Đồ án tốt nghiệp khảo sát độ nhiễm khuẩn và khả năng kháng kháng sinh của pseudomonas aeruginosa phân lập trong nước uống được kiểm nghiệm tại viện pasteur thành phố hồ chí minh

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - THỰC PHẨM - MÔI TRƯỜNG ------ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ĐỘ NHIỄM KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA PHÂN LẬP TRONG NƯỚC UỐNG

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - THỰC PHẨM - MÔI TRƯỜNG

- -

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ĐỘ NHIỄM KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG

KHÁNG SINH CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA

PHÂN LẬP TRONG NƯỚC UỐNG ĐƯỢC KIỂM NGHIỆM TẠI VIỆN PASTEUR THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS BS CAO HỮU NGHĨA

Họ và tên sinh viên: KHANG BẢO KHÁNH

Tôi xin cam đoan đây là bài báo cáo nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả trong đồ án tốt nghiệp này có được để bàn luận là trung thực, không sao chép đồ

án, khóa luận tốt nghiệp khác dưới bất kỳ hình thức nào Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình

Sinh viên thực hiện

Khang Bảo Khánh

Ho Chi Minh City University of Technology

LỜI CẢM ƠN

Đồ án tốt nghiệp được hoàn thành với sự giúp đỡ tận tình, quý báu từ các Thầy

cô, Anh chị tại Viện Pasteur Thành Phố Hồ Chí Minh Tôi xin gửi lời cảm ơn chân

thành và lòng biết ơn sâu sắc đến:

TS BS Cao Hữu Nghĩa, Trưởng khoa Xét nghiệm Sinh Học lâm Sàng, Viện Pasteur Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận tâm hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt

thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp

Quý Thầy, Cô giảng viên Khoa Công Nghệ Sinh Học - Thực Phẩm - Môi Trường, Trường Đại Học Công Nghệ TP Hồ Chí Minh đã tận tình dạy dỗ, truyền

đạt kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập ở trường

ThS Nguyễn Thị Nguyệt và ThS Vũ Lê Ngọc Lan, khoa Xét nghiệm Sinh học

lâm sàng, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh đã nhiệt tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức

và giúp đỡ tôi hoàn thành đồ án này

Các Cô, các Anh Chị Phòng Vi sinh Nước – Thực phẩm và Phòng Vi sinh Bệnh Phẩm, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện

thuận lợi để tôi hoàn thành đồ án tốt nghiệp này

Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ba Mẹ đã luôn nuôi dạy, yêu thương,

động viên và chỗ dựa vững chắc cho tôi

Sinh viên thực hiện

Khang Bảo Khánh

Ho Chi Minh City University of Technology

i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

DANH MỤC SƠ ĐỒ, QUY TRÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

2.1 Mục tiêu tổng quát 2

2.2 Mục tiêu cụ thể 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tình hình nhiễm khuẩn nước uống 3

1.1.1 Trong nước 3

1.1.2 Thế giới 4

1.2. Tình hình kháng kháng sinh của P aeruginosa 6

1.2.1 Trong nước 6

1.2.2 Trong nước 7

1.3. Khái quát về Pseudomonas aeruginosa 9

1.3.1 Hình thái và cấu trúc 9

1.3.2 Đặc điểm 9

1.3.3 Khả năng đề kháng 10

1.3.4 Kháng nguyên 11

1.3.5 Các yếu tố độc lực 11

1.3.6 Khả năng gây bệnh 13

1.3.7 Phòng bệnh 14

1.3.8 Điều trị 14

Ho Chi Minh City University of Technology

ii

1.4.2 Cơ chế tác động của kháng sinh 16

1.4.3 Cơ chế kháng kháng sinh ở vi khuẩn 17

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 21

2.2 Đối tượng nghiên cứu 21

2.3 Cỡ mẫu 21

2.4 Thiết bị, hóa chất, môi trường 21

2.4.1 Thiết bị và dụng cụ 22

2.4.2 Hóa chất, môi trường thí nghiệm 23

2.5 Phương pháp thực hiện 21

2.5.1 Nguồn mẫu 25

2.5.2 Đánh giá kết quả 25

2.5.3 Xử lý số liệu 26

2.5.4 Phương pháp định lượng P aeruginosa trong nước uống 26

2.5.5 Phương pháp thực hiện kháng sinh đồ 28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1. Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa trong nước uống 36

3.1.1 Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa trong nước uống 36

3.1.2 Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa trong từng loại nước uống 36

3.1.2.1 Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa trong 2 nhóm nước uống 36

3.1.2.2 Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa trong các loại nước uống 36

3.2. Tỷ lệ kháng kháng sinh của P aeruginosa trong nước uống 36

3.2.1 Tỷ lệ kháng kháng sinh của P aeruginosa trong nước uống 36

3.2.2 Tỷ lệ kháng kháng sinh của P aeruginosa trong các loại nước uống

38

3.2.3 Tỷ lệ đa kháng kháng sinh của P aeruginosa trong các loại nước uống 42

Ho Chi Minh City University of Technology

iii

3.4.2 Tình hình kháng kháng sinh của P aeruginosa trong nước uống 45

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI 49

4.1 Kết luận 49

4.1 Kiến nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC 55Ho Chi Minh City University of Technology

iv

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

E.coli Escherichia coli

P aeruginosa Pseudomonas aeruginosa

Ho Chi Minh City University of Technology

v

Bảng 2.1: Số mẫu nước uống được phân tích 22

Bảng 2.2: Chỉ tiêu kiểm tra vi sinh vật trong nước uống áp dụng theo QCVN

6-1:2010/BYT 25

Bảng 2.3: Các kháng sinh thử nghiệm trong kháng sinh đồ 29

Bảng 3.1: Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa trong nước uống 33

Bảng 3.2: Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa trong 2 nhóm nước uống đóng chai và nhóm nước uống xử lý 34

Bảng 3.3: Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa trong các loại nước uống 35

Bảng 3.4: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P aeruginosa trong nước uống 36

Bảng 3.5: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P aeruginosa trong nước uống

đóng chai 38

Bảng 3.6: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P aeruginosa trong nước uống

công ty 39

Bảng 3.7: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P aeruginosa trong nước uống

trường học 40

Bảng 3.8: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P aeruginosa trong nước uống

gia đình 41

Bảng 3.9: Tỷ lệ đa kháng kháng sinh của các chủng P aeruginosa trong các loại nước uống 42

Bảng 3.10: So sánh tỷ lệ nhiễm P aeruginosa trong nước uống 43

Bảng 3.11: So sánh tỷ lệ nhiễm P aeruginosa giữa 2 nhóm nước uống 43

Bảng 3.12: Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa trong các loại nước uống 44

Bảng 3.13: So sánh tỷ lệ kháng kháng sinh của P aeruginosa trong nước uống 46

Ho Chi Minh City University of Technology

vi

Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa trong nước uống 33 Biểu đồ 3.2: Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa trong 2 nhóm nước uống 34 Biểu đồ 3.3: Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa trong các loại nước uống 35 Biểu đồ 3.4: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P aeruginosa trong nước uống 37 Biểu đồ 3.5: Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P aeruginosa trong nước uống

Ho Chi Minh City University of Technology

vii

Hình 1.1: Pseudomonas aeruginosa 9

Hình 2.1: Thiết bị lọc vi sinh vật với 3 vị trí đặt phễu lọc 23

Hình 2.2: Tủ ấm 23

Hình 2.3: Đèn UV 24

Hình 2.4: Tủ an toàn sinh học cấp 2 24 Hình 2.5: Đĩa môi trường Mueller Hinton và các đĩa kháng sinh 30 Ho Chi Minh City University of Technology

viii

Sơ đồ 2.1: Phát hiện và đếm vi khuẩn P aeruginosa 27

Sơ đồ 2.2: Quy trình thực hiện kháng sinh đồ 31

Ho Chi Minh City University of Technology

1

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Nước là nguồn tài nguyên vô cùng quan trọng đối với con người và các loài sinh vật trên Trái Đất Trong điều kiện bình thường, mỗi ngày một người lớn trung

bình cần khoảng 2 – 2,5 lít nước và nhu cầu này thay đổi tùy theo nhiệt độ môi trường,

mức độ hoạt động thể lực, tình trạng bệnh lý của cơ thể… Loại nước cơ thể thường

dùng nhất là nước lọc, nước nấu chín Tuy nhiên tại Việt Nam, trong những năm gần

đây, do ảnh hưởng của quá trình biến đổi khí hậu và quá trình công nghiệp hóa, dẫn

đến nguồn nước sạch ở nhiều khu dân cư, đô thị, khu công nghiệp, làng nghề… bị cạn

kiệt và ô nhiễm, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh hoạt và sức khỏe của người dân

Chính vì vậy vấn đề nước uống an toàn ngày càng được chú trọng Nước uống có thể

là nguồn lây nhiễm các loại vi khuẩn gây bệnh ảnh hưởng đến sức khỏe của cộng đồng

[25] Pseudomonas aeruginosa là một trong những vi sinh vật hiện diện trong nước và

là tác nhân gây nhiễm trùng cơ hội và gây nhiễm khuẩn bệnh viện [26] Thêm vào đó,

trong những điều kiện khắc nghiệt như nhiệt độ cao, thiếu dinh dưỡng, chúng vẫn có

thể sinh sôi và phát triển tốt [25]

Tổng kết xét nghiệm 764 mẫu nước uống tại Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh trong 2 tháng năm 2012 Trong đó, có 74 mẫu nước uống đóng chai và 690 mẫu nước

xử lý dùng để uống Mẫu nước uống đóng chai có 13/74 mẫu không đạt tiêu chuẩn

chất lượng, đặc biệt là các mẫu này đều nhiễm P aeruginosa và 162/690 mẫu nước xử

lý dùng để uống cũng nhiễm vi khuẩn này với tỷ lệ là 23,5% [27]

Việc tìm ra kháng sinh đã làm thay đổi mang tính cách mạng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh tràn lan trong những thập kỷ

vừa qua đã dẫn đến sự xuất hiện rất nhiều chủng vi khuẩn kháng lại kháng sinh và tạo

nên mối đe dọa cho nền y học hiện đại Hiện nay, vi khuẩn P aeruginosa chiếm một

tỷ lệ không nhỏ trên các bệnh nhiễm trùng đường tiểu, máu, phổi, vết thương,… và tỷ

lệ tử vong khá cao, có thể lên đến 50% so với các loại vi khuẩn khác [18] Gần đây,

nhiều khảo sát cho thấy tính kháng kháng sinh của vi khuẩn này ngày một gia tăng

P aeruginosa đã đề kháng cao với các kháng sinh thường dùng ở Việt Nam [6] Ở

nước ta, sự kháng kháng sinh của vi khuẩn trong bệnh phẩm được nghiên cứu khá

Ho Chi Minh City University of Technology

2

nhiều nhưng trong nước uống thì vấn đề này vẫn còn hạn chế Do vậy, việc đánh giá

tình hình nhiễm và khả năng kháng thuốc của P aeruginosa là điều cần thiết, nhằm

cung cấp thêm thông tin về vi khuẩn gây bệnh trong nước góp phần định hướng việc

sử dụng kháng sinh và hạn chế sự lây lan của vi khuẩn gây bệnh qua nguồn nước uống

ảnh hưởng đến sức khỏe của con người Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu:

“Khảo sát độ nhiễm khuẩn và khả năng kháng kháng sinh của Pseudomonas

aeruginosa phân lập trong nước uống được kiểm nghiệm tại Viện Pasteur

Thành Phố Hồ Chí Minh”

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Mục tiêu tổng quát

Khảo sát tình hình nhiễm khuẩn và khả năng kháng kháng sinh của

P aeruginosa trong các mẫu nước uống

2.2 Mục tiêu cụ thể

- Xác định tỷ lệ nhiễm P aeruginosa trong các mẫu nước uống

- Khảo sát khả năng kháng kháng sinh của các chủng P aeruginosa phân lập

được

Ho Chi Minh City University of Technology

360 cơ sở không đạt tiêu chuẩn về sản xuất nước uống, 244 mẫu xét nghiệm có hơn

40% nhiễm vi khuẩn và trong đó có 88 mẫu nhiễm P aeruginosa, 43 mẫu nhiễm

Coliforms, 2 mẫu nhiễm E coli Phần lớn các cơ sở sản xuất trong điều kiện tạm bợ,

mất vệ sinh, thiết bị xuống cấp, việc bảo quản thành phẩm không hợp vệ sinh [32]

Theo Lê Trương Hằng Hà (2010) [7], trong 200 mẫu nước uống thì tỷ lệ nhiễm

P aeruginosa trong nước uống đóng chai (23,8%), nước uống công ty (16%), nước

uống gia đình (40%), nước uống bệnh viện (20%) và nước uống trường học (6,9%)

Vương Xuân Vân và cộng sự (2012) [12], trong 400 mẫu nước uống được kiểm

nghiệm thì tỷ lệ nhiễm P aeruginosa trong nhóm nước uống đóng chai (28,9%), nước

uống trường học (25%), nước uống gia đình (34,7%) và nhóm nước uống công ty (31,9%)

Năm 2014, Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm Quảng Ngãi cho biết: sau khi lấy 30 mẫu nước uống đóng chai ngẫu nhiên ở nhiều địa phương trên địa bàn tỉnh kiểm nghiệm, kết quả cho thấy có đến 60% trong tổng số mẫu này có chứa trực khuẩn mủ xanh Vào năm 2015, sở Khoa học - Công nghệ tỉnh Nghệ An cho biết đã gửi 37 mẫu nước đóng chai đi xét nghiệm tại Viện Vệ sinh An toàn thực phẩm (Bộ Y tế) Qua xét nghiệm, 21/37 mẫu nước đóng chai không đạt chất lượng Đáng nói hơn, có nhiều mẫu

nước chứa trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) Đây là loại vi khuẩn gây

biến chứng nguy hiểm cho người, kháng thuốc đối với nhiều kháng sinh, có thể gây viêm màng tim, viêm đường hô hấp, viêm phổi [29]

Năm 2015, tại Quảng Trị, nước uống đóng chai bị nhiễm P aeruginosa có tỷ lệ

khá cao so với một số địa phương khác trong cả nước Kết quả hậu kiểm cho thấy,

trong năm 2011 có 13/56 mẫu nước uống đóng chai bị nhiễm P aeruginosa, chiếm tỷ

lệ 23,21%; năm 2012, có đến 26,32% mẫu nước nhiễm P aeruginosa (15/57), năm

2013 tỷ lệ này chỉ có 13,33% (8/60) và năm 2014 tỷ lệ nước uống đóng chai bị nhiễm

Ho Chi Minh City University of Technology

4

P aeruginosa vẫn còn rất cao 22,22% (14/63) Trong đó thành phố Hồ Chí Minh là

17,6%, tiếp đó là Hà Nam 5,3% và Bình Định 2% mẫu bị nhiễm P aeruginosa [28]

của nước máy thấp hơn rất nhiều so với nước lấy từ máy làm lạnh nước uống Điều này có thể do các bình làm lạnh nước uống không được vệ sinh sạch sẽ là nơi ẩn trú các vi sinh vật gây bệnh [14]

Rusin PA (1997), giám sát bệnh lây lan qua đường uống và sự bùng phát bệnh liên quan đến nước uống và nước không dùng để uống thì vi sinh vật gây bệnh trong

nước uống chủ yếu gồm 3 loại vi khuẩn Gram âm đó là P aeruginosa, Acinetobacte,

Xanthomonas maltophilia với tỷ lệ như sau: P aeruginosa, < 1%-24%; Acinetobacter,

5%-38%; X maltophilia, < 1%-2%; Aeromonas, 1%-27 Theo đó, nước uống cũng là

nguồn lây nhiễm các loại vi khuẩn gây bệnh cơ hội ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ cộng đồng [25]

Bharath J (2003), khảo sát chất lượng nước uống đóng chai nội và ngoại nhập ở

Trinidad nhận thấy sự hiện diện của Coliforms tổng số trong các sản phẩm nội địa là

6,9% so với sản phẩm nhập khẩu là 0% Tương tự như vậy, tổng vi khuẩn hiếu khí trong nước uống đóng chai nội địa cao hơn nhiều so với hàng nhập khẩu (33,6% so với

14,8%) Đối với Pseudomonas sp tỷ lệ nhiễm là 7,6% nhưng tất cả đều âm tính với

Coliform fecal và Salmonella spp Như vậy trên cơ sở không có sự hiện diện của Coliform fecal và Salmonella trong nước uống thì 5% nước uống đóng chai (nội và

ngoại nhập) bán trên thị trường không đảm bảo sức khỏe cho người tiêu dùng [16]

Baumgartner A (2006), đánh giá tình trạng vệ sinh của các loại nước uống: đối với nước uống đóng chai bao gồm nước tinh khiết và nước khoáng từ các máy làm lạnh thì tổng số vi sinh vật hiếu khí ở nước nguồn cao hơn từ các máy làm lạnh Tuy

vậy, P aeruginosa được tìm thấy trong nước nguồn với tỷ lệ 25% và tần số xuất hiện

Ho Chi Minh City University of Technology

5

tương tự như trong các máy làm lạnh, tỷ lệ là 24,1% Kiểm tra tính nhạy cảm kháng

sinh các chủng P aeruginosa tìm thấy trên cả nước nguồn và nước từ máy làm lạnh là

như nhau, chứng tỏ một chủng đơn bắt nguồn từ nước uống đóng chai hơn là xung quanh máy làm lạnh Cho thấy sự nhiễm này bắt nguồn từ nhà sản xuất [15]

Mohammadi Kouchesfahani M và cộng sự (2015), trong 120 mẫu nước uống

thì tỷ lệ nhiễm P aeruginosa là 36,7% (44 mẫu) và heterotrophic bacteria là 32,5%

(39 mẫu) [23]

Ho Chi Minh City University of Technology

thấy 553/7571 (7,8%) bệnh nhân bị nhiễm trùng mắc phải tại bệnh viện trong đó

Pseudomonas aeruginosa (31,5%) Theo kết quả nghiên cứu từ 4 bệnh viện tại

Hà Nội: Việt Đức, Xanh Pôn, Bệnh viện 108 và Bệnh viện 103 từ năm 2005 – 2008

cho thấy P aeruginosa phân lập từ các bệnh phẩm đề kháng rất cao với các loại kháng

sinh như Tetracycline (92,1%), Ceftriaxone (58,5%) và Gentamicin (54%) [30]

Qua luận văn của Nguyễn Hoàng Thu Trang (2007), tỷ lệ kháng kháng sinh của

P aeruginosa trong nước uống đóng chai cho thấy: đa số nhạy cảm với các kháng sinh

thử nghiệm, có một số kháng sinh bị đề kháng với tỷ lệ thấp như Cefulodin,

Tobramycin, Amikacin, Aztreonam nhưng riêng Fosfomycin với tỷ lệ đề kháng lên

đến 50% [8]

Vi khuẩn phân lập từ nước uống công ty đề kháng với Fosfomycin lên đến 44%

còn nước uống gia đình, ngoại trừ Fosfomycin bị đề kháng tới 33% còn các kháng sinh

còn lại khác đều nhạy cảm Nước uống trường học chỉ có 1 mẫu tìm thấy vi khuẩn

P aeruginosa và kết quả kháng sinh đồ cho thấy chủng này nhạy cảm với tất cả các

kháng sinh dùng làm thử nghiệm Nước bệnh viện không tìm thấy P aeruginosa trong

các mẫu khảo sát [8]

Theo Báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện ở Việt

Nam năm 2008 – 2009, tỷ lệ P aeruginosa kháng cao nhất với Ceftazidime (80%),

Ciprofloxacin (60%) và Imipenem (43%) [1]

Theo Vương Xuân Vân và cộng sự (2012), phân tích 400 mẫu nước các loại thì

30,25% mẫu nhiễm P aeruginosa Hầu hết các chủng P aeruginosa đều nhạy cảm với

các loại kháng sinh thử nghiệm Ngoại trừ Fosfomycin và Aztreonam bị kháng khá

nhiều với tỷ lệ lần lượt là 12,5% - 21,4% và 20%, Sulfamides cũng bị kháng nhưng với

tỷ lệ không đáng kể 4,2% [12]

Còn theo kết quả nghiên cứu của Hoàng Doãn Cảnh và cộng sự (2014) [4],

các chủng P aeruginosa được phân lập từ 28 mẫu bệnh phẩm đã kháng tất cả với các

Ho Chi Minh City University of Technology

7

loại kháng sinh Mức độ kháng với các kháng sinh: Amikacin 42,9%, Aztreonam 36%, Colistin 10,7%, Cefepime 45,8%, Cefsulodin 62,5%, Cefoperazone 54,2%, Ciprofloxacin 48,2%, Gentamicin 55,6%, Imipenem 46,2%, Piperacillin 60,7%, Sulfamides 64%, Tobramycin và Ticarcillin/a clavulanic đều là 54,2%

1.2.2 Thế giới

A Lateef (2005) [22], khảo sát tính kháng thuốc của vi khuẩn trên các mẫu

bệnh phẩm, thực phẩm, nước uống cho thấy: P aeruginosa được tìm thấy trong các

mẫu bệnh phẩm, dược phẩm, đất bị nhiễm dầu, nước (nước sông, nước giếng và nước

máy) Kết quả: 3,46% P aeruginosa phân lập từ đất đề kháng với 5 loại kháng sinh

Trong bệnh phẩm, 7,69% đề kháng 6 loại kháng sinh, 30,77% đề kháng 7 loại kháng sinh, 23,1% đề kháng với 8 loại kháng sinh (Ampicillin, Chloramphenicol, Cloxacillin, Erythromycin, Penicillin, Tetracycline, Streptomycin, Gentamicin)

Trong dược phẩm, loại vi khuẩn này cũng có hiện tượng đề kháng đa kháng sinh từ 2, 4 đến 8 loại kháng sinh khác nhau (Augmentin, Amoxycillin, Tetracycline, Cotrimoxazole, Nalidixic acid, Ofloxacin, Nitrofurantoin) Trong nước uống, 6,7%

P aeruginosa kháng lại 4 loại kháng sinh, 8,5% kháng với 5 loại kháng sinh

(Augmentin, Amoxycillin, Tetracycline, Cloxacillin, Cotrimoxazole) [22]

Jonathan K Lutz, Jiyoung Lee (2011) [20], 23 chủng P aeruginosa phân lập

được từ 108 mẫu nước hồ bơi, thì có tỷ lệ kháng với Aztreonam (22%), Imipenem (26%), Trimethoprim/sulfamethoxazole (13%) và Ceftriaxone (4%)

Theo Ghazi M Al Maliki (2012) [19], các chủng P aeruginosa phân lập được

từ 40 mẫu nước uống thì có tỷ lệ kháng khá cao với Nalidixic acid (87,98 %) sau đó

là Tetracycline (77,9%), Ampicillin (68,82 %), Novobiocin (66,63%), Ceftazidime (63,56%), Erythromycin (61,91%) và Streptomycin (57,41%)

Ayodele T Adesoji và cộng sự (2015) [13], P aeruginosa phân lập từ trong

nước có tỷ lệ kháng khá cao với các kháng sinh như Florfenicol (63,6%), Tetracycline (59,1%), Streptomycin (54,6%), Ceftiofur (59,1%), Amoxicillin/clavulanic acid (81,8%) và Sulfamethoxazole (77,3%) tiếp theo là Chloramphenicol (40,9%), Gentamicin (31,8%), Kanamycin (31,8%), cuối cùng là Nalidixic acid (22,7 %)

Ho Chi Minh City University of Technology

8

Còn theo Clemens Kittinger và cộng sự (2016) [17], kiểm tra các mẫu nước

sông cho thấy các chủng Pseudomonas spp phân lập được có tỷ lệ kháng kháng sinh

lần lượt là Meropenem (30,4%), Piperacilin/tazobactam (10,6%), Ceftazidime (4,2%), Imipenem (2,1%), Cefepime (0,8%), Levofloxacin (1,2%), Ciprofloxacin (3,4%)

Ngoài ra, có 9,4% chủng Pseudomonas spp kháng 2 loại kháng sinh, 2,3% chủng

kháng 3 loại kháng sinh, 0,6% và 0,2% chủng kháng lần lượt 4 và 5 loại kháng sinh

Ho Chi Minh City University of Technology

Pseudomonas aeruginosa (hay còn được gọi là trực khuẩn mủ xanh), là trực

khuẩn Gram âm, hiếu khí, hình dạng thẳng hoặc hơi cong nhưng không xoắn, 2 đầu tròn, kích thước 0,5-1 µm x 1,5-5 µm Có một lông duy nhất ở 1 cực, là nơi tiếp nhận nhiều loại thực khuẩn thể (phage) ngoài ra còn giúp vi khuẩn gắn vào bề mặt của tế

bào vật chủ Vi khuẩn P aeruginosa là loài không sinh bào tử [9]

1.3.2 Đặc điểm

❖ Tính chất nuôi cấy

Vi khuẩn mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, điều kiện hiếu khí tuyệt đối Nhiệt độ phát triển tối ưu là 37oC, phát triển được trong khoảng nhiệt độ 5oC - 42oC, pH thích hợp là 7,2 - 7,5 (có thể chịu được pH từ 4,5 - 9) [5]

Trên môi trường đặc thường có 2 loại khuẩn lạc: một loại to, dẹt, nhẵn, trung tâm hơi lồi; một loại nhỏ, xù xì, lồi Trong môi trường lỏng vi khuẩn mọc thành váng

có màu xanh ở trên mặt môi trường, môi trường đục [5]

❖ Phân bố

P aeruginosa phân bố rộng rãi trong tự nhiên như đất, nước, trên bề mặt động

thực vật, đặc biệt là những nơi môi trường ẩm ướt chúng sinh sôi và phát triển rất mạnh Trong tự nhiên người ta tìm thấy chúng trên bề mặt nhiều loại rau quả, trên cơ

thể và phân một số động vật Trong cơ thể người, P aeruginosa hiện diện thường

xuyên trong đường tiêu hóa và một số nơi ẩm ướt trong cơ thể như da, niêm mạc, vùng dưới cánh tay,… [5] Ngoài ra, chúng còn có khả năng sinh trưởng trong các môi

Ho Chi Minh City University of Technology

10

trường hạn chế sự có mặt của các vi sinh vật khác như chất khử trùng, thuốc mỡ, xà

phòng, nước cất, … Kể cả trong bệnh viện (người ta còn phát hiện vi khuẩn

P aeruginosa trong các thiết bị, dụng cụ y tế như chụp thở oxy, ống thông tiểu…) [9]

❖ Sắc tố

Tính chất đặc trưng của loại vi khuẩn này là sinh sắc tố và chất thơm Có 2 loại sắc tố chính: pyocyanin có màu xanh lam tan trong nước và chloroform, làm cho môi

trường nuôi cấy và khuẩn lạc có màu xanh; pyoverdin là sắc tố phát huỳnh quang tan

trong nước nhưng không tan trong chloroform [5] Chất thơm do vi khuẩn sinh ra là

Kimetylamin [18]

Có khoảng 10% P aeruginosa không sinh sắc tố Trong những trường hợp này

chẩn đoán vi khuẩn học gặp nhiều khó khăn Người ta phải dùng các môi trường tăng

sinh sắc tố: môi trường King A (tăng sinh pyocyanin) và môi trường King B (tăng sinh

pyoverdins) Ngoài ra, còn có các loại sắc tố được tổng hợp bởi P aeruginosa như

pyorubin (màu đỏ đậm), pyomelanin (màu nâu đen) [11]

❖ Đặc điểm sinh hóa

P aeruginosa có đủ các cytochrom (b, c, a và oxidase) trong hệ thống vận

chuyển điện tử Trong thực hành người ta thường dùng “oxidase test” để tìm sự có mặt

của cytochrom oxidase

Các tính chất sinh hóa thường sử dụng trong lâm sàng gồm: Urease (-), Indol (-), H2S (-); Citrat Simmon, Agrinin dihydrolase và Gelatinase (+); khử NO3-

thành N2 Trên môi trường OF (Oxidation-Fermentation) nhiều loại carbohydrate bị

thoái hóa theo lối oxy hóa có sinh acid: glucose, mannitol, glycerol, ethalnol,

arabinose, fructose và galactose [11]

1.3.3 Khả năng đề kháng

Chết nhanh chóng ở 100oC; trong môi trường ẩm, thoáng và không có ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp, chúng sống được hàng tuần; trong môi trường có dinh dưỡng

tối thiểu; ở nhiệt độ 5oC, chúng sống được hơn 6 tháng [11]

Ho Chi Minh City University of Technology

11

1.3.4 Kháng nguyên

Kháng nguyên liên kết với tế bào:

- Kháng nguyên O: là kháng nguyên chịu nhiệt, bản chất hóa học là lipopolysaccharid (LPS), dựa vào kháng nguyên này người ta chia

P aeruginosa thành 12 nhóm Kháng nguyên O được nghiên cứu nhiều và

được sử dụng để kích thích miễn dịch bảo vệ chống lại P aeruginosa

- Kháng nguyên H: là kháng nguyên không chịu nhiệt, là các protein nằm trong lông của vi khuẩn Vì khó khăn trong việc điều chế, nên việc định type huyết thanh dựa trên kháng nguyên này chưa được áp dụng rộng rãi

- Protein màng ngoài: các protein ở màng ngoài tế bào có thể kết hợp với LPS tạo thành những thụ thể đặc hiệu của trực khuẩn mủ xanh

- Polysaccharide ngoại tiết: có 2 loại polysaccharide được tạo ra bởi những

chủng P aeruginosa có khuẩn lạc dạng M và dạng R

Các kháng nguyên ngoại bào: vi khuẩn tiết ra rất nhiều chất chuyển hoá trong môi trường (protease, elastase, exotoxin A, glycocalx, hemolysine, ) là những yếu tố

độc lực của vi khuẩn đồng thời còn là những kháng nguyên được nghiên cứu để sử

dụng chế tạo vaccine gây miễn dịch [5]

1.3.5 Các yếu tố độc lực

P aeruginosa là loài vi khuẩn gây bệnh cơ hội Độc tố của P aeruginosa chỉ có

tác động gây chết khi chúng được tạo ra với số lượng lớn Tuy nhiên, loài vi khuẩn này

có nhiều yếu tố độc lực tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập, lan truyền và

gây bệnh [31]:

- Nội độc tố (endotoxin): là thành phần của vách tế bào vi khuẩn Nội độc tố bao

gồm chủ yếu là LPS và một lượng nhỏ protein Hoạt tính sinh học của nội độc

tố chủ yếu do phức hợp LPS đảm nhiệm LPS có vai trò quan trọng trong bệnh sinh nhiễm khuẩn huyết và sốc nhiễm khuẩn huyết

- Ngoại độc tố (exotoxin A): bản chất là protein có trọng lượng phân tử 66,6 kDa Exotoxin A hoạt động tượng tự như cơ chế hoạt động của độc tố vi khuẩn bạch hầu Với khả năng khuếch tán và ức chế sự tổng hợp protein của tế

bào, exotoxin A là một độc tố mạnh nhất của P aeruginosa Exotoxin A gây rối

Ho Chi Minh City University of Technology

12

loạn chức năng huyết động trung tâm, thay đổi chức năng đông máu, rối loạn chuyển hoá lipit, gây tổn thương nhiều cơ quan, nhưng biểu hiện rõ rệt nhất là

tổn thương gan 90% số chủng P aeruginosa sản xuất exotoxin A nhưng đặc

tính của độc tố này rất khác nhau tuỳ từng chủng

- Các enzyme ngoại tiết: vi khuẩn có khả năng sinh nhiều enzyme ngoại tiết, các enzyme này đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập, gây bệnh tại chỗ:

+ Protease: gần 90% các chủng P aeruginosa có khả năng phân giải protein

P aeruginosa tiết ra 2 loại protease quan trọng là alcaline và elastase Nhiều

chủng tiết ra collagenase Các protease này thường có tác dụng hiệp đồng Elastase có thể phá hủy lớp chun keo thành mạch máu gây tổn thương xuất huyết, tạo nên những ổ hoại tử trong thành mạch máu Enzyme này còn gây ức chế hiện tượng opsonin hoá, làm giảm khả năng thực bào của bạch cầu đa nhân trung tính Ngoài tác động trực tiếp, các protease còn có khả năng làm thay đổi sức đề kháng của vật chủ thông qua việc bất hoạt bổ thể, phá hủy cấu trúc của các globulin miễn dịch

+ Hemolysine có 2 loại:

• Glycolipid (hemolysine chịu nhiệt): không có tính enzyme, không có tính kháng nguyên và ít độc Glycolipid đóng vai trò như một chất tẩy hoà tan các lipid là những chất cần cho hoạt động của phospholipase C

• Phospholipase C (hemolysine không chịu nhiệt): là một enzyme tan máu nằm trong một polypeptid đơn Phospholipase C thường tác động hiệp đồng với glycolipid và protease alcaline gây xuất huyết, hoại tử tại chỗ tổn thương

+ Cytotoxine (leukocidin): là một protein rất độc với bạch cầu đa nhân trung tính và các tế bào lympho

+ Exoenzyme S: là một protein, có thể có 2 dạng: dạng không hoạt động và không có tính enzyme và dạng hoạt động, có tính enzyme

+ Enterotoxin và yếu tố thấm qua thành mạch: các độc tố này còn ít được biết đến Một số nghiên cứu đã chứng minh, trong thực nghiệm enterotoxin gây nên tình trạng ứ dịch trong đường ruột; độc tố này có thể là một trong những nguyên nhân gây

Ho Chi Minh City University of Technology

13

viêm ruột non Khi gây nhiễm qua da, yếu tố này có thể thấm vào trong lòng mạch,

gây ban đỏ kèm theo xuất huyết ra ngoài lòng mạch

- Glycocalyx - capsule: ngoài chức năng bảo vệ vi khuẩn chống các yếu tố có hại

cho chúng từ vật chủ như thực bào, kháng thể, bổ thể, kháng sinh, giúp cho quá trình nhân lên của vi khuẩn trong các mô còn thực hiện chức năng bám vào tế bào

- Lông: vai trò của lông trong sinh bệnh học nhiễm P aeruginosa còn chưa rõ

ràng

- Pili: giúp cho vi khuẩn bám vào tế bào biểu mô của vật chủ

1.3.6 Khả năng gây bệnh

P aeruginosa là loại vi khuẩn gây bệnh có điều kiện như khi cơ thể bị suy giảm

miễn dịch, bị bệnh ác tính hoặc mạn tính, khi dùng corticoid lâu dài, việc sử dụng

kháng sinh tùy tiện, việc sử dụng các dụng cụ thăm khám hoặc các vết bỏng, vết

thương hở, … Chúng có thể gây ra nhiêu bệnh khác nhau: gây viêm màng trong tim,

viêm đường hô hấp, viêm phổi, nhiễm trùng đường máu, đường tiết niệu, viêm màng

não mủ và áp xe não, viêm tủy xương, viêm tai, gây bệnh hóa sừng ở mắt, nhiễm trùng

da, mô mềm, … [5]

P aeruginosa xâm nhiễm vào trong mắt thường gây ra những tổn thương giác

mạc, sự nhiễm này thường liên quan đến việc sử dụng kính sát tròng Ở Việt Nam,

theo kết quả nghiên cứu tại Viện Mắt trong vòng khoảng 20 nǎm trở lại đây,

P aeruginosa đã vượt lên với trên 70% các trường hợp xét nghiệm vi khuẩn dương

tính trong viêm loét giác mạc do vi khuẩn [5]

Hiện nay, vi khuẩn này là nguyên nhân hàng đầu gây viêm loét giác mạc sau chấn thương nông nghiệp Các bệnh nhân nằm viện bị mắc các chứng bệnh về tim

mạch, tiểu đường hay bị các u ác tính bị sốc do nhiễm trùng máu thường có tỷ lệ tử

vong khá cao Tác nhân thường gặp là P aeruginosa chiếm từ 5% đến 50% so với các

tác nhân vi khuẩn khác [5]

P aeruginosa dẫn đầu trong các tác nhân nhiễm trùng hô hấp bệnh viện, đặc

biệt đối với những bệnh nhân có hỗ trợ các máy thông khí, khả năng bị viêm phổi cao

Ho Chi Minh City University of Technology

14

gấp 20 lần và tỷ lệ tử vong cao Một số nghiên cứu còn cho thấy P aeruginosa giữ vai

trò gây bệnh trong giai đoạn đầu và cuối của bệnh đái tháo đường [6]

Loài này còn là vi khuẩn kháng thuốc phổ biến đối với nhiều loại kháng sinh Tính kháng thuốc thường được quy định bởi các plasmid và các yếu tố di truyền này

có thể được lan truyền trong quần thể thông qua hiện tượng biến nạp và tải nạp tạo ra

những dạng đột biến kháng thuốc mới P aeruginosa hiện kháng với rất nhiều loại

kháng sinh nên việc làm kháng sinh đồ trước khi điều trị là cần thiết [5]

Phòng bệnh đặc hiệu: một số nước trên thế giới đã chế vaccine phòng bệnh đặc hiệu để dùng cho bệnh nhân bỏng, chấn thương hở, những bệnh nhân chuẩn bị phẫu thuật [31]

1.3.8 Điều trị

Nhất thiết phải làm kháng sinh đồ để lựa chọn thuốc điều trị Trong thực tế

thường sử dụng kết hợp một penicillin có hoạt tính chống P aeruginosa (ticarcillin,

piperacillin, mezlocillin) với kháng sinh nhóm aminoglycoside (tobramicin, amikacin) Hoặc có thể dùng các kháng sinh như: ceftazidim, imipenem và các quinolon mới (nofloxacin, ciprofloxacin) để điều trị

Có thể kết hợp dùng kháng sinh toàn thân với việc sử dụng tại chỗ các thuốc kháng khuẩn đông nam dược

Sử dụng huyết thanh và globulin miễn dịch kháng P aeruginosa kết hợp với

kháng sinh để điều trị cũng là một xu hướng mới và có nhiều triển vọng [31]

Ho Chi Minh City University of Technology

15

1.4 Kháng sinh và cơ chế kháng kháng sinh ở vi khuẩn

1.4.1 Giới thiệu về kháng sinh

❖ Khái niệm

Kỷ nguyên hiện đại của hóa trị liệu kháng khuẩn được bắt đầu từ việc tìm ra sulfonamid (Domagk, 1936) “Thời kỳ vàng son” của kháng sinh bắt đầu từ khi sản xuất penicillin để dùng trong lâm sàng (1941) Khi đó, “kháng sinh được xem là những chất do vi sinh vật tiết ra (vi khuẩn, vi nấm), có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn khác” [5]

Về sau, với sự phát triển của khoa học, người ta đã có thể [2]:

- Tổng hợp, bán tổng hợp các kháng sinh tự nhiên (cloramphenicol)

- Tổng hợp nhân tạo các chất có tính kháng sinh: sulfamid, quinolon

- Chiết xuất từ vi sinh vật những chất diệt được tế bào ung thư (actinomycin)

❖ Phân loại

Các kháng sinh được phân loại theo cấu trúc hóa học [2], từ đó chúng có chung một cơ chế tác động và phổ kháng khuẩn tương tự Mặt khác, trong cùng một họ kháng sinh, tính chất dược động học và sự dung nạp thường khác nhau cũng như đặc điểm về phổ kháng khuẩn cũng không phải giống nhau hoàn toàn, vì vậy cần phân biệt các kháng sinh trong cùng một họ

Dựa trên cấu trúc hóa học, người ta có thể xếp kháng sinh theo các nhóm như:

• Nhóm β-lactam: penicillin, ampicillin, cephalosporin, …

• Nhóm tetracyclines: tetracyclin, oxytetracyclin, …

• Nhóm phenicol: chloramphenicol, thamphenicol, …

• Nhóm aminoglycosides: gentamycin, kanamycin, amikacin , …

• Nhóm macrolides: tylosin, spiramycin, …

• Nhóm kháng sinh với macrolides: lycomycin, virginiamycin, …

• Nhóm polypeptid: colistin, bacitracin, polymycin,…

• Nhóm sulfamides: sulfamethoxazol, sulfadimidin, …

• Nhóm quinolones: oxfloxacin, ciprofloxacin, …

• Ngoài ra còn có một số nhóm khác như glycopeptid, nitrofuran, …

Ho Chi Minh City University of Technology

1.4.2 Cơ chế tác động của kháng sinh

Tác động của kháng sinh lên vi sinh vật gồm 5 cơ chế [3]:

❖ Ức chế sinh tổng hợp vách tế bào vi khuẩn:

Vách tế bào của vi khuẩn (đặc biệt là các vi khuẩn Gram dương) được cấu tạo bởi các phức hợp peptidoglycan, phức hợp này được trùng hợp bởi các enzyme transpeptidases Các kháng sinh nhóm β - lactam gắn chọn lọc vào các enzyme transpeptidase này làm cho vách tế bào của vi khuẩn bị tan rã khiến vi khuẩn bị tiêu diệt

❖ Gây rối loạn chức năng của màng sinh chất:

Chức năng đặc biệt quan trọng của màng bào tương là thẩm thấu chọn lọc; khi

bị rối loạn các thành phần bên trong tế bào bị thoát ra ngoài và nước từ bên ngoài ào ạt vào trong, dẫn tới chết, ví dụ polymyxin B, colistin Với cơ chế tác động này, polymyxin có tác dụng diệt khuẩn tuyệt đối, tức là giết cả tế bào đang nhân lên và cả tế bào ở trạng thái nghỉ – không nhân lên

❖ Ức chế sinh tổng hợp protein:

Tham gia sinh tổng hợp protein ngoài ribosome còn có các RNA thông tin và các RNA vận chuyển Điểm tác động là ribosome 70S (gồm 2 tiểu phần là 30S và 50S) Kết quả là các phân tử protein không được hình thành hoặc được tổng hợp nhưng không có hoạt tính sinh học làm ngừng trệ quá trình sinh trưởng và phát triển

❖ Ức chế sinh tổng hợp acid nucleic:

- Ngăn cản sự sao chép của DNA mẹ tạo DNA con, ví dụ do kháng sinh gắn vào enzyme gyrase làm DNA không mở được vòng xoắn, như nhóm quinolon

Ho Chi Minh City University of Technology

1.4.3 Cơ chế kháng kháng sinh ở vi khuẩn

Hiện tượng kháng kháng sinh xảy ra khi mầm bệnh hay vi khuẩn không bị tiêu diệt triệt để bởi thuốc kháng sinh, chúng vẫn còn tồn tại, sinh sản ra các thế hệ con cháu không có tính cảm ứng với một hay nhiều loại thuốc kháng sinh nào đó [5]

P aeruginosa rất dễ đề kháng với nhiều loại kháng sinh, vì vậy nó rất nguy

hiểm Loại vi khuẩn này có khả năng kháng thuốc tự nhiên do có hàng rào ngăn cản tính thấm ở màng ngoài lipopolysaccharide Đồng thời các nghiên cứu còn cho thấy

Pseudomonas còn mang các plasmid kháng kháng sinh và các yếu tố di truyền này có

thể được lan truyền trong quần thể thông qua hiện tượng tải nạp, giao nạp tạo ra những dạng đột biến kháng thuốc mới [5]

Có 2 dạng đề kháng: đề kháng giả và đề kháng thật [3]

❖ Đề kháng giả

- Khi hệ thống miễn dịch của cơ thể suy giảm (do dùng corticoid, tia xạ, …) hoặc chức năng của đại thực bào bị hạn chế (ví dụ ở ổ mủ), thì cơ thể không đủ khả năng loại trừ được những vi khuẩn đã bị kháng sinh ức chế ra khỏi cơ thể

- Khi vi khuẩn tự đề kháng: Ở trạng thái nghỉ (không nhân lên, không chuyển hóa

do thiếu oxy, pH thay đổi …), vi khuẩn không chịu tác dụng của kháng sinh

- Khi có vật cản, hệ tuần hoàn ứ trệ, kháng sinh không thấm tới ổ viêm thì vi khuẩn cũng đề kháng

❖ Đề kháng thật

Đề kháng tự nhiên: Một số loại vi khuẩn luôn luôn không chịu tác dụng của một

số kháng sinh Ví dụ P aeruginosa kháng với penicillin G, tụ cầu không chịu tác dụng

của colistin Một số vi sinh vật không có vách như Mycoplasma không chịu tác dụng

Ho Chi Minh City University of Technology

hệ khác, cùng với sự phân chia tế bào vi khuẩn

• Nhận gene đề kháng: Gene đề kháng có thể lan truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác qua các hình thức vận chuyển chất liệu di truyền như sau:

- Tiếp hợp: Hai vi khuẩn tiếp xúc nhau và truyền cho nhau gene đề kháng

- Biến nạp: Khi vi khuẩn đề kháng bị ly giải, giải phóng các đoạn DNA tự do và những đoạn này xâm nhập vào tế bào vi khuẩn khác

- Tải nạp: Phage mang gene đề kháng từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác

❖ Cơ chế của sự kháng kháng sinh ở vi khuẩn

• Ức chế bằng enzyme

Vi khuẩn sản xuất ra enzyme gây phân hủy hoặc làm bất hoạt kháng sinh Sự sản xuất enzyme có thể được cảm ứng bới một yếu tố bên ngoài (một kháng sinh khác) hoặc bất biến (không bị ảnh hưởng bởi kích thích bên ngoài) Ví dụ điển hình là sinh enzyme beta-lactamase phá hủy vòng beta-lactam của các nhóm Penicillines hoặc Cephalosporines Các enzyme beta-lactamase do vi khuẩn sinh ra và lây truyền theo đường nhiễm sắc thể hoặc plasmid Trong số các vi khuẩn Gram dương, tụ cầu vàng:

Staphylococccus aureus và các cầu khuẩn Gram dương đường ruột là các tác nhân gây

bệnh thường hay sinh enzyme beta-lactamase lây truyền qua plasmid nhất

Ho Chi Minh City University of Technology

19

• Giảm tính thấm của tế bào vi khuẩn

Vi khuẩn là các vi sinh vật đơn bào: màng tế bào chất phân cách tế bào chất với môi trường bên ngoài Các vi khuẩn Gram âm còn có thêm một màng bao bên ngoài, gọi là màng ngoài, có tác dụng như một hàng rào che chở cho các thành phần vật chất nằm ở bên trong Chất dinh dưỡng và kháng sinh phải đi ngang qua màng này để thấm vào bên trong tế bào vi khuẩn, theo cách thức khuyến tán thụ động ngang qua các kênh (lỗ nhỏ) Sự giảm tính thấm của màng ngoài, làm giảm lượng kháng sinh đi vào bên trong đến đích tác dụng, nguyên nhân do biến đổi tính thấm lớp màng bên trong hoặc bên ngoài vi khuẩn Dạng đề kháng này nói chung xảy ra đối với nhiều kháng sinh của nhiều nhóm khác nhau, do có khi các kháng sinh khác nhau nhưng có thể dùng chung một loại lỗ Mặt khác, sự đề kháng này là đặc hiệu khi một kháng sinh chỉ dùng riêng

một loại lỗ Ví dụ về sự đề kháng của Pseudomonas aeruginosa với imipenem là sự

đề kháng đặc hiệu gây ra do mất đi các lỗ riêng dành cho các Carbapeneme

• Biến đổi vị trí gắn kết

Hiện tượng này là do nhiễm sắc thể hoặc plasmid, theo cơ chế làm giảm độ ái

lực của kháng sinh tại vị trí tác dụng Ví dụ:

- Biến đổi các protein liên kết với Penicillin (PBP): Giảm ái lực của các PBP với các thuốc nhóm beta-lactamase có thể do đột biến gene ở nhiễm sắc thể, hoặc

do mắc phải gene bên ngoài có các PBP mới Cơ chế này thường gặp với các

cầu khuẩn Gram dương, như Staphylococcus aureus và Streptococcus

pneumonia, nhưng rất hiếm gặp ở vi khuẩn Gram âm

- Biến đổi vị trí gắn kết ở ribosome : Biến đổi bên trong tế bào vi khuẩn ở tiểu đơn vị ribosome đích có thể làm giảm hoạt tính của kháng sinh Sự biến đổi này làm cho kháng sinh không đủ khả năng ức chế tổng hợp protein cũng như sự tăng trưởng của vi khuẩn, do không thể gắn kết vào vị trí tác dụng ở ribosome

- Biến đổi enzyme DNA-gyrase và enzyme topoisomerase: DNA-gyrase là enzyme cần thiết cho hoạt tính của các Quinolone Sự đột biến nhất thời ở độc nhất một acid amine của DNA-gyrase gây ra đề kháng

Ho Chi Minh City University of Technology

20

- Biến đổi các enzyme đích: Sự biến đổi của enzyme dihydropteroate synthetase kháng lại sự gắn kết với Sulfamide và của enzyme dihydropteroate reductase làm mất nhạy cảm với Trimetoprime đồng thời gây ra kháng kháng sinh

• Bơm đẩy

Kháng sinh không thể đạt đến vị trí tác dụng do bơm đẩy chủ động đẩy kháng sinh ra khỏi tế bào vi khuẩn Các chất vận chuyển đẩy kháng sinh ra là các thành phần bình thường của tế bào vi khuẩn và góp phần lớn cho tính đề kháng nội sinh của vi khuẩn chống lại nhiều kháng sinh Các bơm này cần năng lượng Việc tiếp xúc với kháng sinh làm thuận lợi cho việc tăng số lượng bơm do đột biến các chất mang, làm tăng mạnh tính đề kháng của vi khuẩn Ví dụ, Ciprofloxacine có thể làm thuận lợi việc phát tán đề kháng với Cephalosporine theo cơ chế bơm đẩy Các vi khuẩn gây bệnh quan trọng trên lâm sàng có mang bơm đẩy gây nên sự kháng kháng sinh, điển hình là

vi khuẩn E coli và Shigella.

Ho Chi Minh City University of Technology

21

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 2/2016 đến tháng 7/2016 tại phòng Vi sinh Thực phẩm – Nước, khoa Xét nghiệm Sinh học lâm sàng, Viện Pasteur TP HCM

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập trong nước uống do khách hàng

mang tới Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh phân tích

Nước uống gồm 2 nhóm chính:

- Nhóm 1: nước uống tinh khiết, nước khoáng thiên nhiên, nước uống đóng chai

- Nhóm 2: nước xử lý dùng để uống: nước uống công ty, nước uống trường học, nước uống gia đình

p: tỷ lệ mẫu nước nhiễm P aeruginosa

d: độ chính xác mong muốn

Ho Chi Minh City University of Technology

22

❖ Nghiên cứu được thực hiện trên 200 mẫu nước uống các loại:

Bảng 2.1: Số mẫu nước uống được phân tích

2.4 Thiết bị, hóa chất, môi trường

- Thước kẻ đo vòng vô khuẩn

Ho Chi Minh City University of Technology

- Nước uống đóng chai: nước tinh khiết và nước khoáng thiên nhiên

- Nước xử lý dùng để uống: nước uống công ty, nước uống trường học, nước uống gia đình

❖ Các mẫu nước do khách hàng mang đến để kiểm nghiệm sau khi được nhận bởi phòng tiếp nhận, nhanh chóng chuyển lên phòng thí nghiệm và phân tích ngay trong ngày Nếu để sang ngày hôm sau thì các mẫu nước được lưu trữ trong tủ mát ở 4oC

2.5.2 Đánh giá kết quả

Đánh giá kết quả theo QCVN 6-1:2010/BYT Trong tiêu chuẩn này quy định mức

đánh giá như sau:

Bảng 2.2: Chỉ tiêu kiểm tra vi sinh vật trong nước uống áp dụng theo QCVN

6-1:2010/BYT [10]

Tuy nhiên, đề tài chỉ thực hiện kiểm tra chỉ tiêu vi khuẩn Pseudomonas

aeruginosa, yêu cầu không được phép xuất hiện P aeruginosa trong 250 ml mẫu nước

uống kiểm tra

1 Coliforms tổng số 0 cfu/250 ml

2 Coliform fecal hoặc E coli 0 cfu/250 ml

3 Streptococcus fecalis 0 cfu/250 ml

4 Pseudomonas aeruginosa 0 cfu/250 ml

5 Bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sulfide 0 cfu/50 ml

Ho Chi Minh City University of Technology

2.5.4 Phương pháp định lượng P aeruginosa trong nước uống

Phân lập và đếm khuẩn lạc P aeruginosa theo phương pháp nuôi cấy truyền

định là P aeruginosa, những khuẩn lạc phát huỳnh quang dưới tia UV

hoặc có màu nâu đỏ cần được khẳng định sinh hóa

- Tính toán số vi khuẩn có trong thể tích thử nghiệm

❖ Môi trường, hóa chất nuôi cấy:

- Môi trường Pseudomonas agar: phân lập P aeruginosa

- Môi trường thạch dinh dưỡng: tăng sinh P aeruginosa

- Môi trường Acetamid: thử khả năng sinh NH3

- Môi trường King’B: kiểm tra khả năng sinh sắc tố Pyoverdin

- Thuốc thử Nessler’s: kiểm tra phản ứng sinh NH3

- Giấy test oxidase: xác định sự hiện diện của enzyme oxidase

❖ Quy trình thực hiện:

Ho Chi Minh City University of Technology

27

Sơ đồ 2.1: Phát hiện và đếm vi khuẩn P aeruginosa

Lọc lượng mẫu thử qua màng lọc (0,45 m) Rồi đặt màng lọc lên đĩa thạch

Thạch PSEU

Khuẩn lạc không tạo màu xanh

Kiểm tra dưới đèn UV

Khuẩn lạc Màu nâu đỏ hoặc không phát huỳnh quang

Khẳng định

P aeruginosa

Khuẩn lạc Không tạo sắc tố pyocyanin Phát huỳnh quang Acetamide broth

Ủ (37 ± 1oC) / 24 giờ

Nhỏ 1-2 giọt thuốc thử

Nessler’s (Môi trường chuyển màu vàng đến màu đỏ gạch) Sinh Amoniac

Khẳng định

P aeruginosa

Ho Chi Minh City University of Technology

28

❖ Tính toán kết quả

Trong đó:

P: số khuẩn lạc có màu xanh da trời / màu xanh lá cây; tất cả được đếm

F: số khuẩn lạc phát huỳnh quang

R: số khuẩn lạc có màu nâu đỏ

nF:số khuẩn lạc phát huỳnh quang được kiểm tra khả năng sinh amoniac

cF:số khuẩn lạc phát huỳnh quang sinh amoniac (dương tính)

nR: số khuẩn lạc màu nâu đỏ được kiểm tra các phản ứng: sinh amoniac, thử oxidase, phát huỳnh quang trên môi trường King’B

cR:số khuẩn lạc màu nâu đỏ cho kết quả dương tính trong các phản ứng: sinh amoniac, thử oxidase, phát huỳnh quang trên King’B

V: thể tích của mẫu nước được phân tích

2.5.5 Phương pháp thực hiện kháng sinh đồ

Thực hiện theo bản hướng dẫn của CLSI (Viện Lâm Sàng Và Tiêu Chuẩn Phòng Thí Nghiệm) [24]

❖ Phương pháp: Phương pháp khuếch tán kháng sinh trên đĩa thạch (phương pháp Kirby – Bauer)

❖ Nguyên lý:

Kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch Mueller – Hinton (MH) có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh

❖ Môi trường, hóa chất:

- Môi trường: Mueller – Hinton

- Hóa chất: Các kháng sinh thử nghiệm

Ho Chi Minh City University of Technology