Sàng lọc in silico các hợp chất có khả năng ức chế thụ thể at1 trong điều trị bệnh tăng huyết áp

diversifolia trên thế giới cho thấy sự hiện diện của nhiều nhóm hợp chất đáng chú ý như alkaloid,flavonoid, saponin, tanin, tinh dầu, triterpen…2-5, góp phần khẳng định các tác dụngsinh

KHOA DƯỢC

BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

ĐỀ TÀI:

KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY DÃ QUỲ

(TITHONIA DIVERSIFOLIA (HEMSL.) A.GRAY)

THU HÁI TẠI ĐẮK NÔNG

ĐỒNG NAI, THÁNG 6/2023

KHOA DƯỢC

BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

ĐỀ TÀI:

KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY DÃ QUỲ

(TITHONIA DIVERSIFOLIA (HEMSL.) A.GRAY)

THU HÁI TẠI ĐẮK NÔNG

ĐỒNG NAI, THÁNG 6/2023

LỜI CẢM ƠN

Đồng Nai, ngày 18 tháng 6 năm 2023

TÁC GIẢ KHÓA LUẬN

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS người đã tận tình giúp đỡ và hướngdẫn tôi trong quátrình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện khóa luận này

Tôi xin trân trọng cảm ơn các Thầy, Cô trong Hội đồng đã đọc và góp ý cho khóa luậncủa tôi

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Quý thầy cô phòng bộ môn: Thực vật, Kí sinh trùng, Dượcliệu và bộ môn Bào chế của Trường Đại học đã giúp đỡ và tạo mọi điềukiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận này

Qua đây, tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè

đã giúp đỡ, động viên, cổ vũ tinh thần cho tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luậnnày

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ v

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY DÃ QUỲ 2

2.1.1 Vị trí phân loại 2

2.1.2 Đặc điểm thực vật 2

2.1.2 Thành phần hóa thực vật 5

2.1.3 Tác dụng dược lý 10

2.2 MỘT SỐ VI KHUẨN, VI NẤM THƯỜNG GẶP 18

2.2.1 Vi khuẩn Gram dương 19

2.2.2 Vi khuẩn Gram âm 20

2.2.3 Vi nấm Candida 22

2.3 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN IN VITRO 22

2.3.1 Phương pháp khuếch tán 22

2.3.2 Phương pháp pha loãng 23

2.4 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA BẰNG DPPH 24

2.4.1 Cơ chế chống oxy hóa 24

2.4.2 Phương pháp DPPH 25

CHƯƠNG 3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

3.1 NGUYÊN VẬT LIỆU – TRANG THIẾT BỊ 27

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 27

3.1.2 Dung môi, hóa chất 27

3.1.3 Dung cụ và trang thiết bị 28

3.1.4 Các chủng vi sinh vật nghiên cứu 28

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

3.2.1 Kiểm tra nguyên liệu 29

3.2.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 29

3.2.3 Chiết xuất cao lỏng 29

3.2.4 Xác định hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm 30

3.2.5 Xác định hoạt tính chống oxy hóa các cao chiết bằng phương pháp DPPH33 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 35

4.1 THỬ TINH KHIẾT DƯỢC LIỆU 35

4.1.1 Độ ẩm 35

4.1.2 Độ tro toàn phần 35

4.2 PHÂN TÍCH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT 35

4.3 KẾT QUẢ CHIẾT XUẤT CAO LỎNG 40

4.3.1 Hiệu suất chiết các cao Dã quỳ 40

4.3.2 Hình thức cảm quan 41

4.3.3 Mất khối lượng do làm khô 41

4.3.4 Độ tro 41

4.4 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG NẤM 42

4.4.1 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch 42

4.4.2 Đánh giá nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật 43

4.5 KHẢO SÁT TÁC DỤNG CHỐNG OXI HÓA CỦA CÁC MẪU CAO THEO PHƯƠNG PHÁP DPPH 46

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50

5.1 KẾT LUẬN 50

5.2 KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ABTS 2,2’-azinobis-3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic

acidBHI Brain heart infusion Môi trường BHI

CUPRAC cupric reducing antioxidantcapacity

DĐVN Dược điển Việt Nam

DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid

DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

GI50 growth inhibition of 50% of

cells Nồng độ ức chế sự phát triển của50% tế bàoHAT Hydrogen Atom Transfer Chuyển nguyên tử hydro

HTCO Hoạt tính chống oxy hóa

IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượngthửMeOH Methanol

MHA Mueller Hinton Agar Thạch Mueller Hinton

MHB Mueller Hinton Broth Canh thang MH

MIC Minimum InhibitoryConcentration Nồng độ ức chế tối thiểu

SET Single Electron Transfer Chuyển điện tử tự do

GC-FID Gas Chromatography/FlameIoniation Detetor kỹ thuật sắc ký khí với đầu dòion hoá ngọn lửaGC-MS GasChromatography/MassSpectroscopy kỹ thuật sắc ký khí ghép nối khốiphổ

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Một số sesquiterpenoid đã được phân lập từ cây Dã quỳ 6

Bảng 3.1 Dụng cụ và trang thiết bị sử dụng 28

Bảng 3.2 Dãy nồng độ dung dịch thử và dung dịch đối chứng tương ứng với các ống nghiệm 33

Bảng 3.3 Cách pha mẫu đo của phương pháp DPPH 34

Bảng 4.1 Kết quả đo độ ẩm của thân, lá và hoa quả cây Dã quỳ 35

Bảng 4.2 Độ tro toàn phần của thân, lá và hoa quả cây Dã Quỳ 35

Bảng 4.3 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật của thân cây Dã quỳ 36

Bảng 4.4 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật của lá cây Dã quỳ 37

Bảng 4.5 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật của hoa quả cây Dã quỳ 38 Bảng 4.6 Thành phần hóa thực vật của các bộ phận trên mặt đất của cây Dã quỳ 39

Bảng 4.7 Hiệu suất chiết cao toàn phần của các bộ phận cây Dã quỳ 41

Bảng 4.8 Kết quả đo độ ẩm của các mẫu cao thân, lá và hoa quả cây Dã quỳ 41

Bảng 4.9 Kết quả đo độ tro toàn phần của cao thân, lá và hoa quả cây Dã quỳ 41

Bảng 4.10 Đường kính vòng kháng khuẩn, kháng nấm của các cao chiết và ceftriaxon .43

Bảng 4.11 Giá trị MIC của các cao chiết từ các bộ phận của cây Dã quỳ 44

Bảng 4.12 Giá trị IC50của các mẫu cao chiết từ Dã quỳ trong thử nghiệm DPPH 47 47

DANH MỤC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình 2.1 Cấu trúc một số hợp chất tagitinin phân lập từ cây Dã quỳ 6

Hình 2.2 Cấu trúc hóa học của một số hợp chất chính trong tinh dầu Dã quỳ 9

Hình 2.3 Công thức phân tử DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 26

Hình 2.4 Phản ứng trung hòa gốc DPPH 26

Hình 3.1 Cây Dã quỳ (Tithonia diversifolia (Hemsl.) A Gray .27

Hình 3.2 Sơ đồ bố trí các mẫu vào đĩa thạch 32

Hình 4.1 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các cao chiết Dã quỳ trên đĩa thạch 42

Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và hoạt tính chống oxy hóa của cao thân Dã quỳ 46

Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và hoạt tính chống oxy hóa của cao lá Dã quỳ 46

Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và hoạt tính chống oxy hóa của cao hoa quả Dã quỳ 47

Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và hoạt tính chống oxy hóa của acid ascorbic 47

Sơ đồ 3.1 Quy trình chiết xuất cao toàn phần 30

Cây Dã quỳ có tên khoa học là Tithonia diversifolia (Hemsl.) A.Gray, thuộc họ Cúc

(Asteraceae), là cây thuốc được sử dụng trong y học cổ truyền ở nhiều quốc gia như

Ấn Độ, Trung Quốc, Mexico,… để điều trị bệnh sốt rét, ký sinh trùng nhiễm trùng, sốt,tiêu chảy, viêm da, viêm gan1 Các công trình nghiên cứu về T diversifolia trên thế

giới cho thấy sự hiện diện của nhiều nhóm hợp chất đáng chú ý như alkaloid,flavonoid, saponin, tanin, tinh dầu, triterpen…2-5, góp phần khẳng định các tác dụngsinh học của loài cây này như tác dụng giảm đau, chống viêm, chống sốt rét, khángkhuẩn, kháng virut, kháng nấm và trị đái tháo đường,…

Ở Việt Nam, cây Dã quỳ phân bố rải rác, trải dài từ Bắc vào Nam Tuy nhiên, các

nghiên cứu trong nước về T diversifolia vẫn còn rất hạn chế Chính vì vậy, chúng tôi

đã tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và một số hoạt tính

sinh học của cây Dã quỳ (Tithonia diversifolia (Hemsl.) A.Gray) thu hái ở Đắk Nông”

với các mục tiêu cụ thể như sau:

1 Kiểm tra nguyên liệu và chiết xuất cao ethanol của các bộ phận thân, lá và hoa quả

Dã quỳ

2 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học trong các bộ phận thân, lá và hoa quả Dã quỳ

3 Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa theo phương pháp đánh bắt gốc tự do bằng thuốcthử DPPH và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các bộ phận khác nhau của cây

Dã quỳ, từ đó sàng lọc được bộ phận cho hoạt tính tốt nhất

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY DÃ QUỲ

Tên Việt Nam: Dã quỳ

Tên gọi khác: Hướng dương dại, Dã quỳ, Sơn quỳ, Cúc quỳ, Hướng dươngMexico,…7,8

Tên khoa học: Tithonia diversifolia (Hemsl.) A.Gray, họ Cúc (Asteraceae)7,8

Đồng danh: Mirasolia diversifolia Hemsl.7

2.1.2 Đặc điểm thực vật

2.1.2.1 Đặc điểm thực vật của họ Cúc

Họ Cúc (Asteraceae) là một trong những họ lớn nhất của ngành Ngọc Lan, giữ vai tròquan trọng đối với hệ thực vật thế giới cũng như hệ thực vật Việt Nam Họ Cúc cókhoảng 1550 chi với 23000 loài, sống ở khắp nơi, trong nhiều môi trường khác nhau,

là họ có vị trí tiến hóa cao nhất, rất đa dạng và phức tạp Vì vậy, các đặc điểm cơ bản

về hình thái rất quan trọng trong việc xác định đúng họ Cúc7

Thân cỏ, sống 1 năm hay nhiều năm Thân gỗ, cây bụi hay dây leo hiếm gặp Lá đơn

hay kép lông chim 2 lần (Bidens bipinnata), hình dạng biến thiên, không có lá kèm,

thường mọc so le hoặc tụ thành hình hoa thị ở gốc, có những loại lá có gai Phiến lánguyên hoặc có thùy, trên cùng một cây có thể có cả 2 dạng.Cụm hoa: đầu, nằm đơn

độc hoặc tập hợp thành ngù, tán Cụm hoa có đế lồi hoặc phẳng, quanh đế cụm hoa làcác lá bắc xếp xít nhau thành tổng bao Có thể xem hoa tự đầu như một gié thu ngắn,trong đó các hoa đính theo một đường xoắn ốc liên tục, hoa già ở bìa, hoa non ở giữa

Dạng thông thường của hoa tự đầu là hình nón, nhưng cũng có thể phẳng hoặc có khilõm hình chén Đầu mang 2 loại lá bắc: Lá bắc ngoài bất thụ, tạo thành một tổng bao.

Các lá bắc này có thể đính trên một hàng (Senecio, Tagetes) hoặc đính trên nhiều hàng

kết lợp Hình dạng và kích thước của lá bắc ngoài rất biến thiên Lá bắc ngoài có thểnguyên hay có răng, có gai; có những loại có màu như cánh Lá bắc thật có mang hoa

ở nách Chúng là những phiến mỏng hẹp, đôi khi có lông, có thể phẳng hay cong xungquanh hoa Hoa đều hoặc không đều, hình ống, trên đỉnh chia 4-5 thùy, lưỡng tính,

mẫu 5, bầu dưới, không có lá bắc con Các hoa trên một đầu có thể giống nhau, cócùng cách cấu tạo, cùng chức năng Kiểu đầu này gọi là đồng giao với toàn những hoahình ống hoặc toàn hoa hình lưỡi nhỏ có 5 răng hoặc đôi khi toàn hoa hình môi Hoa tựđầu có thể gồm 2 loại hoa: Hoa đều hình ống ở giữa có nhiệm vụ sinh sản và hoakhông đều hình lưỡi nhỏ có 3 răng ở bìa, đóng vai trò của tràng để thu hút côn trùng.Kiểu đầu này gọi là dị giao.Bao hoa: Đài dạng vảy có xu hướng thoái hóa Đa số biến

thành mào lông ở đỉnh quả Tràng hoa: Hoa của họ Cúc là hoa lưỡng tính, nhưng nhiềukhi do bộ nhụy hay bộ nhị không phát triển, trên cụm hoa có hoa cái, hoa đực hay hoa

vô tính Tràng gồm 5 mảnh hợp lại thành nhiều dạng khác nhau Bộ nhị: Gồm 5 nhị

bằng nhau, có chỉ nhị luôn gắn vào ống tràng và rời nhau,còn bao phấn thì dính vớinhau làm thành một ống và mở dọc theo kẽ nứt ở phía trong Bộ nhụy: 2 lá noãn ở vị

trí trước-sau, tạo thành bầu dưới 1 ô, đựng 1 noãn đảo, đính đáy Đĩa mật ở trên bầu Ởhoa lưỡng tính và hoa cái, vòi xuyên qua đĩa mật và chia thành 2 nhánh đầu nhụy (vòikhông chia nhánh ở hoa bất thụ), mang ở mặt dưới những lông để quét hạt phấn khivòi mọc xuyên qua ống cấu tạo bởi các bao phấn Sự thụ phấn nhờ côn trùng Vòinhụy 1, gốc vòi có triền tuyến mật Đầu vòi nhụy luôn xẻ 2 thùy sâu Phía trong củathùy có những núm để tiếp nhận hạt phấn.Quả: bế, thường mang một mào lông do đài

biến đổi, có khi mào lông được mang bởi một cuống dài hay ngắn Đôi khi quả trầnhoặc có móc hay có gai.Hạt không có nội nhũ; lá mầm to, nhiều khi chứa đầy dầu [6].

Cơ cấu học: Lông che chở kiểu biến thiên Lông tiết có chân ngắn, đầu đa bào, đặt

trong chỗ lõm của biểu bì Phân họ hoa hình ống và hoa tỏa tròn có ống tiết rất nhỏ.Phân họ hoa hình ống còn có tế bào tiết tinh dầu riêng lẻ Phân họ hoa hình lưỡi nhỏ cóống nhựa mủ có đốt và hình mạng6

2.1.2.2 Đặc điểm thực vật của chi Tithonia

Các loài của chi Tithonia thuộc cây bụi sống hàng năm hoặc lâu năm Thân thẳng

đứng hoặc bụi thấp Lá mọc cách, có cuống, 3 gân từ gốc, phiến lá thường 3 - 7 thùy.Cụm hoa đầu, đường kính không quá 6 cm, đơn độc, ở tận cùng hoặc nách lá, cuốngdài 10 - 25 cm Trong cụm hoa có 2 loại hoa; ở viền là hoa trung tính, 9 - 14 hoakhông kết quả, ở giữa có nhiều hoa lưỡng tính Lá bắc ở tổng bao 2 - 4 hàng; lá ắc hìnhbầu dục đến bầu dục - thuôn, chất thảo, đỉnh uốn cong Đế hoa hình nón có vảy Tràngcủa hoa ở viền dạng lưỡi nhỏ, phiến lưỡi hình bầu dục thuôn, màu vàng hoặc vàng dacam, ống tràng ngắn, đỉnh phiến có 2 - 3 thùy, ngoài có tuyến và lông tơ mảnh, tràngcủa hoa lưỡng tính dạng ống, núm có 5 thùy đỉnh nhọn, màu vàng Bao phấn có đỉnh

tù, gốc hình mũi mác ngắn Thùy vòi nhuỵ ngắn, núm nhọn, phủ lông tơ Quả bế hìnhnêm thuôn hơi bị ép, mào lông trên đỉnh quả là những vảy cứng hoặc răng cứng7, 9

Theo J.C La Duke, Rhodora (1982), chi Tithonia bao gồm 13 taxon phân bố ở 11 loài nhưng loài T diversifolia là phát triển mạnh nhất9 Còn theo Thực vật chí Việt Nam,chi này có 10 loài, phân bố ở Nam Mỹ, chủ yếu là Mexico Ở Việt Nam có 2 loài đượcnhập trồng, trong đó một loài đã trở thành hoang dại7

2.1.2.3 Đặc điểm thực vật cây Dã quỳ (Tithonia diverifolia (Hemsl.) A.Gray)Đặc điểm hình thái

Cây bụi, thân cao 1 - 3 m, phân nhiều cành, toàn thân phủ lông nhám Lá mọc so le,hình bầu dục, hẹp về phía cuống, phiến có thùy, chóp nhọn, gốc thuôn; mép có răngcưa nhỏ; 2 mặt lá phủ lông ngắn và rải rác lông tuyến; gân bên 3 - 4 đôi; cuống dài 2 -

10 cm Cụm hoa đầu, lớn, đơn độc, đường kính 6 - 8 cm, có cuống dài 20 - 25 cm.Tổng bao gồm 3 - 4 hàng lá bắc, xếp hình chuông; lá bắc hàng ngoài ngắn và hẹp, đỉnhnhọn, dài 7 - 10 mm, hàng trong đầu tù hoặc nhọn, dài 20 - 25 mm, mặt lưng phủ lôngngắn;vảy đế hoa hình bầu dục thuôn dài, màu nâu tối, dài 12 mm Hoa ở viền 12 - 14,dạng lưỡi nhỏ,tràng hình ống, màu vàng tươi, có mùi thơm, dài 3 - 5 cm, không kếtquả: ở giữa là hoa lưỡng tính, tràng dạng ống dài 7 - 10 mm, màu vàng nhạt, đầu 5thùy, đỉnh nhọn Bao phấn màu đen, đỉnh màu vàng Quả bế, không có góc, hơi dẹt; vỏnhẵn bóng, dài 5 - 8 mm; mào lông trên đỉnh quả là 2 răng cứng7

Đặc điểm giải phẫu

Duarte M D R và cộng sự (2012) đã nghiên cứu về đặc điểm giải phẫu thân và lá Dãquỳ, cho thấy ở lá có các lỗ khí kiểu dị bào phân bố trên cả hai mặt và các bó mạch rời

rạc sắp xếp thành một vòng ở gân giữa Thân cây được đặc trưng bởi mô dày góc vànội bì dễ quan sát10.

Phân bố, sinh thái

T diversifolia (Hemsl) A Gray có nguồn gốc ở bắc và trung Mỹ, nhưng được du nhập

vào Châu Phi, Châu Úc và Châu Á, là cây phát triển rất mạnh

Ở Việt Nam, cây Dã quỳ hiện nay đã được tự nhiên hóa, mọc phổ biến ở rất nhiều nơi

từ Lai Châu, Điện Biên, Cao Bằng, đặc biệt là ở vùng Tây Nguyên7,8

2.1.2 Thành phần hóa thực vật

Các nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy sự hiện diện của một số nhóm hợp chất trong

Tithonia diversifolia, bao gồm: Alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, tinh dầu, triterpen

và phenolic2-5 Cho đến nay, hơn một trăm chất chuyển hóa thứ cấp đã được phân lập

từ các chiết xuất T diversifolia khác nhau, và cấu trúc của chúng đã được xác định

thông qua phổ hồng ngoại, phổ khối (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).Sesquiterpenoid, diterpenoid và flavonoid được coi là những thành phần nổi bật nhất

có trong cây Dã quỳ1

2.1.2.1 Terpenoid

Terpenoid là chất chuyển hóa phổ biến nhất ở loài này, trong đó phần lớn làsesquiterpen Các sesquiterpenoid chính đã được phân lập chủ yếu thuộc nhómsesquiterpen lacton, bao gồm germacranolid, eudesmanolid và guaianolid1

Cho đến nay, tagitinin là germacranolid được nghiên cứu nhiều nhất Chín loạitagitinin đã được phân lập từ các bộ phận của cây Dã quỳ Tagitinin A, C và F lần đầutiên được phân lập cùng với tirotundin và hispidulin từ các bộ phận trên mặt đất củacây bởi Baruah và cộng sự (1979)11 Năm 2008, từ lá và cụm hoa Ambrósio và cộng sự

đã phân lập được taniginin A, C, F cùng với tagitinin C metylbutyrat và tirotundin

3-O-metyl ete12 G Zhao và cộng sự (năm 2012)13, từ các phần trên mặt đất của Dã quỳ

tagitinin G, H và I đã được phân lập cùng với 1β-hydroxydiversifolin-3-O-metyl ete và tagitinin F 3-O-metyl ete.

Bảng 2.1 trình bày một số sesquiterpen khác đã được phân lập từ cây Dã quỳ

Tagitinin A Tagitinin B

Hình 2.1 Cấu trúc một số hợp chất tagitinin phân lập từ cây Dã quỳ

Bảng 2.1 Một số sesquiterpenoid đã được phân lập từ cây Dã quỳ

1

Germacranolid

2α-hydroxytirotundin

Bộ phậntrên mặtđất

3 1α-hydroxytirotundin 3-O-methyl ether

5 1β-methoxydiversifolin 3-O-metyl ete

6 1α-hydroxydiversifolin 3-O-metyl ete

7 dẫn xuất 2-O-metyl của tagitinin B

21 3β-acetoxy-8β-isobutyryloxyrenosin

22

Guaianolid

11(13)-ene-12,6α;3,10α-diolid Lông tiết

8β-(Isobutyroyloxy)-4-oxo-3,4-secoguai-ở lá vàhoa

glucopyranosyloxy)methyl]-2,3-đất37

(2R)-N-{(1S,2R,8E)-1-[(β-D-hydroxyheptadec-8-en-1-yl}2-hydroxyhexadecanamid2.1.2.2 Tinh dầu

glucopyranosyloxy)-methyl]-2-Tinh dầu là các chất dễ bay hơi tự nhiên thu được từ nhiều loại thực vật bao gồm T diversifolia Tinh dầu có thể thu được từ hoa, lá, thân và rễ của Dã quỳ với hàm lượng

tương đối thấp (0,019-0,1% w/w) so với các loài thực vật khác thuộc họ Cúc14

Moronkola, D O và cộng sự (2007) đã sử dụng kỹ thuật sắc ký khí ghép nối khối phổ(GC-MS) để phân tích thành phần tinh dầu lá và hoa Dã quỳ ở Nigeria thu được từphương pháp cất kéo hơi nước Kết quả cho thấy trong tinh dầu lá có sự hiện diện của

nhiều hợp chất như α-pinen (32,9%), β-caryophyllen (20,8%), germacrene D (12,6%),β-pinen (10,9%), 1,8-cineol (9,1%) Trong khi đó, germacrene D (20,3%), β-caryophyllen (20,1%), và bicyclogermacrene (8,0%) lại đặc trưng cho tinh dầu của hoa

Dã quỳ Một lượng acid béo aliphatic và một hợp chất diterpenoid,sandracopimaradien có trong hoa nhưng không được phát hiện trong tinh dầu lá15.Lawal, O A và cộng sự (2012) đã xác định thành phần của tinh dầu từ hoa, lá , thân

và rễ của T diversifolia bằng phương pháp GC-MS Các chất dễ bay hơi lần lượt

chiếm 96,7%; 93,7%; 88,9% và 93,7% tinh dầu hoa, lá, thân và rễ Các thành phần bayhơi chính trong tinh dầu hoa, lá, thân và rễ đã được báo cáo là α-pinen (60,9-75,7 %),β-pinen (7,2-11,0 %) và limonen (0,9-4,3%)15

Đỗ Ngọc Đài và cộng sự (2015) đã phân tích thành phần tinh dầu T diversifolia bằng

kỹ thuật sắc ký khí với đầu dò ion hoá ngọn lửa FID) và đầu dò khối phổ

(GC-MS) cho thấy các hợp chất α-pinen (30,7 %) cùng với (E,E)-α-farnesen (6,1%) và

β-caryophyllen (5,1%) là thành phần chủ yếu16

Từ các phần trên mặt đất của T diversifolia mọc ở khu vực phía tây Kenya, Wanzala

và cộng sự (2016) đã tìm thấy các hợp chất α pinen, β-pinen, isocaryophyllen,nerolidol, 1-tridecanol, limonen, sabinen, α-copaen, α-gurjunen và cyclodecen17

Năm 2019, bằng kỹ thuật GC-MS và NMR, Ana Luzia Ferreira Farias và cộng sự đãxác định thành phần hóa học của tinh dầu Dã quỳ chủ yếu gồm α-pinen (9,9%),

limonen (5,40%), (Z)-β-ocimen (4,02%), ρ-cymen-8-ol (3,0%), piperiton (11,72%), (E)-nerolidol (3,78%) và spathulenol (10,8%)18

Từ các nghiên cứu trên có thể thấy, α-pinen là thành phần chiếm tỉ lệ cao nhất trong

tinh dầu T diversifolia Tuy nhiên số lượng các hợp chất cũng như tỉ lệ giữa các thành

phần có sự khác biệt nhất định giữa các khu vực, chứng tỏ tinh dầu Dã quỳ có thể chịuảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường, thổ nhưỡng và khí hậu

α-pinen β-pinen

Spathulenol

β-caryophyllen Germacrene D Bicyclogermacrene

Hình 2.2 Cấu trúc hóa học của một số hợp chất chính trong tinh dầu Dã quỳ.

2.1.2.3 Flavonoid

Bongani Sicelo Dlaminia và cộng sự (2020) đã phân lập được bốn flavonoid mới từ

thân T diversifolia là pachypodol (1), 3,7-dimethylquercetin (2), retusin (3) và

chrysosplenetin (4) Các hợp chất (1), (2), (4) có hoạt tính chống gốc tự do vì có nhómhydroxyl, trong khi hợp chất (3) không có hoạt tính Cả 4 flavonoid này đều cho tác

dụng kìm khuẩn thấp đối với các chủng vi khuẩn thử nghiệm, ngoại trừ Bacillus subtilis19

Ngarivhume và cộng sự (2021) đã phân lập được 5 lacton sesquiterpen thuộc nhómgermacranolid và một flavonol mới là 3,6-dihydroxy-2-(40-hydroxyphenyl)-7-methoxy-4H-chromen-4-on Flavonol mới phân lập có tác dụng chống sốt rét đối vớichủng nhạy cảm với chloroquin20.

Bằng kỹ thuật LC-MS/MS, Fatmawaty Yazid và cộng sự (2021) đã xác định sự có mặt

của một số flavonoid như 5-hydroxy-6,4'-dimethoxy flavon-7-O-β-D glucopyranosid, 5-O-methylvisamminol, luteolin-7-O-glucuronid và kaempferol trong lá của cây Dã

quỳ21

2.1.3 Tác dụng dược lý

Các nghiên cứu về thành phần hóa thực vật gần đây đã nhấn mạnh các đặc tính sinh

học của T diversifolia như hoạt tính chống oxy hóa, chống sốt rét, kháng khuẩn và

chống tăng đường huyết Cao chiết lá đã được chứng minh có nhiều tác dụng dược lýnhư kháng khuẩn, kháng viêm, chống co thắt,… Dã quỳ cũng được sử dụng để điều trịrối loạn thấp khớp và viêm ghẻ lở Ở Vân Nam (Trung Quốc), lá dùng trị viêm da dàyruột cấp tính và trị mụn nhọt lỡ (ung sang); còn ở Quảng Tây, được dùng trị lở ngứasưng độc8 Một số tác dụng đã được thử nghiệm lâm sàng đầy đủ và đã ứng dụng làmthuốc

2.1.3.1 Tác dụng chống viêm

Nghiên cứu của Victor B, Owoyele và cộng sự (2004) cho thấy chiết xuất methanol

của lá T diversifolia cho hiệu quả chống viêm và giảm đau trên chuột thử nghiệm.

Nồng độ từ 50-200 mg/kg cân nặng có tác dụng ngăn ngừa chứng phù chân docarrageenan và u hạt phụ thuộc vào liều lượng Đặc biệt, ở liều 100 mg/kg, tác dụngchống viêm của cao methanol cao hơn so với chứng dương indomethacin (5 mg/kg)22.Nghiên cứu trên chuột của García và cộng sự (2006) cho thấy 2 sesquiterpen lacton làtagitinin A và C mang lại tác dụng chống viêm khá khiêm tốn khi so sánh vớiindomethacin Do vậy, những hợp chất này có thể được sử dụng cho các tình trạngviêm nhẹ đến trung bình

Các sesquiterpen lacton khác bao gồm các furanoheliangolid (0,6–10 μM) cũng làmgiảm đáng kể việc tạo ra superoxid bởi bạch cầu trung tính có phụ thuộc liều, theo báocáo của Herrera và cộng sự (2007)23

Để đánh giá thành phần có tác dụng kháng viêm giảm đau trong cây Dã quỳ, Paula và cộng sự (2011) đã thực hiện chiết xuất cao Dã quỳ bằng 3 kỹ thuật: chiết

Chagas-nhanh (LRE), chiết bằng dung môi phân cực (PE) và phương pháp ngâm Ở liều uống10-150 mg/kg, dịch chiết bằng phương pháp LRE và PE tạo ra tác dụng chống phù nề

rõ ràng và phụ thuộc vào liều ở chuột Tuy nhiên, dịch chiết từ phương pháp ngâm lạikhông có tác dụng mặc dù tính chất hóa học của dịch chiết này được cho là gần giốngdịch chiết thu được bằng phương pháp PE Điều quan trọng là ở liều 10 và 50 mg/kg,

PE thể hiện tác dụng chống viêm tốt hơn và nhanh hơn so với LRE và indomethacin(10 mg/kg) PE chứa chủ yếu là các acid chlorogenic và thiếu vắng các sesquiterpenlacton Điều này cho thấy các acid chlorogenic từ chiết xuất phân cực của Dã quỳ cóthể là một ứng cử viên đầy triển vọng cho các loại thuốc chống viêm trong tương lai.Mặt khác, các tác giả cũng đã phát hiện ra rằng khi bôi tại chỗ (0,05 và 0,5 mg/tai) vàotai bị viêm của chuột, cả ba loại dịch chiết đều tạo ra sự ức chế đáng kể việc thu hútbạch cầu trung tính24

Trong số các sesquiterpen lacton phân lập từ lá Dã quỳ, tagitinin C, F và A được pháthiện là làm thay đổi chức năng của bạch cầu trung tính, theo Abe và cộng sự (2015).Thật vậy, ở liều 100 µM, tất cả các tagitinin được nghiên cứu đều ức chế đáng kể quátrình sản xuất interleukin -6 (IL-6), IL-8 và TNF-α bởi bạch cầu trung tính ở người.Các tác giả cũng chỉ ra tagitinin F đã làm giảm đáng kể việc tạo ra myeloperoxidasebởi bạch cầu trung tính ở người ở nồng độ 100 µM Cả ba tagitinin đều làm giảm tỷ lệsống sót của bạch cầu trung tính được kích hoạt Quá trình chết theo chương trình củabạch cầu trung tính tăng lên khi có mặt tagitinin C (1) và nó xảy ra độc lập với sự hiệndiện của lipopolysacarid hoặc dexamethasone Tuy nhiên, tagitinin F là sesquiterpenduy nhất làm giảm bài tiết các sản phẩm gây viêm mà không gây ra quá trình chết theochương trình của bạch cầu trung tính25

Hiransai và cộng sự (2016) đã báo cáo rằng chiết xuất nước của T diversifolia ức chế

đáng kể quá trình sản xuất NO bởi các tế bào RAW264.7 được kích hoạt bằnglipopolysaccharid theo cách phụ thuộc vào nồng độ, với giá trị IC50 là 11,63 μg/ml26.Các nghiên cứu gần đây cho thấy, việc điều trị bằng đường uống với dịch chiết ethanol

từ lá T diversifolia làm giảm sự di chuyển của bạch cầu trung tính, ức chế sản xuất

NO cũng như giảm tổng lượng protein, TNF, IL-1β và CXCL1 trong dịch tiết bị viêm.Các dịch chiết có thể làm tăng quá trình loại bỏ các tế bào bạch cầu đã chết theo quytrình, tăng IL-10 và giảm bài tiết TNF, đồng thời làm giảm sự quá mẫn do carrageenangây ra27

2.1.3.2 Tác dụng chống oxi hóa

Theo C L Juang và cộng sự (2014), dịch chiết ethanol từ lá Dã quỳ cho thấy có khảnăng bắt giữ gốc tự do DPPH với IC50 = 0,93 ± 0,20 μg/ml, yếu hơn so với đối chứngdương vitamin C (IC50 = 0,48 ± 0,10 μg/ml) Kết quả nghiên cứu cũng chứng minhdịch chiết ethanol từ lá Dã quỳ có tác dụng bảo vệ tế bào khỏi độc tính do H2O2gây ra

Thử nghiệm in vivo ở liều 50 mg/kg cho thấy dịch chiết này thể hiện tác dụng bảo vệ ở

mức vừa phải chống lại stress oxy hóa gây ra bởi tổn thương tủy sống ở chuột28

Robson Miranda da Gama và cộng sự (2014) cho rằng T.diversifolia có tác dụng ngăn ngừa lão hóa tế bào khi nghiên cứu sàng lọc thành phần hóa học của hoa khô T diversifolia cho thấy sự hiện diện của các hợp chất phenolic (tannin, flavonoid và

phenol toàn phần) Dịch chiết ethanol từ hoa Dã quỳ mang lại hiệu quả loại bỏ gốc tự

do DPPH mạnh với giá trị IC50là 205,80 µg/ml29

Tania P., M và cộng sự (2016), đã nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của chiết xuất

nước và ethanol từ lá T diversifolia bằng phương pháp DPPH (2,

2-diphenyl-1-picrylhidrazyl) Giá trị IC50của dịch chiết nước và dịch chiết ethanol lần lượt là 2,273mg/ml và 0,630 mg/ml30

Khả năng chống oxy hóa của dịch chiết nước của T diversifolia cũng được Hiransai và

cộng sự đánh giá qua phương pháp DPPH và ABTS với đối chứng dương là Trolox vàN-acetyl cystein Giá trị IC50của dịch chiết lần lượt là 801,06 ± 13,61 μg/ml trong thửnghiệm ABTS và 4099,12 ± 339,20 μg/ml trong thử nghiệm DPPH So với các chấtchống oxy hóa tham chiếu được sử dụng trong mỗi thử nghiệm, khả năng loại bỏ gốc

tự do ABTS của dịch chiết nước T diversifolia tương đương 241,04 ± 11,93 μmol

Trolox và 32,62 ± 1,87 mg N-acetyl cystein trên mỗi gam cao khô Trong khi đó, khảnăng loại bỏ gốc DPPH thì tương đương với 94,89 ± 2,69 μmol Trolox và 20,99 ± 2,79

mg N-acetyl cystein trên mỗi gam cao khô26

Bằng phương pháp ABTS và DPPH, Orsomando và cộng sự (2016) đã chứng minh

tinh dầu của T diversifolia cũng có khả năng loại bỏ gốc tự do với giá trị IC50lần lượt

là 41,7 μg/ml và 108,8 μg/ml31

Ngoài ra, phân đoạn ethyl acetat và n-butanol của T diversifolia cũng được phát hiện

có hoạt tính chống oxy hóa tốt khi được thử nghiệm bằng phương pháp đánh bắt gốc

tự do DPPH và các thử nghiệm chelat hóa kim loại, theo báo cáo của Pulido và cộng

sự (2017)32

Nghiên cứu M S Roopa và cộng sự (2021) đã khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiếtxuất đến hàm lượng phenol, hàm lượng flavonoid và khả năng chống oxy hóa của cácdịch chiết Kết quả cho thấy dịch chiết ethyl acetat cho hiệu quả loại gốc tự do DPPHtốt nhất, với IC50= 60,43 μg/ml5.

Tamfu, A N., Roland, N và cộng sự (2022) đã xác định được 10 hợp chất phenoltrong dịch chiết ethyl acetat và 7 hợp chất phenol trong dịch chiết methanol của

T.diversifolia Đây là những thành phần được xem là có khả năng loại bỏ gốc tự do.

Trong nghiên cứu này, hoạt tính chống oxy hoá của các dịch chiết được đánh giá bằngnhiều phương pháp khác nhau (beta- carotene-linoleic acid, DPPH, ABTS+, CUPRAC

và tạo chelat kim loại ) đều cho thấy kết quả tốt, đặc biệt là trong thử nghiệm bằngDPPH33

2.1.3.3 Tác dụng trị bệnh đái tháo đường

Tác dụng trị đái tháo đường của Dã quỳ đã được Miura và cộng sự (2005) nghiên cứutrên chuột KK-Ay, một loại chuột được gây bệnh đái tháo đường tuýp 2 Sử dụng chiếtxuất ethanol 80% của Dã quỳ với liều duy nhất 500 mg/kg cân nặng giúp làm giảmđường huyết chuột KK-Ay trong vòng 7 giờ điều trị Mặc khác, sau 3 tuần điều trị vớiliều tương tự, lượng đường trong máu và insulin huyết tương chuột đều giảm đáng kể.Những kết quả này ủng hộ giả thuyết rằng Dã quỳ cải thiện chuyển hóa glucose bằngcách giảm tình trạng kháng insulin và có thể hữu ích trong điều trị bệnh đái tháođường tuýp 234

Một báo cáo của G Zhao và cộng sự (2012) cho thấy 4 sesquiterpen phân lập từ cây

Dã quỳ ở nồng độ 10 μg/ml có tác dụng làm tăng đáng kể sự hấp thu glucose trong các

tế bào mỡ 3T3-L1 mà không gây độc tính13

Trong nghiên cứu của Alfred Ngenge Tamfu và cộng sự (2021), dịch chiết ethyl acetat

và methanol của T diversifolia cho hoạt tính kháng một số loại enzym như

cholinesterase (AchE và BchE), tyrosinase, α-amylase và α-glucosidase Trong đó, khảnăng ức chế enzym α-amylase và α-glucosidase của Dã quỳ đều khá tốt, với IC50 lầnlượt 28.35 ± 0.25 mg/ml và 24.59 ± 0.73 mg/ml đối với dịch chiết MeOH và 31.22 ±0.41 mg/ml và 26.30 ± 1.21 mg/ml đối với dịch chiết ethyl acetat Do vậy, Dã quỳ cótiềm năng trong việc sử dụng để điều trị bệnh Alzheimer và kiểm soát bệnh đái tháođường33

Yazid, Fatmawaty và cộng sự (2021) cho rằng chiết xuất lá T Diversifolia làm giảm

đường huyết lúc đói và cải thiện cấu trúc mô học tuyến tuỵ của chuột, có tác dụng bảo

vệ các biến chứng trên gan chuột Sprague Dawley do alloxan gây ra21

2.1.3.4 Tác dụng gây độc tế bào và chống ung thư

Từ 11 chất được phân lập từ dịch chiết ethyl acetat từ phần trên mặt đất của cây Dãquỳ, Jian-Qiao Gu và cộng sự (2002) đã sàng lọc và đánh giá khả năng chống tăngsinh tế bào ung thư ruột kết (Col2) và sự biệt hóa tế bào ung thư bạch cầu tiền tủy bào

ở người (HL-60) Trong các hợp chất này, tagitinin C và 1β,2α-epoxytagitinin C thểhiện hoạt tính chống tăng sinh tốt nhất với IC50 ≤ 5 µg/ml Ở nồng độ 4 µg/ml, tithofolinolid, 3β-acetoxy-8β-isobutyryloxyreynosin và 4α,10α-dihydroxy-3-oxo-8β-

isobutyryloxyguaia-11(13)-en-12,6α-olid gây ra sự biệt hóa tế bào HL-60 với tỉ lệ biệt

hóa trên 30,0% 3β-acetoxy-8β-isobutyryloxyreynosin ức chế đáng kể sự hình thành

tổn thương (63,0%, ở nồng độ 10 µg/ml) trong xét nghiệm nuôi cấy cơ quan tuyến vúchuột35

Kết quả nghiên cứu của Calderón và cộng sự (2006) cho thấy chiết xuất ethanol từ lá

Dã quỳ cũng thể hiện tác dụng ức chế đối với các tế bào ung thư vú MCF-7 (GI50 = 35µg/ml) và các dòng tế bào ung thư khác ở người bao gồm phổi (H-460) và thần kinhtrung ương (SF- 268) với giá trị GI50tương ứng là 33 và 53 µg/ml36

Từ dịch chiết ethanol 80% của phần trên mặt đất T diversifolia, M Kuroda và cộng sự

(2007) đã phân lập được 12 sesquiterpen và 3 flavonoid định hướng gây độc tế bào.Các hợp chất này cho thấy hoạt tính gây độc trên tế bào ung thư bạch cầu HL-60 vớigiá trị IC50nằm trong khoảng từ 0,13 đến 13,0 mM, etoposid được sử dụng làm chứngdương với IC50= 0,43 mM37

Dịch chiết lá Dã quỳ trong methanol cũng thể hiện tác dụng chống tăng sinh ở mứctrung bình đối với các dòng tế bào ung thư thận (TK10), vú (MCF-7) và khối u ác tính(UACC62) ở người với các giá trị GI50 lần lượt là 9,65 µg/ml, 12,70 µg/ml và 7,86µg/ml38

Lee và cộng sự (2011) đã phát hiện rằng chiết xuất lá Dã quỳ trong methanol (IC50=59,2 ± 3,7 μg/ml) cùng với hợp chất tagitinin C (IC50 = 6,1 ± 0,1 μg/ml) cho thấy tácdụng chống tăng sinh đáng kể đối với các tế bào u nguyên bào thần kinh đệm U373.Tác dụng này hoàn toàn độc lập với việc hoạt hóa các caspase39

Trong nghiên cứu của Liao, M H., Tsai, Y N., và cộng sự (2013), dịch chiết methanol

của lá T diversifolia và tagitinin C được phát hiện có hoạt tính gây độc tế bào trên các

tế bào ung thư gan ở người (Hep-G2) khi đánh giá bằng thử nghiệm MTT dimethylthiozol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide), với IC50 lần lượt là 40,0 ±2,0 µg/ml và 2,0 ± 0,1 µg/ml40

(3-(4,5-Tinh dầu Dã quỳ thể hiện tác dụng gây độc tế bào đáng kể trên các tế bào ung thư hắc

tố ác tính (A375), ung thư vú (MDA-MB 231), ung thư biểu mô ruột kết (HCT 116) và

u nguyên bào thần kinh đệm đa dạng (T98 G) với các giá trị IC50lần lượt là 3,02 μg/ml,3,79 μg/ml, 3,46 μg/ml và 12,82 μg/ml theo báo cáo của Giuseppe Orsomando và cộng

sự (2016)31

Nghiên cứu của Min-Ren Lu và cộng sự (2017) đã chỉ ra rằng, chiết xuất ethyl acetatcủa Dã quỳ gây ra quá trình chết theo chương trình (apoptosis) của các tế bào ung thưgan Hep-G2, cho thấy tiềm năng của Dã quỳ như một chất chống ung thư41

Dựa trên các nghiên cứu trước đó về khả năng chống ung thư gan của tigatinin C phânlập từ lá cây Dã quỳ, Chuan-Yi Lin và cộng sự đã thực hiện các nghiên cứu để đánhgiá khả năng chống di căn của tigatinin C trong các mô hình xenograft của ung thư tếbào biểu mô gan (HCC) Kết quả cho thấy tagitinin C phân lập được từ dịch chiếtmethanol của lá Dã quỳ có tác dụng gây độc tế bào trên 2 dòng tế bào ung thư ganHep-G2 và Huh 7 với IC50 lần lượt là 2,0 ± 0,1 µg/ml và 1,2 ± 0,1 µg/ml và có khả

năng chống di căn tế bào trong các thử nghiệm in vitro Mặt khác, tính sinh khối u của

xenograft có nguồn gốc từ tế bào Hep-G2 bị chậm lại đáng kể ở chuột được điều trịbằng 15 µg tagitinin C mỗi ngày Như vậy, tagitinin C có thể được sử dụng như mộtliệu pháp thay thế hoặc phụ trợ để điều trị HCC42

2.1.3.5 Tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm

Nghiên cứu của John-Dewole và Oni, (2013) chỉ ra rằng chiết xuất nước từ lá Dã quỳ

có tác dụng ức chế tăng trưởng đối với S aureus và Escherichia coli với nồng độ ức

chế tối thiểu (MIC) đều là 12,5 mg, nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) trong khoảng

từ 12,50 - 25,00 mg Trong khi đó Pseudomonas aeruginosa và nấm Saccharomyces cerevisiae kháng tất cả các dịch chiết (nước, methanol và ether dầu hỏa) và các kháng

sinh đối chứng43

Trong một nghiên cứu khác của Trần Thị Thanh Thúy và cộng sự (2013) cho thấy dịch

chiết nước từ lá của Dã quỳ không có tác dụng đối với P aeruginosa, Microbacterium

foliorum, B subtilis và Rhodococcus equi Tuy nhiên, xanh nano bạc được tổng hợp từ dịch chiết này lại có hoạt tính cao đối với cả vi khuẩn Gram dương (M foliorum, B subtilis và R equi) và vi khuẩn Gram âm (P aeruginosa) với đường kính vòng ức chế

lần lượt là 13 mm, 15 mm, 10 mm và 14 mm Phát hiện quan trọng này cho thấy rằngquá trình bao bọc nano có thể là một hệ thống phân phối thuốc đầy hứa hẹn cho cácchiết xuất từ Dã quỳ44

Hoạt tính kháng khuẩn in vitro của các dịch chiết nước, ethanol và methanol từ cây Dãquỳ đã được Odeyemi và cộng sự (2014) đánh giá trên một số chủng vi khuẩn gây

bệnh như Enterococcus spp., E coli, P aeruginosa, Salmonella spp., và Shigella spp bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch E coli được phát hiện là nhạy cảm hơn với chiết xuất ethanol từ lá Dã quỳ ở nồng độ 20 mg/ml, tiếp theo là Salmonella và Shigella, Enterococcus và thấp nhất là Pseudomonas spp Ở nồng độ 20 mg/ml, Enterococcus được phát hiện là nhạy cảm hơn với dịch chiết ethanol từ rễ khi so sánh

với các vi khuẩn khác được thử nghiệm Dịch chiết ethanol luôn cho kết quả khángkhuẩn tốt hơn các dịch chiết methanol và nước Các giá trị MIC nằm trong khoảng

1,25 mg/ml - 5 mg/ml Tuy nhiên, các chiết xuất từ hoa T diversifolia không cho thấy

bất kỳ tác dụng kháng khuẩn nào đối với tất cả các vi khuẩn được thử nghiệm Kết quả

chỉ ra rằng T diversifolia có hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng và có thể đóng vai trò là

một nguồn chất chống khuẩn mới tương đối tốt3

Orsomando và cộng sự (2016) cho rằng hoạt tính mạnh trên S aureus của tinh dầu Dã

quỳ (MIC = 2 mg/ml và đường kính vòng kháng khuẩn là 14 mm) là do sự ức chếchọn lọc enzym NadD (nicotinat mononucleotid adenylyltransferase) sinh tổng hợpNAD của vi khuẩn (IC50khoảng 60 µg/ml)31

Nghiên cứu của R N Ahmed và cộng sự (2017) đã đánh giá hoạt tính kháng khuẩncủa Dã quỳ với các dung môi chiết xuất khác nhau như toluen, aceton, ethanol và nước.Kết quả cho thấy ở nồng độ 300 mg/ml, chỉ dịch chiết ethanol thể hiện hoạt tính kháng

khuẩn đối với E coli ST2747 với đường kính vùng ức chế là 14 mm, tốt hơn so với

kháng sinh tham chiếu gentamicin là 3 mm Do đó, dịch chiết ethanol từ Dã quỳ được

đề nghị có thể dùng như một chất thay thế cho tetracyclin và gentamicin trong điều trị

các bệnh nhiễm trùng do E coli ST2747 gây ra25

Trong một nghiên cứu khác, tinh dầu Dã quỳ đã được đánh giá khả năng kháng khuẩn

trên các chủng vi khuẩn E.coli, S aureus và P aeruginosa Kết quả cho thấy tinh dầu

có hoạt tính tốt nhất trên E coli (12,5 mg/ml) Nồng độ từ 50 mg/ml tinh dầu mới có

hiệu quả trên 2 chủng còn lại18

4 flavonoid phân lập từ thân Dã quỳ bao gồm: pachypodol, 3,7-dimethylquercetin,retusin và chrysosplenetin đã được đánh giá về khả năng kháng khuẩn trên 4 chủng vi

khuẩn E coli, S aureus, B subtilis, B enterica Kết quả cho thấy cả 4 hợp chất này

đều cho tác dụng kìm khuẩn tương đối thấp đối với hầu hết các vi khuẩn thử nghiệm

và tác dụng ở mức trung bình đối với B subtilis (MIC < 500 µM)19

Nghiên cứu gần đây của A F Okiti và O T Osuntokun (2021) đã xác định hoạt tínhkháng khuẩn của dịch chiết lá Dã quỳ trên một số chủng vi khuẩn gây bệnh thường

gặp như B subtilis, E coli, Klebsiella pneumonia, Proteus mirabilis, P aeruginosa, Salmonella typhi, Shigella dysentriae, S aureus, Streptococcus pyogenes, Candida albicans và các vi khuẩn đa kháng thuốc Acinetobacter baumannii, Enterobacter agglomerans, Proteus mirabilis, Providencia stuartii, Salmonella subsp 3b, với

levofloxacin và fluconazol là đối chứng dương Kết quả cho thấy dịch chiết ethyl

acetat từ lá Dã quỳ cho hiệu quả tốt nhất trên Candida albicans với đường kính vòng

ức chế là 26±1,414 mm ở nồng độ 100 mg/ml Trong khi đó, B subtilis, P aeruginosa,

S pyogenes, P mirabilis kháng tất cả các dịch chiết Dã quỳ ở các nồng độ thử

nghiệm45

2.1.3.6 Tác dụng trên da

Vũ Thị Thu Hằng và cộng sự (2012) đã khảo sát tác dụng của lá tươi T diversifolia

trên thỏ mắc bệnh ghẻ Lá Dã quỳ tươi với khối lượng khác nhau (300 g, 250 g và 150g) được chiết với 100 ml nước Các dịch chiết được bôi lên vùng tổn thương của thỏ, 4lần một ngày, liên tiếp trong 5 ngày Ivermectin dạng tiêm được sử dụng làm đốichứng dương Kết quả cho thấy các dịch chiết đều cho hiệu quả trong việc điều trị ghẻ

ở thỏ và nồng độ cao nhất (300 g dược liệu tươi trong 100 ml nước) cho kết quả tốtnhất, tương đương với liều điều trị của Ivermectin46

2.1.3.7 Tác dụng chống sốt rét

E Goffin và cộng sự đã nghiên cứu khả năng chống sốt rét của Dã quỳ trên 3 chủng

Plasmodium falciparum Kết quả cho thấy dịch chiết ether và tagitinin C phân lập từ

phần trên mặt đất của Dã quỳ đều cho hoạt tính tốt trên chủng A, với IC50lần lượt là0,75 µg/ml và 0,33 µg/ml Các tác giả cũng ghi nhận dịch chiết nước thì không có tácdụng47

Từ phần trên mặt đất của Dã quỳ, Elufioye và cộng sự (2004) đã chiết xuất với ethanol70% bằng phương pháp ngâm Cao chiết được sử dụng để nghiên cứu khả năng khángsốt rét ở giai đoạn đầu và giai đoạn lây nhiễm trên chuột thử nghiệm với liều 50-400mg/kg mỗi ngày Kết quả đã chỉ ra rằng liều 200 mg/kg cân nặng một ngày là liều điềutrị có hiệu quả48.

Dịch chiết nước và methanol từ Dã quỳ cho hiệu quả loại bỏ ký sinh trùng sốt rét trênchuột thử nghiệm lần lượt là 54% và 74%, theo nghiên cứu của Oyewole và cộng sự.(2008) Kết quả còn cho thấy, việc sử dụng các dịch chiết sớm, khi bắt đầu có triệuchứng sốt rét sẽ mang lại hiệu quả cao hơn trong việc giảm lượng ký sinh trùng Trongkhi đó, sử dụng trong đợt sốt rét cũng mang lại hiệu quả nhưng thời gian điều trị sẽkéo dài hơn Nghiên cứu trên người tình nguyện cũng chỉ ra tinh dầu từ Dã quỳ có khả

năng xua muỗi Anopheles gambiae, Aedes aegypti và Culex quinquefasciatus và kéo

dài thời gian bảo vệ ở các nồng độ thử nghiệm khác nhau Qua đó cho thấy tiềm năngtrong việc sử dụng Dã quỳ như thuốc xua muỗi để bảo vệ chống lại bệnh sốt rét và cácbệnh khác bao gồm chikungunya, sốt xuất huyết, sốt vàng da và Zika49

Nghiên cứu của Muganga và cộng sự (2010) cho thấy dịch chiết nước, methanol vàdicloromethan từ lá và hoa Dã quỳ đều cho hoạt tính kháng ký sinh trùng sốt rét Dịchchiết dicloromethan được báo cáo là cho kết quả tốt nhất trên cả 2 chủng sốt rét nhạycảm và kháng cloroquin Trong khi đó, dịch chiết nước chỉ cho tác dụng trên chủngnhạy cảm cloroquin với IC50lần lượt là 24,5 µg/ml và 15,6 µg/ml tương ứng với dịchchiết hoa và lá50

Ngoài ra, nghiên cứu in vitro của Funmilayo I.D Afolayan và cộng sự (2016) cũng chỉ

ra rằng, sự kết hợp của T divesifolia và Lawsonia inermis với tỉ lệ 1:1 cho hiệu quả

kháng sốt rét tốt với IC50 lần lượt là 0,43±0,02 µg/ml trên P falciparum nhạy cảm cloroquin và 2,55±0,19 µg/ml đối với chủng P falciparum kháng cloroquin51

2.2 MỘT SỐ VI KHUẨN, VI NẤM THƯỜNG GẶP

Vi khuẩn và vi nấm là những sinh vật có thể gây tổn thương mô và can thiệp vào cơthể chúng ta hoạt động đến mức gây bệnh, vi khuẩn rất nhỏ và không nhìn thấy bằngmắt thường

2.2.1 Vi khuẩn Gram dương

2.2.1.1 Staphylococcus aureus

Hình thể và tính chất bắt màu: Tụ cầu là những vi khuẩn hình cầu có đường kính 0,8

-1 µm đứng tụ lại với nhau thành từng đám như chùm nho, bắt màu Gram (+) Tụ cầuthường không có vỏ, không có lông, không sinh nha bào

Khả năng gây bệnh: Tụ cầu thường ký sinh ở mũi họng và da, vi khuẩn này thường

gây bệnh cho người bị suy giảm đề kháng Tụ cầu vàng là vi khuẩn gây bệnh thườnggặp nhất và có khả năng gây nhiều loại bệnh khác nhau như:

- Nhiễm khuẩn ngoài da như mụn nhọt, đầu đinh, các ổ apxe, eczema, hậu bối, Mức

độ nhiễm khuẩn phụ thuộc vào sự đề kháng của cơ thể và độc lực của vi khuẩn.Thường gặp ở trẻ em và người suy giảm miễn dịch

- Nhiễm khuẩn huyết: Tụ cầu vàng là vi khuẩn hay gây nhiễm khuẩn huyết nhất,thường xảy sau những nhiễm khuẩn tiên phát (các nhiễm khuẩn ngoài da) từ đó xâmnhập vào máu Đây là một nhiễm trùng nặng, từ máu, tụ cầu đến các cơ quan khác gâycác ổ apxe (ở gan, phổi, não, xương) có thể gây viêm tắc tĩnh mạch, tỷ lệ tử vong cao

- Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp: Do ăn uống phải độc tố ruột hoặc do tụ cầuvàng cư trú ở đường ruột, khi dùng kháng sinh kéo dài thì vi khuẩn bình thường bị tiêudiệt còn tụ cầu vàng (kháng kháng sinh) có điều kiện thuận lợi phát triển nhanh và tiếtđộc tố ruột gây bệnh Triệu chứng ngộ độc rất cấp tính Sau khi ăn phải thức ăn nhiễmđộc tố vài giờ, bệnh nhân nôn và tiêu chảy dữ dội, phân nhiều nước Có thể dẫn đếnsốc do mất nước và điện giải

- Viêm phổi: Viêm phổi do tụ cầu vàng ít gặp Thường xảy ra sau viêm đường hô hấp

do virus hoặc sau nhiễm khuẩn huyết Có thể tiên phát do tụ cầu vàng, gặp ở trẻ em,người già và những người suy yếu

- Nhiễm khuẩn bệnh viện thường hay gặp, nhất là nhiễm trùng vết mỗ, vết bỏng,… từ

đó dẫn đến nhiễm khuẩn huyết, các chủng tụ cầu ở bệnh viện đề kháng kháng sinh rấtmạnh Ngoài ra, tụ cầu còn gây hội chứng phồng rộp da, viêm da hoại tử, sốc nhiễmđộc do phụ nữ sử dụng bông gạc không sạch trong thời kỳ kinh nguyệt522,53

2.2.1.2 Bacillus subtilis

Hình thể và tính chất bắt màu: Đây là một loài vi khuẩn có hình que (trực khuẩn),

gram (+), ưa khí không bắt buộc, có chiều dài 1,5 - 10µm, đường kính (chiều ngang)0,25 - 1µm, hai đầu tròn, có thể có 8 - 12 lông nhỏ Bào tử hình bầu dục nhỏ, kích

thước từ 0,8 - 1,8 µm, được bao bọc bởi vỏ gồm nhiều lớp màng với các thành phầnlipoprotein, peptidoglycan,… có khả năng chịu được pH thấp, có khả năng chịu nhiệt(ở 100oC trong 180 phút).

Tính chất nuôi cấy: B subtilis thuộc nhóm loài sinh vật hiếu khí và kị khí tùy nghi.

môi trường thuận lợi nhất cho loài về nhiệt độ tối ưu là 37oC, về pH khoảng 7,0 - 7,4

B subtilis còn được gọi là trực khuẩn cỏ hoặc trực khuẩn rơm vì hay được tìm thấy

trong cỏ, rơm và cả đất; tuy nhiên chúng phát triển nhiều trong ống tiêu hóa của người

và nhiều loài gia súc B subtilis là vi khuẩn có lợi cho con người52,53

2.2.2 Vi khuẩn Gram âm

2.2.2.1 Shigella

Hình thể và tính chất bắt màu: Shigella là những trực khuẩn dài 1- 3µm, nuôi cấy vi khuẩn có dạng trực khuẩn điển hình Shigella không có lông, không có vỏ, không sinh

nha bào, bắt màu Gram (-)

Khả năng gây bệnh cho người: Trực khuẩn Shigella gây nên bệnh lỵ ở người Trực

khuẩn xâm nhập vào cơ thể bằng đường ăn uống, cư trú và sinh sản nhanh ở niêm mạcđại tràng Nội độc tố gây sung huyết, xuất tiết tạo thành những ổ loét và mảng hoại tửniêm mạc đại tràng; tác động lên thần kinh giao cảm gây co thắt và tăng nhu động ruột.Bệnh biểu hiện bằng hội chứng lỵ: đau quặn, mót rặn, phân có nhầy máu Ngoại ra,

độc tố của trực khuẩn Shigella có độc tính với thần kinh trung ương, có thể gây viêm

màng não và hôn mê Lỵ trực khuẩn thường gây bệnh ở thể cấp tính53

2.2.2.2 Escherichia coli

Hình thể và tính chất bắt màu: Trực khuẩn E coli kích thước dài, ngắn khác nhau,

trung bình dài 2 - 3µm, đường kính 0,5µm, Gram (-) Một số ít chủng có vỏ, hầu hết cólông và di động, không sinh nha bào

Tính chất nuôi cấy: E coli hiếu khí, kỵ khí tuỳ tiện, phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường Trong điều kiện nhiệt độ thích hợp là 37 °C, E coli

phát triển nhanh

Sức đề kháng: E coli nhạy cảm với các thuốc sát khuẩn thông thường Ở nhiệt độ

55 °C, vi khuẩn chết sau 1 giờ, 60 °C chết sau 30 phút

Khả năng gây bệnh: E coli là vi khuẩn bình thường ở ruột người, đặc biệt ở đại tràng, chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí (80%) E coli là vi khuẩn gây bệnh

quan trọng, đứng hàng đầu trong các vi khuẩn gây tiêu chảy, viêm đường tiết niệu,

viêm đường mật Đứng hàng thứ hai sau tụ cầu khuẩn trong nhiễm khuẩn huyết E coli còn gây nhiều bệnh khác như viêm phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thương, viêm phúc mạc đặc biệt sau thủng ruột E coli gây tiêu chảy cấp ở trẻ em nhất là trẻ

em dưới 2 tuổi, bệnh có tính chất dịch và gây tử vong cao ở trẻ em53

2.2.2.3.Pseudomonas aeruginosa

Hình thể và tính chất bắt màu: Trực khuẩn thẳng hoặc hơi cong, hai đầu tròn Có một

lông ở một đầu, di động, ít khi có vỏ, không sinh nha bào Nhuộm bắt màu Gram (-)

Tính chất nuôi cấy: Trực khuẩn mủ xanh mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy

thông thường, hiếu khí Nhiệt độ thích hợp 37 °C, pH thích hợp 7,2 - 7,5 Trên môitrường đặc có thể gặp 2 loại khuẩn lạc: 1 loại to, nhẵn, dẹt, trung tâm lồi lên, có xuhướng mọc lan; 1 loại xù xì, bờ không đều, đôi khi có loại khuẩn lạc nhày Trong môitrường lỏng vi khuẩn mọc váng ở trên, môi trường đục

Sức đề kháng: Trực khuẩn mủ xanh bị tiêu diệt ở nhiệt độ 100 °C và các thuốc sát

khuẩn thông thường

Kháng kháng sinh: Trực khuẩn mủ xanh đã kháng lại rất nhiều loại kháng sinh Hiện

nay, loại kháng sinh còn tác dụng là amikacin hay các cephalosporin thế hệ 3 Tốt nhấtcần điều trị theo kháng sinh đồ

vi khuẩn xâm nhập và gây viêm các cơ quan như viêm bàng quang, viêm tai giữa,viêm màng não, viêm màng bụng, Vi khuẩn có thể vào máu gây nhiễm khuẩn huyết,viêm nội tâm mạc Ngoài ra, ngày nay trực khuẩn mủ xanh được coi là tác nhân gâynhiễm khuẩn bệnh viện mắc phải ở những bệnh nhân nằm viện lâu ngày Nhiễm khuẩn

do trực khuẩn mủ xanh ngày càng trở nên trầm trọng do sự kháng kháng sinh rất mạnhcủa vi khuẩn52

2.2.3 Vi nấm Candida

Nấm là các sinh vật nhân chuẩn được tìm thấy dưới dạng nấm men, nấm mốc hoặcnấm lưỡng tính

Hình thể: Candida là một dạng nấm men, có hình dạng thay đổi từ đơn bào hình bầu

dục sang dạng sợi, có thể phát triển tốt ở 20 – 38oC, pH từ 2,5 - 7,5

Khả năng gây bệnh

Candida xuất hiện phổ biến trong khoang miệng, đường tiêu hóa, dương vật âm đạo

hoặc các bộ phận khác Chúng có khả năng gây bệnh khi được đặt trong môi trườngthuận lợi ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người, có thể gây nhiễm trùng nặng, đặc

biệt ở những bệnh nhân bị suy giảm miễm dịch Bệnh nấm Candida hiện là bệnh nấm

thường gặp nhất ảnh hưởng đến con người trên toàn cầu54

2.3 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN IN VITRO

Thực vật và các nguồn tự nhiên khác cung cấp một lượng lớn các hợp chất có tiềmnăng kháng khuẩn, kháng nấm Do vậy, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để đánhgiá hoặc sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật trong ống nghiệm của các chiết xuất hoặchợp chất tinh khiết phân lập từ dược liệu, từ đó tìm ra những kháng sinh mới chống lại

vi khuẩn đa kháng thuốc Hiện nay có nhiều phương pháp dùng để đánh giá hoạt tính

kháng khuẩn, kháng nấm in vitro như: Phương pháp khuếch tán, phương pháp pha

loãng, phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh tự ký (Thinlayer chromatography bioautography), xét nghiệm phát quang sinh học ATP (ATP bioluminescence assay),phương pháp đo huỳnh quang dòng chảy, thử nghiệm chết theo thời gian (time-killtest), Trong đó phương pháp khuếch tán và pha loãng là hai phương pháp cơ bản,được biết đến nhiều nhất và được sử dụng nhiều nhất trong các phòng thí nghiệm55,56

-2.3.1 Phương pháp khuếch tán

2.3.1.1 Phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Agar disk-diffusion method)

Phương pháp này được phát triển và chuẩn hóa bởi W M M Kirby và A W Bauervào cuối những năm 1950, đầu những năm 1960 nên còn được gọi là thử nghiệmkhuếch tán đĩa Kirby-Bauer Để xác định độ nhạy hay tính đề kháng của vi sinh vật đốivới một hợp chất, ta sử dụng khoanh giấy (đĩa giấy) đường kính 6 mm, có tẩm dungdịch chất thử đặt lên bề mặt thạch đã tráng một lớp huyền dịch vi khuẩn Chất thử sẽkhuếch tán vào trong thạch, tạo gradient nồng độ Nồng độ chất thử cao nhất tại rìa

khoanh giấy và giảm dần đến vị trí không còn tác dụng ức chế đối với vi sinh vật Mộtvòng trong suốt sẽ được hình thành xung quanh đĩa giấy sau thời gian ủ nếu chất thử

có khả năng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn Đánh giá khả năng kháng khuẩn quađường kính vô khuẩn xung quanh khoanh giấy55

2.3.1.2 Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (Agar well diffusion method)Phương pháp này thường được sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cácthuốc kháng sinh hay các chất chiết từ thực vật Dùng đĩa thạch đã được tráng sẵn mộtlớp huyền dịch vi khuẩn, để khô mặt thạch, đục các lỗ tròn đường kính 6 - 8 mm đếnđáy đĩa bằng đầu đục vô trùng Cho dung dịch thử (20 - 100 µl) vào các giếng và đem

ủ trong các điều kiện thích hợp tùy loại vi sinh vật thử nghiệm Chất thử sẽ khuếch tánvào lớp thạch xung quanh, tạo thành vùng ức chế quanh giếng Đánh giá khả năngkháng khuẩn qua đường kính vòng vô khuẩn xung quanh lỗ đục56

2.3.2 Phương pháp pha loãng

Các phương pháp pha loãng là những phương pháp thích hợp nhất để xác định giá trịMIC, thông qua khả năng ước tính nồng độ của chất kháng khuẩn được thử nghiệmtrong môi trường thạch hoặc môi trường canh thang (đa lượng hoặc vi lượng) Phươngpháp pha loãng canh thang hoặc thạch có thể được sử dụng để định lượng hoạt tínhkháng vi sinh vật trong ống nghiệm đối với vi khuẩn và nấm Giá trị MIC được ghinhận chính là nồng độ thấp nhất của chất thử nghiệm có tác dụng ức chế sự phát triển(có thể quan sát được) của vi sinh vật thử nghiệm và thường được biểu thị bằng µg/mlhoặc mg/l56

2.3.2.1 Phương pháp pha loãng trong môi trường lỏng (pha loãng canh thang Broth dilution method)

-Dùng 1 dãy ống nghiệm có thể tích tối thiểu 2 ml (pha loãng vĩ mô) hoặc đĩa 96 giếng(vi pha loãng) có chứa môi trường lỏng với chất dinh dưỡng thích hợp cho sự pháttriển của vi khuẩn Thêm chất thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau (phương pháp hệnồng độ) và dùng pipet vô khuẩn để đưa vi khuẩn thử nghiệm vào Đem ủ ở 37 oCtrong vòng 24 giờ Nếu có tác dụng kháng khuẩn, chất thử sẽ ức chế sự tăng trưởngcủa vi khuẩn trong môi trường lỏng (môi trường sẽ trong), ngược lại nếu có sự tăngtrưởng của vi khuẩn môi trường sẽ đục Giá trị MIC được đọc ở ống hay giếng có nồng

độ thấp nhất ức chế vi khuẩn phát triển56

2.3.2.2 Phương pháp pha loãng trong thạch (Agar dilution method)

Pha loãng chất thử theo phương pháp pha loãng nối tiếp 2 lần trong môi trường thạchnóng chảy rồi đổ vào hộp petri Trải huyền dịch vi khuẩn lên bề mặt thạch, các đĩapetri được để yên 30 phút, sau đó được ủ trong 24 giờ ở 37 oC Quan sát và ghi nhận

sự phát triển của vi sinh MIC được ghi nhận là nồng độ của chất thử cho thấy không

có sự phát triển (có thể nhìn thấy) hoặc chỉ có ≤ 20 khuẩn lạc phát triển57

Nếu tiến hành thử nghiệm nhiều chủng phân lập trên một hợp chất đơn lẻ hoặc nếuhợp chất (hoặc dịch chiết) được thử nghiệm có màu sắc làm che dấu khả năng pháthiện sự phát triển của vi sinh vật trong môi trường lỏng, thì phương pháp pha loãngthạch thường được ưu tiên hơn so với pha loãng canh thang để xác định MIC Phaloãng thạch thường được khuyến nghị như một phương pháp tiêu chuẩn hóa đối với

các sinh vật khó tính như vi khuẩn kỵ khí và các loài Helicobacter56 Tuy nhiênphương pháp này không được sử dụng phổ biến vì mất nhiều thời gian và công sức

2.4 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA BẰNG DPPH

Trong những năm gần đây, đã có rất nhiều sự chú ý đối với lĩnh vực hóa học gốc tự do

Sự cân bằng giữa các gốc tự do và chất chống oxy hóa là cần thiết cho các chức năngsinh lý Các gốc tự do tồn tại trong cơ thể quá nhiều có khả năng tấn công các đại phân

tử quan trọng như: lipid, protein và acid nucleic dẫn đến tổn thương tế bào và phá vỡcân bằng nội môi Các tế bào, mô mất chức năng và suy yếu làm giảm khả năng đềkháng với tác nhân gây bệnh từ bên ngoài như vi sinh vật Ngoài ra, sự hiện diện quánhiều gốc tự do góp phần gia tăng các bệnh viêm nhiễm và lão hóa Các chất chốngoxy hóa tổng hợp như hydroxytoluen butylat và hydroxyanisol butylat gần đây đãđược báo cáo là nguy hiểm cho sức khỏe con người58 Do đó, việc tìm kiếm các hợpchất tự nhiên không độc hại và có hoạt tính chống oxy hóa đã được tăng cường trongnhững năm gần đây

2.4.1 Cơ chế chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa có thể bất hoạt gốc tự do theo 2 cơ chế chính là cơ chế chuyểnnguyên tử hydro và cơ chế chuyển electron đơn độc59

 Cơ chế chuyển nguyên tử hydro (HAT - Hydrogen Atom Transfer)

Đánh giá tác dụng loại bỏ gốc tự do của các chất chống oxy hóa bằng cách chuyểnhydro (chuyển hydro bất kỳ), bao gồm các thử nghiệm: TEAC (Trolox equivalent

antioxidant capacity), ORAC (Oxygen radical absorbance capacity), β-caroten/acid

linoleic

Ẋ̇●+ AH XH + A●

 Cơ chế chuyển electron đơn độc (SET - Single Electron Transfer)

Phát hiện tác dụng chống oxy hóa bằng cách chuyển một electron để khử một hợp chấtbất kỳ như kim loại, carbonyl và các gốc tự do Các thử nghiệm theo cơ chế này làDPPH, FRAP

X●+ AH X-+ AH●+

AH● + A●+ H3O+

X-+ H3O+ XH + H2OM(III) + AH AH++ M(II)DPPH và TEAC đánh giá hoạt tính chống oxy hóa theo cả 2 cơ chế HAT và SAT.Ngoài ra, còn có các thử nghiệm theo cơ chế khác như thử nghiệm đánh giá khả năngkết hợp với ion sắt II (Iron chelating activity), thử nghiệm đánh giá khả năng đánh bắtgốc superoxyd O2*-(Superoxide scavenging) và khả năng đánh bắt peroxyhydro H2O2(Hydrogen peroxide scavening activity)

2.4.2 Phương pháp DPPH

Có nhiều phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa nhưng DPPH hiện là phươngpháp phổ biến và dễ thực hiện DPPH là một gốc tự do bền, màu tím Các chất chốngoxy hóa sẽ trung hòa gốc tự do DPPH bằng cách cho nguyên tử hydro làm mất đi màutím đặc trưng của dung dịch DPPH và chuyển sang màu vàng nhạt Sự giảm màu củaDPPH được xác định bằng cách đo độ hấp thu ở bước sóng cực đại tại 517 nm và kếtquả thể hiện qua giá trị IC50 Giá trị IC50càng thấp, khả năng chống oxy hóa của chấtthử nghiệm càng cao60

H 2 O

Hình 2.3 Công thức phân tử DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl).

Hình 2.4 Phản ứng trung hòa gốc DPPH.

Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) sẽ được xác định bằng công thức sau:

HTCO % = AbschứngAbs− Absthử

Abs: Độ hấp thu đo được ở bước sóng 517 nm

Thử nghiệm này được thực hiện đơn giản, nhanh chóng, rẻ tiền, không yêu cầu thiết bịchuyên dụng có thể dùng phương pháp tự động, bán tự động hay thủ công, thích hợpcho chất chống oxy hóa thân dầu và thân nước Tuy nhiên thử nghiệm này không pháthiện được những chất chống oxy hóa hoạt động theo cơ chế chuyển nguyên tử hydronhư các thiol là gulathion và các protein59