TỔNG QUAN
Giới thiệu về cộng đồng vi khuẩn trong dạ cỏ bò
1.1.1 Hệ vi sinh vật trong dạ cỏ bò
Hình 1.1.Hệ tiêu hóa của trâu bò [2]
Dạ cỏ, chiếm tới 2/3 dung tích dạ dày, là túi đặc biệt nhất trong hệ tiêu hóa, nơi diễn ra hàng loạt phản ứng sinh hóa để phân giải và hấp thu thức ăn.
Dạ cỏ của bò chứa hàng tỷ vi sinh vật cộng sinh, đóng vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa thức ăn Hệ vi sinh vật này không chỉ giúp bò tiêu hóa chất xơ và tinh bột hiệu quả mà còn sản xuất axit béo, cung cấp khoảng 60 đến 80% năng lượng cần thiết cho bò Sự đa dạng của hệ vi sinh vật là yếu tố then chốt giúp dạ bò có khả năng tiêu hóa nhiều loại thức ăn khác nhau.
Hệ vi sinh vật trong dạ cỏ bò bao gồm vi khuẩn, protozoa và nấm, với số lượng vi khuẩn lên tới 10^9 - 10^10 cfu trong 1ml chất chứa và hơn 60 loài vi khuẩn đã được xác định Sự đa dạng và số lượng vi khuẩn của từng loài phụ thuộc chủ yếu vào khẩu phần ăn của bò.
Ngoài ra còn có Mycoplasma, các loại virus và các thể thực khuẩn Mycoplasma, virus và thể thực khuẩn không đóng vai trò quan trọng trong tiêu hóa
Quần thể vi sinh vật trong dạ cỏ thay đổi theo thời gian và phụ thuộc vào đặc điểm của khẩu phần ăn Hệ vi sinh vật này chủ yếu sử dụng năng lượng từ quá trình lên men các chất dinh dưỡng.
Hình 1.2.Protazoa cùng với vi khuẩn và bào tử nấm.[33]
Vi khuẩn được phân loại thành nhiều nhóm khác nhau, có khả năng phân giải cellulose, hemicellulose, tinh bột, đường và protein Chúng xuất hiện trong dạ cỏ của loài nhai lại, đặc biệt ở lứa tuổi còn non, bất kể là nuôi cách biệt hay cùng với mẹ Vi khuẩn thường chiếm số lượng lớn nhất trong vi sinh vật dạ cỏ và đóng vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa xơ Việc phân loại vi khuẩn dạ cỏ có thể dựa trên cơ chất mà chúng sử dụng hoặc sản phẩm lên men cuối cùng Một số nhóm vi khuẩn dạ cỏ chính bao gồm những loại có khả năng tiêu hóa các chất dinh dưỡng khác nhau.
Vi khuẩn phân giải cellulose là nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong dạ cỏ của gia súc ăn chủ yếu cellulose Các loài vi khuẩn quan trọng trong quá trình này bao gồm Bacteroides succinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus flavefaciens, Ruminococcus albus và Cillobacterium cellulosolven.
Ruminococcus flavefaciens là một loại vi khuẩn gram dương, nổi bật với khả năng sản sinh phức hệ enzyme bám vào thành tế bào thực vật, từ đó xúc tác cho nhiều hoạt động sinh hóa khác nhau.
Nhóm vi khuẩn phân giải hemicellulose cũng có khả năng phân giải cellulose, nhưng không phải tất cả các loài sử dụng hemicellulose đều có khả năng thủy phân cellulose Một số vi khuẩn tiêu biểu trong việc sử dụng hemicellulose bao gồm Butyrivibrio fibrisolvens, Lachnospira multiparus và Bacteroides ruminicola.
Vi khuẩn phân giải tinh bột đóng vai trò quan trọng trong dinh dưỡng carbohydrate của các loài nhai lại, đứng thứ hai sau cellulose Phần lớn tinh bột từ thức ăn được phân giải trong dạ cỏ nhờ hoạt động của vi sinh vật, bao gồm nhiều loại vi khuẩn, trong đó có cả vi sinh vật phân giải cellulose Các loại vi khuẩn này có vai trò thiết yếu trong quá trình tiêu hóa và chuyển hóa năng lượng cho động vật nhai lại.
Bacteroides amylophilus, Bacteroides Ruminantium, Steptococcus bovis Prevotella bryantil là vi khuẩn gram âm có thể sử dụng polysaccharide hòa tan, là xylans.[8]
Vi khuẩn phân giải đường có khả năng sử dụng polysaccharide, disaccharide và monosaccharide Các loài vi khuẩn như Lachnospira multiparus và Selenomonas ruminantium cho thấy khả năng tiêu thụ hiệu quả carbohydrate hòa tan.
Vi khuẩn có khả năng sử dụng axit hữu cơ, đặc biệt là axit lactic, mặc dù nồng độ axit này trong dạ cỏ thường rất thấp.
7 những trường hợp đặc biệt Những loài sử dụng lactic là Veillonella gasogenes, Veillonella alacalescens, Peptostreptococuss elsdenii.[8]
Vi khuẩn phân giải protein trong dạ cỏ bò đóng vai trò quan trọng trong việc tiết kiệm nitơ và quản lý nguy cơ dư thừa amoniac Amoniac cần thiết cho vi khuẩn dạ cỏ để tổng hợp sinh khối protein, trong khi một số vi khuẩn được kích thích bởi các acid amin, peptid và isoacid từ valine, leucine và isoleucine Trong số các loài sinh aminoac, Peptostreptococus và Clostridium có khả năng phân giải protein lớn nhất.
Vi khuẩn tạo methan, hay còn gọi là methanogens, là những vi khuẩn chịu trách nhiệm sản xuất methan trong dạ cỏ của bò thông qua quá trình lên men sử dụng carbon Chúng được phân thành hai nhóm chính: Methano sphaera stadtmanae và Methano brevibacter ruminatium.
Trong dạ cỏ bò, các vi khuẩn thuộc nhóm Methano bacteriaceae (Methano sphaera stadtmanae) chiếm ưu thế, tiếp theo là Methano corpusculaceae và Methano spirillaceae Nhóm Methano brevibacter ruminatium bao gồm Methano microbium, Methano bacterium và Methano sarcina, là những vi khuẩn có khả năng sử dụng khí methane, có hình dạng que ngắn, không sinh nội bào tử, với nhiệt độ phát triển tối ưu là 40°C và pH từ 6,1 đến 6,9.
Vi khuẩn tổng hợp vitamin: Nhiều loại vi sinh vật trong dạ cỏ bò có khả năng tổng hợp vitamin B và vitamin K.[8]
Vi khuẩn lên men pectin phát triển ở pH khoảng 6.0, ngoại trừ Bacterioides với pH 5,1 Đã có 32 chủng vi khuẩn lên men pectin được phân lập từ dạ cỏ bò, trong đó nổi bật là 3 chủng chính: Lachnospira multiparous, Butyrivibrio fibrisolvens và Bacteroides ruminicola Tất cả các vi khuẩn này đều là vi khuẩn kỵ khí, có đường kính từ 1,0 – 1,2 𝜇m, và chúng thường lên men pectin để tạo thành format và khí H2 Các sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men pectin sẽ được sử dụng bởi các vi khuẩn khác, chẳng hạn như succinate.
Giới thiệu về hệ enzym cellulase
Cellulase là tên chung cho các nhóm enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân của cellulose và các dẫn xuất celluoligosaccharide.[11]
According to the classification by the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB), the cellulose hydrolysis system includes the enzymes endoglucanase (EC 3.2.1.4), exoglucanase (EC 3.2.1.91), and β-glucosidase (EC 3.2.1.21).
Tên thường gọi là cellulase1,4-β –glucanase
Tên hệ thống: 1,2-(1,3:1,4)- β-D-glucan-4- glucanohydrolase
Enzym này, còn được biết đến với các tên gọi như endo-1,4-β-D-glucanase, β-1,4-glucanase và cellulase A, có chức năng thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucosid trong cellulose cũng như các β-D-glucan có trong ngũ cốc.
Tên thường gọi là cellulase 1,4-β-cellobiosidase
Tên hệ thống: 1,4- β-D-glucan cellobiohydrolase
Các tên khác: exo- cellobiohydrolase; exoglucanase; CBH1… Enzym này có tác dụng thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucosid trong cellulose và cellotetraose từ đầu không khử
Tên thường gọi là β-glucosidase
Tên hệ thống: β-D-glucosid glucohydrolase
Các tên khác: cellobiase; β-glucosid glucohydrolase; β-1,6-glucosidase… Enzym này thủy phân các gốc β-D-glucosid, một số trường hợp cũng thủy phân β-D-galactosidase, β-D-fucoside, β-D-xyloside, α-L- arabinoside
Cellulase là một loại protein được hình thành từ các đơn vị acid amin liên kết với nhau qua liên kết peptid Cấu trúc không gian của cellulase bao gồm một tâm xúc tác và một đuôi không gian, trong đó đuôi này được gắn thêm vùng glycosil hóa và có phần cuối là vùng gắn kết với cellulose Vùng gắn kết này có cấu trúc khác biệt so với các liên kết thông thường của protein, và sự thay đổi chiều dài của vùng glycosil hóa có thể ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzym.
Enzym cellulase có trọng lượng từ 30-110 KDal và cấu trúc không gian bao gồm từ 280 đến 600 acid amin Chiều dài trung bình của cellulase thường dao động từ 300 đến 450 acid amin, với trung tâm xúc tác chứa khoảng 250 acid amin.
Hệ enzym cellulase, với vai trò chính của exoglucanase, đã bẽ gãy các liên kết β-1,4-glucan để thủy phân cellulose thành glucose.
Enzyme exocellulase có khả năng thủy phân liên kết β-1,4-glucoside tại đầu không khử của chuỗi cellulose và cellodextrin, trong khi enzyme endocellulase thủy phân liên kết này ở các vị trí ngẫu nhiên trong chuỗi cellulose, cellodextrin và các dẫn xuất cellulose Ngoài ra, β-glucosidase cũng có khả năng thủy phân gốc β-D-glucan của rơm rạ.
Enzyme có tính chất lý hóa và hóa sinh đặc biệt, khi ở nhiệt độ cao, enzyme dễ bị biến tính, dẫn đến giảm hoặc mất hoạt tính Ngược lại, ở nhiệt độ thấp dưới 0°C, hoạt tính enzyme cũng giảm nhưng có khả năng phục hồi khi được đưa về nhiệt độ thích hợp.
Enzyme có thể hoạt động hiệu quả trong môi trường có pH trung tính, kiềm hoặc acid, tùy thuộc vào bản chất của chúng Hoạt tính của enzyme bị ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường sống, và chúng có khả năng điều chỉnh tốc độ phản ứng Trong tự nhiên, vi sinh vật có thể điều chỉnh các điều kiện enzyme để đạt được mức phản ứng tối ưu hoặc phát triển hệ enzyme thích nghi với các điều kiện khắc nghiệt.
Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose
Trong đó, ion Hg 2+ ức chế cellulase hoàn toàn, các ion khác như Mn 2+ , Ag + ,
Cellulosome là một phức hệ enzyme ngoại bào quan trọng của vi khuẩn kị khí, đóng vai trò then chốt trong việc thủy phân cellulose trong biomass với hiệu quả cao Vi khuẩn Clostridium thermocellum chứa một số lượng lớn gen mã hóa cho cellulosome, bao gồm các enzyme cellulase, xylanase, xyloglucanases, pectinases, glycosidases, và protein cấu trúc, cùng với ít nhất một thành phần protein không xúc tác đang được nghiên cứu Các thành phần trong cellulosome không phân bố đồng đều và không phải tất cả gen đều được biểu hiện Hệ enzyme này nằm trên bề mặt tế bào, giúp giảm thiểu sự khuyếch tán của enzyme và sản phẩm thủy phân, từ đó đảm bảo rằng sản phẩm được hấp thu hoàn toàn vào quá trình chuyển hóa của tế bào.
Các bằng chứng cho thấy bộ máy enzyme phân giải cellulose của
C.thermocellum có hiệu quả gấp 50 đến 100 lần so với enzyme của nấm, trong mỗi gam protein Tuy nhiên việc sản sinh cellulosome bởi thermophilic hiện nay là rất thấp Người ta sẽ cải thiện bằng cách đột biến chọn lọc hoặc dùng kỹ thuật chuyển đổi gen giữa các loài vi khuẩn.[28] Điều đáng chú ý là cellulosome chỉ mới được sản xuất từ loài vi khuần
Clostridiaceae và Lachnospiraceae là những vi khuẩn kỵ khí quan trọng trong dạ cỏ, đóng vai trò thiết yếu trong quá trình tiêu hóa cellulose Phức hợp enzyme cellulosome đang được nghiên cứu như một mô hình tiềm năng cho các ứng dụng sinh học in vitro, mang lại nhiều triển vọng cho công nghệ sinh học hiện đại.
Phân giải rơm qua xử lý
Lignocellulose là thành phần chính của rơm rạ, bao gồm ba thành phần là cellulose, hemicellulose và lignin Trong đó, cellulose chiếm 32-47%, hemicellulose chiếm 19-27% và lignin chiếm 5-24%.[16]
Trong hemicellulose các pentoses chiếm ưu thế, trong đó xylose là đường quan trọng nhất chiếm 14,8 – 20,2%.[16]
Thành phần phần trăm các chất trong rơm rạ được thể hiện trong hình 1.4
Hình 1.4 Thành phần của lignocellulose.[25]
1.3.2 Cấu trúc của rơm trong tự nhiên
Hình 1.5 Cấu trúc hiển vi của lignocellulose.[24]
Lignocellulose chủ yếu bao gồm cellulose, là chuỗi các phân tử glucose liên kết bằng liên kết 𝛽1,4-glucoside Hemicellulose, thành phần phổ biến thứ hai, bao gồm các monosaccharide 5-6 carbon như arabinose, galactose, glucose, mannose và xylose, thường có mặt trong vỏ hạt, bẹ ngô, cám, rơm rạ và trấu Lignin, với ba thành phần chính là p-coumaryl alcohol (H), coniferyl alcohol (G) và sinapyl alcohol (S), được hình thành qua các phản ứng trùng ngưng Tỷ lệ các thành phần này thay đổi tùy theo loại cây, mô gỗ và các lớp tế bào khác nhau.
Cấu trúc của cellulose, hemicellulose và lignin, được gọi là microfibrils, đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định cấu trúc trung gian của tế bào thực vật Hình 1.5 minh họa rõ nét cấu trúc hiển vi của lignocellulose.
Hình 1.6.Cấu trúc của lignocellulose.[35]
Các phân tử cellulose cấu thành nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3nm, và khi kết hợp lại, chúng tạo thành vi sợi Trong môi trường tự nhiên, vi sợi thường không đồng nhất và tồn tại trong hai vùng khác nhau.
Vùng kết tinh của cellulose là nơi các mạch cellulose liên kết chặt chẽ với nhau thông qua các liên kết hydro giữa các nhóm hydroxyl Khu vực này có độ bền cao trước các tác động từ môi trường Enzyme cellulase chỉ có khả năng tác động ở bề mặt của hệ sợi trong vùng kết tinh này.
Vùng vô định hình của cellulose có cấu trúc lỏng lẻo, nơi các mạch liên kết với nhau thông qua lực Vander Waals, làm cho nó dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố bên ngoài.
1.3.3 Các phương pháp tiền xử lý rơm rạ
Rơm rạ là sản phẩm từ các sợi polymer cacbonhydrat phức tạp, bao gồm cellulose và hemicellulose, được bao phủ bởi lớp lignin dày đặc Lignin này ngăn cản sự thủy phân enzyme, do đó cần thực hiện bước tiền xử lý để phá vỡ lignin, giúp lộ ra cellulose và hemicellulose cho quá trình thủy phân enzyme hiệu quả hơn.
Tiền xử lý có mục đích giảm cellulose kết tinh, tăng diện tích bề mặt biomass, loại bỏ hemicellulose và phá vỡ lớp lignin Quá trình này giúp cellulose dễ tiếp cận hơn với enzyme, từ đó tăng tốc độ và hiệu quả chuyển đổi polymer carbohydrate thành đường lên men.
Tiền xử lý là một bước quan trọng trong quá trình chuyển đổi đường cellulose để lên men, bao gồm các phương pháp hóa học, vật lý, nhiệt và sự kết hợp giữa chúng Phương pháp tiền xử lý vật lý nhằm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc và khe rỗng bên trong vật liệu, đồng thời giảm độ kết tinh và polyme hóa của cellulose, thường áp dụng để giảm dư lượng lignocellulosic thông qua các kỹ thuật như hấp, nghiền, xay, chiếu xạ, nhiệt độ và áp suất Các phương pháp tiền xử lý hóa học cũng hứa hẹn mang lại hiệu quả cao trong quá trình này.
Tiền xử lý với kiềm
Tiền xử lý với ammonia
Tiền xử lý với acid
Tiền xử lý với các tác nhân oxy hóa
Tiền xử lý sinh học là một phương pháp hứa hẹn, sử dụng ít năng lượng và hóa chất, nhằm loại bỏ lignin từ lignocellulose một cách an toàn và thân thiện với môi trường Mặc dù chưa có hệ thống điều khiển nhanh chóng và hiệu quả, nấm trắng thối thuộc lớp Basidiomycetes được đánh giá cao nhờ khả năng thay đổi số lượng và cấu trúc của rơm sau xử lý, cũng như tính nhạy cảm với thủy phân enzym.
Hiệu quả thủy phân lignocellulosic biomass được cải thiện khi sử dụng kết hợp nhiều loại enzyme như cellulase, xylanases và pectinases Tuy nhiên, chi phí của phương pháp này tăng đáng kể, mặc dù từ góc độ sinh thái, nó vẫn được xem là một giải pháp tiềm năng.
17 d Tiền xử lý kết hợp
Nghiên cứu của Kun et al (2009) cho thấy rằng việc tiền xử lý rơm rạ bằng kiềm có xúc tác H2O2, kết hợp với tiền xử lý vi sóng, đã làm thay đổi đáng kể tính chất vật lý và vi cấu trúc của rơm Tương tự, Zhu et al (2006) đã báo cáo về một số phương pháp tiền xử lý vi sóng kết hợp với axit và kiềm, trong đó có khả năng loại bỏ hemicellulose và lignin hiệu quả.
1.3.4 Con đường phân giải rơm
❖ Cơ chế phản ứng theo công nghệ sinh học hiện đại
Endocellulase xúc tác cắt liên kết 1,4 -glucoside trong cellulose, lignin và 𝛼 -
D - glucan ngẫu nhiên Sản phẩm là cellulose phân tử nhỏ, cellobiose và glucose.[6]
Exocellulase : cắt 2 hoặc 4 đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose tạo thành các cellobiose (disaccharide) và một số cellotetrose
Cellobiase: tham gia phân giải disaccharide và cellotetrose thành glucose
Cơ chế này được thể hiện qua hình 1.7
Hình 1.7.Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase theo Erikson [1]
Thủy phân enzyme là quá trình phá vỡ polyme cellulose và hemicellulose bằng cách sử dụng enzyme Polyme cellulose chủ yếu chứa glucans, trong khi hemicellulose chứa nhiều loại đường như mannan, xylan, glucan, galactan và arabinan Kết quả của quá trình thủy phân cellulose là glucose, trong khi hemicellulose tạo ra một số pentoses và hexoses Tuy nhiên, hàm lượng lignin cao trong rơm làm cản trở sự tiếp xúc của enzyme, dẫn đến ức chế sản phẩm cuối cùng và giảm tốc độ cũng như năng suất thủy phân Ngoài lignin, cellobiose và glucose cũng có tác động ức chế mạnh mẽ đến quá trình thủy phân của cellulases.
Thủy phân hemicellulose thường được thực hiện dưới điều kiện nhẹ, bao gồm áp suất thấp và thời gian lưu giữ lâu dài.
Nghiên cứu về Aspergillus niger cho thấy khả năng sản xuất glucose từ rơm rạ đạt hiệu suất từ 43% đến 87%, với kích thước rơm giảm từ 425 xuống 75 mm khi nhiệt độ tối ưu là 45 - 50°C và pH khoảng 4.5 – 5.0 Nồng độ và tỷ lệ glucose sản xuất phụ thuộc vào giai đoạn tiền xử lý rơm, nồng độ cơ chất và tế bào Hiệu quả thủy phân lignocellulosic trong biomass được cải thiện khi sử dụng phối hợp nhiều loại enzyme như cellulase, xylanases và pectinaza, thay vì chỉ sử dụng cellulase đơn lẻ.
Hiện trạng sử dụng rơm rạ tại Việt Nam và các nước trên thế giới
Rơm rạ vẫn là nguồn năng lượng chính cho việc nấu nướng ở nhiều vùng nông thôn, đồng thời được sử dụng để sản xuất các vật dụng sinh hoạt như chổi rơm, mũ rơm, giấy và xây dựng nhà cửa.
Rơm đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nông nghiệp, không chỉ là nguồn thức ăn cho gia súc mà còn được sử dụng để làm phân bón hữu cơ, trồng nấm rơm, nấm bào ngư, nấm sò và rau sạch Ngoài ra, rơm còn giúp giữ ẩm và giữ ấm cho cây trồng Việc áp dụng các giải pháp kỹ thuật để nâng cao giá trị dinh dưỡng và sử dụng rơm một cách hiệu quả sẽ mang lại lợi ích đáng kể trong chăn nuôi gia súc nhai lại.
Trong ngành công nghiệp hiện đại, rơm rạ được chế biến thành ván ép để sản xuất đồ nội thất, làm tường ngăn thay thế cho gỗ và sử dụng làm phụ gia trong sản xuất xi măng.
Rơm là nguồn tài nguyên thân thiện với môi trường, đóng góp vào sản xuất công nghiệp và nông nghiệp, tạo ra việc làm cho người lao động và nâng cao đời sống tinh thần cho xã hội Việc tận dụng rơm rạ, thường được xem là phế phẩm, không chỉ tạo ra giá trị nghệ thuật mà còn cung cấp các vật dụng cần thiết cho cuộc sống hàng ngày.
Rơm lúa là nguồn thức ăn phổ biến cho trâu bò ở các nước nhiệt đới, với 75% rơm lúa rẫy và 82% rơm lúa nước ở Thái Lan được sử dụng cho chăn nuôi Tại Bangladesh, tỷ lệ này là 47% Ở Mỹ, có 538 dự án xây dựng nhà bằng rơm rạ được đăng ký, trong đó một số dự án đã hoàn thành xung quanh thủ đô Washington Những công trình như nhà ở, trường học và công sở với tường bằng rơm rạ được đánh giá cao nhờ khả năng chống thấm nước, chống cháy, tiết kiệm năng lượng và khả năng chịu đựng bão, góp phần bảo vệ môi trường.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu
Rơm đã qua tiền xử lý và chưa qua xử lý từ trường Đại Học Bách Khoa TPHCMtheo dự án JICA (Japan International Cooperation Agency)
Enzyme được chiết xuất từ hệ vi sinh vật trong dạ cỏ bò, được lấy từ một lò mổ tại huyện Trảng Bom, tỉnh Đồng Nai Mẫu dạ cỏ bò này đã được thu thập vào tháng 2 năm 2014.
Sơ đồ 2.1.Quy trình thu nhận enzyme cellulase
Môi trường PCS có pH đạt chuẩn Hấp khử trùng 121°C, 15 phút
50 ml môi trường PCS có pH phù hợp với từng cộng đồng vi sinh vật
Mẫu thức ăn dạ cỏ bò
Ly tâm 6000 vòng trong 5 phút, nhiệt độ phòng
Bảo quản trong tủ lạnh
1 ml dịch mẫu dạ cỏ bò Đồng nhất mẫu Tài liệu HUTECH
Thiết bị, hóa chất
Máy so màu OD 1100RS Spectrophotometer
Một số thiết bị thông dụng khác như: Tủ cấy Laminar; Nồi hấp thanh trùng Hirayama HVE-50; Cân điện tử Excell; Tủ ấm Memmert; máy ly tâm Hettich…
A Hóa chất trong phản ứng xác định hoạt tính enzyme Cellulase
➢ Agar CMC 1% (Carboxymethylcellelose Sodium Salt):
Nước cất vừa đủ 1000 ml
CMC là hợp chất không tan trong nước ở nhiệt độ thường, cần gia nhiệt và khuấy để tan hoàn toàn Sau khi CMC đã tan, trút agar vào, khuấy đều và hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút.
Nước cất vừa đủ 500 ml
➢ Dung dịch NaOH 1M giải nhuộm congo red:
Dung dịch acid citric 0.1M (a): 21,01g C6H8O7.H2O hòa tan và định mức đến
Dung dịch trinatri citrate 0.1M (b): 29,41g C6H5O7Na3 2H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml
Bảng 2.1.Dung dịch đệm citrate a (ml) b (ml) pH
Dung dịch mononatri orthophosphate (A): 27,8g Na2PO4 hòa tan và định mức đến 1000ml
Dung dịch dinatri hydrophosphate (B): 53,05g Na2HPO4 7H2O hoặc 71,7g
Na2HPO4.12H2O hòa tan và định mức đến 1000ml
Bảng 2.2.Dung dịch đệm phosphate
A (ml) B (ml) pH A (ml) B (ml) pH
➢ Thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalicylic acid):
Hòa tan 7,486 g DNS và 6,92 g NaOH trong 1000 ml nước cất, sau đó thêm 216 g muối sodium potassium tartrate (KNaC4H4O6) và 5,36 ml phenol ở nhiệt độ 50 o C, cùng với 5,86 g Na2S2O5 Cuối cùng, lưu trữ dung dịch trong chai sẫm màu và bảo quản ở nhiệt độ lạnh.
➢ Dung dịch đường chuẩn 1mg/ml: cân 10mg đường để chuẩn độ bằng cân phân tích, pha trong 10ml nước cất, lắc đều và giữ lạnh
Phẩm màu Coomasie Brilliant Blue 0,1g được hòa tan trong 50ml ethanol 99% và sau đó pha loãng với nước cất thành 500ml để tạo thành dung dịch (1) trong chai màu tối Đồng thời, 100ml H3PO4 85% được pha loãng thành 500ml để tạo dung dịch (2) Khi cần sử dụng, hòa trộn 1 phần dung dịch (1) với 1 phần dung dịch (2) để lấy dịch trong.
➢ Dung dịch protein chuẩn 1mg/ml: cân 10mg albumin bằng cân phân tích, pha trong 10ml nước cất, lắc đều và giữ lạnh
B Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
• Môi trường PCS medium (Peptone cellulosic solution):
Rice straw (rơm rạ khô xay) 20 g/l
Môi trường được chuẩn độ pH bằng NaOH hoặc HCl để thay đổi pH từ 5,5 – 7,0, hấp khử trùng 121Tài liệu HUTECH o C, 15 phút
Phương pháp nghiên cứu
Sơ đồ 2.2.Tóm tắt toàn bộ thí nghiệm
Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ lên hoạt tính cellulase bằng pp Filter paper:
- pH 6.0, 6.1, 6.3, 6.5, 6.7, 6.9 Thu dịch enzyme cellulase thô
Phân giải rơm qua xử lý Chọn lọc hệ enzyme cellulase tối ưu
Khảo sát lượng đường khử sinh ra bằng pp DNS:
- Nhiệt độ, pH: tùy mẫu
Khảo sát khả năng sử dụng rơm rạ Chọn lọc mẫu
Tăng sinh trong PCS có kèm theo miếng giấy lọc để làm chất chỉ thị,
Thử CMC và kiểm tra sự phân giải giấy lọc sau 4, 7, 10, 13 ngày
Mẫu thức ăn từ dạ cỏ bò
Thử CMC và kiểm tra sự phân giải giấy lọc sau 7, 10, 13 ngày
Khảo sát điều kiện phát triển của hệ vi sinh vật:
2.3.1 Quy trình tăng sinh chọn lọc
Mục đích của việc tăng sinh là phát triển mạnh mẽ hệ vi sinh vật mong muốn trong môi trường nuôi cấy thích hợp, và quá trình này được thực hiện lặp lại nhiều lần để đảm bảo sự ổn định.
➢ Quy trình tăng sinh lần 1 được thể hiện theo các bước ở sơ đồ 2.3
Sơ đồ 2.3 Quy trình tăng sinh chọn lọc mẫu
Hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C trong 15 phút và để nguội qua đêm để theo dõi khả năng nhiễm khuẩn sau quá trình khử trùng Đồng nhất mẫu và lấy 1 ml dịch, sau đó gắp khoảng 0,1 g mẫu rơm dạ cỏ bò để phân phối vào các bình chứa môi trường.
Mẫu được ủ ở nhiệt độ 37°C, pH 7.0, kèm mẫu đối chứng trong 13 ngày
Chuẩn bị môi trường PCS pH 7.0 có kèm miếng giấy lọc 1x4 cm làm chỉ thị khả năng phân giải cellulose
Kiểm tra CMC và ngày phân giải giấy lọc
Chọn lọc các bình nuôi cấy có vòng CMC vượt trội (≥13mm) và ngày phân giải giấy lọc ngắn (≤7ngày)
2.3.2 Quy trình tăng sinh khảo sát nhiệt độ phát triển của hệ vi sinh vật
➢ Quy trình tăng sinh lần 2: Khảo sát nhiệt độphát triển của hệ vi sinh vật được thể hiện theo sơ đồ 2.4
Sơ đồ 2.4.Quy trình khảo sát nhiệt độ phát triển của hệ vi sinh vật
Hấp khử trùng 121°C trong 15 phút và để nguội qua đêm để quan sát khả năng bị nhiễm sau khi khử trùng
Lựa chọn các mẫu đã phân hủy hết giấy lọc trong đợt tăng sinh lần 1
Lắc mạnh, trộn đều các mẫu được chọn, hút 1 ml dịch nuôi cấy cho vào bình môi trường PCS
Mẫu được ủ ở 2 nhiệt độ 39°C và 41°C, pH 7.0, kèm mẫu đối chứng
Chuẩn bị môi trường PCS pH 7.0 có kèm miếng giấy lọc 1x4 cm làm chỉ thị khả năng phân giải cellulose
Kiểm tra CMC và ngày phân giải giấy lọc
Chọn lọc các bình nuôi cấy có vòng CMC vượt trội (≥13 mm) và ngày phân giải giấy lọc ngắn (≤7 ngày)
2.3.3 Quy trình tăng sinh khảo sát pH phát triển của hệ vi sinh vật
➢ Quy trình tăng sinh lần 3: Khảo sát pH phát triển của hệ vi sinh vật được thể hiện theo sơ đồ 2.5
Sơ đồ 2.5.Quy trình khảo sát pH phát triển của hệ vi sinh vật
Hấp khử trùng 121°C trong 15 phút và để nguội qua đêm để quan sát khả năng bị nhiễm sau khi khử trùng
Lựa chọn các mẫu đã phân hủy hết giấy lọc trong đợt tăng sinh lần 2
Lắc mạnh, trộn đều các mẫu được chọn, hút 1 ml dịch nuôi cấy cho vào bình môi trường PCS
Tùy từng mẫu được ủ ở các nhiệt độ thích hợp, thay đổi pH
Chuẩn bị môi trường PCS pH 7.0 có kèm miếng giấy lọc 1x4 cm làm chỉ thị khả năng phân giải cellulose
Kiểm tra CMC và ngày phân giải giấy lọc
Chọn lọc các bình nuôi cấy có vòng CMC vượt trội (≥13 mm) và ngày phân giải giấy lọc ngắn (≤7 ngày)
Xác định hàm lượng, hoạt tính của enzyme cellulase
2.4.1 Quy trình phát hiện sinh tổng hợp enzyme endoglucanase trên thạch đĩa CMC
Sau quá trình tăng sinh, kiểm tra sinh tổng hợp enzyme endoglucanase bằng thuốc thử Congo red 0,1% trên thạch đĩa CMC
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường PCS ở nhiệt độ khảo sát sau 4, 7, 10 và 13 ngày Để tiến hành thí nghiệm, môi trường CMC được khử trùng và đổ vào đĩa, sau đó tạo các giếng trên mặt thạch Tiếp theo, 20𝜇l dịch nuôi cấy được bơm vào từng giếng và ủ trong 24 giờ ở nhiệt độ khảo sát.
Cho 5 ml dung dịch thuốc thử Congo red 0,1% vào các đĩa thạch đã ủ 24 giờ ở nhiệt độ khảo sát Sau 30 phút, loại bỏ dung dich thuốc thử và thực hiện bước giải nhuộm với 5ml NaCl 1M Sau 15 phút, loại bỏ NaCl và đọc kết quả Mẫu nào có sự phân giải CMC sẽ tạo vùng phân giải nhạt màu hơn so với màu của thuốc thử Congo red
2.4.2 Định lượng hàm lượng protein tổng trong dịch nuôi cấy theo phương pháp Bradford
Nguyên tắc của phương pháp phát hiện protein bằng Coomassie Brilliant Blue là tạo thành hợp chất màu hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm, với cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch Phương pháp này có độ nhạy cao, có khả năng phát hiện tới vài àg protein/ml, đồng thời dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian.
Phương pháp này giúp xác định các hệ vi sinh vật có khả năng sản xuất enzyme cellulase với hàm lượng cao, qua đó khảo sát các điều kiện lên men tối ưu.
Thuốc thử Coomasie Brilliant Blue
Dung dịch albumin chuẩn 1mg/ml
Dịch enzyme thô được pha loãng 50 lần
➢ Lập đồ thị đường chuẩn Để dung dich albumin chuẩn có cỏc nồng độ từ 10-40 àg/ml ta thực hiện như sau:
Bảng 2.3: Thông số xây dựng đường chuẩn albumin Ống nghiệm ĐC 1 2 3 4
Nồng độ albumin (àg/ml) 0 10 20 30 40
Dung dịch albumin chuẩn (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4
Nước cất vô trùng (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6
Thuốc thử Bradford được sử dụng trong 5 ống nghiệm, mỗi ống chứa 2 ml thuốc thử Ống 1 tương ứng với thời gian xuất phát ban đầu là 0 phút, và các ống còn lại (2, 3, 4) được thực hiện phản ứng cách nhau 1 phút Mẫu thí nghiệm được pha loãng để đảm bảo trị số mật độ quang đo được nằm trong khoảng đường chuẩn, với bước sóng đo là 595 nm.
Để xác định hàm lượng protein trong mẫu phân tích, chúng ta vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (àg/ml) và mật độ quang OD595 Dựa vào phương trình của đường tuyến tính này, có thể tính toán chính xác hàm lượng protein trong mẫu.
Tổng hàm lượng protein trong 1ml dịch enzyme thô được tính theo công thức:
Với: X: nồng độ protein suy ra từ đường chuẩn (àg/ml) n: hệ số pha loãng (50 lần) m: khối lượng mẫu (500 𝜇l=0.5 ml)
V: thể tích mẫu hút đi đo OD (1 ml)
2.4.3 Định lượng hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp Filter Paper
➢ Nguyên lý phương pháp Filter Paper:
Phương pháp FPA là cách kiểm tra hoạt tính enzyme cellulase phổ biến nhất được IUPAC khuyên dùng, dựa trên sự chuyển đổi lượng cơ chất từ 2mg đường trong 50mg giấy lọc trong thời gian 60 phút Hoạt tính của cellulase được tính bằng đơn vị giấy lọc (FPU) trên thể tích dung dịch enzyme ban đầu Ưu điểm của phương pháp này là sử dụng cơ chất rộng rãi và dễ bị tác động bởi hoạt tính cellulase, nhưng nhược điểm là cần thời gian cho phản ứng và dễ bị ảnh hưởng bởi sai số thiết bị.
Dung dịch đường glucose chuẩn 1mg/ml
Dịch enzyme: dịch nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường PCS sau 14 ngày
Bảng 2.4.Thông số xây dựng đường chuẩn glucose Ống nghiệm ĐC 1 2 3 4
Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4
Dung dịch glucose chuẩn(ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4
Dung dịch đệm photphate pH 6.3 (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6
▪ Chuẩn bị ống trắng và ống đối chứng
▪ Ống trắng : 1,5ml đệm phosphate
▪ Ống đối chứng: {1 ml đệm + 0,5 ml enzyme.
▪ Ống phản ứng : 1 ml đệm + giấy lọc + 0,5 ml enzyme, sao cho giấy lọc phải được ngập hết trong dung dịch đệm Votex nhẹ
▪ Ủ các ống vào 39°C trong 60 phút để thực hiện phản ứng
▪ Sau ủ, hút dung dịch thí nghiệm vào effendorf 1,5ml và ly tâm 10000 vòng/phút trong 3 phút
▪ Sau khi ly tâm, hút 1ml dung dịch nổi phía trên vào trong một ống nghiệm khác và thêm 2ml thuốc thử DNS và trộn đều
▪ Đun sôi các ống nghiệm trong 5 phút (có đậy nút)
▪ Chuyển các ống nghiệm vào nước lạnh để làm nguội
▪ Đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 540nm
Số đo OD của lượng đường khử thực sự được giải phóng là:
∆OD= OD ống nghiệm phản ứng – OD ống nghiệm đệm + giấy lọc – OD ống nghiệm đệm+enzyme
Sử dụng phương trình của đường chuẩn để tính hàm lượng đường khử thực sự X(mg/ml) được giải phóng bởi phản ứng thủy phân
Tính hàm lượng đường trong 1ml mẫu ban đầu (mg/ml) = 𝑋∗𝑛∗𝑉1
Với: X: nồng độ đường suy ra từ đường chuẩn (mg/ml) n: hệ số pha loãng (3lần)
V: thể tích mẫu phân tích (0,5ml)
V1: thể tích mẫu hút đi đo OD (1ml)
Hoạt tính enzyme FPU (U/ml)= ℎà𝑚 𝑙ươ𝑛𝑔 đườ𝑛𝑔 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 1 𝑚𝑙 𝑚ẫ𝑢 𝑏𝑎𝑛 đầ𝑢
2.5 Khảo sát nhiệt độ, pH thích hợp của hệ enzyme cellulase
Các enzyme cellulase từ các nguồn khác nhau có điều kiện phản ứng tối ưu khác nhau Nhiệt độ và pH là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt tính của cellulase Vì vậy, việc xác định các điều kiện tối ưu cho hoạt tính cellulase là cần thiết.
2.5.1 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính cellulase
Xác định hoạt tính FPase của enzyme cellulase bằng phương pháp DNS tại dung dịch đệm phosphate có pH: 6.0, 6.1, 6.3, 6.5, 6.7 và 6.9
2.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính cellulase
Xác định hoạt tính FPase của enzyme cellulase được thực hiện bằng phương pháp DNS ở các nhiệt độ phản ứng 37°C, 39°C và 41°C Sử dụng đệm phosphate với pH phù hợp cho từng mẫu đã khảo sát Mục tiêu là xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính của enzyme cellulase.
Khảo sát quá trình enzyme cellulase thủy phân cellulose từ rơm rạ
Sơ đồ 2.6: Quy trình phân giải rơm bằng hệ enzyme cellulase
Rơm đã được xử lý, xay nhuyễn và sấy khô ở nhiệt độ 70°C trong 1 ngày, sau đó để nguội trong bình hút ẩm Tiến hành cân 500mg rơm bằng cân điện tử, cho vào bình chứa và thêm 10ml dịch đệm phosphate phù hợp với pH của từng hệ enzyme, rồi hấp khử trùng.
Thu nhận rơm còn lại, sấy khô
Thu nhận kết quả và phân tích,xử lý số liệu Ủ ở nhiệt độ, pH thích hợp
Sau 2, 3, 4 và 5 ngày, thu dịch, thử đường khử theo phương pháp DNS
500 mg rơm qua xử lý + 10 ml đệm phosphate
Nghiên cứu được thực hiện ở nhiệt độ 121°C trong 15 phút, với 1ml enzyme thô được thêm vào bình rơm và ủ ở nhiệt độ thích hợp Sau 2 ngày, dịch được thu và quay ly tâm ở 10.000 vòng trong 5 phút để thu dịch trong Lượng đường khử được xác định bằng phương pháp DNS vào ngày thứ 3, 4 và 5 Sau 5 ngày, rơm còn lại được lọc qua giấy lọc đã sấy khô và cân khối lượng khô, sau đó sấy khô ở 70°C trong 1 ngày Kết quả thu được sẽ được phân tích để xác định hàm lượng đường khử và mức độ phân giải của rơm.
2.6.1 Định lượng đường khử bằng phương pháp DNS
➢ Nguyên lý phương pháp DNS
Phương pháp này sử dụng phản ứng tạo màu giữa đường khử và thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS), trong đó cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một khoảng nhất định Việc so màu được thực hiện ở bước sóng 540nm, và từ đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS, có thể xác định hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.
➢ Dụng cụ, thiết bị: Máy so màu, bếp điện, pipetman, effenphore 1.5ml, ống nghiệm có nắp, pipetman
Dung dịch đường glucose chuẩn 1 mg/ml để dựng đường chuẩn glucose tương tự như phương pháp ở mục 2.4.3
Dịchthu nhận từ bình phân giải rơm được ly tâm 10000vòng trong 5 phút Hút 1ml dịch trong cho vào ống nghiệm Thêm 2 ml thuốc thử DNS
Lắc đều các ống nghiệm và đun sôi trong 5 phút với nắp đậy Sau đó, làm lạnh đến nhiệt độ phòng bằng cách đặt trong chậu nước mát Đặt độ hấp thụ của ống số 0 ở bước sóng 540nm bằng 0 và tiến hành đo độ hấp thụ của các ống còn lại ở cùng bước sóng 540nm.
Sử dụng phương trình của đường chuẩn để tính hàm lượng glucose có trong dịch phân giải rơm
Tính hàm lượng đường trong 1ml mẫu ban đầu (mg/ml)= X*n
Với: X: nồng độ đường suy ra từ đường chuẩn (mg/ml)
34 n: hệ số pha loãng (9,09 lần)
2.6.2 Khả năng phân giải rơm rạ
➢ Mục đích: Xác định lượng rơm được phân giải sau 5 ngày thủy phân bằng enzyme
Bình hút ẩm có silicagel
Tủ sấy, điều chỉnh nhiệt độ 70℃
Cân phân tích độ chính xác đạt ± 0.001 g
Để thực hiện thí nghiệm, trước tiên cần cân khối lượng rơm và giấy lọc đã được sấy khô ở 70℃ trong 1 ngày Sau 5 ngày, thu hồi lượng rơm còn lại bằng cách lọc qua giấy lọc và sấy khô tại nhiệt độ 70℃, bắt đầu tính thời gian khi tủ sấy đạt nhiệt độ này Sau 1 ngày sấy, lấy giấy lọc và rơm ra, để nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng (thường mất khoảng 30 – 40 phút) Cuối cùng, cân lại khối lượng rơm và giấy lọc, và lặp lại quy trình cho đến khi đạt được lượng mất đi mong muốn.
2 lần cân liên tiếp không chênh lệch nhau quá 50 mg
➢ Kết quả mrơm tiêu thụ = m rơm ban đầu – (m rơm còn lại + giấy lọc – m giấy lọc)
Trong nghiên cứu này, khối lượng rơm khô bị hệ enzyme cellulase thủy phân được gọi là mrơm tiêu thụ (mg) Khối lượng rơm khô ban đầu được ký hiệu là mrơm ban đầu (mg) Sau quá trình xử lý, khối lượng rơm còn lại và giấy lọc được sấy khô ở 70℃ trong 1 ngày được ghi nhận là mrơm còn lại + giấy lọc (mg) Cuối cùng, khối lượng giấy lọc sấy khô và được cân trước khi lọc rơm được ký hiệu là mgiấy lọc (mg).
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Kết quả tăng sinh trên môi trường PCS
Kết quả kiểm tra ngày phân giải giấy lọc trong môi trường PCS và vòng phân giải trên đĩa thạch CMC tại 37°C, pH 7.0 được trình bày chi tiết trong bảng 3.1.
Bảng 3.1 Kết quả kiểm tra ngày phân giải giấy lọc trong môi trường PCS và vòng phân giải trên đĩa thạch CMC tại 37°C, pH 7.0
Mẫu Ngày phân giải giấy lọc
(ngày) Đường kính vòng phân giải CMC (mm)
Ghi chú:“ –“ : không có vòng phân giải CMC, hoặc giấy lọc chưa bị phân giải
Kết quả cho thấy sự khác biệt giữa các chủng trong khả năng sử dụng giấy lọc và tạo vòng phân giải CMC So sánh với nghiên cứu của Lương Ngọc Tuấn Anh (2012) và Hoàng Nguyên (2011), kết quả này tương tự Do đó, chúng tôi quyết định chọn lọc những mẫu có khả năng này để thực hiện thí nghiệm tiếp theo.
• Ngày phân giải giấy lọc trước 7 ngày và đường kính vòng phân giải CMC khoảng 13mm cùng với sự ổn định qua các ngày thử
• Đó là các mẫu M4, M5, M15, M16, M17, M19, M20, M22 và M24
Hình 3.1.Chín mẫu dạ cỏ bò tăng sinh ở 37°C, pH 7.0
Hình 3.2.Vòng phân giải trên đĩa thạch CMC của 9 mẫu dạ cỏ bò ở 37°C, pH 7.0 sau 7 ngày tăng sinh trong môi trường PCS
Hình 3.3.Vòng phân giải trên đĩa thạch CMC của 9 mẫu dạ cỏ bò ở 37°C, pH 7.0 sau 10 ngày tăng sinh trong môi trường PCS
Hình 3.4.Vòng phân giải trên đĩa thạch CMC của 9 mẫu dạ cỏ bò ở 37°C, pH 7.0 sau 13 ngày tăng sinh trong môi trường PCS.
Kết quả khảo sát nhiệt độ phát triển của hệ vi sinh vật
Kết quả tối ưu nhiệt độđược thể hiện qua các bảng 3.2, 3.3 và 3.4
Bảng 3.2.Kết quả khảo sát sự phân hủy giấy lọc và CMC ở 37°C, pH 7.0
Mẫu Ngày phân giải giấy lọc (ngày) Đường kính vòng phân giải CMC (mm)
Bảng 3.3.Kết quả khảo sát sự phân hủy giấy lọc và CMC ở 39°C, pH 7.0
Mẫu Ngày phân giải giấy lọc (ngày) Đường kính vòng phân giải CMC (mm)
Bảng 3.4.Kết quả khảo sát sự phân hủy giấy lọc và CMC ở 41°C, pH 7.0
Mẫu Ngày phân giải giấy lọc (ngày) Đường kính vòng phân giải CMC (mm)
Ghi chú:“ –“ : không có vòng phân giải CMC, hoặc giấy lọc chưa bị phân giải
Kết quả kiểm tra cho thấy rằng các mẫu M4, M5 và M20 phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 37°C, trong khi mẫu M15 và M19 thích hợp với nhiệt độ 39°C Các mẫu M16, M17, M22 và M24 lại thích ứng với nhiệt độ 41°C Sự phát triển của các mẫu này phản ánh sự biến đổi của cộng đồng vi khuẩn trong dạ cỏ bò, phụ thuộc vào nguồn thức ăn.
Kết quả khảo sát pH phát triển của hệ vi sinh vật
Kết quả tối ưu pH của 9 mẫu nuôi cấy trên môi trường PCS lỏng được thể hiện qua bảng 3.5
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát sự phân hủy giấy lọc và CMC ở các pH khác nhau
Ngày phân giải giấy lọc (ngày) Đường kính vòng phân giải CMC
Ghi chú:“ –“ : không có vòng phân giải CMC, hoặc giấy lọc chưa bị phân giải
Sau khi kiểm tra sinh tổng hợp cellulase trên thạch đĩa CMC ở các pH khác nhau, chúng tôi nhận thấy rằng đường kính vòng CMC thay đổi đáng kể tùy thuộc vào độ pH, với hầu hết các mẫu tập trung trong khoảng pH 6.5 - 7.0, ngoại trừ mẫu M20 ở pH 6.0 Đặc biệt, mẫu M19 cho kết quả phân giải vòng CMC nhanh hơn và có phạm vi pH hoạt động rộng hơn, vượt trội so với các mẫu khác Kết quả tối ưu về nhiệt độ và pH này tương đồng với môi trường trong dạ cỏ bò, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của hệ vi sinh vật.
✓ Mẫu M4 thích hợp phát triển ở pH 7, mẫu M5 thích hợp phát triển ở pH 6.5, mẫu M20 thích hợp phát triển ở pH 6.0 và tại nhiệt độ 37°C
✓ Mẫu M15 và M19 thích hợp phát triển ở pH 7, tại nhiệt độ 39°C
✓ Mẫu M16, M24 thích hợp phát triển ở pH 6.5 và mẫu M17 , M22 thích hợp phát triển ở pH 7, tại nhiệt độ 41°C
Kết quả hàm lượng protein tổngtheo phương pháp Bradford
Kết quả nồng độ protein tổng của 9 mẫu vi sinh vật dạ cỏ bò đo theo phương pháp Bradford được thể hiện trong bảng 3.6 và biều đồ 3.1
Bảng 3.6.Nồng độ protein tổng của 9 mẫuvi sinh vật dạ cỏ bò
Mẫu OD Nồng độ protein (μg/ml)
Biểu đồ 3.1.Nồng độ protein tổng của 9 mẫuvi sinh vật dạ cỏ bò
Từ đồ thị cho ta thấy nồng độ protein tổng của mẫu M5 (4073,9𝜇g/ml) và M19 (4160,9𝜇g/ml)là cao nhất và thấp nhất là mẫu M20 (1900,0𝜇g/ml) và M24 (1552,2𝜇g/ml)
Mẫu vi sinh vật dạ cỏ bò
Kết quả đo hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp Filter Paper
Kết quả đo vòng phân giải CMC trên đĩa thạch cho thấy hoạt tính của enzyme cellulase, chủ yếu mang tính chất định tính Do đó, cần tiến hành kiểm tra hoạt tính tổng thể của cellulase bằng phương pháp FPA.
3.5.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt tính cellulase
Kết quả đo mật độ quang học ở bước sóng 540nm của 9 mẫu enzyme cellulase theo phương pháp FPA ở 39°C và thay đổi pH từ 6.0 – 6.9 được thể biện trong bảng 3.7
Bảng 3.7 Giá trị OD 540nm của 9 mẫu khảo sát hoạt tính cellulase thay đổi pH từ
Mẫu pH6.0 pH6.1 pH6.3 pH6.5 pH6.7 pH6.9
Kết quả khảo sát cho thấy pH tối ưu cho hoạt tính cellulase bằng phương pháp FP dao động từ 6.0 đến 6.9 ở nhiệt độ 39°C Cụ thể, các mẫu M15, M20 và M22 thích ứng ở pH 6.0, trong khi mẫu M5 thích ứng ở pH 6.3, và các mẫu M4, M16, M17, M19, M24 thích ứng ở pH 6.5 Những kết quả này phù hợp với điều kiện phát triển của cộng đồng vi khuẩn trong dạ cỏ bò, nơi mà pH này được tạo ra nhờ sản phẩm của hệ vi khuẩn, giúp chúng có thể cùng tồn tại trong môi trường không khắc nghiệt.
3.5.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính cellulase
Kết quả đo mật độ quang học ở bước sóng 540nm của 9 mẫu enzyme cellulase theo phương pháp FPA được trình bày trong bảng 3.8, cho thấy sự thay đổi khi nhiệt độ được điều chỉnh ở 37°C, 39°C và 41°C, cùng với pH tối ưu.
Bảng 3.8.Giá trị OD540nm của 9 mẫu khảo sát hoạt tính cellulase thay đổi nhiệt độ
Từ kết quả khảo sát nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính cellulase bằng phương pháp
Khi thay đổi nhiệt độ ở 37°C, 39°C và 41°C tại pH tối ưu, các mẫu enzyme cho thấy sự phù hợp khác nhau Các mẫu M16, M19 và M22 hoạt động hiệu quả nhất ở nhiệt độ 37°C, trong khi M20 và M24 thích hợp cho nhiệt độ 39°C Các mẫu còn lại, bao gồm M4, M5, M15 và M17, cho thấy khả năng hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 41°C.
Kết quả tối ưu pH và nhiệt độ cho hoạt tính của hệ enzyme cellulase được thể hiện rõ ràng trong bảng 3.9 và biểu đồ 3.2, cho thấy hoạt tính cellulase tổng số.
Bảng 3.9.Kết quả hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp FPA
Hàm lượng glucose (mg/ml)
Biểu đồ 3.2.Hoạt tính cellulase tổng số của 9 mẫuenzyme cellulase
Biểu đồ 3.2 cho thấy hoạt tính cellulase tổng số của 9 mẫu enzyme cellulase từ cộng đồng vi khuẩn dạ cỏ bò khác nhau có sự khác biệt Kết quả này không hoàn toàn nhất quán với nồng độ protein tổng Nguyên nhân có thể là do thành phần cộng đồng vi khuẩn dạ cỏ bò cần thích nghi với điều kiện thức ăn thay đổi, dẫn đến việc chúng phải sản sinh enzyme cellulase với hoạt tính mạnh hơn.
Hoạt tính cellulase tổng số không hoàn toàn tỷ lệ thuận với hàm lượng protein tổng, cho thấy sự cạnh tranh và cùng tồn tại giữa các hệ enzyme cellulase khác nhau, dẫn đến tỷ lệ các thành phần enzyme khác nhau.
Theo nghiên cứu của Faridha Begum et al (2013) và Nurulnisa Binti Nor Azman (2009), hoạt tính của hệ enzyme cellulase trong 9 mẫu cho kết quả khác nhau Cụ thể, các mẫu M4, M5, M17 và M20 có hoạt tính cellulase tổng số từ 0.064 U/ml đến 0.075 U/ml, trong khi các mẫu M15, M16, M19, M22 và M24 đạt hoạt tính từ 0.088 U/ml đến 0.161 U/ml Đối với đường kính vòng phân giải CMC, các mẫu M4, M5, M16 và M22 đạt trung bình từ 15,67 mm đến 17,33 mm, còn M15, M17, M19, M20 và M24 đạt từ 18,33 mm đến 22,33 mm Dựa trên kết quả này, ba hệ enzyme cellulase có tiềm năng cao đã được chọn để thực hiện thí nghiệm tiếp theo.
✓ Mẫu M15 có hoạt tính cellulase tổng số là 0,088 U/ml, ngày phân giải giấy lọc là 7ngày, trung bình đường kính vòng phân giải CMC là 22,00 mm
✓ Mẫu M19 có hoạt tính cellulase tổng số là 0,114 U/ml, ngày phân giải giấy lọc là 7ngày, trung bình đường kính vòng phân giải CMC là 22,33 mm
✓ Mẫu M24 có hoạt tính cellulase tổng số là 0,088 U/ml, ngày phân giải giấy lọc là 7ngày, trung bình đường kính vòng phân giải CMC là 18,67 mm.
Kết quả đo lượng đường khử sau khi phân giải rơm theo phương pháp DNS
Nghiên cứu của Nguyễn Văn Tuyên (2011) và Jadhav A.R et al (2013) cho thấy thời gian thủy phân có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất thủy phân bằng enzyme Để khảo sát, tôi đã chọn các mốc thời gian 2, 3, 4 và 5 ngày để theo dõi quá trình này, với điều kiện tối ưu cho enzyme cellulase hoạt động Trong thí nghiệm, lượng enzyme sử dụng là 1ml và rơm là 500mg Sau khi quá trình thủy phân kết thúc, dịch lọc được thu lại và mật độ quang OD 540nm được đo theo phương pháp đã định.
DNS Kết quả nồng độ dịch đường khi theo dõi thời gian thủy phân rơm được thể hiện trong bảng 3.10 và biểu đồ 3.3 như sau
Bảng 3.10.Kết quả hàm lượng glucose trong dịch sau phân giải rơm của 3 mẫu enzyme cellulase
Mẫu 0ngày 2ngày 3ngày 4ngày 5ngày
M15 có nồng độ 1,78 mg/ml, 1,90 mg/ml, 2,10 mg/ml, 2,24 mg/ml và 2,15 mg/ml M19 có nồng độ 1,66 mg/ml, 1,83 mg/ml, 2,54 mg/ml, 2,74 mg/ml và 2,80 mg/ml M24 có nồng độ 2,09 mg/ml, 2,15 mg/ml, 2,19 mg/ml, 2,47 mg/ml và 2,39 mg/ml.
Biểu đồ 3.3.Hàm lượng glucose tạo thành trong dịch sau phân giải rơm của 3 mẫu enzyme cellulase
Phân tích từ bảng 3.10 và biểu đồ 3.3 cho thấy hàm lượng glucose thay đổi theo thời gian, với mẫu M19 có sự tăng rõ rệt sau 5 ngày đạt 2,80 mg/ml Mẫu M15 và M24 cũng cho thấy nồng độ glucose tăng dần, đạt cao nhất vào ngày thứ 4 với 2,24 mg/ml và 2,47 mg/ml, nhưng không tăng đáng kể sau 5 ngày Điều này chứng tỏ quá trình thủy phân bằng enzyme diễn ra mạnh mẽ trong 4 ngày đầu, sau đó hoạt động xúc tác của enzyme diễn ra chậm lại Vì vậy, với hệ enzyme cellulase M19, thời gian thủy phân rơm cần ít nhất 5 ngày để đạt hiệu quả tối ưu.
0ngày 2ngày 3ngày 4ngày 5ngày
Nồng độ glucose (mg/ml)
48 còn hệ enzyme cellulase M15 và M24 nên diễn ra ít nhất 4 ngày mới đạt được hiệu suất thủy phân cao.
Kết quả phân giải rơm rạ
Kết quả khả năng phân giải rơm sau xử lý được trình bày trong bảng 3.11 và biểu đồ 3.4 dưới đây:
Bảng 3.11.Khả năng phân giải rơm của 3 mẫu enzyme cellulase
Mẫu Khối lượng rơm bị thủy phân (mg) % Rơm bị thủy phân
Biểu đồ 3.4.Khả năng phân giải rơmcủa 3 mẫu enzyme cellulase
Phân tích thống kê cho thấy cả ba hệ enzyme cellulase đều có khả năng tiêu thụ rơm cao, với mẫu M19 đạt 21,01% sau 5 ngày phân giải Kết quả này phản ánh sự khác biệt trong thành phần enzyme của từng hệ cellulase, trong đó enzyme endoglucanase đóng vai trò chủ yếu trong việc phân giải lignocellulose Do đó, mẫu vi sinh vật dạ cỏ bò M19, với khả năng sinh ra enzyme endoglucanase vượt trội, cho thấy khả năng phân giải rơm rạ tốt hơn hẳn.