyển gen (DX1-3, DX1-4, DX1-7) và cây đối

chứng không chuyển gen (WT)

mọt không thể tồn tại được Khi mọt ăn hạt đậu xanh, defensin đã ức chế hoạt động của α-amylase, do đó ngăn chặn sự tiêu hóa tinh bột, kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển và dần mọt sẽ chết (Henrik et al., 2009; Liu et al., 2006) Trong những năm gần đây đã có một số nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của defensin thực vật, đề xuất ứng dụng trong công nghệ sinh học trong nghiên cứu chức năng của gen defensin và nâng cao khả năng kháng mọt

ở cây đậu xanh (Cavalho et al., 2009, 2011; Dos et al., 2010; Henrik et al., 2009; Tavars et al, 2008) Defensin thực vật biểu hiện ở nhiều cơ quan khác nhau của cây và tạo ra tuyến phòng vệ đầu tiên trước các đối tượng sâu bệnh Mặc dù sự tác động giữa defensin thực vật và nhiều đối tượng sâu bệnh còn chưa được hiểu rõ, nhưng những defensin có thể được sử dụng để tạo ra cây trồng biến đổi gen, giúp cải thiện khả năng chống chịu mọt Chuyển gen

defensin ở đậu xanh là biện pháp công nghệ làm tăng hàm lượng defensin nhằm

tăng cường khả năng ức chế α-amylase của ấu trùng mọt, từ đó nâng cao khả năng kháng mọt ở đậu xanh

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Sử dụng hạt 8 giống đậu xanh, trong đó 6 giống (Tằm TH, ĐX11, ĐX22,

ĐXVN5, ĐXVN6, ĐX14) do Trung tâm nghiên cứu và phát triển đậu đỗ, Viện Cây Lương thực và Thực phẩm, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp, hai giống (ĐX17, V123) do Viện nghiên cứu Ngô Đan Phượng cung cấp Giống thuốc lá K326 do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam cung cấp

Các chủng vi khuẩn E coli DH5α và A tumefaciens CV58 do phòng

Công nghệ tế bào thực vật của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp Các loại vector: Vector tách dòng pBT, vector pBeta-Phaseolin và vector pDON201-SLHEP do Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam cung cấp

2.2 HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Hoá chất, các bộ KIT được mua tại các hãng nổi tiếng Thế giới như

Bio-Neer, Fermentas, Invitrogen ; Thí nghiệm đánh giá khả năng kháng mọt

của 8 giống đậu xanh nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm của

Trung tâm Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Bắc Giang Các thí

nghiệm phân lập gen, thiết kế vector chuyển gen vào cây thuốc lá và phân tích

cây chuyển gen được tiến hành tại phòng Công nghệ ADN ứng dụng, phòng

Công nghệ Tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam Thí nghiệm chuyển gen vào cây đậu xanh được

tiến hành tại phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học,

trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp đánh giá kháng mọt của các giống đậu xanh nghiên

cứu

Phương pháp lây nhiễm mọt nhân tạo theo Tomooka và cs (1992), Hà

Quang Hùng (2005)

2.3.2 Phương pháp phân lập, tách dòng và xác định trình tự nucleotide

Kỹ thuật tách dòng gen được thực hiện theo Sammbrook và cs (2001)

Trình tự nucleotide của gen VrPDF1 được xác định trên máy đọc trình

tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied

Biosystem) sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn BigDye® Terminator v3.1 Cycle

Sequencing

2.3.3 Thiết kế vector chuyển gen

(1) Tạo cấu trúc độc lập mang gen chuyển pDON201-SLHEP-VrPDF1; (2)

Gắn cấu trúc mang gen chuyển VrPDF1 vào vector chuyển gen thực vật

pBetaphaso-VrPDF1

2.3.4 Phương pháp tạo cây chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens

Tạo cây thuốc lá chuyển gen: Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua A

tumefaciens được tiến hành theo phương pháp của Topping (1998)

Tạo cây đậu xanh chuyển gen: Phương pháp chuyển gen thông qua nách lá

mầm nhờ A tumefaciens được tiến hành dựa trên nghiên cứu của Sonia và cs

(2007) và tham khảo hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen vào đậu xanh của

Nguyễn Thị Luyện (2009), Chu Hoàng Mậu (2010) và Nguyễn Vũ Thanh

Thanh (2012)

19

Hiệu suất chuyển gen VrPDF1 ở giai đoạn này được xác định đạt 0,79% (5/630

=0,79%)

Sử dụng Southern blot kiểm tra kết quả gắn gen chuyển VrPDF1 vào

hệ gen của tế bào chủ Năm dòng đậu xanh chuyển gen T0 dương tính với PCR DX0-1, DX0-3, DX0-4, DX0-7, DX0-8 và cây đối chứng không chuyển gen WT đã được sử dụng để phân tích Southern blot, kết quả thể hiện ở hình 3.20

Kb M (+) WT 1 2 3 4 5

1,5 2,0 3,0 4,0 5,0 7,0 10,0

Hình 3.20 Kết quả phân tích Southern blot của DNA tổng số các cây đậu xanh

chuyển gen VrPDF1 với đoạn dò nptII được đánh dấu bằng biotin M: Marker

1kb, (-): cây đậu xanh ĐX22 không chuyển gen; DX0-1, DX0-3, DX0-4, DX0-7

và DX0-8: các dòng đậu xanh chuyển gen T0 dương tính với PCR

Như vậy, những bằng chứng về sự có mặt và dung hợp của gen chuyển trong hệ gen của các cây chuyển gen ở thế hệ T0 bằng PCR và Southern blot chính là kết quả bước đầu tạo cơ sở cho sự thành công của quy

trình chuyển gen VrPDF1 vào cây đậu xanh Các dòng cây đậu xanh chuyển

gen được chăm sóc và ưu tiên phát triển phục vụ những phân tích tiếp theo về

khả năng hoạt động và biểu hiện mạnh của gen chuyển VrPDF1 trong cây

chuyển gen

3.3.3 Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển VrPDF1 trong các dòng cây

đậu xanh chuyển gen T1

Kết quả lai Western phân tích biểu hiện protein tái tổ hợp từ hạt của 3 dòng cây đậu xanh chuyển gen và cây WT trên hình 3.21 cho thấy, trên màng lai xuất hiện băng màu ở vị trí kích thước khoảng gần 10 kDa ở 2 dòng cây đậu xanh chuyển gen (DX1-3, DX1-7) ở thế hệ T1 Dòng chuyển gen DX1-4

Bảng 3.9 Kết quả biến nạp cấu trúc pPhaso-dest-VrPDF1 vào giống đậu xanh

ĐX22

Đối chứng và

thí nghiệm

Tổng

số mẫu

Số mẫu tạo chồi

Số chồi kéo dài

Số chồi

ra rễ

Số cây sống trên giá thể

Số cây sống sót trong nhà lưới

Thí nghiệm 3

lần

630 247 107 46 35 23 Ghi chú: ĐC0 * lá mầm đậu xanh không chuyển gen được cấy trên môi trường tái

sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1 * lá mầm đậu xanh không chuyển gen được cấy

trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh

3.3.2 Xác định sự có mặt và sự dung hợp của gen chuyển VrPDF1 trong

hệ gen cây đậu xanh chuyển gen

Để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển VrPDF1 trong hệ gen của các

dòng cây đậu xanh được chuyển gen, thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi

đặc hiệu, kết quả thể hiện ở hình 3.19

M (+) (-) 1 2 3 4 5 6 7 8

0,5 kb 

Hình 3.19 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen VrPDF1 từ các

dòng cây đậu xanh được chuyển gen ở thế hệ T0 bằng cặp mồi

VrPDF1-HinIII-F/VrPDF1-SalI-R M: thang DNA chuẩn 1 kb; (+): đối chứng dương là plasmid

pBT-VrPDF1; (-) sản phẩm PCR nhân gen VrPDF1 cây đậu xanh không chuyển

gen; 1-8: các dòng cây đậu xanh được chuyển gen VrPDF1

Kết quả trên đã chỉ ra rằng, trong hệ gen của cây đậu xanh chuyển gen

tương ứng với làn điện di số 1, 3, 4, 7, 8 đã có mặt của gen chuyển VrPDF1 Trong

630 mẫu biến nạp thu được 5 cây đậu xanh T0 dương tính với PCR và 5 dòng cây

đậu xanh chuyển gen T0 được ký hiệu là DX0-1; DX0-3, DX0-4, DX0-7, DX0-8

2.3.5 Nhóm phương pháp phân tích cây chuyển gen

Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR Phân tích cây đậu xanh chuyển gen bằng Southern blot ở thế hệ T0

0

được thực hiện theo Southern EM (1975) Phân tích biểu hiện protein tái tổ hợp VrPDF1 trong hạt cây chuyển gen ở thế hệ T1 bằng phương pháp điện di protein theo Laemmli (1970) và Western blot Định lượng protein VrPDF1 tái tổ hợp bằng kỹ thuật ELISA theo phương pháp của Sun và cs (2006)

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT VÀ PHÂN LẬP GEN VrPDF1

CỦA CÂY ĐẬU XANH

3.1.1 Khả năng kháng mọt của các giống đậu xanh nghiên cứu

Chỉ số mẫn cảm mọt được xác định thông qua các chỉ tiêu: khối lượng đậu xanh hao hụt, tỷ lệ nhiễm mọt và hệ số gia tăng quần thể mọt Giống có chỉ số mẫn cảm mọt nhỏ thì khả năng kháng mọt cao và ngược lại Kết quả được thể hiện qua bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả đánh giá khả năng kháng mọt của các giống đậu xanh qua

các thời gian nhiễm mọt

Chỉ số mẫn cảm mọt

Bảng 3.1 cho thấy, giống đậu xanh Tằm TH có chỉ số mẫn cảm mọt thấp nhất (634,63) và giống ĐX22 có chỉ số mẫn cảm mọt cao nhất (1058,72) Kết hợp các các kết quả phân tích trên có thể nhận thấy giống đậu xanh Tằm

TH có khả năng kháng mọt tốt nhất và giống ĐX22 kháng mọt kém nhất Lựa chọn 2 giống này để tiếp tục phân lập, tách dòng gen

3.1.2 Khuếch đại và tách dòng gen VrPDF1 từ giống đậu xanh Tằm TH

và ĐX22

Lựa chọn hạt của giống Tằm TH (kháng mọt tốt nhất) và giống ĐX22

(kháng mọt kém nhất) làm đối tượng để phân tích đặc điểm của gen VrPDF1

RNA tổng số, DNA tổng số được tách từ mầm hạt đậu xanh và được kiểm tra

bằng điện di trên gel agarose Kết quả được thể hiện ở hình 3.2

Hình 3.2 Kết quả điện di kiểm tra sản

phẩm PCR nhân gen VrPDF1 của hai

giống đậu xanh Tằm TH và ĐX22 (M:

Thang DNA chuẩn 1 kb plus; 1, 3: sản

phẩm PCR nhân từ mRNA và DNAhệ

gen của Tằm TH ; 2, 4: sản phẩm PCR

nhân từ mRNA và DNA hệ gen của

ĐX22 )

Hình 3.3 Kết quả điện di kiểm tra sản

phẩm colony-PCR nhân gen VrPDF1

từ các dòng khuẩn lạc E coli DH5

(M: Thang DNA chuẩn 1 kb; 1, 2, 5, 6:

các dòng khuẩn lạc chứa vector mang cDNA và DNA gen VrPDF1 của giống Tằm TH; 3, 64, 7, 8: các dòng khuẩn lạc chứa vector mang cDNA và DNA VrPDF1 của giống ĐX22)

Hình 3.2 cho thấy, băng DNA có kích thước khoảng 0,25 kb và 0,35 kb

đúng như tính toán lý thuyết về kích thước cDNA và kích thước của gen

VrPDF1 Sản phẩm PCR được tách khỏi bản gel, tinh sạch và gắn trực tiếp

vào vector tách dòng pBT, sau đó được nhân dòng trong tế bào E coli DH5

Tiến hành chọn dòng bằng phản ứng colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc Kết

quả điện di cho thấy sản phẩm colony-PCR xuất hiện một băng DNA có kích

thước khoảng 0,22 kb và 0,35 kb đúng như tính toán lý thuyết (Hình 3.3) Kết

quả ở hình 3.3 cũng cho thấy kết quả chọn dòng thành công và các dòng

khuẩn lạc dương tính với PCR được sử dụng tách chiết plasmid tái tổ hợp

phục vụ việc xác định trình tự nucleotide

1 2 M 3 4

 0,25 kb

 Gen (DNA) cDNA 

0,5 kb 

1 2 3 4 M 5 6 7 8

 0,35 kb 0,22 kb 

17

3.3 TẠO CÂY ĐẬU XANH CHUYỂN GEN VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP rVrPDF1 Ở GIỐNG ĐẬU XANH ĐX22

3.1.1 Chuyển cấu trúc pPhaso-dest-VrPDF1 và tạo cây đậu xanh chuyển gen

Chuyển cấu trúc pBetaPhaso-dest-VrPDF1 vào giống đậu xanh ĐX22 được thực hiện nhờ A.tumefaciens lây nhiễm qua nách lá mầm Kết quả được

thể hiện ở hình 3.18 và bảng 3.9

B

L

J

K

Hình 3.18 Hình ảnh quá trình biến nạp cấu trúc pBetaPhaso-VrPDF1 qua

mô nách lá mầm và tái sinh cây đậu xanh chuyển gen A: Hạt đậu xanh

ĐX22; B: Khử trùng hạt bằng khí clo; C: Gieo hạt trên môi trường GM; D: Nảy mầm hạt sau 3 ngày; E: lá mầm và nách lá mầm làm nguyên liệu biến nạp; F: Nhiễm khuẩn trong 30 phút; G: Đồng nuôi cấy trên CCM; H: Cảm ứng tạo chồi trên SIM 1; I: Sau 2 tuần trên SIM 1; J: Cảm ứng tạo chồi 2 tuần trên SIM 2; K: Chọn lọc và kéo dài chồi trên SEM; L: Ra rễ; M: Cây

ra giá thể; N-O: Cây trồng trong chậu ở điều kiện nhà lưới

0 3,57

0 2 4 6 8

Hình 3.16 Biểu đồ so sánh hàm lượng protein rVrPDF1 tái tổ hợp (g/mg protein

tổng số) giữa các dòng thuốc lá chuyển gen WT: cây thuốc lá không chuyển gen,

T1-7, T1-8, T1-10, T1-11: bốn dòng thuốc lá chuyển gen Các số liệu trên mỗi cột

biểu đồ là hàm lượng protein rVrPDF1 (g/mg protein tổng số) Thanh đứng trên

mỗi cột biểu đồ là sai số chuẩn

Thử nghiệm hoạt động ức chế  -amylase của protein tái tổ hợp rVrPDF1

Để phân tích chức năng sinh học của protein tái tổ hợp rVrDEF1

trong hạt của các dòng thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T1 Dịch chiết chứa

enzyme -amylase của ấu trùng mọt đậu xanh được ủ với dịch chiết protein từ

hạt các dòng cây chuyển gen và dịch chiết protein từ hạt cây đối chứng không

chuyển gen để kiểm tra ảnh hưởng của protein tái tổ hợp rVrDEF1 đến hoạt

động của -amylase phân giải tinh bột, kết quả được trình bày ở hình 3.17

100,00

0 20 40 60 80 100 120

Hoạt độ của alpha-amylase từ ấu trùng mọt khi ủ với dịch chiết protein của cây chuyển gen so với khi ủ với dịch chiết protein của cây đối chứng

Hình 3.17 Biểu đồ so sánh kết quả thử nghiệm hoạt động ức chế của rVrPDF1

đối với -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh

Kết quả biểu hiện gen ở cây thuốc lá mô hình thành công là cơ sở để

chúng tôi tiến hành chuyển cấu trúc vào cây đậu xanh

3.1.3 Đặc điểm của gen VrPDF1 phân lập từ hai giống đậu xanh Tằm TH

và ĐX22

Đặc điểm của đoạn mã hóa thuộc gen VrPDF1 phân lập từ mRNA

Kết quả đọc trình tự nucleotide cho thấy: Đoạn cDNA gen VrPDF1

có 228 nucleotide và bằng BLAST trong NCBI cho thấy: So với trình tự gen

PDF1 mang mã số AB020613.1 với gen VrPDF1 phân lập từ mRNA của

giống Tằm TH và DX22 có độ tương đồng tương ứng là 99% và 96% (Hình

3.4) Trình tự nucleotide của gen VrPDF1 (cDNA) phân lập từ mRNA của hai

giống đậu xanh Tằm TH và ĐX22 đã được đăng ký trên ngân hàng gen với

mã số LN913082.1 và LN913083.1 So với AB020613.1 gen VrPDF1 của

Tằm TH có 5 vị trí nucleotide sai khác và ĐX22 có 8 vị trí nucleotide

Hình 3.4 Trình tự nucleotide của gen VrPDF1 (cDNA) ở hai giống đậu xanh

Tằm TH, ĐX22 và trình tự mang mã số AB020613 trên GenBank

Tiếp tục phân tích, so sánh trình tự amino acid suy diễn từ trình tự cDNA của giống Tằm TH và ĐX22 với protein suy diễn từ AB020613.1 trên Ngân hàng Gen, kết quả được thể hiện ở hình 3.5

Hình 3.5 Trình tự amino acid suy diễn từ gen VrPDF1 của hai giống đậu xanh

Tằm TH, ĐX22 và đoạn trình tự mang mã số AB020613

10

Từ hình 3.5 cho thấy, protein VrPDF1 gồm 75 amino acid và có độ

tương đồng cao So với protein mang mã số AB020613 thì trình tự amino acid

suy diễn của giống Tằm TH có độ tương đồng 96%, của mẫu ĐX22 có độ

tương đồng 92%; còn trình tự amino acid suy diễn VrPDF1 của hai giống đậu

xanh tương đồng là 88%

Trình tự gen VrPDF1 (cDNA) phân lập từ mRNA của giống Tằm TH

kháng mọt tốt nhất được sử dụng để thiết kế vector chuyển gen VrPDF1 nhằm

mục đích nâng cao khả năng kháng mọt của cây đậu xanh

Đặc điểm của gen VrPDF1 phân lập từ DNA tổng số

Kết quả giải trình tự nucleotide của gen VrPDF1 phân lập từ DNA tổng số

của giống đậu xanh Tằm TH và ĐX22 cho thấy: Gen VrPDF1 có kích thước 356

nucleotide và bằng BLAST trong NCBI độ tương đồng của gen VrPDF1 so với

gen PDF1 mang mã số AB020613.1 trên GenBank từ 95% đến 99% Việc so

sánh trình tự gen VrPDF1 phân lập từ DNA và từ cDNA ở hai giống đậu xanh

Tằm TH và ĐX22 cho phép xác định được đặc điểm cấu trúc của gen

Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen VrPDF1 phân lập từ DNA hệ

gen và gen VrPDF1 phân lập từ mRNA đã khẳng định gen VrPDF1 đã phân

lập thành công từ hệ gen hai giống đậu xanh Tằm TH và ĐX22 Hai trình tự

gen VrPDF1 của giống Tằm TH và ĐX22 đã được công bố trên Ngân hàng

Gen với các mã số LT797533, LT797534

3.1.4 Thảo luận về cấu trúc của protein defensin

Kết quả so sánh vùng chức năng của VrPDF1 giữa giống đậu xanh

kháng mọt tốt và kháng mọt kém không thấy có sự thay đổi ở các cầu nối

disunfide giữa 4 cặp Cys trong vùng chức năng của defeinsin (Hình 3.7) và

cấu trúc không gian giữa hai protein VrPDF1 không có sự khác nhau

Tam TH

DX22

Hình 3.7 Sơ đồ các cầu nối disulfide giữa các cặp Cys trong vùng chức năng của

protein VrPDF1 Các cầu nối disulfide: a-Cys14 - Cys35; b-Cys20 - Cys41;

c-15

vào cây thuốc lá và gen chuyển VrPDF1 đã được hợp nhất vào hệ gen cây

thuốc lá

3.2.4 Phân tích sự biểu hiện protein VrPDF1 tái tổ hợp trên cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T1

Trong 7 dòng thuốc lá chuyển gen cho kết quả lai Southern có 5 cây

chuyển gen thu được hạt Hạt của các cây T0 chính là thế hệ cây chuyển gen T1 và các dòng thuốc lá chuyển gen T0 thu được hạt ký hiệu là T1-4, T1-7, T1-8, T1-10, T1-11 Sử dụng 5 dòng thuốc lá chuyển gen T1 và cây đối chứng không chuyển gen để phân tích sự biểu hiện protein VrPDF1 tái tổ hợp trong hạt Kết quả thể hiện qua hình 3.15

M WT T1-4 T1-7 T1-8 T1-10 T1-11

35 kDa 

25 kDa 

15 kDa 

Hình 3.15 Kết quả lai Western của protein hạt từ một số dòng thuốc lá

chuyển gen thế hệ T1 với kháng thể cmyc M: thang protein chuẩn từ 10 đến

180 kDa; WT: protein cây thuốc lá đối chứng (không chuyển gen); 4,

T1-7, T1-8, T1-10, T1-11: protein của các dòng cây thuốc lá chuyển gen dương tính với lai Southern

Hình 3.15 cho thấy, trên màng lai nitrocellulose xuất hiện băng màu ở

vị trí kích thước khoảng gần 10 kDa ở 4 dòng cây thuốc lá chuyển gen (T1-7, T1-8, T1-10, T1-11) ở thế hệ T1

Để đánh giá mức độ biểu hiện protein tái tổ hơp sử dụng kỹ thuật ELISA, kết quả được thể hiện ở biểu đồ trên hình 3.16 Trên hình 3.16 các dòng thuốc lá chuyển gen có hàm lượng protein rVrPDF1 dao động từ 3,57

g/mg protein tổng số đến 8,57 g/mg protein tổng số và dòng T1-10 có hàm lượng protein VrPDF1 cao nhất (8,57 g/mg protein tổng số)