Mục tiêu đề tài
Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào protease và chitinase của các chủng nấm Purpureocillium lilacinum (P lilacinum) được phân lập từ đất vùng rễ cây tiêu bị bệnh vàng lá và từ đất vùng rễ cây tiêu khỏe mạnh.
So sánh khả năng xâm nhập vào khối trứng và con cái tuyến trùng
Meloidogyne spp của một số chủng nấm P liacinum đại diện từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh và khỏe mạnh.
Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu đầu tiên về hoạt tính enzyme ngoại bào và khả năng kí sinh tuyến trùng của nấm P lilacinum được phân lập từ đất vùng rễ tiêu ở Vũng Tàu mang ý nghĩa thực tiễn quan trọng trong việc ứng dụng nấm này trong nông nghiệp và quản lý dịch hại.
Từ nghiên cứu này có thể xác định được sự tồn tại của các chủng nấm
P lilacinum sở hữu hoạt tính enzyme ngoại bào protease và chitinase, cùng với khả năng ký sinh mạnh mẽ đối với tuyến trùng trong đất trồng tiêu Điều này góp phần quan trọng vào việc phát triển và ứng dụng chế phẩm vi sinh nhằm phòng trừ tuyến trùng gây hại cho cây tiêu trong tương lai.
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian thực hiện: 04/2015 – 08/2015 Địa điểm: Phòng thí nghiệm vi sinh thuộc phòng Công nghệ vi sinh (Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Tp.HCM)
Các chủng nấm P lilacinum được phân lập từ đất vùng rễ tiêu trồng ở Vũng
Tàu Trong đó, có 16 chủng được phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh và 13 chủng từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh.(Bảng 2.1)
2.3 Vật liệu, dụng cụ, hóa chất, thiết bị dùng trong thí nghiệm
Con cái và khối trứng tuyến trùng Meloidogyne.spp được tách ra từ sần rễ tiêu và được bảo quản trong dung dịch nước muối sinh lý NaOCl 0.5% cho đến khi sử dụng.
Dụng cụ Ống nghiệm 5ml, 10ml Đĩa Petri 5cm, 9cm
Pipep các loại Ống đong các loại
Nồi nấu môi trường Đèn cồn, diêm, dao cấy, que cấy, bông thấm, bông không thấm, giấy báo cũ, đũa khuấy, giấy lọc, phễu, vải lọc…
Cân phân tích điện tử
Máy chụp ảnh kỹ thuật số
Các môi trường và thuốc thử sử dụng
Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA)
Môi trường cảm ứng enzyme ngoại bào
Môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme protease dựa theo Gradisar và ctv, 2005 có cải tiến
Cách pha casein 1%: đun sôi cách thủy 1g casein trong đệm sorence đến tan hoàn toàn ( pha trong 100ml môi trường)
Dung dịch đệm Sorensen được chuẩn bị bằng cách hòa tan 5,96g Na2HPO4 trong nước để tạo thành 250ml dung dịch Na2HPO4 1/15M Tiếp theo, hòa tan 0,9072g KH2PO4 trong nước thành 100ml dung dịch KH2PO4 1/15M Sau đó, trộn 177ml dung dịch Na2HPO4 1/15M với 23ml dung dịch KH2PO4 1/15M và điều chỉnh pH về mức 7,6 để có dung dịch đệm Sorensen 1/15M Đối với thuốc thử Trichloroacetic acid (TCA) 10%, hòa tan 10g TCA trong nước cất cho đủ 100ml, thuốc thử này được sử dụng để kiểm tra khả năng phân giải casein.
Môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme chitinase dựa theo Gradisar và ctv,
Để chuẩn bị huyền phù chitin 1%, cân 5g vỏ tôm xay nhuyễn và hòa tan trong 50ml dung dịch HCl đậm đặc, khuấy đều trong 3 phút Tiếp theo, từ từ thêm nước cất lạnh 5°C cho đến khi đạt 500ml, tạo ra huyền phù chitin màu trắng sữa Huyền phù này cần được lọc qua giấy lọc và rửa lại với nước cất nhiều lần cho đến khi đạt pH trung tính (pH=7) Cuối cùng, bảo quản huyền phù trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 2°C đến 6°C (Dai và ctv, 2011).
Lugol (thuốc thử dùng để xác định khả năng phân giải chitin)
Nghiền KI với 5 – 10 ml nước cất và thêm Iod tinh thể cho đến khi hòa tan hoàn toàn Sau đó, đổ dung dịch vào cốc đong và thêm nước cất đến 300 ml Bảo quản trong lọ màu và sử dụng trong vòng 30 ngày (Nguyễn Đức Lượng, 2003).
Môi trường Water agar (WA)
Môi trường khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng - Môi trường Water Agar (WA) mềm
Bảng 2.1 Danh sách các chủng nấm P lilacinum được phân lập từ đất vùng rễ tiêu ở Vũng Tàu
STT Ký hiệu chủng Nguồn gốc phân lập
1 KL 1.4 Đất vùng rễ cây tiêu khỏe mạnh (lá xanh)
14 KL 1.2 Đất vùng rễ cây tiêu bị bệnh vàng lá
Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào protease và chitinase của các chủng nấm P lilacinum được phân lập từ các hệ sinh thái đất trồng tiêu tại tỉnh Vũng Tàu Nghiên cứu này nhằm đánh giá hiệu quả của các chủng nấm trong việc sản xuất enzyme, từ đó góp phần vào việc cải thiện chất lượng đất và năng suất cây trồng.
Khảo sát khả năng ký sinh của các chủng P lilacinum từ đất vùng rễ cây tiêu khỏe mạnh và bị bệnh ở Vũng Tàu cho thấy sự khác biệt trong khả năng ký sinh khối trứng và con cái của tuyến trùng Meloidogyne spp Nghiên cứu này giúp làm rõ mối quan hệ giữa các chủng nấm và sự phát triển của tuyến trùng, từ đó cung cấp thông tin hữu ích cho việc quản lý dịch hại trong cây tiêu.
2.5.1 Phương pháp định tính hệ enzyme ngoại bào của nấm P lilacinum -
Phương pháp đo vòng phân giải cơ chất trên môi trường thạch
Khi nuôi cấy nấm P lilacinum trên môi trường chứa cơ chất như casein và chitin, nấm sẽ tiết ra enzyme protease và chitinase Enzyme này phân giải cơ chất, tạo ra vòng trong suốt quanh khuẩn lạc khi nhỏ thuốc thử vào Kích thước của vòng trong suốt phản ánh hoạt động của enzyme, cho thấy hiệu quả của quá trình phân giải (Lê Thị Huệ, 2010).
Giống nấm P lilacinum được bảo quản trong ống giống ở nhiệt độ 4°C, sau đó được cấy chuyền sang môi trường PDA và ủ ở nhiệt độ 28°C ± 2°C trong 5-7 ngày Tiếp theo, giống nấm này được cấy chuyền sang môi trường WA và ủ ở cùng nhiệt độ 28°C ± 2°C trong 5 ngày.
Các môi trường cần thiết: môi trường PDA, WA và môi trường cảm ứng enzyme ngoại bào được chuẩn bị rồi phân phối ra các đĩa Petri
Sử dụng khoan thạch 5 mm đã khử trùng để lấy mẫu thạch có tơ nấm từ môi trường WA, sau đó dùng dao khử trùng để đặt khoanh thạch vào tâm đĩa chứa 10ml môi trường cảm ứng enzyme Mỗi chủng nấm sẽ được cấy lặp lại 3 lần trên 3 đĩa khác nhau Trước khi đưa ra khỏi tủ cấy, cần quấn đĩa bằng parafilm và ghi lại tên giống cũng như ngày, giờ cấy để tiện theo dõi.
Chỉ tiêu theo dõi đường kính vòng phân giải cơ chất (D, mm) và đường kính khuẩn lạc (d, mm) được thực hiện sau khi nhuộm thuốc thử ở các thời điểm 24h, 48h và 72h nuôi cấy Mức độ phân giải cơ chất của nấm được đánh giá dựa vào hiệu D – d (mm), với hiệu D – d càng lớn cho thấy khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng nấm càng mạnh.
- Đối với thử nghiệm định tính enzyme protease:
Chủng có khả năng tiết enzyme mạnh là chủng có D – d ≥ 9 mm
Chủng có khả năng tiết enzyme khá là chủng có 9 mm > (D – d) ≥ 7 mm
Chủng có khả năng tiết enzyme trung bình là chủng có 7 mm > (D – d) ≥ 5 mm + Chủng có khả năng tiết enzyme yếu là chủng có (D – d) < 5mm
- Đối với thử nghiệm định tính enzyme chitinase:
Chủng có khả năng phân hủy chitin mạnh: D – d >5 mm
Chủng có khả năng phân hủy chitin khá: 5 mm > (D – d) ≥ 4 mm
Chủng có khả năng phân hủy chitin trung bình : 4 mm > (D – d) ≥ 3 mm
Chủng có khả năng phân hủy chitin yếu : (D – d) < 3 mm
2.5.2 Phương pháp khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp của nấm P lilacinum
Giống nấm P lilacinum được bảo quản ở nhiệt độ 4°C và được cấy chuyền sang môi trường PDA, ủ ở 28°C ± 2°C Sau khoảng 5 đến 7 ngày, giống nấm này sẽ được cấy chuyển sang đĩa Petri chứa 10 ml môi trường WA mềm.
Khối trứng và con cái tuyến trùng được rửa nhiều lần bằng nước cất đã được hấp khử trùng để loại bỏ tạp chất, nhằm hạn chế nhiễm khuẩn trong quá trình theo dõi khả năng ký sinh Sau khi rửa sạch, chúng được đặt vào các đĩa Petri có lớp giấy mỏng đã được làm ẩm và vô trùng.
Các môi trường cần thiết: môi trường PDA, Môi trường WA mềm được chuẩn bị rồi phân phối ra các đĩa Petri
Sử dụng khoan thạch 5 mm đã khử trùng để lấy mẫu thạch có tơ nấm trên môi trường PDA, sau đó cắt khoanh thạch và đặt vào tâm đĩa môi trường WA mềm Tiếp theo, đặt 4 trứng hoặc con cái tuyến trùng tại 4 điểm xung quanh, cách khoanh nấm 0.5 cm Mỗi chủng nấm sẽ được cấy lặp lại 3 lần trên 3 đĩa môi trường WA mềm và ủ ở nhiệt độ phòng (28 - 30 độ C) để theo dõi sự ký sinh của nấm.
Theo dõi sự ký sinh sau mỗi 24 giờ cho đến khi có chủng nấm khảo sát ký sinh hoàn toàn trên số khối trứng hoặc con cái trong một lần lặp lại Tính số lượng con cái hoặc khối trứng bị nấm ký sinh, trong đó sợi nấm xâm nhập và sử dụng chất dinh dưỡng của ký chủ, hình thành một cụm sợi nấm bao gồm cả thể bình và bào tử xung quanh khối trứng hoặc con cái Mức độ ký sinh của tuyến trùng được tính theo phần trăm (%) và được chia thành 4 cấp độ.
- Ký sinh mạnh: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh trên 75%
- Ký sinh khá: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh trong khoảng 50 -75%
- Ký sinh trung bình: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh từ 25 - 50%
- Tỷ lệ ký sinh yếu: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh dưới 25%
2.5.3 Bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu
Thí nghiệm khảo sát khả năng tiết enzyme ngoại bào của P lilacinum
Thí nghiệm được thực hiện theo kiểu CRD hoàn toàn ngẫu nhiên, với 2 yếu tố chính: 29 chủng nấm Purpureocillium spp và 3 mức thời gian khảo sát là 24, 48, 72 giờ Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần trên 3 đĩa Petri chứa môi trường cảm ứng enzyme tương ứng.
Vật liệu, dụng cụ, hóa chất, thiết bị dùng trong thí nghiệm
Con cái và trứng của tuyến trùng Meloidogyne spp được tách ra từ sần rễ tiêu và được bảo quản trong dung dịch nước muối sinh lý (NaOCl 0,5%) cho đến khi sử dụng.
Dụng cụ Ống nghiệm 5ml, 10ml Đĩa Petri 5cm, 9cm
Pipep các loại Ống đong các loại
Nồi nấu môi trường Đèn cồn, diêm, dao cấy, que cấy, bông thấm, bông không thấm, giấy báo cũ, đũa khuấy, giấy lọc, phễu, vải lọc…
Cân phân tích điện tử
Máy chụp ảnh kỹ thuật số
Các môi trường và thuốc thử sử dụng
Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA)
Môi trường cảm ứng enzyme ngoại bào
Môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme protease dựa theo Gradisar và ctv, 2005 có cải tiến
Cách pha casein 1%: đun sôi cách thủy 1g casein trong đệm sorence đến tan hoàn toàn ( pha trong 100ml môi trường)
Dung dịch đệm Sorensen được chuẩn bị bằng cách hòa tan 5,96g Na2HPO4 trong nước để tạo thành 250ml dung dịch Na2HPO4 1/15M Tiếp theo, hòa tan 0,9072g KH2PO4 trong nước để có 100ml dung dịch KH2PO4 1/15M Sau đó, trộn 177ml dung dịch Na2HPO4 1/15M với 23ml dung dịch KH2PO4 1/15M và điều chỉnh pH về 7,6 để hoàn thành dung dịch đệm Sorensen 1/15M Đối với thuốc thử Trichloroacetic acid (TCA) 10%, hòa tan 10g TCA trong nước cất cho đủ 100ml, được sử dụng để kiểm tra khả năng phân giải casein.
Môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme chitinase dựa theo Gradisar và ctv,
Để chuẩn bị huyền phù chitin 1%, cân 5g vỏ tôm xay nhuyễn và hòa tan trong 50ml dung dịch HCL đậm đặc, khuấy đều trong 3 phút Sau đó, từ từ thêm nước cất lạnh 5°C cho đến khi đạt 500ml, tạo ra huyền phù chitin màu trắng sữa Huyền phù này cần được lọc qua giấy lọc và rửa lại nhiều lần với nước cất cho đến khi đạt pH trung tính (pH=7) Cuối cùng, bảo quản huyền phù trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 2°C đến 6°C (Dai và ctv, 2011).
Lugol (thuốc thử dùng để xác định khả năng phân giải chitin)
Nghiền KI với 5 – 10 ml nước cất và thêm Iod tinh thể cho đến khi hòa tan hoàn toàn Sau đó, đổ dung dịch vào cốc đong và thêm nước cất cho đến đạt 300 ml Bảo quản trong lọ màu và sử dụng trong vòng 30 ngày (Nguyễn Đức Lượng, 2003).
Môi trường Water agar (WA)
Môi trường khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng - Môi trường Water Agar (WA) mềm
Bảng 2.1 Danh sách các chủng nấm P lilacinum được phân lập từ đất vùng rễ tiêu ở Vũng Tàu
STT Ký hiệu chủng Nguồn gốc phân lập
1 KL 1.4 Đất vùng rễ cây tiêu khỏe mạnh (lá xanh)
14 KL 1.2 Đất vùng rễ cây tiêu bị bệnh vàng lá
Nội dung nghiên cứu
Khảo sát khả năng tiết enzyme ngoại bào protease và chitinase của các chủng nấm P lilacinum được thực hiện tại các hệ sinh thái đất trồng tiêu ở tỉnh Vũng Tàu Nghiên cứu này nhằm so sánh hiệu quả hoạt động của các enzyme này trong môi trường đất khác nhau, từ đó đánh giá tiềm năng ứng dụng của nấm P lilacinum trong nông nghiệp.
Khảo sát và so sánh khả năng kí sinh của khối trứng và con cái của tuyến trùng Meloidogyne spp được thực hiện với một số chủng P lilacinum Các chủng này được lấy từ đất vùng rễ của cây tiêu khỏe mạnh và cây tiêu bị bệnh tại Vũng Tàu Nghiên cứu nhằm hiểu rõ hơn về mối quan hệ giữa các chủng nấm và tuyến trùng trong điều kiện sinh thái cụ thể.
Phương pháp nghiên cứu
2.5.1 Phương pháp định tính hệ enzyme ngoại bào của nấm P lilacinum -
Phương pháp đo vòng phân giải cơ chất trên môi trường thạch
Khi nuôi cấy nấm P lilacinum trên môi trường có cơ chất như casein và chitin, nấm sẽ tiết ra enzyme protease và chitinase Sự phân giải cơ chất dưới tác động của enzyme tạo ra vòng trong suốt quanh khuẩn lạc, kích thước của vòng này phản ánh hoạt động của enzyme (Lê Thị Huệ, 2010).
Giống nấm P lilacinum được bảo quản ở nhiệt độ 4°C và được cấy chuyền sang môi trường PDA, ủ ở 28°C ± 2°C trong 5-7 ngày Sau đó, nấm sẽ được cấy chuyền sang môi trường WA và ủ tiếp tục ở nhiệt độ 28°C ± 2°C trong 5 ngày.
Các môi trường cần thiết: môi trường PDA, WA và môi trường cảm ứng enzyme ngoại bào được chuẩn bị rồi phân phối ra các đĩa Petri
Sử dụng khoan thạch 5 mm đã khử trùng để lấy mẫu thạch có tơ nấm từ môi trường WA, sau đó dùng dao khử trùng để đặt khoanh thạch vào trung tâm đĩa chứa 10ml môi trường cảm ứng enzyme Mỗi chủng nấm sẽ được cấy lặp lại 3 lần trên 3 đĩa khác nhau Trước khi đưa ra khỏi tủ cấy, quấn đĩa bằng parafilm và ghi lại tên giống cũng như ngày, giờ cấy để tiện theo dõi.
Chỉ tiêu theo dõi đường kính vòng phân giải cơ chất (D, mm) và đường kính khuẩn lạc (d, mm) được thực hiện sau khi nhuộm thuốc thử ở thời điểm 24h, 48h và 72h nuôi cấy Mức độ phân giải cơ chất của nấm được đánh giá dựa vào hiệu D – d (mm), trong đó hiệu D – d càng lớn cho thấy khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng nấm càng mạnh.
- Đối với thử nghiệm định tính enzyme protease:
Chủng có khả năng tiết enzyme mạnh là chủng có D – d ≥ 9 mm
Chủng có khả năng tiết enzyme khá là chủng có 9 mm > (D – d) ≥ 7 mm
Chủng có khả năng tiết enzyme trung bình là chủng có 7 mm > (D – d) ≥ 5 mm + Chủng có khả năng tiết enzyme yếu là chủng có (D – d) < 5mm
- Đối với thử nghiệm định tính enzyme chitinase:
Chủng có khả năng phân hủy chitin mạnh: D – d >5 mm
Chủng có khả năng phân hủy chitin khá: 5 mm > (D – d) ≥ 4 mm
Chủng có khả năng phân hủy chitin trung bình : 4 mm > (D – d) ≥ 3 mm
Chủng có khả năng phân hủy chitin yếu : (D – d) < 3 mm
2.5.2 Phương pháp khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp của nấm P lilacinum
Nấm P lilacinum được nhân giống từ ống giống bảo quản ở nhiệt độ 4°C, sau đó được cấy chuyền sang môi trường PDA và ủ ở nhiệt độ 28°C ± 2°C Sau khoảng 5 – 7 ngày, nấm sẽ được cấy chuyển sang đĩa Petri chứa 10 ml môi trường WA mềm.
Khối trứng và con cái tuyến trùng được rửa kỹ bằng nước cất đã được hấp khử trùng để loại bỏ tạp chất, nhằm hạn chế nhiễm bẩn trong quá trình theo dõi khả năng ký sinh Sau khi rửa sạch, chúng được đặt vào các đĩa Petri có lớp giấy mỏng đã được làm ẩm và vô trùng.
Các môi trường cần thiết: môi trường PDA, Môi trường WA mềm được chuẩn bị rồi phân phối ra các đĩa Petri
Sử dụng khoan thạch 5 mm đã khử trùng để lấy mẫu thạch có tơ nấm trên môi trường PDA, sau đó dùng dao khử trùng để đặt khoanh thạch vào tâm đĩa môi trường WA mềm Tiếp theo, đặt 4 trứng hoặc con cái tuyến trùng xung quanh khoanh nấm, cách 0.5 cm Mỗi chủng nấm sẽ được cấy lặp lại 3 lần trên 3 đĩa môi trường WA mềm và ủ ở nhiệt độ phòng từ 28 đến 30 độ C để theo dõi sự ký sinh của nấm.
Theo dõi sự ký sinh sau mỗi 24 giờ cho đến khi có chủng nấm khảo sát ký sinh hoàn toàn trên số khối trứng hoặc con cái trong một lần lặp lại Tính số lượng con cái hoặc khối trứng bị nấm ký sinh, trong đó sợi nấm xâm nhập và sử dụng chất dinh dưỡng của ký chủ để tạo thành một cụm sợi nấm bao gồm cả thể bình và bào tử xung quanh khối trứng hoặc con cái Mức độ ký sinh của tuyến trùng được tính theo phần trăm (%) và chia thành 4 cấp độ.
- Ký sinh mạnh: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh trên 75%
- Ký sinh khá: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh trong khoảng 50 -75%
- Ký sinh trung bình: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh từ 25 - 50%
- Tỷ lệ ký sinh yếu: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh dưới 25%
2.5.3 Bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu
Thí nghiệm khảo sát khả năng tiết enzyme ngoại bào của P lilacinum
Nghiên cứu này sử dụng thiết kế thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với hai yếu tố chính: 29 chủng nấm Purpureocillium spp và thời gian khảo sát được chia thành 3 mức: 24, 48 và 72 giờ Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần trên 3 đĩa Petri với môi trường cảm ứng enzyme tương ứng.
Sau khi thu thập chỉ tiêu, hiệu D-d được tính toán bằng chương trình Excel Phân tích ANOVA cho hiệu D-d được thực hiện bằng phần mềm SAS 9.0 Sự khác biệt giữa các nghiệm thức được so sánh theo phương pháp LSD với mức ý nghĩa 0.05.
Thí nghiệm khảo sát khả năng ký sinh của P lilacinum trên tuyến trùng Meloidogyne spp
Thí nghiệm được thiết kế ngẫu nhiên theo kiểu CRD, với hai yếu tố chính: mười chủng nấm Purpureocillium spp có khả năng tiết enzyme ngoại bào tối ưu và thời gian khảo sát (đối với con cái là 1, 2, 3, 4 ngày; đối với khối trứng từ ngày 1 đến ngày 14) Mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần trên ba đĩa Petri chứa môi trường WA mềm.
Sau khi thu thập chỉ tiêu, tỷ lệ ký sinh được tính toán bằng chương trình Excel Phân tích ANOVA tỷ lệ ký sinh được thực hiện bằng phần mềm SAS 9.0, và sự khác biệt giữa các nghiệm thức được so sánh theo phương pháp LSD với mức ý nghĩa 0.05.
