GIỚI THIỆU
Cơ sở hình thành luận văn
Thoái hóa khớp (THK) là dạng viêm khớp phổ biến nhất, ảnh hưởng đến khoảng 9,6% nam giới và 18% nữ giới trên 60 tuổi toàn cầu (WHO) Tại Việt Nam, 23,3% người trên 40 tuổi mắc THK, gây ra cơn đau từ nhẹ đến nặng và giảm khả năng vận động, thậm chí có thể dẫn đến tàn phế (Cuadra et al., 2014) Theo WHO, 80% người bị THK gặp khó khăn trong vận động, trong đó 25% không thể tự thực hiện các hoạt động hàng ngày THK không chỉ làm giảm chất lượng cuộc sống mà còn gia tăng gánh nặng chi phí y tế cho chăm sóc sức khỏe (Lane et al., 2017).
Chẩn đoán sớm là yếu tố quan trọng trong điều trị bệnh THK, với tiêu chuẩn vàng hiện nay là dựa vào triệu chứng lâm sàng và hình ảnh X-quang Tuy nhiên, phương pháp này có hạn chế về độ nhạy, không thể phát hiện thay đổi sớm của bệnh Do đó, cần tìm kiếm các dấu chứng sinh học mới để phát hiện sớm THK và theo dõi tiến triển của bệnh.
MicroRNA (miRNA) là nhóm RNA nhỏ không mã hóa, có vai trò điều hòa biểu hiện gen bằng cách gắn vào vùng 3’UTR của mRNA Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra mối liên hệ giữa miRNA và bệnh THK Hiện nay, miRNA tuần hoàn, có mặt trong dịch ngoại bào như huyết thanh và nước tiểu, đang được chú ý do tính bền vững và khả năng tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt Chúng không bị phân hủy bởi RNAase và có thể lưu trữ lâu dài Việc lấy mẫu miRNA tuần hoàn cũng không yêu cầu phương pháp xâm lấn, giúp giảm rủi ro cho bệnh nhân trong quá trình chẩn đoán.
Nghiên cứu đã chỉ ra rằng miRNA tuần hoàn có tiềm năng làm dấu chứng sinh học trong lâm sàng và hỗ trợ chẩn đoán nhiều bệnh như ung thư phổi, ung thư đại trực tràng và tiểu đường Đặc biệt, miRNA cũng cho thấy khả năng ứng dụng trong lâm sàng đối với bệnh THK Tuy nhiên, các kết quả liên quan đến miRNA tuần hoàn trong bệnh THK lại không đồng nhất giữa các nghiên cứu.
Dựa trên tiềm năng sử dụng miRNA tuần hoàn trong chẩn đoán sớm thoái hóa khớp (THK) và sự thiếu hụt nghiên cứu về mức độ miRNA này tại Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài “Xác định các miRNA tuần hoàn liên quan đến thoái hóa khớp” Nghiên cứu sẽ xác định hệ thống mức độ biểu hiện của tất cả các miRNA có trong huyết tương người thông qua kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (Next Generation Sequencing - NGS).
Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu nghiên cứu là xác định các miRNA tuần hoàn có biểu hiện bất thường liên quan đến bệnh THK tại Việt Nam, nhằm hỗ trợ cho việc chẩn đoán sớm bệnh này.
Câu hỏi nghiên cứu
Xây dựng bộ dữ liệu về mức độ biểu hiện của tất cả các miRNA có trong huyết tương của người bệnh THK và người bình thường ở Việt Nam
Xác định một bộ các miRNA có sự thay đổi về mức độ biểu hiện trong THK so với người bình thường.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng: Phân tử miRNA trong máu của bệnh nhân bị chỉ định THK và người bình thường
Phạm vi nghiên cứu: 30 bệnh nhân bị bệnh thoái hóa khớp và 30 người bình thường ở Việt Nam, thu nhận ở bệnh viện Nguyễn Tri Phương, TP Hồ Chí Minh.
Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật NGS nhằm xây dựng bộ dữ liệu toàn diện về mức độ miRNA tuần hoàn trong máu của bệnh nhân THK và người khỏe mạnh Các miRNA tiêu biểu sẽ được xác thực lại bằng phương pháp realtime PCR (RT-qPCR) để đảm bảo độ tin cậy cao.
Ý nghĩa nghiên cứu
Kết quả của nghiên cứu này cung cấp nền tảng quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo, nhằm phát triển các phương pháp chẩn đoán sớm và điều trị hiệu quả bệnh THK.
CƠ SỞ TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
Tổng quan về thoái hóa khớp (osteoarthritis)
2.1.1 Thoái hóa khớp là gì?
THK (thoái hóa khớp) là một bệnh mãn tính về cơ xương khớp phổ biến, đặc biệt ở người cao tuổi và những người có chấn thương khớp, do mất cân bằng giữa quá trình tổng hợp và phân hủy sụn cũng như xương dưới sụn Bệnh đặc trưng bởi sự mất mát sụn khớp và xương dưới sụn bị xơ cứng, kèm theo nhiều thay đổi ở các mô khác trong khớp như dịch khớp, bao hoạt dịch và dây chằng Hậu quả của THK là sự phá hủy dần lớp sụn khớp, dẫn đến viêm, sưng khớp, xơ hóa xương dưới sụn và hình thành gai xương Người mắc THK thường trải qua cơn đau, cứng khớp, khó khăn trong vận động, giảm chất lượng cuộc sống và có thể dẫn đến tàn phế nếu bệnh trở nặng.
Các khớp thường bị ảnh hưởng bởi thoái hóa khớp (THK) bao gồm khớp gối và khớp hông, cùng với các khớp gần và xa, khớp cổ tay đầu tiên, khớp cổ chân đầu tiên, và các khớp mặt của cột sống Trong khi đó, khớp khuỷu tay, cổ tay, vai và mắt cá chân ít bị ảnh hưởng bởi THK hơn.
2.1.2 Tỷ lệ bệnh thoái hóa khớp
Bệnh thoái hóa khớp (THK) là loại bệnh phổ biến nhất trong hơn 100 loại bệnh liên quan đến khớp, chiếm hơn 50% tổng số ca bệnh (Lane et al., 2017) Theo thống kê của WHO, tỷ lệ mắc THK ở nam giới là 9,6% và ở nữ giới là 18% trong nhóm tuổi trên 60 Ước tính năm 2017, có hơn 300 triệu người mắc THK trên toàn cầu, trong đó THK gối chiếm 87% (James et al., 2018) Tại Việt Nam, khoảng 23% người trên 40 tuổi mắc bệnh này, với tỷ lệ mắc ở nữ giới cao hơn nhiều so với nam giới, trong đó 80% các trường hợp THK gối là nữ (Bộ Y tế, 2016).
2.1.3 Các giai đoạn thoái hóa khớp
Hệ thống phân loại Kellgren và Lawrence là một trong những phương pháp phổ biến nhất để phân loại thoái hóa khớp (THK) Dựa trên hình ảnh X-quang, THK được chia thành 4 giai đoạn, phản ánh mức độ thay đổi trong khớp.
(K/L: Kellgren and Lawrence) (Kellgren và Lawrence, 1957)
Hình 2.1 Hình chụp X-quang minh họa các giai đoạn của THK
Giai đoạn 1 của bệnh là giai đoạn sớm, người bệnh chưa có triệu chứng lâm sàng bất thường Trên hình X-quang, khe khớp vẫn giữ độ rộng bình thường và sụn khớp không bị bào mòn, chức năng khớp hoạt động ổn định Tuy nhiên, có thể quan sát thấy sự xuất hiện của các gai xương nhỏ.
Giai đoạn 2 của bệnh thường biểu hiện bằng cơn đau khi vận động mạnh hoặc liên tục, nhưng tình trạng đau sẽ giảm khi người bệnh nghỉ ngơi Vào buổi sáng, người bệnh có thể cảm thấy cứng khớp, nhưng triệu chứng này không kéo dài lâu Trên hình chụp X-quang, gai xương bắt đầu xuất hiện rõ ràng và khe khớp có dấu hiệu hẹp nhẹ.
Giai đoạn 3 của bệnh lý khớp đặc trưng bởi cơn đau ở khớp gia tăng đáng kể X-quang cho thấy sự xuất hiện của các đặc điểm bất thường như gai xương lớn, khe khớp hẹp rõ rệt, và vùng sụn khớp ở đầu xương bị bào mòn nghiêm trọng Ngoài ra, xương dưới sụn trở nên đặc hơn và bề mặt khớp có khả năng bị biến dạng.
Giai đoạn 4 của bệnh là giai đoạn nặng nề và nghiêm trọng, với người bệnh trải qua cơn đau dữ dội và gặp khó khăn trong việc vận động Kết quả chụp X-quang cho thấy khe khớp hẹp đáng kể, xuất hiện gai xương lớn, xương dưới sụn trở nên đặc và bề mặt khớp bị biến dạng rõ rệt.
2.1.4 Triệu chứng bệnh thoái hóa khớp Đau nhức ở vị trí khớp xương bị thoái hóa là triệu chứng nổi trội nhất của THK Triệu chứng của cơn đau khớp có thể được thành 2 dạng là đau âm ỷ liên tục hoặc đau dữ dội gián đoạn (Hawker et al., 2008) Các cơn đau do THK tiến triển chậm và âm thầm theo thời gian Trong giai đoạn đầu của bệnh, sự xuất hiện của cơn đau có thể được biết trước do thực hiện các hoạt động mạnh Tuy nhiên, càng về sau thì cơn đau xuất hiện nhiều, dữ dội hơn và không thể biết trước, việc thực hiện các hoạt động hàng ngày đều có thể ảnh hưởng và dẫn đến đau (Hawker et al., 2008) Cơn đau của THK cũng thường tăng lên theo suốt cả ngày và khi hoạt động nhiều hơn Đáng chú ý là mức độ cơn đau không phải lúc nào cũng tương đồng với mức độ THK
Các triệu chứng của thoái hóa khớp (THK) ngoài cơn đau bao gồm sưng và biến dạng khớp, chuột rút, cứng khớp vào buổi sáng, cùng với giảm phạm vi hoạt động của khớp (Abramoff và Caldera, 2020) Những triệu chứng như sốt, sụt cân, và kết quả xét nghiệm máu bất thường thường không xuất hiện ở bệnh nhân THK Sự hiện diện của các triệu chứng này có thể chỉ ra các bệnh lý khác như nhiễm trùng hoặc bệnh ác tính.
Các triệu chứng của THK dẫn đến hạn chế vận động, suy giảm khả năng thực hiện các hoạt động yêu thích và giảm chất lượng cuộc sống Nghiên cứu của Fautrel và cộng sự (2005) cho thấy 81,5% bệnh nhân THK bị hạn chế trong sinh hoạt hàng ngày, 61,5% gặp khó khăn khi ra khỏi nhà và 12,8% phải ở trong nhà (Abramoff và Caldera, 2020, Fautrel et al., 2005) Ngoài ra, bệnh nhân THK còn hạn chế tham gia các hoạt động như thể thao, mua sắm, làm vườn và dọn dẹp nhà cửa, dẫn đến việc bỏ lỡ nhiều công việc so với người bình thường.
2.1.5 Các nguyên nhân và yếu tố nguy cơ gây bệnh thoái hóa khớp
THK là một bệnh phức tạp với nhiều yếu tố nguy cơ có thể ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển của bệnh (Abramoff và Caldera, 2020) Những yếu tố này tác động khác nhau lên các khớp và ở các giai đoạn khác nhau của bệnh Các yếu tố nguy cơ thường không thể phân biệt riêng lẻ mà có sự tương tác lẫn nhau, dẫn đến khởi phát hoặc tích lũy dần, từ đó hình thành hoặc tiến triển bệnh Nguyên nhân gây bệnh THK được chia thành hai loại: nguyên phát và thứ phát (Abramoff và Caldera, 2020) (Bộ Y tế).
Nguyên nhân nguyên phát của thoái hóa khớp (THK) là do sự mất cân bằng giữa quá trình tổng hợp và thoái hóa sụn cùng xương dưới sụn (Sharma et al., 2013) Những yếu tố này đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của THK nguyên phát.
Lão hóa là yếu tố nguy cơ chính dẫn đến sự phát triển của thoái hóa khớp (THK), đặc biệt ở người cao tuổi, với tỷ lệ mắc bệnh tăng theo độ tuổi: 27% ở độ tuổi 63-70 và 44% ở trên 80 tuổi (Abramoff và Caldera, 2020) Sự thay đổi trong sụn khớp do tuổi tác xảy ra khi các tế bào chondrocyte, loại tế bào duy nhất có trong sụn, giảm hoạt động phân bào và tổng hợp, dẫn đến khả năng duy trì và sửa chữa mô sụn bị suy giảm.
Genetic factors play a significant role in the risk of developing osteoarthritis (OA), as individuals with a family history of the disease are at a higher risk Research indicates that over 80 genes are associated with the pathogenesis of OA, with most having minor effects while a few, such as those coding for the vitamin D receptor (VDR), insulin-like growth factor 1 (IGF-1), frizzled-related protein (FRZB), collagen (COL), and interleukin-1 (IL-1), having a more substantial impact Additionally, OA is linked to a specific single nucleotide polymorphism (SNP) located in a critical region.
3’UTR của gen GDF5 (Growth Differentiation Factor 5) tham gia vào sự phát triển bình thường của xương và sụn (Khan et al., 2007, Reynard và Loughlin,
Tổng quan về microRNA
MicroRNA (miRNA) là các RNA không mã hóa nhỏ (18-25 nucleotide) có vai trò điều hòa biểu hiện gen sau phiên mã bằng cách gắn vào vùng 3’UTR của mRNA, dẫn đến phân hủy hoặc ức chế dịch mã Hơn 50% gen mã hóa protein ở người được miRNA điều chỉnh, theo dự đoán từ các chương trình bioinformatics Trình tự miRNA cũng được bảo tồn tiến hóa giữa các loài khác nhau Các nghiên cứu hiện tại đã chỉ ra rằng miRNA có vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học và sự biểu hiện bất thường của chúng liên quan đến sinh bệnh học của nhiều bệnh.
MicroRNA (miRNA) là những phân tử nhỏ được phát hiện trong động vật, thực vật, và một số loại vi khuẩn cùng virus Phân tử miRNA đầu tiên, được gọi là lin-4, đã được xác nhận tại tuyến trùng Caenorhabditis elegans.
1993, mặc dù lin-4 đã được phát hiện từ năm 1984 (Chalfie, 1981, Lee et al., 1993, Wightman et al., 1993) Sau đó, phân tử miRNA thứ hai là let-7 cũng được tìm thấy ở
C elegans (Reinhart et al., 2000) Đến năm 2001, thuật ngữ “microRNA” được đưa ra để chỉ nhóm các phân tử RNA nhỏ, không mã hóa có chức năng điều hòa biểu hiện gen này (Lagos-Quintana et al., 2001, Lau et al., 2001, Lee và Ambros, 2001) Phân tử miRNA đầu tiên tìm thấy ở người là let-7 năm 2000 (Pasquinelli et al., 2000) Và cho đến hiện nay, có khoảng 38.589 miRNA đã được tìm thấy trong các tế bào người trên hệ thống dữ liệu miRBase (www.mirbase.org, release 22.1, 2018)
2.2.2 Quá trình sinh tổng hợp (biogenesis) của microRNA
2.2.2.1 Vị trí miRNA trong DNA bộ gen
Trình tự DNA mã hóa cho miRNA chủ yếu nằm trong vùng giữa các gen (intergenic region) và trong intron của pre-mRNA mã hóa protein, được gọi là intergenic miRNA và intronic miRNA Một số ít trình tự miRNA cũng xuất hiện trong exons của mRNA hoặc trên mạch ngược Mặc dù chức năng của miRNA và mRNA khác nhau, nhưng chúng có nhiều điểm tương đồng trong cơ chế điều hòa phiên mã Các intronic miRNA được điều hòa tương tự như gen chủ do cùng một promoter, trong khi các con đường điều hòa sau phiên mã của gen chủ có thể ảnh hưởng đến sự ổn định và xử lý của pri-miRNA hoặc pre-miRNA Đối với intergenic miRNA, mỗi miRNA có thể có một promoter riêng hoặc nhiều miRNA có thể chia sẻ một promoter, tương tự như cấu trúc polycistronic.
Hình 2.2 Vị trí của miRNA trong DNA bộ gen
2.2.2.2 Quá trình trưởng thành (maturation) của miRNA điển hình
Một miRNA điển hình trải qua nhiều giai đoạn phát triển khác nhau, như được minh họa trong hình 2.3 Quá trình này diễn ra ở hai vị trí chính: trong nhân và trong tế bào chất của tế bào.
Hình 2.3 Quá trình trưởng thành của miRNA điển hình
Trong nhân tế bào, gen mã hóa cho miRNA được phiên mã từ DNA nhờ RNA polymerase II, tạo ra phân tử pri-miRNA mang cấu trúc kẹp tóc của các miRNA khác nhau Các phân tử pri-miRNA thường có mũ ở đầu 5’ nhưng có thể không có đuôi poly-A ở đầu 3’ Sau đó, phức hợp Microprocessor, gồm enzyme Drosha và DGCR8, cắt các cấu trúc kẹp tóc để tạo ra pre-miRNA có kích thước từ 70 - 100 nucleotide Cuối cùng, các pre-miRNA được vận chuyển từ nhân ra tế bào chất thông qua Exportin-5/RanGTP.
Khi vào tế bào chất, Dicer (RNAse III) cắt tiền miRNA thành RNA mạch đôi, tạo ra miRNA và mạch bổ sung Enzyme Helicase sau đó tháo xoắn RNA, dẫn đến hình thành miRNA trưởng thành MiRNA trưởng thành tương tác với phức hợp RISC, chứa protein Argonaute (Ago-2), gắn lên vùng 3’UTR của mRNA mục tiêu qua bắt cặp bổ sung, từ đó ức chế dịch mã hoặc làm phân hủy mRNA Mạch bổ sung với miRNA sẽ bị loại bỏ sau khi tách.
2.2.2.3 Quá trình trưởng thành của miRNA không điển hình
Một số nhóm RNA có cấu trúc và chức năng tương tự như miRNA nhưng bỏ qua một số bước trong quá trình trưởng thành, bao gồm con đường không phụ thuộc Drosha và Dicer Đặc biệt, các đoạn intron ngắn trong mRNA (mirtron) tạo cấu trúc kẹp tóc giống pre-miRNA Trong quá trình trưởng thành của mRNA, cấu trúc kẹp tóc này được cắt ra bởi spliceosome thay vì Drosha, và sau đó được vận chuyển ra tế bào chất bằng Exportin 5 để tiếp tục quá trình trưởng thành giống như các miRNA điển hình (Westholm và Lai, 2011).
Hình 2.4 Quá trình trưởng thành của miRNA không điển hình
Một phân tử miRNA có thể tạo ra nhiều isoform khác nhau (isomiR) thông qua các cơ chế khác nhau Sự lựa chọn không chính xác giữa mạch miRNA trưởng thành và mạch bổ sung trong quá trình phân hủy dẫn đến hai loại miRNA với chức năng khác nhau, được ký hiệu là miR-3p (mạch miRNA) và miR-5p (mạch bổ sung) Cắt không chính xác của Drosha với pri-miRNA hoặc Dicer với pre-miRNA cũng tạo ra các isomiR có trình tự khác nhau ở đầu 5’ hoặc 3’ Ngoài ra, quá trình sửa chữa RNA (RNA editing) cũng góp phần hình thành các isomiR.
Các chỉnh sửa tạo ra các isomiR khác nhau ở đầu 5’ của miRNA có thể ảnh hưởng đến khả năng nhắm đến đích của miRNA, đặc biệt khi nucleotide ở seed site bị thay đổi Trong khi đó, các chỉnh sửa ở đầu 3’ không làm ảnh hưởng đến việc nhắm đích của miRNA vì chúng không tác động đến trình tự seed site.
2.2.3 Nhận diện gen mục tiêu
Các miRNA chủ yếu nhận diện gen mục tiêu thông qua vùng 3’UTR của mRNA, tuy nhiên chúng cũng có thể tương tác với các vùng khác như 5’UTR hoặc vùng mã hóa, mặc dù hiệu quả ức chế dịch mã sẽ thấp hơn (Lee et al., 2009).
Việc gắn của miRNA lên vùng 3’UTR của mRNA đích được đặc hiệu bởi trình tự
“Seed sequence” hay “seed site” là đoạn nucleotide từ thứ 2 đến thứ 8 ở đầu 5’ của phân tử miRNA, có vai trò quan trọng trong việc gắn kết với mRNA đích Nucleotide đầu tiên cũng hỗ trợ cho sự gắn kết này Trong động vật, seed site của miRNA có khả năng bắt cặp bổ sung gần như 100% với trình tự mRNA đích, điều này rất quan trọng cho sự ổn định và tính đặc hiệu của tương tác Trình tự tám nucleotide này (8-mer) là cơ sở để các công cụ tin sinh học dự đoán gen mục tiêu của miRNA Mức độ bắt cặp của các nucleotide còn lại trên miRNA với mRNA đích có sự khác biệt, dẫn đến các cơ chế làm im lặng gen khác nhau Sự bắt cặp giữa miRNA và mRNA đích có thể xảy ra theo hai trường hợp: hoàn toàn, dẫn đến phân hủy mRNA, hoặc không hoàn toàn, dẫn đến ức chế dịch mã Trong thực vật và một số động vật, sự bắt cặp thường là hoàn toàn, trong khi ở người, sự bắt cặp chủ yếu là không hoàn toàn.
2.2.4 Cơ chế điều hòa biểu hiện gen của miRNA
Các miRNA đóng vai trò điều hòa âm trong việc kiểm soát biểu hiện của mRNA đích, với khả năng một miRNA có thể tác động lên nhiều mRNA và ngược lại, nhiều miRNA có thể cùng điều chỉnh một mRNA Tùy thuộc vào mức độ bắt cặp bổ sung giữa miRNA và mRNA, có hai cơ chế điều hòa biểu hiện gen: phân hủy mRNA và ức chế dịch mã.
Phân hủy mRNA diễn ra khi miRNA bắt cặp với mRNA đích tại seed site và khoảng 10-11 base khác, với sự tham gia của Ago2 cắt mRNA thông qua hoạt tính endonuclease Sản phẩm cắt sẽ bị phân hủy theo cơ chế phân hủy mRNA chung, bắt đầu bằng deadenylation để loại bỏ đuôi poly-A, tiếp theo là sự tham gia của các exosome chứa enzyme 3’-5’ exonuclease Bên cạnh đó, mRNA cũng có thể bị gắn mũ bởi enzyme Dcp1 và Dcp2, dẫn đến phân hủy theo chiều 5’-3’ bởi exoribonuclease Xrn1p Trong khi đó, ức chế phiên mã xảy ra khi có nhiều vị trí bắt cặp không hoàn toàn giữa miRNA và mRNA, tạo ra cấu trúc bulge, làm giảm hoạt tính cắt của Ago2 nhưng vẫn ngăn chặn quá trình dịch mã của mRNA ở tất cả các giai đoạn: mở đầu, kéo dài và kết thúc.
Sự khác biệt giữa phân hủy mRNA và ức chế dịch mã nằm ở tính thuận nghịch; phân hủy mRNA là quy trình không thể đảo ngược, trong khi ức chế dịch mã có thể phục hồi khi yếu tố ức chế được loại bỏ Các yếu tố như vị trí, số lượng và khoảng cách của các seed site trên mRNA đích, cùng với cấu trúc của mRNA đích, đều ảnh hưởng đến khả năng ức chế biểu hiện gen của miRNA.
Tổng quan về microRNA tuần hoàn
2.3.1 MicroRNA tuần hoàn là dấu chứng sinh tiềm năng cho chẩn đoán THK
Với tiềm năng lớn của miRNA trong điều trị bệnh khớp, nghiên cứu hiện nay đang hướng tới việc sử dụng miRNA như chỉ thị sinh học để chẩn đoán sớm và theo dõi quá trình điều trị Tuy nhiên, việc kiểm tra miRNA trong các mô khớp như sụn hay xương dưới sụn gặp khó khăn do tính xâm lấn và nguy cơ lây nhiễm Do đó, các nghiên cứu đang tập trung vào microRNA tuần hoàn, nhằm cải thiện tính khả thi trong chẩn đoán lâm sàng.
MicroRNA tuần hoàn là các miRNA có mặt trong dịch sinh học ngoại bào, chủ yếu là trong máu ngoại vi, cũng như trong sữa mẹ, nước bọt, nước mắt, nước tiểu, và nhiều dịch khác Cơ chế giải phóng microRNA tuần hoàn vào môi trường ngoại bào vẫn chưa được làm rõ, nhưng có giả thuyết cho rằng chúng được giải phóng có chọn lọc để truyền tín hiệu giữa các tế bào và liên quan đến tình trạng bệnh lý Một số miRNA tuần hoàn có thể là sản phẩm không đặc hiệu của hoạt động sinh lý và sự chết của tế bào Trong khi các RNA khác bị phân hủy nhanh chóng trong môi trường ngoại bào, microRNA tuần hoàn có thể ổn định và tồn tại lâu dài trong máu và dịch cơ thể nhờ được bảo vệ trong các vi nang, exosome, phức hợp protein Ago hoặc lipoprotein mật độ cao (HDL).
MicroRNA tuần hoàn được coi là phân tử tiềm năng trong chẩn đoán và điều trị bệnh nhờ vào mối liên hệ giữa sự thay đổi biểu hiện của chúng và các bệnh lý Chúng có nhiều ưu điểm như khả năng chịu đựng điều kiện khắc nghiệt, độ bền cao với thời gian bán rã lên đến 5 ngày trong huyết thanh, không bị ảnh hưởng bởi hoạt tính của RNase, ổn định ở nhiệt độ phòng và khả năng chịu đựng quá trình đông lạnh nhiều lần Đặc biệt, việc thu thập mẫu miRNA tuần hoàn không yêu cầu các phương pháp xâm lấn, giảm thiểu nguy cơ cho bệnh nhân MicroRNA tuần hoàn đã được xác nhận là dấu ấn sinh học quan trọng cho nhiều bệnh, bao gồm tiểu đường type II.
2013), Parkinson, cao huyết áp, loãng xương, ung thư (Kumar et al., 2017)
2.3.2 Các phương pháp phát hiện miRNA tuần hoàn
Việc phát hiện và định lượng miRNA tuần hoàn trong dịch cơ thể gặp khó khăn do nồng độ thấp và kích thước nhỏ RT-qPCR là phương pháp phổ biến nhờ độ nhạy cao, nhưng chỉ phát hiện miRNA đã biết và có lượng dữ liệu đầu ra thấp Microarray cải thiện khả năng phát hiện nhiều miRNA cùng lúc, nhưng hạn chế về phạm vi hoạt động và không phát hiện được miRNA mới NGS cho phép phát hiện cả miRNA đã xác định và mới với lượng dữ liệu đầu ra cao, nhưng yêu cầu lượng vật liệu lớn và công cụ tin-sinh học phức tạp NanoString nCounter, công nghệ mã vạch phân tử kỹ thuật số mới, cho phép đếm chính xác số lượng miRNA trong mẫu sinh học, nhưng chỉ phát hiện tối đa 800 miRNA trên một slide Do đó, việc lựa chọn phương pháp phù hợp phụ thuộc vào mục đích và điều kiện nghiên cứu.
2.3.3 Tình hình nghiên cứu về microRNA tuần hoàn trong bệnh thoái hóa khớp
Hiện tại, Việt Nam chưa có công bố nào về khảo sát tiềm năng của miRNA tuần hoàn trong bệnh THK, nhưng miRNA tuần hoàn đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học toàn cầu như một dấu chứng sinh học tiềm năng cho chẩn đoán sớm bệnh này Các nghiên cứu thường sử dụng mẫu huyết thanh hoặc huyết tương do tính không xâm lấn và nồng độ miRNA tuần hoàn cao hơn so với các dịch khác như nước bọt hay nước tiểu.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra sự biểu hiện bất thường của miRNA tuần hoàn ở bệnh nhân THK so với người bình thường Cụ thể, nồng độ miR-132 trong huyết tương của bệnh nhân THK giảm đáng kể (Murata et al., 2010) Cuadra và cộng sự đã phát hiện 12 miRNA tăng biểu hiện trong huyết tương của người mắc THK giai đoạn đầu, bao gồm miR-16, miR-19c, miR-20b, miR-30b, miR-93, miR-126, và miR-146a.
Nghiên cứu của Cuadra et al (2014) đã xác định các miRNA như miR-186, miR-195, miR-345 và miR-885-5p có liên quan đến thoái hóa khớp (THK) Beyer et al (2015) phát hiện miRNA let-7e trong huyết thanh giảm ở giai đoạn cuối của bệnh THK Năm 2017, Ntoumou et al khảo sát 2.549 miRNA trong huyết thanh của bệnh nhân THK và người bình thường, tìm thấy 279 miRNA biểu hiện bất thường, trong đó 205 miRNA tăng và 74 miRNA giảm Phân tích tin-sinh học chỉ ra 77 miRNA điều hòa gen đích liên quan đến THK, với 3 miRNA (miR-33b-3p, miR-140-3p, miR-671-3p) có biểu hiện giảm rõ rệt ở nhóm THK Cũng trong năm 2017, Kong et al phát hiện 41 miRNA tăng và 29 miRNA giảm ở mẫu THK, với 3 miRNA (miR-19b-3p, miR-122-5p, miR-486-5p) có thể là dấu chứng sinh học cho chẩn đoán sớm THK Skrzypa et al (2019) ghi nhận miR-146a-5p tăng trong cả sụn và huyết thanh của bệnh nhân THK so với đối chứng Các nghiên cứu tiếp theo tiếp tục phát hiện các miRNA bất thường khác giữa người bệnh và người bình thường (Ali et al., 2020; Feng et al., 2020; Rousseau et al., 2020; Xie et al.).
Bảng 2.2 Các miRNA tuần hoàn biểu hiện bất thường ở người bệnh thoái hóa khớp so với người bình thường
Các miRNA biểu hiện bất thường TLTK
1 Huyết tương miR-132 Murata et al., 2010
2 Huyết tương miR-16, miR-19c, miR-20b, miR-30b, miR-93, miR-126, miR-146a, miR-
Các miRNA biểu hiện bất thường TLTK
3 Huyết thanh let-7e Beyer et al., 2015
4 Dịch hoạt dịch (*) miR-23a-3p, miR- 24-3p, miR-27a-3p, miR-27b-3p, miR- 29c-3p, miR-34a- 5p, miR-186-5p
5 Huyết tương miR-19b-3p, miR- 122-5p, miR-486-
6 Huyết thanh miR-33b- 3p, miR- 140-3p, miR-671-3p
7 Huyết tương miR-136 Wan et al., 2018
8 Dịch hoạt dịch miR-100- 5p, miR- 200c-3p, miR-1826
9 Huyết thanh miR-146a-5p Skrzypa et al.,
10 Dịch hoạt dịch miR-210 Xie et al., 2019
11 Huyết tương (*) miR-191- 3p, miR- 199a-5p, miR-335- 3p, miR- 335-5p, miR-543, miR-671- 3p, miR- 1260b
12 Huyết thanh let-7e Feng et al., 2020
Các miRNA biểu hiện bất thường TLTK
13 Huyết thanh miR-146a-5p Rousseau et al.,
(*) mẫu THK giai đoạn muộn (K/L 3-4) với mẫu THK giai đoạn sớm (K/L 0-1 hoặc
Mặc dù nhiều nghiên cứu đã xác định sự biểu hiện của các miRNA tuần hoàn trong bệnh THK, nhưng kết quả giữa các nghiên cứu lại không đồng nhất, ngoại trừ let-7e và miR-146 Điều này khiến cho việc lựa chọn các miRNA tuần hoàn tiềm năng làm dấu chứng sinh học cho chẩn đoán THK trở nên khó khăn Do đó, cần thiết phải xây dựng một hồ sơ tổng thể về tất cả các miRNA trong mẫu THK so với người bình thường, nhằm cung cấp cái nhìn tổng quát về sự khác biệt giữa các miRNA tuần hoàn ở bệnh nhân THK và người khỏe mạnh, từ đó làm nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo Công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) có thể hỗ trợ thực hiện yêu cầu này.
2.4 Tổng quan về Next Generation Sequencing
2.4.1 Next Generation Sequencing là gì?
Công nghệ giải trình tự DNA thế hệ mới (NGS), ra đời khoảng năm 2010, mang lại tốc độ và công suất vượt trội so với phương pháp Sanger truyền thống NGS cho phép giải trình tự hàng loạt đoạn DNA cùng lúc, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí, đồng thời tạo ra lượng dữ liệu khổng lồ Ví dụ, việc giải mã toàn bộ bộ gen người trước đây mất hơn 10 năm với phương pháp Sanger, nhưng với NGS, thời gian này chỉ còn 1 ngày và chỉ cần một địa điểm thực hiện Công nghệ NGS được xem là cách mạng, đóng góp đáng kể cho các nghiên cứu về bộ gen con người và các sinh vật khác, với số lượng bộ gen công bố và nghiên cứu tăng mạnh từ năm 2012.
2.4.2 Nguyên tắc của kỹ thuật NGS (Krishna et al., 2019)
Kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) đã trải qua nhiều cải tiến để tăng cường khả năng xử lý, với nhiều nền tảng khác nhau như Roche/454, Ion Torrent, Illumina và ABI/SOLiD Các công nghệ tối ưu hơn như SMRT sequencing và nanopore sequencing cho phép giải trình tự hàng triệu đoạn DNA cùng lúc Quá trình phân tích tin-sinh học sẽ lắp nối các đoạn DNA dựa trên tín hiệu và so sánh với bộ gen tham chiếu Vật liệu ban đầu cho NGS thường là DNA sợi đôi, có thể tách chiết từ nhiều loại tế bào, và trong một số trường hợp, DNA có thể được biến đổi để chỉ giải trình tự các exon Ngoài DNA, các kỹ thuật hiện nay cũng cho phép sử dụng cDNA và RNA làm mạch khuôn.
Roche/454 sequencing, còn gọi là pyrosequencing, là nền tảng NGS tiên phong dựa trên phương pháp giải trình tự tổng hợp bằng enzyme DNA polymerase và pyrosequencing thông qua phản ứng quang hóa học Quy trình thực hiện bao gồm ba bước chính: chuẩn bị thư viện, PCR nhũ tương và pyrosequencing.
Hình 2.5 Kỹ thuật NGS Pyrosequencing
Để bắt đầu, cần chuẩn bị thư viện bằng cách tạo ra các mẫu DNA được phân mảnh ngẫu nhiên hoặc các amplicon có kích thước phù hợp Các đoạn DNA này sẽ được gắn với adaptor 454 để tiến hành các bước tiếp theo trong quy trình phân tích.
Trong bước 2 của quy trình PCR nhũ tương, các đoạn DNA đã gắn adaptor được kết nối với hạt bead streptavidin, với mỗi hạt chỉ gắn một đoạn DNA, giúp giữ chúng trong các giọt nhũ tương riêng biệt Sau đó, phản ứng PCR được thực hiện bằng cách thêm hỗn hợp các thành phần PCR cơ bản, tạo ra hàng triệu bản sao của mỗi đoạn DNA trên bề mặt hạt bead Mỗi hạt bead sẽ tương ứng với một lần đọc trình tự, và các hạt bead chứa mẫu sẽ được chuyển sang đĩa picotiter (PTP) với các giếng kích thước nanomet, chuẩn bị cho bước pyrosequencing tiếp theo Đĩa PTP cho phép thực hiện hàng nghìn phản ứng giải trình tự đồng thời, nâng cao lượng dữ liệu đầu ra so với phương pháp Sanger truyền thống.
Bước 3 pyrosequencing là quá trình giải trình tự DNA thông qua phản ứng tổng hợp, sử dụng các thành phần như DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase, apyrase, adenosine 5’ phosphosulfate (APS) và luciferin Trong quá trình này, từng loại nucleotide được thêm vào lần lượt, và khi một nucleotide gắn vào chuỗi DNA, pyrophosphate (PPi) sẽ được giải phóng, kích thích phản ứng tạo ra ánh sáng Tín hiệu ánh sáng này được ghi lại bằng máy ảnh tích hợp trong thiết bị, cho phép xác định nucleotide vừa được thêm vào Sau khi rửa bỏ các nucleotide chưa gắn, quá trình sẽ tiếp tục với nucleotide khác cho đến khi hoàn thành chu kỳ, tạo ra trình tự DNA đầy đủ Mỗi giếng chứa hạt bead với hàng triệu bản sao của một trình tự, giúp tăng cường độ ánh sáng thu được, nâng cao độ chính xác so với phương pháp pyrosequencing trước đây.
Công nghệ Roche/454 sequencing cho phép giải mã hàng ngàn trình tự trên đĩa PTP cùng một lúc, thường được sử dụng cho các trình tự có cấu trúc bậc hai phức tạp như cấu trúc kẹp tóc và trình tự cuối đảo ngược (ITR) của adenovirus Tuy nhiên, công nghệ pyrosequencing gặp phải hạn chế lớn là tỷ lệ lỗi cao ở các vùng trình tự lặp lại giống nhau (homopolymer) và các khu vực có đặc điểm chèn hoặc xóa Thêm vào đó, quy trình chuẩn bị mẫu mất nhiều thời gian do cần trải qua PCR nhũ tương trước khi tiến hành pyrosequencing, và chiều dài đoạn trình tự giải mã bằng phương pháp này ngắn hơn so với phương pháp Sanger, gây ra một nhược điểm đáng kể.
Tổng quan về RT-qPCR
RT-qPCR, short for quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, is a real-time PCR method that uses RNA as the template instead of DNA, distinguishing it from conventional real-time PCR techniques.
2.5.2 Nguyên tắc phản ứng RT-qPCR
Phản ứng RT-qPCR gồm 2 bước chính:
Bước 1 trong quy trình chuyển RNA thành cDNA (DNA bổ sung) liên quan đến việc sử dụng enzyme Reverse transcriptase để phiên mã ngược RNA tổng số hoặc mRNA thành cDNA Việc lựa chọn giữa RNA tổng số và mRNA phụ thuộc vào mục đích nghiên cứu, mặc dù mRNA có độ nhạy cao hơn, RNA tổng số thường được ưu tiên do nhiều lợi ích RNA tổng số yêu cầu ít bước tinh sạch hơn, giúp thu được lượng mẫu RNA lớn hơn và cải thiện khả năng chuẩn hóa kết quả từ số lượng tế bào ban đầu Hơn nữa, việc thu RNA tổng số không cần bước làm giàu mRNA, giúp tránh sai lệch do hiệu suất thu hồi khác nhau Cuối cùng, định lượng tương đối các gen mục tiêu trở nên quan trọng hơn trong các ứng dụng nghiên cứu so với việc chỉ tăng độ nhạy phát hiện gen mục tiêu.
Có 3 loại mồi có thể dùng được cho bước phiên mã ngược, đó là: mồi oligo-T, bắt cặp với đuôi poly-A trên mRNA; mồi ngẫu nhiên (random primer), thường là hỗn hợp các đoạn oligo 6 nucleotide, bắt ngẫu nhiên trên trình tự mRNA; và mồi đặc hiệu trình tự, bắt đặc hiệu lên gen mục tiêu Trong đó, hỗn hợp của mồi oligo-T và mồi ngẫu nhiên thường được dùng nhất Các mồi gắn lên mạch khuôn mRNA ở những vị trí khác nhau tùy theo loại mồi, cung cấp điểm khởi đầu cho enzyme Reverse trancriptase tổng hợp cDNA
Enzyme Reverse transcriptase có khả năng tổng hợp DNA từ RNA và một số loại enzyme này có hoạt tính RNase, giúp phân hủy RNA trong phân tử lai RNA-DNA sau phiên mã Để tối ưu hóa hiệu quả của phản ứng realtime PCR, nếu sử dụng enzyme không có hoạt tính RNase, cần thêm enzyme RNaseH để cắt RNA Tuy nhiên, cần giảm thiểu hoạt tính của RNaseH khi muốn phiên mã đầy đủ các mRNA dài, vì chúng có thể bị cắt sớm, dẫn đến cDNA cụt Do đó, enzyme Reverse transcriptase có hoạt tính RNase nội tại là lựa chọn tốt nhất Ngoài ra, nên chọn enzyme có khả năng chịu nhiệt tốt để thực hiện phản ứng ở nhiệt độ cao, giúp phiên mã thành công các RNA có cấu trúc thứ cấp phức tạp và đảm bảo enzyme duy trì hoạt tính trong suốt quá trình phản ứng, từ đó tạo ra hiệu suất tốt hơn Các cDNA sau khi tổng hợp sẽ được sử dụng làm khuôn cho phản ứng realtime PCR tiếp theo.
Bước 2 - Thực hiện phản ứng realtime PCR
Realtime PCR là phương pháp khuếch đại DNA hoặc cDNA cho phép theo dõi lượng sản phẩm PCR trong thời gian thực nhờ vào chất nhuộm huỳnh quang Trong bước 2 của RT-qPCR, quy trình tương tự như realtime PCR thông thường, với hai phương pháp định lượng sản phẩm: sử dụng mẫu dò huỳnh quang hoặc chất nhuộm DNA như Sybr Green Điểm khác biệt của RT-qPCR so với realtime PCR là thiết kế mồi, nên được thiết kế bắt qua vị trí nối exon-exon hoặc tại hai exon có intron dài ở giữa trong DNA bộ gen Thiết kế mồi như vậy giúp tránh sai lệch kết quả do nhiễm DNA bộ gen trong quá trình tách chiết Nếu không thể thiết kế mồi theo cách này, RNA mẫu cần được xử lý với enzyme RNase-free DNase trước khi phản ứng.
I hoặc dsDNase để loại DNA bộ gen bị nhiễm vào
Hình 2.9 Cách thiết kế mồi tối ưu cho phản ứng RT-qPCR
RT-qPCR có thể được thực hiện theo hai phương pháp: phản ứng một bước (one-step) và phản ứng hai bước (two-step) Phản ứng một bước sử dụng đồng thời enzyme Reverse transcriptase và DNA polymerase trong cùng một ống nghiệm với mồi đặc hiệu cho gen mong muốn Ngược lại, phản ứng hai bước thực hiện phiên mã ngược và PCR thời gian thực trong hai ống nghiệm riêng biệt, với các hệ đệm, điều kiện phản ứng và mồi được tối ưu hóa khác nhau.
